KR101307008B1

KR101307008B1 - 한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 고급육 생산 한우 진단 방법

Info

Publication number: KR101307008B1
Application number: KR1020110014949A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 신성철; 허재필
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2013-09-11
Also published as: KR20120095559A

Abstract

본 발명은 한우의 근내지방도(marbling)와 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자표지를 이용한 고급육 생산 한우 진단 방법에 관한 것으로서, 육질 형질이 우수한 한우의 유전적 자질을 예측하고 판정하는 유전적 분자표지를 개발하여 조기 선발 및 개체 평가의 정확성을 제고하는 데 활용 가능한 유전자 진단 방법을 제공하기 위한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 한우 PDE1B (phosphodiesterase 1B) 유전자의 인트론(intron) 3번 영역 내에 존재하는 특정 SNP를 이용하여 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 기법으로 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 DNA marker를 검출함으로써 이들 가운데 가장 바람직한 유전자형(AG형)을 가진 개체를 유전적으로 근내지방도가 높은 육질이 우수한 한우 개체로 진단하여 선발하는 방법을 제공한다.

Description

한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 고급육 생산 한우 진단 방법 {Diagnosis method of high meat producing Hanwoo using the DNA marker associated with marbling score}

본 발명은 분자유전학적 분석기법인 PCR-RFLP 분석을 통하여 한우 육질 형질과 밀접하게 연관되어 있는 PDE1B (phosphodiesterase 1B) 유전자의 특정 단일염기다형(SNP)을 이용한 한우 육질 관련 분자표지를 개발함으로써, 이를 이용하여 유전적으로 육질이 우수한 한우를 조기에 진단할 수 있는 기술을 제공한다.

현대에는 분자유전학 및 유전자 분석기술의 발달로 인해 DNA 분자수준에서 가축의 특정 형질과 밀접하게 연관되어 있는 후보유전자들의 특이적인 DNA 염기서열 변이에 따른 유전적 형질 진단용 분자표지 기술개발이 활발히 이루어지고 있다. 최근에는 PCR 기술을 이용하는 RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSCP (single strand conformation polymorphisms) 기법 및 microsatellite 등 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 가축의 주요 경제형질과 관련된 분자표지를 이용한 조기 진단 및 선발 기술은 물론 다양한 산업 전반에 걸쳐 본 기술이 활용되고 있는 실정이다. 특히, 특정 유전자의 PCR product에 제한효소를 처리하여 해당 염기변이 부위의 차이에 따라 DNA 절편이 각각 다르게 나타나는 것을 이용한 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석기법은 타 분석기법들에 비해 재현성과 정확성이 뛰어나 유전자 검사에 매우 유용한 기술로 평가되고 있다.

이와 같은 시대적 흐름에 발맞추어 최근에는 분자유전학적 기술을 이용한 한우 경제형질 관련 분자표지를 이용한 고능력 우량 한우 조기진단 기술이 몇몇 개발되어 대한민국 특허청에 특허출원/등록 되어 있다. 그 대표적인 예로, 한우의 근내지방도 연관 프라이머 및 그를 이용한 한우근내지방도 성적 검사방법(출원번호 : 10-2000-0065925), 한우의 경제형질과 연관성 있는 마이크로새틀라이트 DNA 및 이의 분석용 프라이머 세트(출원번호 : 10-2004-0091892) 및 신규 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 선발방법(출원번호 : 10-2003-0093288) 등 DNA 분자표지를 이용한 한우 경제형질 진단 방법과 관련된 발명기술들이 특허등록되어 있다.

그러나, 상기에 제시한 기존의 발명들은 특정한 형질 발현과 밀접하게 연관되어 있는 유전자를 이용하는 본 발명에서의 분석방법과 달리, 약 2-7 bp 크기의 DNA 염기 반복 수에 따라 개체별 유전적 다형성을 구분하는 마이크로새틀라이트(microsatellite) 분석기술을 이용한 분자표지들로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석기법에 비해 분자표지의 재현성이 낮아 정확성이 현저하게 떨어지는 단점이 있다. 그에 반해 본 발명에서는 한우 경제형질과 밀접하게 연관되어 있는 PDE1B 후보유전자의 특정 SNP영역을 이용하여 PCR-RFLP기법으로 분자표지를 개발한 것으로서 한우 경제형질과 보다 연관성 있는 유전자 분자마커를 제공할 수 있을 뿐만이 아니라, 타 분석기법들에 비해 RFLP 마커의 재현성이 뛰어나 보다 정확성 높은 유전자 분자표지를 제공하는 장점이 있다.

최근 한미 FTA 협상 타결 등 쇠고기 수입개방에 대응한 국내 한우 사육농가의 보호 및 발전을 위해서는 한우육의 육질 고급화를 통한 수입육과의 차별화로 품질경쟁력을 높이는 전략이 필요하다. 이를 위해서는 최적의 사육 환경 조성도 중요하겠지만, 근본적으로 유전적 자질이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발하는 최첨단 육종개량 모델을 개발하여 품질 좋고 경제성 높은 고능력 고품질 한우를 생산함으로써 소비자들에게 안전하고, 맛 좋은 고급육 한우를 보다 저렴한 가격에 제공할 수 있을 것이다. 현재 우리나라 축산물 등급판정은 한우 육질등급 판정의 경우 근내지방도(marbling), 육색, 지방색, 조직감 및 성숙도 등의 도체성적 항목을 이용하여 1++, 1+, 1, 2, 3 등급으로 육질등급을 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 근내지방도는 육질등급을 결정하는데 매우 지대한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 따라서, 한우의 육질 고급화를 통한 품질경쟁력을 높이려면 유전적으로 근내지방도가 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육 관리하는 것이 중요하다.

가축의 육종개량에 있어 종래의 양적 유전학적 방법은 가축의 표현형적 기록에 의존해왔다. 즉, 후보종모우는 혈통기록과 체형 발달 등의 당대 기록으로 우선 선발하고 빈우와의 교배에 의해 생산되는 후대 검정우를 사육, 도축하여 도체 및 육질형질들을 기록하고 가축이 사육되어진 환경 요인들을 최대한 배제하면서 가축의 진정한 육종가를 추정해 내기 위한 가장 적절한 통계 모델식을 고안하여 종축을 선발하게 되는데 이러한 표현형적 관찰치를 측정하는 데는 많은 시간이 소요되므로 종축의 선발을 지연하게 되어 세대 간격이 길어지고 많은 두수의 후보 종축을 사육하게 되므로 사료비, 시설투자비 및 유지비, 인건비 등의 경제적 비용과 과도한 노동력이 소요된다. 이와 같이 종래의 전통적인 양적 유전학적 방법만으로 높은 개량 효과를 기대하기에는 어느 정도 한계가 있기 때문에 최근에는 MAS (marker assisted selection)를 이용한 첨단 육종 방법이 각광받고 있다. MAS 방법은 가축이 도축 되기 이전에 유전자 검사 즉 DNA marker 분석을 통하여 육질 및 육량 등 특정 형질이 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 방법으로서 과거 전통적인 육종방법에 추가하여 본 기술을 이용할 경우 개량의 속도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 더 높은 개량효율을 기대할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 한우의 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자의 분자표지를 탐색하여 이를 이용한 고급육 생산 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 기술을 개발하고자 수행하였다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 연구 개발한 결과, 소의 5번 염색체에 존재하는 PDE1B 유전자를 한우의 육질형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 근내지방도와 밀접하게 연관되어 있는 분자표지를 발굴하고 이를 이용한 고급육 생산 한우 진단 방법을 발명하였다. 본 발명에서 이용한 한우 PDE1B 유전자는 아미노산 서열, 기질 특이성, 기작에 의한 촉매 기능이 조절에 따라 모두 11개의 family로 분류되며 이들은 숫자로 구분된다. 이들 가운데 calcium과 calmodulin에 의존성을 가지는 phosphodiesterase 1B는 cAMP, cGMP, AMP와 GMP로의 전환을 촉매 시킨다. 선행 연구에 따르면 phosphodiesterase 1B는 지방조직에 관련한 유전자로 도체 지방 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 즉, cAMP와 cGMP는 아드레날린, ACTH, 글루카곤 등의 호르몬에 작용하고 이 호르몬들은 지방 조직에 작용하여 지방을 분해하게 되는데, phosphodiesterase가 증가하면 cAMP와 cGMP가 AMP와 GMP로의 전환이 증가하여 지방 분해를 억제하게 되어 지방이 축적되고, phosphodiesterase가 감소하면 cAMP와 cGMP가 AMP와 GMP로의 전환이 감소하여 지방이 분해되어 지방이 축적되지 않는 것으로 보고하였다. 따라서 본 발명에서는 체내의 지방 축적 및 지방 대사에 관련되어 있는 PDE1B 유전자를 한우 육질형질 관련 후보유전자로 최종 선정하고, PDE1B 유전자의 특정 SNP를 이용한 PCR-RFLP 분석 및 육량 및 육질관련 형질과의 연관성 통계 분석을 통해 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 분자표지(DNA marker)를 개발하여 유전적으로 근내지방도가 우수한 고급육 생산 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 DNA 분자표지를 개발하였다.

더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, 이를 PDE1B 유전자의 인트론 3번 영역을 포함하는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물에 Mbi Ⅰ 제한효소를 첨가하여 절단된 DNA 단편을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적과의 연관성 통계분석을 통해 근내지방도와 연관되어 있는 DNA marker를 발굴함으로써 이를 이용하여 유전적으로 육질이 우수한 한우 조기 진단 방법을 제공한다.

한우 PDE1B 유전자 인트론 3번 영역의 증폭영역 내 130번째 A↔G 염기치환으로 인한 DNA 유전자형 마커(AA, AG 및 GG형)를 이용하여 한우 개체의 근내지방도에 대한 도체 육질 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 고능력 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, PDE1B 유전자의 AG 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.

도면 1은 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 PDE1B 유전자 증폭 영역 내 130번째 A↔G 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker) 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 PDE1B 유전자 증폭 영역 내 130번째 A↔G 단일염기다형(SNP)에 대한 각 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker)의 염기서열 분석 크로마토그램

상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시 예 1 : 한우 PDE1B 유전자의 SNP 유전자형 검출

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제

본 발명에 사용한 한우는 국가 후대검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 후보 종모우 집단 총 309두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.

2. 한우 PDE1B 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출

한우 PDE1B 유전자의 intron 3 ~ intron 5번 영역을 포함하는 서열번호 1에 제시한 800 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank 등록번호 NC_007303.4호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.

한우 PDE1B 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열

유전자명	좌위	프라이머 염기서열 (5'-3')	서열번호
PDE1B	intron 3 - intron 5	정방향 F-AGCAAAAGAAAGTCAAGGGAG	2
PDE1B	intron 3 - intron 5	역방향 R-ACACATGGGAAGCAGGAAAATA	3

PDE1B 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분 간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 한우 PDE1B 유전자의 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1에 제시한 바와 같이 총 800 bp 크기의 염기를 검출하였으며, 검출된 이들 증폭 영역 내 염기에서 총 7개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, NCBI GenBank 등록번호 NC_007303.4호의 17,122번째(서열번호 1의 130번째) 염기에서 A↔G 염기치환에 따른 SNP를 검출하였고, 17,507번째(서열번호 1의 515번째) 염기에서 A↔C 염기치환에 따른 SNP를 검출하였으며, 17,575번째(서열번호 1의 583번째) 염기에서 A↔G 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다. 또한 17,607번째(서열번호 1의 615번째) 염기에서 T↔C 염기치환에 따른 SNP를 검출하였고, 17,609번째(서열번호 1의 617번째) 염기에서 C↔A 염기치환에 따른 SNP를 검출하였으며, 17,692번째(서열번호 1의 700번째) 염기에서 C↔T 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다. 마지막으로 17,707번째(서열번호 1의 785번째) 염기에서도 C↔G 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다. 검출된 이들 총 7개의 SNP들 가운데 17,122번째(서열번호 1의 130번째) A↔G 염기치환에 따른 SNP에 대한 각 검정대상 한우 개체별 SNP 유전자형 분석을 위해 Mbi Ⅰ 제한효소를 이용하여 RFLP 분석을 수행하였다.

3. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 PDE1B 유전자의 SNP 유전자형 마커 분석

검출된 한우 PDE1B 유전자의 증폭영역 내 130번째 A↔G SNP 부위에 Mbi Ⅰ 제한효소 인지부위(5'-GAG^↓CGG-3')가 존재하여 RFLP 기법으로 한우 PDE1B 유전자의 세 종류 SNP 유전자형(AA, AG 및 GG)에 상응하는 분자표지(DNA marker)를 검출하였다[도면 1 및 도면 2].

한우 PDE1B 유전자의 RFLP 분석은 5 ㎕의 PCR 증폭산물에 2 unit의 Mbi Ⅰ 제한효소를 첨가한 다음 37℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 2% 아가로즈젤에 약 100 volt 전압으로 약 2시간 전기영동하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 즉, AA homo 유전자형을 가진 개체들에서는 2개의 제한효소 인지부위가 존재하여 62, 263 및 475 bp 크기를 갖는 총 3개의 DNA 단편이 검출되었고, GG homo 유전자형을 가진 개체들에서는 3개의 제한효소 인지부위 존재하여 62, 130, 133 및 475 bp 크기를 갖는 총 4개의 DNA 단편이 검출되었다. 그리고 AG hetero 유전자형을 가진 개체들은 이들 5가지의 DNA 단편이 모두 검출되어 62, 130, 133, 263 및 475 bp 크기를 갖는 DNA band가 검출되었다[도면 1]. 단, 분자량의 크기가 매우 흡사한 130 및 133 bp의 DNA 단편은 2% 아가로즈젤 상에서는 하나의 단편으로 발현되어 검출되었다.

이상과 같은 방법으로 한우 후대 검정우 집단 총 309두를 대상으로 분석한 PDE1B 유전자의 증폭영역 내 130번째 SNP 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현율을 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 A 대립유전자가 약 58.2%, G 대립유전자가 약 41.8%로 A 대립유전자 출현빈도가 G 대립유전자에 비해 높게 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 AA형 44.0%(136두), AG형 28.5%(88두), 그리고 GG형 27.5%로(85두) GG 유전자형이 가장 낮고, AA 유전자형이 가장 높은 것으로 분석되었다.

실시 예 2. 한우 PDE1B 유전자의 DNA marker 유전자형과 육질 및 육량 형질과의 연관성 통계 분석

본 발명을 통해 검출된 한우 PDE1B 유전자의 SNP 유전자형이 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적 및 육종가 추정치에 미치는 효과를 추정하기 위해 SASⓐ8.2 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan′s Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다.

그 결과 한우 PDE1B 유전자의 인트론 3번 영역 내 A↔G 염기치환에 의한 SNP 부위(서열번호 1의 130번째)의 유전자형은 한우의 근내지방도 육종가 추정치와의 유의적 연관성이 입증되었다(P<.05). 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 근내지방도 육종가 추정치에서 AG 유전자형을 가진 개체들이 AA 및 GG 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 0.047 및 0.013 정도 유의적으로 높게 나타났다(P<.05).

한우 PDE1B 유전자의 DNA marker 유전자형과 육량 및 육질형질과의 연관성 통계분석 결과

육량 및 육질형질	SNP genotype			P-value
육량 및 육질형질	AA	AG	GG	P-value
생시체중/kg	535.179±6.997	556.217±8.624	545.060±9.183	0.160
도체중/kg	305.524±4.465	318.201±5.503	312.383±5.860	0.194
도체율/%	57.048±0.0221	57.154±0.272	057.267±0.290	0.840
등지방두께/cm	0.586±0.032	0.747±0.040	0.683±0.042	0.017
배최장근단면적/cm²	73.855±1.076	75.912±1.327	76.187±1.413	0.342
근내지방도/1-7	2.049±0.183	1.737±0.225	2.230±0.240	0.258
도체중 육종가추정치	1.623±1.106	4.390±1.363	3.677±1.451	0.258
배최장근단면적 육종가추정치	0.156±0.311	0.706±0.384	0.799±0.409	0.388
근내지방도 육종가추정치	-0.046±0.011^b	0.001±0.013^a	-0.012±0.014^ab	0.026
등지방두께 육종가추정치	0.043±0.078	-0.084±0.096	0.125±0.102	0.267

a,b : 서로 다른 부호간에는 유의차가 있음(p<.05).

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 PDE1B 유전자의 증폭영역 내 130번째 A↔G SNP 유전자형은 한우의 육질등급 판정에 있어 매우 중요한 항목인 근내지방도 육종가 추정치에 대한 유의적 연관성이 입증되어 본 분자표지를 이용하여 유전적으로 근내지방도가 우수한 한우를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 DNA 분자표지로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

도면 1에서, M: 100 bp DNA size marker; 1~5: 한우 개체번호; AA, AG, GG: 본 발명의 PDE1B 유전자 SNP 에 의한 각각의 DNA marker 유전자형. 62, 130, 133, 263, 475 bp: DNA 단편의 크기
도면 2에서, AA, AG, GG : 본 발명의 PDE1B 유전자 SNP에 의한 염기서열 분석 크로마토그램에 대한 각각의 DNA marker 유전자형.

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PCR-RFLP 분석법으로 검출된 한우 PDE1B 유전자의 세 가지 분자표지(DNA marker) 유전자형(AA, AG 및 GG) 가운데 AG 유전자형을 나타내는 한우개체를 AA 및 GG 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 근내지방도 육종가 추정치가 높은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 고급육 생산 한우 진단 방법