KR101304677B1 - 밤송이 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 밤송이로부터 수득한 용매 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 및 항균 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

밤송이 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{A Chestnut bur Extracts and A Cosmetic Composition Containing The Chestnut bur Extracts as An Active Ingredient}

본 발명은 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 밤송이로부터 수득한 용매 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백, 주름개선 및 항염 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에서는 보다 건강하게 살아가고자 하는 욕구에 따라 질병을 치료하거나 예방할 수 있는 다양한 물질을 탐색하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중에서도 천연물을 이용하여 다양한 생리활성을 탐색하고 유효성분을 분리 정제하여 그 성분의 생화학적 기능을 규명하고 약효를 과학적으로 검증하고자 하는 연구에 집중되고 있다. 인간의 노화 요인에는 여러 가지가 있지만, 인체 내의 다양한 질병과 더불어 노화를 촉진하는 원인 중의 하나로 활성산소가 기인하는 것으로 밝혀져 활성산소를 제거하기 위한 기능성 식품과 기능성 화장품 분야의 연구가 활발히 진행되고 있다.

더불어, 최근 생활수준의 향상과 평균 수명이 연장됨에 따라 피부 미용에 대한 관심이 증가되고 있는데, 특히 환경오염에 따른 피부의 자외선 노출 증가로 인해 피부의 광노화 증가는 피부미백에 대한 관심을 더욱 증폭시키고 있다.

천연물을 중심으로 한 미백효과, 노화 억제 및 자외선 차단 기능을 가진 기능성 화장품의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 피부노화 현상은 여러 가지 구조적, 기능적 변화를 보이는데 특히 나이, 자외선 등 내외적인 여러 가지 스트레스는 피부의 탄력성과 윤택성을 감소시키고 기미, 주근깨 등 피부 색소를 침착시켜 주름이 생기게 하는 등 피부노화 현상을 촉진한다.

자연계에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연 색소인 멜라닌은 피부에서 세포내의 티로시나아제라(tyrosinase)는 효소의 생합성 과정에서 만들어지며, 자외선, 건조, 극한 온도 등에 대한 피부의 저항력을 높여주지만, 과도한 멜라닌 생성은 인체에 기미, 주근깨, 검버섯 등과 같은 색소 침착을 일으키고, 피부의 노화를 촉진시킨다. 그러므로 피부 노화의 주원인인 티로시나아제의 활성을 저하시킴으로써 피부노화를 억제할 수 있다

특히, 소비자들의 선호도가 높은 천연 재료에 관심이 집중되고 있다. 화학적 미백소재는 임상 실험 등을 통해 알레르기 반응과 같은 거부 반응, 지속적이지 못한 미백효과 등의 부작용이 일어나고 있어 피부에 친화적이고 안정적인 미백소재를 발견하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이에, 본 발명자들은 밤송이로부터 용매 분획한 밤송이 추출물에 대해 항산화, 항염증, 미백, 주름억제등과 같은 생리활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 밤송이 추출물의 다양한 기능에 기반을 둔 것으로,

본 발명의 주된 목적은 밤송이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는, 산화적 스트레스 및 염증으로 유발되는 피부 질환 예방 및 개선용 피부외용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 조성물을 제공한다.

특히, 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는, 화장료 조성물 또는 산화적 스트레스 및 염증으로 유발되는 피부 질환 예방 및 개선용 피부외용 조성물을 제공한다.

이 때, 밤송이의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물일 수 있고, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 가용한 추출물; 상기 극성용매 가용 추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매로부터 가용한 추출물; 그리고 상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명의 밤송이 추출물은 바람직하게는 부탄 추출물이다.

특히, 본 발명의 조성물은 항산화 활성, 미백 활성, 항염 활성, 항균 활성 및 주름개선 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물은 0.001~10%중량으로, 바람직하게는 0.1 내지 10 % 중량으로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 제한은 없지만, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클린징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도 등의 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 밤송이 추출물은 항산화 활성, 미백 활성, 항염 활성, 항균 활성 및 주름개선 활성이 있으므로 산화적 스트레스 및 염증으로 유발되는 피부 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 피부 외용 조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 밤송이의 사진이다.
도 2는 밤송이 추출물의 추출용매에 따른 전자 공여능 그래프이다.
도 3은 밤송이 추출물의 추출용매에 따른 ABTS+ cation radical scavenging activity 그래프이다.
도 4는 밤송이 추출물의 추출용매에 따른 Superoxide anion radical 소거능 그래프이다.
도 5은 밤송이 추출물의 mushroom tyrosinase 저해활성 그래프이다.
도 6는 멜라닌 세포 B16F10에 대한 밤송이 추출물의 세포 생존능 결과이다.
도 7은 멜라닌 세포 B16F10에 대한 밤송이 추출물의 tyrosinase 저해활성 결과이다.
도 8은 멜라닌 세포 B16F10에 대한 밤송이 추출물의 멜라닌 합성 저해활성에 관한 결과이다.
도 9는 밤송이 추출물의 elastase 저해능을 나타낸다.
도 10은 밤송이 추출물의 collagenase activity 억제능을 나타낸다.
도 11은 fibroblast(CCD-986sk)상에서 밤송이 추출물의 세포 생존능을 나타낸다.
도 12는 fibroblast(CCD-986sk)상에서 밤송이 추출물의 Collagen 합성을 나타낸다.
도 13은 macrophage(Raw264.7) 상에서 밤송이 추출물의 세포 생존능을 나타낸다.
도 14는 밤송이 추출물의 nitric oxide 저해능을 나타낸다.
도 15는 Staphylococcus aures에 대한 밤송이 추출물의 항균활성을 나타낸다.
도 16은 Staphylococcus epidermidis에 대한 밤송이 추출물의 항균활성을 나타낸다.
도 17은 Escherichia coli에 대한 밤송이 추출물의 항균활성을 나타낸다.
도 18은 Propinoibacterium acnes에 대한 밤송이 추출물의 항균활성을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"추출물"은 밤송이의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

"조추출물"은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"극성용매 가용 추출물"은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올, 보다 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"비극성용매 가용 추출물"은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

"유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

"약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 밤송이 추출물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다. "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다

"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

"기능성 조성물"이란, 본 발명의 밤송이 추출물을 첨가함으로써 일반 조성물의 기능성을 향상시킨 제품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반 조성물, 예를 들어 식품이나 화장품에 첨가할 경우, 일반 식품 또는 화장품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능을 가진 제품을 포괄적으로 '기능성 조성물'이라 정의한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 밤송이 추출물의 용도에 관한 것으로, 밤송이 추출물이 내포하고 있는 특정 생리활성 및 기능의 발휘에 관한 것이다.

밤송이(도 1)는 열매를 감싸고 있는 두꺼운 겉껍데기 부분을 말한다. 밤나무는 참나무과(Fagaceae) 밤나무속(Castanea)에 속하는 낙엽활엽교목으로 전 세계적으로 10여종이 분포하고 있는데, 국내에서 밤수확을 목적으로 재배되고 있는 종은 주로 일본밤/한국밤(Castanea crenata), 중국밤(C. mollisima), 미국밤(C. dentata), 유럽밤(C. savita)등 4종이 있다. 현재까지 밤의 열매인 밤의 속껍질에 관련된 연구만 활발히 진행되고 있다. 율피는 피부를 청결하고 아름답게 하며 노화를 방지하는 것으로 알려져 있으며, 피부에 수분을 공급하거나 피부로부터 수분이 과도하게 증발되는 것을 막아주는 보습효과가 있는 것으로도 알려져 있다. 알려진 성분으로는 ellagic acid, quercetin, morin, maringenin, flavonol 이며, Senter등은 밤 성분 중에서 gallic acid가 가장 많은 것으로 보고 하여, 항산화능에 효과가 우수하다.

밤송이 추출물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 밤송이 추출물 또는 조추출물은 밤송이 중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량 (w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 6의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올을 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 10 내지 60 시간, 바람직하게는 30 내지 50 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수추출법으로 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 밤송이 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 50~100% 에탄올 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다. 바람직하게는 부탄 추출물을 수득하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 밤송이 추출물을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 따라 밤송이 추출 분획물의 제조과정은 도 2에 나타내었다.

상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다.예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 추출방법은 당분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해 성공적으로 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 밤송이 추출물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.

본 발명은 밤송이 추출물은 다양한 기능을 가지고 있다.

항산화 활성

생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화과정 중에 상당량의 활성산소들이 생성된다. 이들 활성산소는 생체 내 제거기작에 의해 대부분 소멸되지만 순간적으로 활성산소가 다량으로 발생되거나 만성적으로 활성산소가 발생되어 항산화 방어계와의 균형이 깨지면 각종 질환의 원인이 된다. 활성산소의 독성을 억제하기 위한 항산화성 물질로 는 아스코르빈산, 토코페롤, 카로티노이드, 플라보노이드, 단백질, 인지질 등의 천연 항산화제와 butylated hydroxy anisol(BHA) 및 butylated hydroxy toluene(BHT) 등 합성 항산화제가 있다. 합성 항산화제의 경우 생체 효소 및 지방의 변이원성과 독성으로 인체에 암을 유발할 수 있다는 보고가 있어, 보다 안전하고 효력이 강한 천연 항산화제가 요구되고 있다.

본 발명의 밤송이 추출물은 우수한 항산화능 효과를 가진다.

일 실시예에서, 밤송이의 항산화능을 보기 위해 DPPH, ABTS, Superoxide anion radical을 측정한 결과 항산화능이 우수함을 확인할 수 있었다.

밤송이 추출물의 전자공여능을 측정한 결과 밤송이 n-BuOH층의 경우 1,00/mL에서 99.9%의 효과를 나타내었고, ABTS cation radical은 1,00/mL의 농도에서 99%의 효과를 나타내었다. 또한, Super anion radical 소거능은 아세톤 추출물이 1,000/mL에서 87.8%의 저해능을 나타내었고 n-BuOH층의 경우는 99.80%를 나타내었다.

본 발명의 밤송이 분획물중 특히, 부탄올 분획물이 가장 강한 항산화 활성을 나타내며, n-BuOH > H₂O > EtOAc > n-hexane 분획물 순서로 항산화 활성을 가진다.

미백 활성

표피 기저층에 존재하는 멜라닌은 인간의 피부색을 결정짓는데 가장 중요한 역할을 하며, 멜라닌 세포(melanocyte)내의 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관인 멜라닌소체(melanosome)에서 합성된다. 자외선은 피부 멜라닌생성을 유발하며, 일반적으로 자외선과 같은 외부자극요인으로부터 피부를 보호하기 위해 만들어진다. 하지만 과도한 멜라닌 합성과 축적은 기미, 주근깨와 같은 시각적으로 좋지 않은 질병을 낳게 되며 멜라닌소체에는 정상적인 멜라닌을 합성하는데 필요한 효소들을 함유하고 있는데 이 효소들 중 가멜라닌을 합성하는데 필요한 효소들을 함유하고 있는데 이 효소들 중 가장 잘 알려진 것으로 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2 등이 있다

멜라닌의 합성은 아미노산의 하나인 티로신(tyrosine)을 기질로 하여 티로시나아제에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)와 DOPA 퀴논으로 대사된다. DOPA 퀴논 이후의 반응은 크게 적갈색에서 황색을 결정하는 pheomelanin과 흑갈색에서 갈색을 결정하는 eumelanin 생성의 2가지로 나뉘어 진다. 멜라닌 생합성에서 티로시나아제는 티로신이 DOPA 퀴논으로 전환되는 중요한 속도조절 단계를 매개하기 때문에 피부 색소조절 과정을 연구하는데 중요한 표지 유전자이다. 또한 티로시나아제는 eumelanin의 중간 대사산물인 5,6-dihydroxyindole(DHI)을 indole-5,6-quinone으로 전환하는 과정에도 관여한다고 알려져 있다12). TRP-1의 기능은 아직 확실하게 밝혀져 있지는 않지만, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA) 산화효소의 역할을 할 것이라는 보고와 더불어 티로시나아제를 안정화시키는 작용을 할 것이라는 보고도 있다.

멜라닌 생합성에서 티로시나아제는 tyrosine이 dopaquinone으로 전환되는 중요한 속도조절 단계를 매개하기 때문에 피부 색소조절 과정을 연구하는데 중요한 표지 유전자이다. 또한 티로시나아제는 eumelanin의 중간 대사산물인 5,6-dihydroxyindole(DHI)을 indole-5,6-quinone으로 전환하는 과정에도 관여한다고 알려져 있다. TRP-1의 기능은 아직 확실하게 밝혀져 있지는 않지만, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA) 산화효소의 역할을 할 것이라는 보고와 더불어 티로시나아제를 안정화시키는 작용을 할 것이라는 보고도 있다.

피부가 자외선 자극을 받으면 각질형성세포(Keratinocyte)에서 endothelin-1 (ET-1), α-MSH, 부신피질 자극 호르몬, 일산화질소(NO) 등이 분비되어 피부색소가 증가된다. α-MSH는 멜라닌 생성세포에 있는 melanocortin-1 수용체에 결합하여 cyclic denosine monphosphate(cAMP) 농도를 증가시켜 멜라닌 생성을 증가시키고, 일산화질소는 cyclic guanidine monophosphat (cGMP) 경로를 통해 멜라닌 생성을 증가 시킨다.

본 발명의 밤송이 추출물은 상기 멜라닌 합성에 관여하는 효소 및 유전자의 발현을 억제한다.

일 실시예에서, 밤송이 n-BuOH층에 대해 melanin 생합성 저해, tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 melanin 생합성을 억제함을 확인할 수 있었다.

구체적으로, n-BuOH 분획물이 1,000μg/mL에서 82.1%의 티로시나아제 저해능을 나타내었고, B16F10 세포에서 밤송이 n-BuOH의 미백효과를 측정 결과 티로시나아제 저해능 에서는 n-BuOH이 10μg/mL에서 37.6%의 저해능을 나타내었고, 멜라닌 생합성은 10μg/mL의 농도에서 60%가 넘는 생합성 저해율을 나타내었다.

주름 개선 활성

피부는 나이가 들어감에 따라 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소하게 된다. 이는 내적으로 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 피부 세포들의 활성이 저하되어 피부 구성 단백질의 생합성이 줄어들게 되어서 나타나는 현상이다. 또한 강한 주름과 두꺼운 피부로 특정 지어지는 광노화 피부는 자외선에 의해 증가되는 자유 라디칼 및 유해 활성 산소종에 의한다. 이런 노화들이 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등 구조 단백질을 생성하는 능력이 감소하고 type Ⅰ collagenase(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하여 피부 구조 단백질을 더 많이 분해하게 된다. 또한 누적되는 산화적 스트레스는 이런 피부 노화를 더 촉진하게 된다

피부의 노화는 피부 건조와 두께, 피부색조, 피부탄력의 변화 및 혈관의 확장과 주름 생성 등 다양한 증상으로 나타나게 된다. 자외선에 의해 증가되는 여러 단백질 효소 중에서 기질을 분해하는 matrix metalloproteinase(MMPs)는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다. 피부 진피 내 세포 외 기질단백질(extracellular matrix)은 피부의 구조와 탄력성을 유지하는데 중요한 역할을 하는데, 그 중 80-85%가 제 1형 교원질(type Ⅰprocollagen)로 이루어져있다. 1형 교원질은 전구체인 procollagen 형태로 합성이 된 후 세포 밖으로 배출되어 아미노 말단과 카복실말단이 잘려나간 후 완성된 교원질을 만들게 된다.

기질 단백질의 재구성에는 여러 생체 반응이 관하며, 이중 특히 MMPs가 기질 단백질들을 분해하는 중요한 역할을 하고 있으며 intestitial collagenase (MMP-1), 72kD gelatinase(MMP-2), 92kD gelatinase(MMP-9), neutrophil collagenase(MMP-8), collagenase(MMP-13) 등 26가지 이상의 MMPs가 이미 알려져 있다. 자외선에 노출된 피부에서는 MMPs의 발현이 증가되며, 증가된 MMPs가 피부를 구성하고 있는 교원질을 분해하여 기질 단백질의 결핍을 초래하게 됨으로써 피부노화가 일어 난다. 피부노화는 인체에 있어서 자연스러운 현상으로 노화의 과정은 몸을 구성하는 기관 전체에서 일어나며 피부도 나이가 들어감에 따라 노화가 진행되어 가는 것이다.

본 발명의 밤송이 추출물은 상기 피부 노화에 관여하는 효소 활성을 억제한다.

일 실시예에서, 밤송이 n-BuOH 분획층의 Collagen 생합성능이 20 μg/ml에서도 50%가 넘는 효과를 나타내었으며, 밤송이 n-BuOH 추출물이 Elastase 저해능 측정 결과 50μg/mL에서 74%의 저해능을 보였고, collagenase 저해능은 1,000μg/mL의 농도에서 59.12%의 효과를 나타내었다.

항염증 활성

염증반응(inflammatory response)은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적인 변화가 가해질 때, 이에 대해 방어할 수 있도록 다양한 작용기전을 통해 빠르게 활성화되는 숙주의 방어 작용으로써, 대식세포(macrophage)에 의해서 유도되는 면역반응 중에서 가장 중요한 반응이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발하지만 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 여러 질환을 발생시키는 원인이 된다.

특히, 대식세포에서 cytokines, prostagrandin E2(PGE2), lysosomal enzyme, fee radicals 등 다양한 매개물질이 관여되어 있다. 특히 대식세포에서 cytokines, tumor necrosis factor-α(TNF-α), lipopolysaccharide (LPS)와 같은 자극에 의해 염증반응의 전사인자인 nuclear factor-κB (NF-κB/p65)를 활성화 시키며, 그 결과 inducible nitric oxide synthase (iNOS), cycloxygenase-2(COX-2)를 발현시켜 과량의 nitric oxide(NO)와 PGE2를 생성하여 염증을 일으킨다.

본 발명의 밤송이 추출물은 상기 염증에 관여하는 효소 활성을 억제한다.

일 실시예에서, 대식세포 내에서 밤송이 n-BuOH 추출물이 NO 발현을 감소시킴을, 20μg/mL 농도에서 60% 가까운 저해율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

항균 활성

나아가, 본 발명의 밤송이 추출물은 항균활성을 가진다.

일 실시예에서, 밤송이 n-BuOH층에 대해, 피부에 문제되는 균 중, 4가지 균(포도 상구균, 표피포도구균, 대장균, 여드름균)을 선택해 항균 실험을 진행한 결과 4가지 균 모두에서 n-BuOH층에서의 항균효과가 우수하게 나타남을 확인하였다.

이처럼, 본 발명의 밤송이 추출물은 우수한 항균, 항산화능, 미백능, 항염증 및 주름 개선능의 다양한 효능을 가진다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 조성물에 관한 것이다.

이러한 기능성 조성물로는 예를 들어, 건강 기능식품, 화장료 또는 피부외용 조성물 등을 들 수 있다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 밤송이 추출물을 첨가할 경우, 해당 조성물의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이다.

즉, 본 발명의 밤송이 추출물은 다양한 기능성 식품, 화장품, 피부외용제 제조시 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다. 일 구체예로서, 기능성 조성물 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 전체 조성물 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 상기 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물 또는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

가장 바람직한 예로서, 본 발명은 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 밤송이 추출물을 0.001 내지 10 % 중량, 바람직하게는 0.1~10%중량으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백, 주름개선 및/또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물은 피부의 노화방지 및 주름개선 등 피부 개선 효과를 위한 화장품 또는 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류(화장료)와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액일 수 있다.

이 때, 화장품류(화장료)는 화장수, 유액, 크림, 젤, 미용액(엣센스), 팩 화장료 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로, 제한은 없지만, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클린징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도 등의 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효량 포함하는 화장료는 도포한 부위의 피부 조직의 재생이 촉진되므로, 특히, 항산화, 미백, 항염증, 주름 개선 및/또는 노화 방지 효과에 의해 젊고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

"화장수"는 일반적으로 피부를 청결하고 건강하게 유지하기 위해서 피부 표면에 도포하는 투명 액상의 화장료이다. 화장수의 기본 기능은 피부의 각질층에 수분이나 보습 성분을 보급하는 것이며, 화장수는 피부를 유연하게 하는 기능 등도 있다. 화장수에는 물에 녹기 어려운 물질을 용해시키고 안정시켜 외관을 투명상태로 한 것, 마이크로에멀젼이나 리피드나노스피어를 이용한 투명 또는 반투명의 것, 수%의 유분을 O/W형(오일인워터형), W/O형 또는 W/S형으로 유화한 불투명 화장수, 및 수용성 고분자를 배합한 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 트리트먼트 방법으로는 공지의“화장수”를 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다.

화장수에는 본 발명의 조성물 이외, 예를 들어 이하의 성분이 포함되어 있다. 즉, 화장수에는 이온 교환수 등, 수용성 성분을 용해하여, 각질층에 수분을 공급하기 위한 정제수； 에탄올, 프로파놀 등, 유용성 성분을 용해하고, 살균하여, 청량감을 주기 위한 알코올； 글리세린, PEG, 히알론산 등, 각질층의 보습을 위한 보습제； 에스테르유, 식물유 등, 보습성이나 사용감의 향상을 위한 에모리엔트제(수분이 증발하는 것을 막는 기름 성분)； 폴리옥시에틸렌오레일알코올 에테르 등, 원료 성분을 가용화하기 위한 가용화제； 구연산, 유산, 아미노산류 등, 제품의 pH를 조정하기 위한 완충제； 바니린, 오렌지플래이버, 레몬플래이버, 밀크후레이버게라니올,리나롤 등 향을 부가하기 위한 향료； 메틸파라벤, 페녹시 에탄올 등의 미생물을 억제하여, 부패를 방지하기위한 방부제； 착색하기 위한 착색제； 금속 이온 봉쇄제, 자외선 흡수제 등, 퇴색이나 변색을 방지하기 위한 퇴색 방지제； 및 수렴제, 살균제, 활력제, 소염제, 또는 미백제 등의 약제가, 2종 이상 혼합되어 포함되어 있을 수 있다.

화장수의 전체량을 100 중량%로 했을 경우에, 본 발명의 조성물을 0.00 ~ 20 중량%, 바람직하게 는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량% 정도 포함할 수 있다.

"유액"은 화장수와 크림의 중간적인 성질을 가지는 것이며, 일반적으로는 유동성이 있는 에멀젼이다. 유액은 주로 피부의 모이스처 밸런스, 보습성 및 유연성을 유지하기 위해서, 피부에 수분, 보습제 및 유분 등을 공급하기 위해 이용되는 화장료이다. 유액에 포함되는 성분은 후술의 크림에 포함되는 성분과 유사하지만, 유액은 유동성이 있으므로, 크림에 비해 고형 유분이나 납류의 양이 적다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의“유액”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다.

유액은 본 발명의 조성물을 예를 들어, 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량% 정도 포함할 수 있다.

"크림"은 물과 기름처럼 서로 서로 섞이지 않는 액체의 한쪽을 분산상으로서, 다른쪽 분산매에 안정적인 상태로 분산시킨 에멀젼의 일종이다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의“크림”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다. 이러한 크림으로는 피부의 보습이나 유연을 위한 에모리엔트 크림, 혈행을 촉진하기 위한 맛사지 크림, 피부의 세정을 위한 클렌징 크림, 탈모를 위한 헤어 리무버, 냄새제거를 위한 데오도란트 크림, 및 각질연화를 위한 각질연화 크림 등을 들 수 있다.

크림에는 예를 들면 아래의 성분이 포함되어 있다. 즉, 크림에 포함되는 수상성분으로는 이온 교환수 등의 정제수； 에탄올, 프로파놀 등, 유용성 성분을 용해하고 살균하여, 청량감을 주기 위한 알코올； 글리세린, PEG,히알론산 등, 각질층의 보습을 위한 보습제； 및 퀸스시드, 펙틴, 셀룰로오스 유도체 등의 점액질을 들 수 있다. 크림에 포함되는 유상성분으로는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 바셀린, 고형 파라핀 등의 탄화수소； 올리브유, 아몬드유, 카카오지방, 피마자유 등의 유지； 밀납, 라놀린, 호호바유 등의 납； 스테아린산, 올레인산, 팔미틴산 등의 지방산, 세타놀, 스테아릴알코올 등의 고급 알코올； IPM, 글리세린트리에스텔, 펜타에리스리톨테트라에스테르 등의 에스테르； 및 폴리실록산류 등의 실리콘유 등을 들 수 있다. 크림에 포함되는 각 성분의 양은 그 종류나 용도에 따라 크게 다르지만, 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의 것을 적절히 이용하면 된다.

크림은 본 발명의 조성물을 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량% 정도 포함하면 된다.

젤은 겔 또는 졸 등 외관 상태가 균일하고 투명에서부터 반투명의 화장료이다. 본 발명의 트리트먼트 방법으로는 공지의“젤”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다. 피부에 수분을 보급하고, 보습하기 위한 수성젤, 피부의 보습을 유지하고, 유분을 보급하기 위한 유성 젤, 혈행을 촉진하기 위한 맛사지 용수성 젤, 및 세정용의 젤 등을 들 수 있다. 젤로는 카르복시비닐폴리머, 메틸셀룰로오스 등의 수용성 고분자를 포함한 겔화제를 이용해 제조하는 것을 들 수 있다. 또한, 겔상의 맛사지 오일을 이용해도 된다.

"미용액(엣센스)"은 기본적으로는 상기의 화장수, 유액 및 크림과 같은 성분이며, 유제, 가용화제, 보습제, 물, 및 그 외의 약제를 포함하는 것을 들 수 있다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서의 공지의 미용액을 이용할 수 있다. 미용액에 포함되는 유제로는 올리브유, 동백유, 참기름, 해바라기유, 스위트아몬드유, 호호바유 등의 천연 식물유；카프린산, 미리스틴산, 올레인산, 이소스테아린산 등의 지방산의 디글리세린 에스테르 또는 트리글리세린에스테르 등을 들 수 있다. 이러한 유제는 주로 에모리엔트제로서 기능한다. 미용액에 포함되는 가용화제로는 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르,솔비탄지방산에스테르, 및 모노스테아린산프로필렌 글리콜 등의 프로필렌글리콜지방산에스테르류, 글리세린,디글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1, 3－부틸렌글리콜 등의 다가(多價)알코올 등을 들 수 있다. 한편, 가용화제는 글리세린 또는 디글리세린을 사용하는 것과, 맛사지에 있어서 온열 효과를 높이므로 바람직하다. 미용액에 포함되는 물로는 증류수, 및 탈이온수를 들 수 있다. 기타 약제로는 살균제, 방부제, 비타민류,식물로부터의 천연 엑기스, 색소, 향료 등을 들 수 있다.

미용액을 구성하는 각 성분의 양은 공지 성분량을 채용할 수 있다. 예를 들면, 미용액 전체량을 100 중량%로 했을 경우에, 본 발명의 조성물을 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량% 정도 포함하면 된다. 또한, 유제 65 ~ 90 중량%,가용화제 1 ~ 10 중량%, 보습제 1 ~ 30 중량%, 기타 약제 0 ~ 10 중량% 정도, 및 나머지는 물을 들 수 있다. 미용액은 공지 제조 방법에 따라 제조하면 된다.

"팩 화장료"는 피부의 보습, 혈행 촉진, 청정을 목적으로, 대상 부위에 도포하는 것이다. 팩 화장료에는 일반적으로, 젤리상, 페이스트상, 분말상, 크림상 액상 등을 들 수 있으며, 안면에 도포하여 피막을 형성시킨 후 박리하는 것이나,도포 후에 닦아내는 것, 도포 후 씻어내는 것 등이 있다. 분말상의 것은 사용시에 물 등에 균일하게 녹이던지 현탁해서 사용한다. 또한, 아이마스크 등의 형상의 부직포나 콜라겐 시트에 화장료를 함침시킨 팩 화장료나 상기 부직포 등을 사용시에 화장료에 침지해 이용하는 팩 화장료 등이어도 된다.

팩 화장료는 본 발명의 조성물을 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 2 중량% 정도 포함하면 된다. 기타 조성은 팩 화장료에 이용되는 공지 조성으로 하면 되고, 공지 제조 방법에 따라 제조하면 된다.

그러나, 상기 설명에 제한받지 않고, 상기의 화장료는 각각이 통상 이용되는 방법에 따라 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유효성분인 밤송이 추출물 이외에도 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드,엽산, 비타민 C, 비타민 H 일 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 포함할 수 있다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

상기 유용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤)일 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤,니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등)들도 포함할수 있다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다. 또한, 상기 고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴일 수 있으며, 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다. 또한, 고분자 다당으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등)일 수 있으며, 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다 스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질일 수 있고, 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다. 해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스일 수 있으며, 또한, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨,아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다

또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 혼합되는 다른 성분들도 포함할 수 있다.

이외에도 첨가할 수 있는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 밤송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 산화적 스트레스 및 염증으로 유발되는 피부 질환 예방 및 개선용 피부외용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 피부외용 조성물은 약제학적 조성물의 일 종으로서, 그 유효성분인 밤송이 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴,탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름,면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.

본 발명의 피부외용 조성물은 그 1일 경피 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 밤송이 추출물 함유 조성물은 천연 식물성 성분이기 때문에, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 사용하는 경우에도 안심하고 사용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다

시약, 기기 및 방법

1. 항산화능 및 항염증 측정 시약

항산화능과 항염증 측정 실험에 사용된 시약인 1,1-diphenyl- 2-picryl -hydrazyl(DPPH), xanthine, xanthine oxidase, nitro blue tetrazolium(NBT), tween-20, hyaluronidase, protease inhibitor, griess reagent , 2,2'- azino - bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), ripa buffer, Hemoglobin 등은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD Bioscience(Sanjose, CA, USA), COX-2 Cayman(Ann Arbor, MI, USA), β-Actin(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IG-G horseradish peroxidase(HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하였으며, PGE2, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 측정을 위한 ELISA kit는(R&D saystems Inc., Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, cDNA polymerase kit, dNTP mixture(Promega, Madison, WI, USA)에서 구입하였다.

2. 미백 및 주름억제 효과 측정 시약

미백과 주름억제 효과 측정 실험을 위하여 사용된 mushroom tyrosinase, tyrosine, L-3,4-dihydroxyphenyl-alanine(L-DOPA), dimethyl sulfoside(DMSO), porcine pancreas elastase(PPE), N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide,collagenase 및 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl - Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위해 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 Gibco (New york, USA)에서 구입하여 사용하였다. cAMP kit는(Cayman, Ann Arbor, MI, USA), MMP-1, MMP-3, MMP-9, MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase primary antibody와 mouse-anti-goat, rabbit-anti-mouse 등 secondary antibody 는 Santacruz(CA, USA)에서 구입하였다. 그 외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다.

3. 세포 독성 측정에 사용된 세포주 및 시약

세포 독성에 측정에 사용된 세포주는 melanoma 세포인 B16F10, fibroblast 세포인 CCD-986k, macrophage 세포인 Raw 264.7을 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정 시약은 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co.(Grand Island, U.S.A.) 및 Haemacytometer(Marienfeld, Germany)에서 구입하여 사용하였으며, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다.

4. 항균력 측정에 사용된 균주 및 배지

항균력 검색 실험에서 사용한 공시 균주는 피부 상재균인 Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Escherichia coli. KCTC 1039를 사용하였고, 여드름 유발균으로서 Propionibacterium acnes KCTC 3065를 계대 배양하여 사용하였다. 전 배양 및 본 배양을 위한 액체 배지로서 Escherichia coli 및 Staphylococcus epidermidis의 액체 배지로는 nutrient broth(NB)를 Difco Lab.(Sparks, U.S,A.)에서 구입하여 사용하였으며, Staphylococcus aureus의 배지는 tryptic soy broth(TSB)를 Difco Lab.(Sparks, U.S,A.)에서 구입하여 사용하였다. Propionibacterium acnes의 전 배양 및 본 배양을 위한 액체 배지로는 Gifu anaerobic medium(GAM, Nissui Co. Japan)에서 구입하여 사용하였다. 고체 배지는 tryptic soy agar(TSA), nutrient agar(NA)는 Difco Lab.(Sparks, U.S,A.)에서 구입하여 사용하였고, Gifu anaerobic medium(GAM)은 Nissui Co. Japan에서 구입하여 사용하였다. 또한 Gifu anaerobi medium(GAM, Nissui Co. Japan) 액체배지는 본 배지에 agar powder를 첨가하여 실험에 사용하였다.

5. 실험에 사용된 기기

생리활성 실험에 사용된 기기는 UV/VIS spectrophotometer (Hitachi, Japan), rotary vacuum evaporator(ToKyo, Rikakikai CO. Japan), centrifuge(Hitachi, Japan), freeze drier(Ilsin, Korea), microscope (Olympus, Japan), CO2 incubator(Hanbaek Scientific Co. Korea), pH meter(Metrohm, Switzerland), BOD incubator(Hanbaek Co. Korea), autoclave(Hanbaek Scientific CO. Korea), ELISA reader(Tecan Ma nnedorf), PCR Bio-Rad, USA), ABI step one plusTM(Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하였으며, 화장품 안정성 실험에 사용된 기기는 pH meter(Thermo Scientific, Canada, USA), homo mixer (Tokushu Kika Kogyo Co. Japan), agi mixer(Young Hana Tect. Korea) hot plate(Young Hana Tech. Korea) 등을 사용하셔 측정하였다.

6. LLCE ( Lamellar Liquid Crystal Emulsion )제조 시 사용된 시약

Methylparaben(Rita), Butylene Glycol(Daicel), Hydrogeneted Lecithin(Lipoid), Ceteayrl alcohol(Cognis), Caprylic/Capric triglyceride (Kokyu), Tocopheryl aceteate(Basf), Cyclopentasioxane(shhin Etsu), Phenoxyethanol(Basf), Triethanolamine(Basf)에서 구입하여 사용하였다.

7. 세포배양

본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 DMEM배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

8. MTT assay 에 의한 세포 독성 측정

세포 독성 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. 각 세포주[melanoma(B16F10), macrophage(Raw 264.7) cell, fibroblast (CCD-986sk) cell]을 96 well plate에 5×104cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군과 무 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포독성(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

실시예 1 : 밤송이 추출물 제조

본 실험에 사용한 밤송이(Chestnut bur) 는 경북 청도군에서 2010년 10, 11월경 수확하여 실험 재료로 사용하였다.

시료의 추출은 다음과 같이 수행하였다.

아세톤 추출물의 경우 70% 아세톤을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물들은 원심분리, 여과 및 농축 후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다. 밤송이 300 g을 70% 아세톤을 가하여 상온에서 1주일간 3회 추출한 다음 filter paper(Whatman No. 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압 농축하여 아세톤 추출물(37.04g)을 얻었다. 이 아세톤 추출물을 증류수에 현탁 시킨 후 용매 극성 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 밤송이 아세톤 추출물과 n-hexane을 1:1 비율로 분획 깔대기에 넣고 n-hexane으로 분획하였고, n-hexane층을 다시 감압 농축하여 hexane 분획물 1.25 g을 얻었다. 동일한 과정을 통해 EtOAc층(6.91g), BuOH층(4.51g) 및 H2O(18.79 g)을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었다.

실시예 2 : 밤송이 추출물의 항산화 효과 측정

2-1. 총 폴리페놀 함량 측정

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 분자구조와 분자량을 가진다. 이들은 phenolic hydroxyl(OH)기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하여, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다. 페놀성 물질 대부분은 식물기원으로 나무, 수피, 줄기, 잎, 과일, 뿌리, 꽃, 씨앗 등의 식물 모든 부분에 광범위하게 존재 한다.

폴리페놀 정량은 AOAC에 준하여 정량하였다. 즉, 100배 희석한 시료 용액 3 mL에 Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약 1 mL를 가하고, 1N HCl 0.2mL을 넣은 후, 포화용액 Na2CO3 1 mL를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, 640nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준 물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다. 상기 Tannic acid를 기준물질로 하여 표준곡선을 그린 후 밤송이 추출물의 폴리페놀 함량을 측정한 결과를 표 1에 나타내었다.

샘플	함량((mg/g)
Chestnut bur ext.	60.37
n-Hexane ext.	11.35
EtOAc ext	66.89
n-BuOH ext.	87.05
H2O ext.	70.50

2-2. 전자 공여능 측정

밤송이 추출물을 천연 항산화제로서의 이용 가능성을 확인하기 위하여 전자 공여능을 측정하였다. 전자 공여능(EDA:electron donating ability)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다.

1,1 diphenyl-2-picrylhycrazyl (DPPH)는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 free radical로서 cystein, glutathion과 같은 함황아미노산과 L-ascorbic acid 및 BHA 등에 의해 환원되어 탈색되므로 다양한 천연소재로부터 항산화물을을 검색하는데 많이 이용되고 있다. Free radical은 인체 내에서 지질 또는 단백질 등과 결합하여 노화를 일으키기 쉬운데 페놀성 화합물의 경우 free radical을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 강해 인체 내에서 free radical에 의한 노화를 억제하는 척도로 이용 할 수 있다. 이러한 활성산소에 대한 내인성 방어기작으로는 glutathione S-transferase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase 그리고 catalase 등의 효소가 있으며 외인성 방어기작으로는 비타민 A, C, E, flavonoid계 색소, 폴리페놀류 등이 존재 한다.

따라서, 각 시료용액 2 mL에 0.2mM의 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl(DPPH) 1 mL 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자 공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

전자공여능(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

결과를 도 2와 같이 나타내었다. 100 μg/mL에서 아세톤 추출물의 경우 91.7%, 에틸아세테이트 분획물 87.69%, 부탄올 분획물 96.2%, 물 분획물이 78.9%를 나타내었으며, 대조군인 BHA에서는 100ug/mL에서 96.9%의 전자 공여능을 나타내었다. 밤송이 부탄올 분획물의 경우 50 μg/mL에서 80% 이상의 효과를 나타내어 대조군인 butylated hydroxyanisole(BHA)와 유사한 효과를 나타내었다. 밤송이 분획물중 부탄올 분획물이 가장 강한 활성을 나타내었으며, n-BuOH > H₂O > EtOAc > n-hexane 분획물의 전자 공여능이 나타났다.

이는, 종래의 Kim 등(Korea J. Food. Sci. Technol 32, 1409-1413, 2000)의 율무의 전자공여능 측정에서 메탄올 추출물이 795 μg/mL에서 50.0%의 저해능을 나타낸 결과; Choi 등(Korean J. Biotechnol. Bioeng 18(4), 282-288,2003)의 두충, 목단피, 백작약, 복분자를 ethyl acetate 용매로 분획하여 전자공여능을 측정한 결과 1,000 mg/mL에서 95.0% 이상의 활성을 나타낸 결과보다 더 우수한 항산화능을 나타내었다. 또한, Park 등(Korean J.food preservation 9(2), 248-252, 2002)의 쑥의 물추출물과 에탄올추출물의 전자공여능을 측정한 결과 100ug/mL에서 41%, 39%로 나타났으며, An BJ 등(Korean J. Medicinal Crop Sci. 14(3), 168-172,2006)의 추출조건에 따른 울금의 전자공여능 측정결과 초임계 추출 시료 1,000 μg/mL에서 89.0%의 효과가 나타났다.

즉, 이러한 결과를 통해, 본 발명의 밤송이 부탄올 분획물이 더욱 우수한 항산화 효과를 나타내었으며, 천연 항산화제로서의 이용 가능성을 확인할 수 있었다.

2-3. ABTS +. cation radical scavenging activity 측정

ABTS+. radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+. cation decolorization assay 방법에 의하여 측정하였다.

ABTS+ radical cation 소거능은 수소공여항산화제(hydrogen donating antioxidants)와 연쇄절단형 항산화제(Chain-braking antioxidants) 모두를 측정할 수 있으며 수용상(aqueous phase)과 유기상(organic phase) 모두에 적용 가능한 측정 방법이다. ABTS radical cation 소거능은 2,2 - azino - bis(3-ethyl- benthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS)와 potassium persulfate 와의 반응으로 ABTS+ radical이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 시료를 첨가함에 따라 연한 녹색으로 decolorization 되는 것을 측정하는 방법이며, hydrogen- donating antioxidant 와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다.

7mM 2,2- azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.4mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+.을 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 ABTS+. 100μL에 시료 100μL를 가하여 1분 동안 방치한 후 732nm 흡광도에서 측정하였다.

소거율(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

그 결과, 아세톤 추출물 및 용매 분획물의 ABTS 전자공여능을 도 3에 나타내었다.

100 μg/mL에서 헥산 분획물을 제외한 모든 층이 99%를 나타내었으며, 5 μg/mL에서 부탄올 분획물은 93.9%, 물 분획물 88.6%로 대조군 butylated hydroxyanisole(BHA) 79.5%보다 높은 전자 공여능을 나타내었다. 밤송이 분획물 중에서 부탄올 분획물이 가장 강한 활성을 나타내었다. 이는 종래 Oh 등(Kor. J. Herbology. 25(1), 83-91, 2010)의 울금과 강황 추출물이 ABTS+ radical cation 소거능에서 1,000 μg/mL의 농도에서 75% 이상의 효능을 나타내었다. 이는 밤송이 헥산 분획물을 제외한 모든 추출물 보다는 낮은 효능을 나타낸다. 이로써 밤송이 추출물은 ABTS+ cation의 높은 소거능을 가지는 것을 알 수 있다.

2-4. Superoxide anion radical 소거능 측정

Superoxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법46)에 의해 측정하였다.

산소 분자가 환원되어 생기는 superoxide anion radicla(·O₂- ·2O₂ + 2e- → 2 · 2O₂ )을 제거하는 첫 번째 방어 메카니즘에 관여하는 중요한 효소(2O₂- + 2H+ → H₂O₂ + O₂- )이며, 가장 독성이 강한 hydroxy radical의 생성을 예방하는 작용을 하여 현재 항염증소재나 피부 노화방지를 위한 미용소재로 화장품등의 첨가제로서 사용되어지고 있다.

각 시료용액 0.1mL와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 mL xanthine(0.4mL)과 NBT(0.24mM)을 녹인 기질 액 1 mL를 첨가하고 xanthine oxidase(0.049 U/mL) 1mL를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 1N HCl 1 mL를 가하여 반응을 종료 시킨 다음, 반응 액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

소거율(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

본 발명의 밤송이 추출물의 superoxide anion radical 소거능은 도 4에 도시하였다.

밤송이 Acetone 추출물은 1,000 μg/mL의 농도에서 87.8%의 소거능을 보였으며, n-Hexane의 경우 1,000 μg/mL에서 42.7%의 소거능을 보였다. EtOAc 가 1,000 μg/mL에서 91.89%, n-BuOH 1,000 μg/ml에서 99.8% , H2O이 83.3%을 나타내었으며, 대조군인 Vit.C에서는 1,000 μg/mL에서 88.4%의 소거능을 나타내었다. 위의 결과로 미루어 보아 EtOAc, n-BuOH이 대조군인 Vit.C보다 우수한 superoxide anion radical 소거능이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

각 분획물의 저해능은 n-BuOH > EtOAc > H2O > n-Hexane 순으로 radical 소거능이 나타났다.

실시예 3 : 미백 효과 측정

3-1. Tyrosinase 저해활성 측정

사람의 피부색은 멜라닌(멜라닌)이나 카로틴(carotene)과 같은 색소 성분과 혈관의 분포, 각질층의 두께 등에 의해서 결정 된다. 멜라닌은 태양 광선으로부터 들어오는 자외선을 차단하는 색소로서 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 약해지면 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 및 다양한 색소로 나타난다. 이런 멜라닌은 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소세포내의 멜라닌소체에서 생합성 된다. Tyrosine 은 멜라닌 세포내에서의 tyrosinase 의해 L-3,4-dihydroxyl phenylalanine(DOPA), DOPA quinone으로 산화된다. 그 후 DOPA quinone이 DOPA chrome, 5,6 - dihydroxyindole, indole - 5,6 - quinone이 되고, 이어서 indole - 5,6 - quinone으로의 중합에 의해 멜라닌을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 피부 내에서 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 저해 활성을 측정하고자 하였다.

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응 구는 0.175M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5 mL에 10mM L-DOPA를 녹인 기질 액 0.2 mL 및 시료용액 0.1 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(110 U/mL) 0.2 mL을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

저해율(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

그 결과를 도 5에 나타내었다.

밤송이 Acetone 추출물은 1,000 μg/mL에서 50.4%의 저해능을 나타내었으며, n-Hexane 분획물 10.6% , Ethyl acetate 분획물 42.7%, n-BuOH 분획물 82.1% 그리고 H2O 분획물 61.6%을 나타내어, n-BuOH가 가장 높은 저해활성을 나타내었지만, 대조군인 Vit.C 는 500ug/mL에서 99%를 나타내어 그 효과에 미치지는 못하였다. An등의 진달래꽃 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 열수 및 에탄올 추출물 1,000ug/mL에서 각각 24.0%, 48.0%의 저해를 나타낸 결과와 Lee 등의 제주산 식물을 이용한 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 1,000 μg/mL에서 닭의장풀, 번행초, 산박하, 쇠무릎, 측백, 환삼덩굴의 클로로포름 분획물이 각각 4.27%, 5.57%,6.23%, 4.41%, 6.55%을 나타냈으며, Kwak 등의 치자 에탄올 추출물 및 헥산, 클로로포름 분획물의 tyrosinase 저해능이 10,000 μg/mL에서 62.7%, 72.6%, 59.9%를 나타낸 것과 비교하여 밤송이 n-BuOH 분획물의 활성이 더욱 우수함을 확인할 수 있었다.

3-2. Melanoma cell (B16F10)의 생존률 확인

세포 생존율을 확인하기 위한 MTT 검색법은 96 well plate를 사용하며, 검사결과를 ELISA reader(multiwell microplate reader)를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있는 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 널리 사용되고 있는 방법 중의 한 방법이다. 암세포의 경우 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 노란색 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시킨다. MTT formazan의 흡광도는 550nm 근처 파장에서 최대가 되며, 이는 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하는 것이다.

밤송이 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과를 도 6에 나타내었다.

밤송이 Acetone 추출물과 ethyl acetate 분획물의 경우 75 μg/mL까지 80%이상으로 낮은 세포 독성율을 확인하였지만, n-Haxane 분획물은 50 μg/mL , n-BuOH 분획물은 20 μg/mL, H2O 분획물은 10 μg/mL 까지만 세포독성을 나타 내지 않았다. melanoma cell(B16F10)에서의 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생합성량 측정은 모든 추출물이 독성을 나타내지 않은 10 μg/mL에서 진행 하였으며, n-BuOH 분획물의 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생합성량, 미백관련 신호전달 인자 측정은 생존률이 90%가 넘는 농도인 5, 10, 15, 20 μg/mL의 농도로 확인하였다.

3-3. Melanoma cell (B16F10)에서의 tyrosinase 저해 활성 확인

멜라닌 생성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 효소는 바로 tyrosinase이며 멜라닌소체내에 tyrosine을 산화 시켜 3,4-dihydortyphenylalanine(DOPA)를 만드는 tyrosine hydroxylase로 DOPA를 산화시켜 dopachrome을 만드는 DOPA oxidase로 작용하여 최종적으로 멜라닌 polymer를 합성하게 된다. 따라서 피부 미백제의 개발에 있어서 tyrosinase 활성 억제 실험은 유용하다.

Cellular tyrosinase 저해활성 측정

Melanoma(B16F10) 세포를 각 culture dish에 가득 배양 한 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 각 dish에 lysis buffer(67mM sodium phosphate buffer, 1% trito X-100, 0.1mM phenylmethyl sulfonylfluoride)를 100μL 첨가한 후 얼음에 방치하여 세포를 파괴시키고, 세포를 수집하여 ultra sonication 하였다. 이를 1시간 동안 방치한 후 13,200rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 효소용액으로 사용하였다. 이를 67mM phosphate buffer(pH6.8)에 녹인 8.0mM의 L-DOPA 120uL와 시료용액 40μL를 96-well plate에 넣은 후, 67mM phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 효소용액 40μL을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양 한 후, 생성된 DOPA chrome의 양을 490nm에서 측정하였다.

저해율(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

밤송이 추출물, 분획물의 melanoma 세포에서의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.

밤송이 Acetone 추출물의 경우 10 μg/mL에서 28%의 저해효과를 나타내었으며, n-BuOH 분획물은 10 μg/mL에서 37.6%의 저해효과를 나타내어 분획물들 중에서 가장 효과를 나타내었다. n-BuOH는 농도 의존적으로 저해 효과를 나타내었다.

3-4. Melanoma cell (B16F10) 에서의 멜라닌 생합성 저해 확인

멜라닌은 동물, 식물, 미생물에 널리 분포하는 색소로서 사람의 경우 피부색을 결정하는 동시에 유해한 자외선이나 유리기(free radical)로부터 인체를 보호하는 역할을 담당하고 있다. 이 색소는 인체에서 피부 중 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 생성세포(melanocyte cell)가 자외선을 비롯한 각종 자극에 의해 활성화되어 만들어져 각질 형성세포(Keratinocyte cell)에 의해 만들어진 케라틴과 함께 위로 이행하여 표피의 가장 바깥층인 각질층에 존재한다. 멜라닌 색소의 생합성은 tyrosinase 효소를 비롯하여 여러 효소들에 의하여 조절되고 있는 것으로 알려져 있다. 색소침착과 피부 흑화 현상의 원인인 멜라닌은 자외선 등에 의한 피부의 광노화나 일광각화증을 억제하고 보호하는 긍적적인 기능과 미용적인 측면에서 색소침착 뿐만 아니라 멜라닌 전구물질들에 의 한 독성으로 세포의 사멸을 촉진하는 부정적인 기능도 가지고 있다. 색소 침착을 치유하기 위해 멜라닌 생성을 억제하는 hydroquinone, resorcinol 등의 페놀 유도체나, L-ascrobic acid와 그 유도체 및 Kojic acid, arbutin, lactic acid, glucosamine, tunicamycin 등이 개발되었으나, 피부 저자극성이나 안정성에 문제가 있어 극히 제한된 양만 사용되고 있다.

Melanoma cell (B16F10)에서의 멜라닌 생합성 저해율 측정

피부 melanoma 세포로부터의 멜라닌 생합성 저해 측정은 Hosoi 등의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 100mm culture dish에 1×106cell/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×106 세포 당 1 mL의 5% TCA로 처리하고, 2,500rpm으로 2회 원심분리 한 후 분리된 멜라닌을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether : ethanol(1:3) 1 mL을 가하여 2회 원심분리 한 후 ether 1mL로 세척 건조 시켰다. 건조된 멜라닌에 1N NaOH를 1 mL 가하여 80℃에서 1시간 반응 시킨 후 분광 광도계 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생합성 저해는 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

멜라닌 합성저해율(%) = (1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

밤송이 분획물의 melanoma 세포에서의 멜라닌 생합성 저해효과를 측정한 결과를 도 8에 나타내었다.

밤송이 Acetone 추출물의 경우 10 μg/mL의 농도에서 41%의 효과를 나타내었으며, n-BuOH가 65%의 효과를 나타내어 밤송이 분획물 중에 가장 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 4 :주름개선 효과

4-1. Elastase 저해활성 측정

노화란 세포와 신체 조직 전 기관에 걸쳐 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 벼화라 할 수 있다. 인간의 피부는 시간이 지남에 따라 호르몬 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 활성이 저하되어 생체 구성 단백질의 생합성이 줄어들게 되어 생기는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외적으로 오염된 공기와 약물, 자외선에 의한 광노화(photo aging)에 의해 피부가 얇아지며, 주름이 증가되고, 탄력이 감소될 뿐만 아니라, 기미, 주근깨 및 검버섯이 증가하게 된다. 섬유아세포에서 유래한 elastase는 피부 탄력성섬유의 3차원적 뒤틀림에 중요한 역할을 하며, 이러한 elastase의 활성 증가는 피부의 탄력 섬유를 감소시킴으로써 피부 주름 형성에 기여한다. 인체의 중성구 과립구내에 존재하는 elastase는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비 특이적 가수분해 효소이다. 따라서 elastase 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, ursolic acid 등이 elastase 저해제로 이용되고 있다

이에, 진피내 피부탄력을 유지하는데 중요한 elastase 기질인 N-succinyl-(Ala)-3-p-nitroanilide를 이용하여 nitroanilide (NA)가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여 측정해서 elastase 활성을 확인하였다.

Elastase 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 405nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 제조하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(2.5 U/mL) 용액 0.5 mL을 가한 후 기질로 50mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(0.5mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율을 나타내었다.

저해율(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

주름 생성과 관련 elastase 저해활성 측정 결과를 도 9에 나타내었다.

밤송이 Acetone 추출물의 경우 100 μg/mL, 59.55%에서 Positive control인 EGCG 1000 μg/mL, 58.08%과 비슷한 활성 저해율을 보였다. n-BuOH의 경우는 50 μg/mL, 74%로 낮은 농도에서도 높은 저해 효과를 나타내었다.

종래 Kwak 등(Korean J. Medicinal Crop Sci 13(6), 213-216, 2005)의 각종 약용 식물로부터 elastase 저해 활성을 측정한 결과, 대부분이 1 mg/mL의 농도에서 30.0% 미만의 저해활성을 나타내었으며, Kim 등(J. Soc. Cosmet. Scientisis Korea 30(1), 15-22, 2004)의 홍화씨 추출물과 식물성 유사 호르몬으로 알려진 ursolic acid, genistein, oleanolic acid에 대한 elastase 저해활성 측정 결과 ursolic acid의 경우 IC50이 50.8 μg/mL로 나타났고, 홍화씨 추출물은 265 μg/mL으로 나타났으며, genistein 및 ursolic acid는 각각 0.5 mg/mL에서 31.7% 1 mg/mL에서 40.7%의 저해율을 나타냈었다. 따라서, 본 발명의 밤송이 n-BuOH 분획물 층이 더 우수한 elastase저해활성을 나타냄을 확인하였다.

4-2. Collagenase 저해활성 측정

세포 외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성 성분인 collagen은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질이다. 또한 생체 단백질 총중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. Collagen은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부의 진피에 그 포함량이 높다. Collagen의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다

나이가 증가하면 섬유아세포의 작용과 세포수가 감소하여 섬유성분 (콜라겐, 엘라스틴)의 합성양이 줄어들고 피부 세포내 수분이 손실되며, 각질층의 구조가 변화된다. 또한 collagenase의 작용이 증가하여 콜라겐의 가교된 형태가 증가함으로써 매끄러움, 보습, 팽팽함이 감소 된다. collagen은 트립신 등의 단백질 분해효소의 작용을 받지 않으나, collagenase에 의해 분해된다는 보고가 있다.

밤송이 추출물의 collagenase 저해 활성을 확인코자, Wunsch 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 반응 구는 0.1M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4mM CaCl2를 첨가하여,4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3 mg/mL)를 녹인 기질 액 0.25 mL 및 시료용액 0. 1 mL의 혼합액에 Collagenase(0.2 mg/mL) 0.15 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5 mL을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5 mL을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

저해율(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

그 결과를 도 10에 도시하였다.

밤송이 Acetone 추출물의 경우 1000 μg/mL에서 54.73%, 각각 용매 분획물은 1000 μg/mL에서 53.44%, 57.22%, 59.12%, 55.79%를 나타내었다. 1000 μg/mL에서 비슷한 저해활성을 나타내었지만, 저 농도인 5 μg/mL에선 n-butyl alcohol이 25%로 Positive control인 EGCG보다 높은 저해활성율을 보였다. 이는 Lee등의 유백피 추출물의 collagenase 저해활성 측정결과 100 μg/mL에서 27.6%를 나타낸 것과 Kang등의 토사자, 음양곽, 건지황 250 μg/mL에서 각각 40%, 37.5%, 35%의 저해능과 비교시 밤송이 n-butyl alcohol이 더 우수한 저해율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

4-3. Fibroblast cell ( CCD -986 sk )의 생존율 확인

밤송이 추출물에 의한 섬유아세포의 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과 도 11에 도시하였다.

n-butyl alcohol 분획물과 water 분획물에서는 75 μg/mL에서부터 세포 독성이 나타났다. 분획물 모두 세포독성 수치가 미비한 20 μg/mL이하의 농도에서 collagen 생합성량 측정 및 western blot, polymerase chain reaction (PCR)을 측정하였다.

4-4. Fibroblast ( CCD -986 sk )에서의 collagen 생합성량 확인

콜라겐은 피부 건조 중량의 75%를 차지하는 주요 구조 단백질로 진피층의 주세포인 섬유아세포(fibroblast)에서 생성된 후 세포외 기질로 분비되어 triple helix 구조를 통해 피부의 탄력성 유지 기능을 한다. 체내 콜라겐은 20여 가지 유형으로 나누어지는데, 피부 진피에는 type Ⅰ,Ⅲ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ 유형의 콜라겐이 존재하며 특히 콜라겐 type Ⅰ은 전체 콜라겐의 80~85%, 콜라겐 type Ⅲ은 10~15%를 차지한다. 콜라겐은 비타민 C, Fe2+, silicon 등을 조효소로 hydroxylation 과정을 거쳐 합성된다. 콜라겐 단백질에 다량 존재하는 주요 아미노산인 proline과 lysine은 각각 hydroxylation 되는 posttranslational modification과 콜라겐의 triple helix 구조를 형성하여 피부 탄력을 유지시키는 기능을 하며, Gly-X-Y 형태의 아미노산 배열에 위치하는 규칙성에 의해 그 구조를 안성화 시킨다. Hydroxyproline보다 양적으로 적은 hydroxylysine은 triple helix 안정화뿐 아니라 콜라겐 합성의 최종 단계인 섬유의 숙성, 즉, cross-linking 형성에 중요한 역할을 하며, 이 단계에 미량 원소인 skilicon이 효소 활성을 조절하여 콜라겐을 안정화 시킨다. 콜라겐(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ and Ⅴ)들은 pro-collagen이라는 전구물질의 형태로 합성된다. pro-collagen은 아미노 말단과 카르복시 말단에 프로펩티드라는 펩티드염기서열을 포함한다. 프로펩티드의 기능은 소포체내에서 pro-collagen 분자의 folding을 도와줌과 동시에 콜라겐 중합반응이 일어날 때 콜라겐 분자로부터 절단, 분리 된다고 알려져 있다. 그래서 분리된 프로 펩타이드의 양을 측정함으로써, 세포내에서의 콜라겐 생합성 정도를 파악할 수 있다.

밤송이 추출물의 섬유아세포에 대한 procollagen type Ⅰ C-peptide(PICP) enzyme immunoassay에 의한 collagen 생합성량을 측정한 결과를 도 12에 나타내었다.

밤송이 수출물은 50 μg/mL에서 56.71% 의 효과를 나타내었다. Lee등의 유백피 추출물의 collagen 생합성량을 측정한 결과 200 μg/mL에서 44.4% 생합성량을 나타내었으며, Lee의 도화 추출물의 경우 100 μg/mL의 농도에서 40%에 가까운 생합성량을 나타내어, 밤송이 n-BuOH층의 collagen 생합성 효과가 높음을 알 수 있었다.

실시예 5 : 항염증 효과 측정 결과

5-1. Macrophage cell ( Raw264 .7)의 생존율 확인

생체의 면역기구로서 제 1선을 담당하는 macrophage는 골수에서 생산되는 탐식세포로서 체내에 들어온 이물질을 비 특이적으로 탐식하고 소화하며, hydrogen peroxide (H₂O₂)나 NO 와 같은 각종 세포독성물질을 분비하여 이종세포나 암세포를 파괴하는 면역세포이다.

밤송이 분획물에 의한 macrophage세포의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과를 도 13에 나타내었다.

밤송이 분획물이 LPS로 유도된 nitiric oxide의 생성을 감소시킨 것인지, 화합물의 세포 독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하는 것인지를 측정한 결과 도 25에 보이는 것처럼 n-Hexane, EtOAc, n-BuOH, Water층 모두 20 μg/mL의 농도에서도 90%의 생존율을 나타내었다. Nitric oxide 측정은 90% 이상의 생존율을 가지는 20μg/mL이하의 농도에서 진행하였다.

5-2. Nitric oxide 저해활성 측정결과

Nitric oxide(NO) 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide(NO)의 양을 nitrite and griess로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원 된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 5×10⁵개의 cell confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing 한 후에 무 혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 LPS 1 mμg/mL을 control군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. NO 생성량은 24시간 후에 supernatant를 모아 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 540nm에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성 된 NO의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.

Raw264.7 cell의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 밤송이 분획물 층을 농도별로 세포에 처리하여 생성되는 NO양을 측정한 결과를 도 14에 나타내었다.

LPS 처리군은 LPS 무처리 군에 비하여 높은 NO발현 양을 나타내었으며 각 분획 층마다 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. EtOAc과 n-butanol의 경우 20μg/mL의 농도에서 60% 가까운 저해율을 나타내는 것을 확인하였다. 대식세포주에서의 염증 발현을 억제시키는 것에 밤송이 EtOAc층와 n-butanol층의 높은 효과를 알 수 있었다. 특히 n-butanol은 10 μg/mL인 저농도에서도 40%에 가까운 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Kim등 의 상황 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 cell의 NO 생성 억제능과, Yun등의 인진호탕의 NO 생성을 300 μg/mL의 농도에서 74% 저해한 것보다 밤송이 n-butanol의 NO 생성 억제 효과가 뛰어난 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 6: 항균 효과 측정 결과

6-1. 균 배양

전 배양 및 본 배양을 위한 액체 배지로는 Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermis KCTC 1917, Escherichia coli KCTC 1039를 계대 배양하여 사용하였다. 전 배양 및 본 배양을 위한 액체 배지로서 Escolichia coli, Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis의 액체 배지로는 nutrient broth(NB)를 사용하였고, 상기 액체 배지에 아가(agar)를 첨가하여 본 실험에 사용하였다. Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermis KCTC 1917, Escherichia coli KCTC 1039는 CO₂ incubator에서 37℃로 배양하였다.

6-2. 생육 저해 환( Clear zone ) 확인

일반적으로 피부 상재균 중 피부에 염증을 유발할 수 있는 세균으로는Staphylococcus aures, Staphylococcus epidermidis, Exdherichia coli, Propinoibacterium acnes등이 보고되어 있는데, Staphylococcus aures, Staphylococcus epidermidis, Exdherichia coli, Propinoibacterium acnes 는 가축의 피부와 점막에 상재하면서 동물의 광범위한 질병에 원인이 된다. 또 Staphylococcus aures, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Propinoibacterium acnes는 화농성질환의 원인균으로서 식중독 및 패혈증 등을 일으키며, 이들 세균은 화농성 뿐만 아니라 건강한 사람이나 동물들의 비강 및 체표 등에 널리 분포하고 있다.. Staphylococcus epidermidis는 피부 포도상구균이라고도 불리는 세균으로서 우리 피부에 정상적으로 존재하는 피부 상재균 중 가장 대표적인 균주로써 인체에 해를 가하지는 않아 의학적으로 큰 문제를 야기하는 균은 아니지만, 최근 항생제 내성을 보이는 균주들이 많아지면서 이 균주에 의해 패혈증이 생기거나 중추신경계 기회 감염이 발생한다. 최근 식품산업에 대두되고 있는 병원성 식중독균인 Escherichia coli 는 병원성을 일으키는 독소의 존재 여부 및 감염 패턴에 따라서 크게 Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Enterohemorrhagic Escherichia coli (EPEC), Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC), Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC), Diffusely adherent Escherichia coli (DAEC)로 분류된다173). 여드름의 면포내에 상주하는 세균은 Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Staphylococcus epidermidis가 있으며, P. acnes가 염증에 관여하는 증거로는 P.acnes에 의한 세포독성의 작용, P.acnes에서 분비하는 염증성 매개물, 효소등 외에도 체액성 혹은 세포매개 면적이전이 이 보고되어 있다. 다양한 요인에 의해 피부 모공이 막히게 되는 경우, 절대 혐기성 세균인 Propinoibacterium acnes 가 모공 내에서 증식하게 되고, 지질분해효소인 lipase를 분비하여 피지의 주성분인 triglyceride를 free fatty acid로 분해하고, 생성된 free fatty acid는 모낭 벽 상피세포를 자극하여 각질세포형성이 증가되고, 동시에 정체 과각화가 이루어져 여드름 형성과정의 초기단계인 미세 면포를 형성하게 되며, 계속해서 각질과 피지가 분비됨으로 해서 모낭벽이 얇아지고 마침내 염증을 일으키게 된다.

생육 저해환 ( Clear zone ) 측정

항균력 측정은 paper disc법을 이용하여 측정하였다. 즉, 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이 취해서 액체 배지 10 mL에서 18~24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10 mL에 균액을 0.1 mL 접종하여 3~6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수가 약 1×10⁷ cells이 되게 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균 된 filter paper disc (8mm, Tokyo, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 0.05 mL/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18~24시간 배양하여 disc 주위의 clear zone(mm)의 직경을 측정하였다.

밤송이 분획물의 항균효과를 살펴본 결과를 하기 표 2 및 도 15-18에 도시하였다.

n-hexane을 제외한 나머지 분획물에서 Staphylococcus aures, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Propinoibacterium acnes 에 대해 항균효과가 나타났다. n-BuOH분획층은 실험한 모든 균에 대하여 0.1mg/disc 이상에서 생육 저해환을 나타내었으며, Escherichia coli, Staphylococcus aures에 대해서는 1mg/disc에서 각각 9.3±4.2mm, 8.2±2.4mm생육 저해 환을 나타내었다.

실시예 7 : 밤송이 추출물을 함유한 다양한 제형의 제조

7-1. 스킨로션의 제조

실시예 1의 밤송이 추출물을 함유한 화장료 중 스킨로션을, 다음과 같이 제조하였다.

7-2. 로션의 제조

실시예 1의 밤송이 추출물을 함유한 화장료 중 로션을, 다음과 같이 제조하였다.

7-3. 세럼의 제조

실시예 1의 밤송이 추출물을 함유한 화장료 중 세럼을, 다음과 같이 제조하였다.

7-4. 크림의 제조

실시예 1의 밤송이 추출물을 함유한 화장료 중 크림을, 다음과 같이 제조하였다.

7-5. 제형의 성능 확인

개발된 원료나 제품을 이용할 때 피부염이 일어나는지 확인하기 위해서 간편한 예비실험으로 사람의 팔과 등 부위에 첩포 시험을 행한다.

첩포 시험은 Waggoner 등, Matsumura 등, Aberer 등, Kim의 방법을 응용하여 상온에서 30일 보관한 밤송이 n-BuOH이 첨가된 제형을 판 안쪽 부위의 피부에 Finn chamber on Scanpor 테이프를 사용하여 24시간 동안 밀폐 첩포 한 후 피부의 반응을 육안으로 확인하였다. 본 실험은 남, 여 10명을 대상으로 실시하였다.

상기 제조한 제형을 이용하여 첩포 시험을 수행한 결과를 하기 표에 기재하였다.

스킨로션

로션

세럼

크림

이처럼, 인체 첩포시험 검사 결과 실시예 1의 밤송이 추출물을 포함하는 조성물은 무자극 범위에 속하여 인체에 안전한 물질임을 확인하였다.

Claims (15)

1. 항산화 활성, 미백 활성, 항염 활성, 항균 활성 및 주름개선 활성을 가지는, 밤송이의 부탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
   
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3. 삭제
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5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서,
   조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.001 내지 10 % 중량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클린징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 이루어진 군 중에서 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
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