KR101304535B1 - Ｋｌｏｔｈｏ 유전자의 단일염기다형을 이용한 심혈관계 질환 예측 방법 - Google Patents
Ｋｌｏｔｈｏ 유전자의 단일염기다형을 이용한 심혈관계 질환 예측 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 klotho 유전자의 SNP를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 마커, 상기 마커를 확인할 수 있는 수단을 포함하는 심혈관계 질환 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트 및 상기 키트를 이용한 심혈관계 질환의 발병가능성에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 klotho 유전자의 SNP를 이용하면, 심혈관계 질환이 발병할 수 있는 유전적 소인을 조기에 확인할 수 있으므로, 심혈관계 질환의 예방 및 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 Klotho 유전자의 단일염기다형을 이용한 심혈관계 질환 예측 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 klotho 유전자의 SNP를 포함하는 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 마커, 상기 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 키트 및 상기 마커를 검출하는 단계를 포함하는 심혈관계 질환의 발병 위험에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
심혈관계 질환은 산업화된 국가 및 한국의 주요 사망 원인 중 하나이다. 심혈관계 질환 중에 중요한 부분을 차지하는 관상동맥질환(coronary artery disease)은 대개 동맥경화에 의해서 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 막히거나, 좁아져서 심장 근육에 혈액을 충분하게 공급하지 못하여 발생한다. 이러한 심혈관계 질환 발생의 위험요인에는 고혈압, 당뇨, 흡연 그리고 고콜레스테롤혈증(고지혈증), 비만, 운동부족, 스트레스, 여성의 폐경, 유전적 요인으로 알려져 있으며 복합적으로 동반할 경우 질병발생의 위험도 동시에 증가한다. 관상동맥 질환으로 인한 사망률이 1996년과 비교하여 2006년에 약 2.3배의 증가율을 보임으로써 심혈관계 질환 예방이 시급함을 알 수 있다. 하지만 현재 심혈관 질환의 경우, 심장 내부 및 관상동맥을 X-선 및 초음파 촬영하여 진단하려면 발병 후에야 가능하다는 단점이 있다. 그러므로 최근에는 질환의 조기진단 및 개인별 맞춤치료에 질병과 직접 또는 간접적으로 관련 있는 유전적 특성을 활용하는 연구가 활성화되고 있다.
단일염기다형성은 세포핵 속의 염색체가 갖고 있는 30억 개의 염기 서열 중 개인의 편차를 나타내는 한 개 또는 수십 개의 염기변이를 말한다. 개인 간의 DNA 염기순서를 비교하며 수백 염기 서열을 읽으면 개인과 개인 간의 DNA 상에 존재하는 염기쌍에 차이가 있는 다형성(polymorphism)이 나타난다. 그 중 다른 염기가 동일위치에서 발견되는 다형성을 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)이라고 한다. 단일염기다형성은 대략 1,000개의 염기마다 1개 꼴로 나타난다. 일반 집단에서 나타나는 대립인자 가운데 소수 빈도의 대립인자가 1% 이상으로 조사될 때를 돌연변이(mutant)가 아닌 단일염기다형성이라고 말한다. 인간의 경우 염기쌍이 약 30억 개이기 때문에 적어도 100만개의 변이를 갖는다. 인간은 99.9% 유전자가 일치하지만 0.1%의 단일염기다형성 차이때문에 키와 피부색 등이 달라지게 된다. 인간마다 머리 색깔, 피부, 키, 눈 색깔 등이 다르고 같은 약을 사용해도 사람마다 반응이 제각각 다르게 나타나는 것도 모두 단일염기다형성 때문이다.
모든 단일염기다형성가 질병을 일으키는 것은 아니지만, 단일염기다형성은 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형성 형태 중 어느 하나에 의하여 결함 있거나 변이된 단백질이 발현되어 치명적 질병을 일으킬 수 있다. 혹은 프로모터와 같은 전사조절부위 염기서열에 있는 단일염기다형성은 발현되는 유전자의 양을 조절할 수 있다. 때문에 단일염기다형성의 패턴을 분석하면 어떤 유전적 형질일 때 어떤 병이 많은지, 같은 병이라도 인종에 따라 발병 원인이 왜 다른지 등에 따라 효과적인 약물을 판단하고 맞춤 의약 및 신약 개발을 할 수 있다. 개인의 다양한 생리작용과 체질의 변화, 발병 가능성을 조기에 진단 및 예측할 수 있으며 환자에 따라 맞는 약을 진단 및 처방하여 종합적 예후 향상을 기대할 수 있다.
한편, 단일염기다형성 마커를 이용한 심혈관질환의 발병 위험성을 진단하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허출원공개 제2007/0072821호에는 핵산 내의 단일염기다형성의 하나 이상의 대립인자를 검출하여 이의 존재 또는 부존재가 개체의 급성 관상 동맥 질환 발병(coronary event)에 대한 변경된 위험 또는 스타틴 처리에 반응할 가능성과 연관된 방법이 개시되어 있다. 또한, 한국공개특허 제2010/0049989에는 관상동맥 질환의 발병과 연관성을 갖는 단일염기다형성 마커 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이, 키트 및 상기 폴리뉴클레오티드 중의 단일염기다형성 뉴클레오티드를 결정하여 관상동맥 질환 발병의 변경된 위험도를 갖는 대상을 확인하는 방법을 개시하고 있고, 한국공개특허 제2006/0119737에는 심혈관 질환 진단용 다중 단일염기다형성, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트를 통한 심혈관 질환 진단방법에 대해 개시하고 있다.
한편, Klotho는 인슐린에 대한 감도를 통해 몇 가지 제어 기능을 제공하는 유형-I 막 관통 단백질로 다양한 노화 표현형의 억제 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는데(H. Kurosu et al., Science, 2005), 상기 Klotho를 암호화하는 유전자는 염색체 13q12에 위치해 있고, 5개의 엑손으로 구성되어 있으며, 인간 klotho 유전자 안의 10개 이상의 돌연변이 또는 단일염기다형성이 존재하는 것으로 보고되었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 Klotho를 암호화하는 유전자에 존재하는 SNP 중에서 심혈관계 질환과 직접적으로 관련성이 있는 SNP를 규명하기 위하여 예의 연구노력한 결과, Klotho를 암호화하는 유전자에 존재하는 SNP 중에서 rs36217263이 심혈관계 질환의 발명 위험성과 관련이 있어 이를 마커로서 사용할 경우 심혈관계 질환의 발병 위험도를 예측할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 klotho 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커를 검출하는 단계를 포함하는 심혈관계 질환의 발병 위험에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, klotho 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 마커를 제공한다. 상기 마커는 SNP가 아닌 유전자에서 27 번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 -744번째 염기)인 A가 결실된 서열번호 3의 염기서열을 갖는 rs36217263에서 선택되며, 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 구성된다.
rs36217263:5'-gggtattctgagagatctaatcaaagtagagtgctggtttgaaattattaa-3'(서열번호 3)
본 발명에서 용어, "단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)"이란 하나의 단일염기가 변화하여 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 유전자를 의미하는데, 이러한 SNP는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에서 용어, "SNP ID"란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다.
본 발명의 진단용 마커를 이용하여 진단한 수 있는 심혈관계 질환은 전체 심혈관계 질환을 대상으로 하므로, 특정질환에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 심근경색증, 협심증, 죽상경화증, 고혈압, 심부전, 동맥류, 동맥경화증, 색전증, 뇌졸중, 혈전증 등이 될 수 있다.
본 발명자들은 정상인 중년 한국인의 심혈관계 질환 진단용 마커를 개발하기 위하여 노화와 동맥경화와 관련이 있는 klotho 유전자의 다형성을 이용하였다. klotho 유전자의 다형성과 혈청 지질 중, 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수준과의 상관관계를 연구하였다. 혈청 지질은 대사 증후군을 포함하는 많은 질환의 지표이고, 특히 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤의 증가는 고콜레스테롤혈증, 동맥경화증, 관동맥심질환, 뇌졸중 등의 심혈관계 질환을 초래 할 수 있다.
이런 콜레스테롤의 축척을 초래하는 심혈관계 질환 진단용 마커임을 다음과 같은 입증을 통해 확인하였다. 본 발명자들은 다형성 마커를 발굴하였다. 정상인 중년 한국인을 선별하였고(실시예 1), 그들의 klotho 유전자로부터 5개의 단일염기다형성을 발굴하였고(실시예 2-1), 이 다형성의 대립형질 빈도와 콜레스테롤 수치와의 상관관계를 밝혔다(실시예 2-2). 그 결과 2개의 다형성인 klotho 유전자의 전사시작점에서 -744번째 염기 A가 결실되는 SNP(klotho rs36217263 g. A>del) 및 klotho 유전자의 전사시작점에서 +38816번째 염기 C가 T로 치환되는 SNP(klotho rs3752472 g. C>T)가 심혈관계 위험성과 유의적으로 연관되었다는 것을 밝혔다(표 3).
본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 용어, ‘프로브’란 목적하는 유전자의 표적부위와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열 및 상기 염기서열에 결합된 표지물질로 구성된 유전자단편, 상기 유전자단편의 변이체 등을 의미하는데, 상기 프로브를 사용하면 시료에 상기 표적부위가 존재하는지의 여부를 직접적으로 확인할 수 있다. 본 발명에서, 상기 프로브는 rs36217263에 표적부위인 A 염기가 존재하는지 또는 상기 표적부위가 결실되었는지를 확인하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, ‘프라이머’란 PCR을 통하여 목적하는 유전자의 일부 영역을 증폭하기 위하여, 목적하는 유전자 영역의 말단부위에 상보적으로 결합할 수 있는 유전자단편, 상기 유전자단편의 변이체 등을 의미하는데, 대체로 15 내지 30 뉴클레오티드로 구성된다. 상기 프라이머는 목적하는 유전자 영역과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 영역과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머를 사용하면, 목적하는 유전자 영역의 염기서열 결정, 목적하는 유전자 영역의 클로닝 등에 활용할 수 있다. 본 발명에서, 상기 프라이머는 rs36217263를 포함하는 유전자단편을 증폭시키고, 증폭된 유전자단편의 염기서열을 확인함으로써, rs36217263에 표적부위인 A 염기가 존재하는지 또는 상기 표적부위가 결실되었는지를 확인하는데 사용될 수 있다.
상기 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
한편 상기 키트의 형태는 특별히 이에 제한되지 않으나, klotho 유전자의 SNP, 바람직하게는 rs36217263을 검출할 수 있는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 등이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 시료에서 발현된 klotho 유전자의 rs36217263을 분석하기 위하여, 시료에 포함된 klotho mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 증폭시킨 다음, 증폭된 cDNA의 염기서열을 확인할 수 있는 RT-PCR 키트가 될 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 klotho 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 시료에서 발현된 klotho 유전자의 rs36217263을 분석하기 위하여, 시료에 포함된 klotho 유전자의 rs36217263에 직접적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩 키트가 될 수 있다. 상기 DNA 칩 키트는 상기 rs36217263에 해당하는 klotho 유전자의 전사시작점에서 -744번째 염기(A)가 존재하는 유전자단편과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브 및 상기 -744번째 염기(A)가 결실된 유전자 단편과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브 중의 어느 하나만을 포함하거나 또는 상기 두가지 프로브를 모두 포함하는 기판을 포함할 수 있고, 상기 기판은 상기 프로브 이외에도, 별도의 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 DNA 칩 키트에 시료를 가하여 rs36217263을 분석하는 방법은 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 예를 들어, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 상기 DNA 칩 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은서열번호 3의 염기서열을 갖는 rs36217263에서 선택되며, 27 번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 -744번째 염기)가 A이거나 결실된, 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 마커 또는 키트를 이용하여 심혈관계 질환 발병 위험에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 심혈관계 질환 발병 위험에 대한 정보를 제공하는 방법은 (a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 3의 27번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 -744번째 염기)의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하고, 이에 따라 심혈관계 질환 발병 위험도를 분석하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 서열번호 3의 27번째 염기가 A인 경우 심혈관계 질환의 발병 위험도가 낮은 것으로 판단하고, 상기 서열번호 3의 27번째 염기가 결실된 경우 심혈관계 질환의 발병 위험도가 높은 것으로 판단한다.
본 발명의 용어, "검체"란 심혈관계 질환의 발병을 예측하기 위한 대상 인간으로, DNA의 수득은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 심혈관계 질환의 발병가능성에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, DNA 또는 mRNA로부터 rs36217263의 서열을 확인하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 검체로부터 수득한 DNA 중에서 rs36217263를 포함하는 DNA 부위를 증폭시킨 다음, 증폭된 DNA 부위의 염기서열을 확인함에 의하여 수행하거나, 검체로부터 수득한 mRNA로부터 cDNA를 합성하고 합성된 cDNA중에서 rs36217263를 포함하는 DNA 부위를 증폭시킨 다음, 증폭된 DNA 부위의 염기서열을 확인함에 의하여 수행하거나 또는 검체로부터 수득한 DNA를 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지하고 표지된 DNA를 klotho 유전자의 rs36217263에 직접적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩에 가하여 혼성화시킨 다음 그 결과를 분석함에 의하여 수행할 수 있으며, 그 외 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등이 사용될 수 있다.
아울러, 심혈관계 질환의 발병가능성에 대한 정보를 제공함에 있어서 오차의 발생확율을 감소시키기 위하여, 상기 rs36217263 이외의 다른 SNP의 서열을 확인하고, 이로부터 심혈관계 질환의 발병가능성을 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 사용되는 SNP는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 rs3752472에서 선택되며, 27번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 +38816번째 염기)를 포함하는 염기서열을 사용함이 바람직하다.
rs3752472:5'-gcttccctcctttacctgaaaatcagtccctagaagggacatttccctgtga-3'(서열번호 4)
상기 DNA 또는 mRNA로부터 검체의 유전자에 존재하는 rs3752472의 서열을 확인하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 검체로부터 수득한 DNA 중에서 rs3752472를 포함하는 DNA 부위를 증폭시킨 다음, 증폭된 DNA 부위의 염기서열을 확인함에 의하여 수행하거나, 검체로부터 수득한 mRNA로부터 cDNA를 합성하고 합성된 cDNA중에서 rs3752472를 포함하는 DNA 부위를 증폭시킨 다음, 증폭된 DNA 부위의 염기서열을 확인함에 의하여 수행하거나 또는 검체로부터 수득한 DNA를 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지하고 표지된 DNA를 klotho 유전자의 rs3752472에 직접적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩에 가하여 혼성화시킨 다음 그 결과를 분석함에 의하여 수행할 수 있다.
상기 확인된 rs3752472의 서열로부터 심혈관계 질환의 발병가능성을 판정하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 검체로부터 수득한 DNA 또는 mRNA로부터 검체의 유전자에 존재하는 rs3752472의 서열을 확인하여, 상기 rs3752472의 서열이 C인 경우에는 심혈관계 질환의 발병가능성이 낮은 것으로 판정하고, 상기 rs3752472의 서열이 T인 경우에는 심혈관계 질환의 발병가능성이 높은 것으로 판정함에 의하여 수행된다.
본 발명의 klotho 유전자의 SNP를 이용하면, 심혈관계 질환이 발병할 수 있는 유전적 소인을 조기에 확인할 수 있으므로, 심혈관계 질환의 예방 및 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1의 A는 5개의 klotho 유전자의 단일염기다형성의 위치를 나타내는 그림이고, 도 1의 B는 5개의 klotho 유전자의 단일염기다형성 사이의 연관 불균형 계수를 나타낸 표이다.
도 2의 A는 간세포주 HepG2에서 klotho 유전자의 단일염기다형성 중 -744A/del 단일염기다형성의 프로모터 어쎄이 결과를 나타내는 그림이고, 도 2의 B는 인간 배아신장 293 세포에서 klotho 유전자의 단일염기다형성 중 -744A/del 단일염기다형성의 프로모터 어쎄이 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 간세포주 HepG2안에서 klotho 억제제 여부로 인한 phospho HMG CoA 환원효소의 발현양의 차이를 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타내는 그림이다.
도 2의 A는 간세포주 HepG2에서 klotho 유전자의 단일염기다형성 중 -744A/del 단일염기다형성의 프로모터 어쎄이 결과를 나타내는 그림이고, 도 2의 B는 인간 배아신장 293 세포에서 klotho 유전자의 단일염기다형성 중 -744A/del 단일염기다형성의 프로모터 어쎄이 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 간세포주 HepG2안에서 klotho 억제제 여부로 인한 phospho HMG CoA 환원효소의 발현양의 차이를 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타내는 그림이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 실험 대상의 선정 및 특징 파악
대상체는 대전한방병원과 원광한방병원에서 모집하였다. 당뇨병(type-2 당뇨병), 고지혈증(dyslipidemia), 관동맥심질환 및 간/신장 기능 장애를 갖는 대상체는 유전적 인자를 찾는데서 제외하였다. 대상체가 의학적 약물을 복용할 경우, 대사 증후군에 영향을 주므로 역시 제외하였다. 최종적으로 223명 남성과 286명 여성 중 491명을 대상으로 분석하였고, 대상체의 평균 나이는 62.15살이었다. 대상체들의 전반적인 임상적/신체적 특징은 하기의 표 1에 기술하였다. 본 연구는 대상체에게 사전 동의를 구한 후 진행하였고, 각 병원과 한국한의학연구원에서 승인하였다.
실시예
2:
Klotho
유전자 상에
존재하는 단일염기다형성
마커
동정
실시예
2-1:
RT
-
PCR
분석 및 단일염기다형성 동정
Taqman 기법을 이용하여 klotho 유전자의 5개의 단일염기다형성 유전자형 분석을 수행하였다. Taqman® 유전자형 마스터 키트(Applied Biosystems)로 PCR을 수행하였다. 게놈 DNA 10ug에 프로브 프라이머 1pmol, PCR 프라이머 각 2pmol 및 2?master mix를 가하여 전체 용량이 20ul되게 PCR 혼합액을 제조하였다. 이어, 상기 혼합액을 95℃ 30초, 68℃ 2분에서 60회 반응하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 PCR 프라이머와 프로브 프라이머의 구체적인 염기서열은 하기 표 2 및 표 3에 기재하였다.
| SNP | 프라이머 염기서열(5-3) | 서열번호 | |
| rs36217263 | 정방향 | ttcaccagggtattctgagagatct | 5 |
| 역방향 | gggttttgctctcccttttactgtt | 6 | |
| rs1207568 | 정방향 | cctggagcggcttcgt | 7 |
| 역방향 | gggcccggcaggat | 8 | |
| rs3752472 | 정방향 | gatagagaaaaatggcttccctcctt | 9 |
| 역방향 | caagcaaagtcacagggaaatgtc | 10 | |
| rs7323281 | 정방향 | cccgtagcacctcactgt | 11 |
| 역방향 | tgtttctcatcaagcctaacttaatgact | 12 | |
| rs564481 | 정방향 | agccccagatcgctttactc | 13 |
| 역방향 | cagtccagggagaagcgaaaa | 14 | |
| rs648202 | 정방향 | gcctgccctttctcccaaaa | 15 |
| 역방향 | ccagccagccaatgtcaaattc | 16 | |
| SNP | 프로브 염기서열(5-3) | 서열번호 | |
| rs36217263 | VIC | ccagcactcta-ctttga | 17 |
| FAM | cagcactctatctttga | 18 | |
| rs1207568 | VIC | ccgaccaactttccccgac | 19 |
| FAM | cgaccaacttttcccgac | 20 | |
| rs3752472 | VIC | acctgaaaatcagcccctag | 21 |
| FAM | cctgaaaatcagtccctag | 22 | |
| rs7323281 | VIC | agctagaaccaatacattat | 23 |
| FAM | ctagaaccaacacattat | 24 | |
| rs564481 | VIC | tgtgtaacgtgcatttc | 25 |
| FAM | tgtgtaacatgcatttc | 26 | |
| rs648202 | VIC | caaaactctctcggccacc | 27 |
| FAM | caaaactctctcagccacc | 28 | |
PCR 증폭 후에 대립유전자의 대립형질변별(allelic discrimination)도 같은 기계에서 수행하였다(ABI 7900HT). 플레이트를 읽는 동안 SDS v2.4 소프트웨어로 흡광을 측정하여 계산하였고, 각 웰로부터의 신호에서 기반된 Rn 값을 표지하였다. 그 후 자동 또는 수동 대립유전자 호출(call)로 플레이트를 분석하였다(도 1의 A). 도 1의 A는 5개의 klotho 유전자의 단일염기다형성의 위치를 나타내는 그림이다.
Real time PCR로 대상체의 프로모터와 코딩영역 위치에 있는 염색체 13q12 위치에 존재하는 klotho 유전자의 단일염기다형성 유전자형 분석으로 5개를 분류하여 코딩엑손은 검정 블락, 3‘UTR은 흰 블락으로 그 위치를 도 1의 A에 나타내고 각각의 특징을 하기의 표 4에 나타내었다. 5개의 단일염기다형성 rs36217263; 프로모터, rs1207568; 프로모터, rs3752472; 엑손 3, rs564481; 엑손 4 및 rs648202; 엑손 4이었다.
한편, 프로모터 지역의 2개의 단일염기다형성 중, A가 삽입/결실된 것과, G가 A로 변화한 것을 검색하고, 엑손 지역의 3개의 단일염기다형성 중, 이중 표현형이 있는 것으로, +38816 위치의 염기 C가 T로 변이되면서 아미노산이 프롤린(P)에서 세린(S)으로 바뀐, 비동의 다형성(nonsynonymous polymorphism)을 검색하였다.
국제 합맵 프로젝트(HapMap project)로부터 나타낸 모든 klotho 유전자의 단일염기다형성은 하디바인베르크평형(Hardy-Weinverg Equilibrium, HWE)을 만족하여(p>0.01) 개체간의 집단 내 각 위치의 평형성(equilibrium)을 갖는 것을 확인할 수 있었다. Klotho 다형성 중 5개의 단일염기다형성의 각기 두 대립형질 사이에서 발생할 수 있는 모든 쌍의 연관 불평형(Linkage disequilibrium, LD) 계수(coefficients)는 r2<0.5이었고, 이는 한국인 대상체에 대해서 이 단일염기다형성 서로간의 연관성이 없다는 것을 의미하는 것으로 분석되었다(도 1의 B). 도 1의 B는 5개의 klotho 유전자의 단일염기다형성 사이의 연관 불균형 계수를 나타낸 표이다.
도 1의 B에서 보듯이, 정상인 한국인 중년 대상체 내에 하디바인베르크평형(Hardy-Weinverg Equilibrium, HWE)을 만족하여 유전자 분석 결과에 오류가 없다는 것을 증명할 수 있었고, 서로간의 연관성 없이 서로 독립적으로 존재하는 5개의 단일염기다형성을 발견하였다.
실시예
2-2: 단일염기다형성과 혈액 내 콜레스테롤 지수와의 연관성 분석
실시예 2-1에서 얻은 5개의 단일염기다형성 중, 혈청 지질과 통계학적으로 유의미함을 알아보기 위해 통계분석을 수행하였다.
구체적으로, 대조군 대상체 안에서의 단일염기다형성 평형을 결정하기 위하여 하디바인베르크평형(HWE)을 P값≥0.05로 수행하였다. 일배체형(haplotype)과 그들의 빈도(frequency)는 알고리즘(HapAnalyzer, http://hap.ngri.go.kr)을 사용하여 추론하였다. 데이터는 SAS소프트웨어(SAS institute Inc.)로 통계학적으로 분석하였다. 연속적변이(continuous variable)는 성별, 나이, 흡연, 음주 및 고혈압으로 보정된 일반 선형 모델 분석에 의해 구하였고, 통계적 유의도(statistical significance)는 p<0.05로 설정하였다.
상기 분석에 따라, 각각의 5개의 단일염기다형성과 각각의 혈청 지질(serum lipid) 수준을 비교한 것을 하기의 표 5에 나타내었다.
상기 표 5에서 혈청 지질은 각각 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤을 포함한다. 60세 이하 연령의 한국인 중, 성별, 나이, 흡연, 음주 및 고혈압으로 보정된 혈청 지질과 klotho 다형성의 공분산(covariance) 분석에 관해 나타내었다. 대상체의 수(평균 ± 표준편차) 및 3개의 대안 모델(공우성, 우성, 열성)의 P값을 나타내었다. 고딕체로 나타낸 수치는 P값이 0.05 이하로서 통계적으로 중요한 연관성이 있음을 의미한다. 상기 표 3에서 C/C, C/R 및 R/R은 동형접합체를 일반적인(common, C) 대립형질로, 이형접합체 및 동형접합체를 희귀한(rare,R) 대립형질로 각각 나눈 값을 의미하고, ND는 수가 너무 작아서 통계적으로 분석할 수 없는 값을 의미한다.
상기 표 5에서 보듯이, 통계분석으로 rs36217263의 혈청 지질과 연관성을 통계학적으로 유의미함을 알 수 있었고, rs3752472도 연관성의 경향이 있었다. 성별, 나이, 흡연, 음주 및 고혈압으로 보정된 AA타입의 대상체와 rs36217263(-744A>del)의 대상체를 비교했을 때, rs36217263(-744A>del)의 대상체의 총콜레스테롤 수준과 LDL-콜레스테롤 수준이 매우 증가하였으며, 각각 우성 모델(dominant model) 중 p=0.005 및 p=0.032인 통계학적으로 유의미한 값을 가진다. 또한 혈청 트리글리세라이드도 rs36217263(-744A>del)의 대상체의 경우 증가하는 경향을 보임을 알 수 있었다(p=0.065). 다른 단일염기다형성인 rs3752472(=C38816T)의 경우, 성별, 나이, 흡연, 음주 및 고혈압으로 보정된 CC타입과 비교했을 때, rs3752472(=C38816T)의 대상체의 LDL-콜레스테롤이 증가하는 경향을 나타내었다(p=0.056).
이 결과로 klotho 유전자의 기능상의 단일염기다형성이 중년의 대상체에서 혈청 콜레스테롤의 증가에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다. 구체적으로, 실시예 2-1에서 찾은 5개의 klotho 유전자의 단일염기다형성 중 두 종류의 rs36217263(-744A>del)와 rs3752472(=C38816T)의 경우 혈청 콜레스테롤의 증가에 영향을 줄 수 있음을 발견하였다. 그 중에서 통계학적으로 더 유의미한 값을 가지는 klotho 유전자의 rs36217263(-744A>del) 단일염기다형성을 발견하였다. 이러한 결과는 rs36217263 단일염기다형성을 마커로 사용하여 동맥경화증과 같은 심혈관계 질환의 발명 위험도를 예측할 수 있음을 나타내는 것으로 분석되었다.
실시예
3: 프로모터 분석
Klotho 유전자의 프로모터 활성에 대한 프로모터 위치의 rs36217263(-744A>del) 다형성 효과를 증명하기 위해 프로모터 리포터 분석을 수행하였다.
구체적으로, -800부터 -1의 위치의 klotho 프로모터 지역을 하기의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시켜서 준비하였다.
정방향 프라이머 5'-gcacagattacctgctaagt-3'(서열번호 1)
역방향 프라이머 5'-ccgaagcttgggagccaggctccggggccc-3'(서열번호 2)
그런 다음, rs36217263(-744A>del)과 -744A의 게놈 DNA를 PCR을 이용해 증폭한 klotho 프로모터 지역을 luciferase(Luc) 유전자를 포함하는 pGL3-기본 벡터 안으로 삽입하였다.(벡터이름이 도면과 본문이 다르오니 확인 부탁드립니다.) 루시퍼라제 어쎄이는 듀얼-루이퍼라제 리포터 어쎄이 시스템(Dual-Luciferase Reporter Assay System)과 루미노메터 GLO/Max 루미노메터(Luminometor GLO/Max luminometer)를 사용하여 형질주입 48시간 후에 수행하였다. 해당값은 기본(basal) 프로모터의 발현양과 비교하여 도 2에 나타내었다.
프로모터 리포터 분석은 간세포주인 HepG2 및 인간 배아 신장 293 세포에서 수행하였다. 먼저, 간세포주인 HepG2 관련 프로모터 활성은 -744A 타입과 비교 했을 때 rs36217263(-744A>del)에서 상당히 감소(흡광도의 감소를 통해 판단가능)하였다(도 2의 A). rs36217263(-744A>del)의 다향성 프로모터 활성은 인간 배아(embryonic) 신장 293 세포(도 2의 B) 안에서도 같은 양상을 보였다. 이 결과는 rs36217263(-744A>del) 타입 대상체들이 -744A타입보다 낮은 klotho 발현 수준을 갖는 것을 나타내었다.
상기 결과로 부터, klotho 유전자의 단일염기다형성 중, 통계학적으로 더 유의미한 수치를 가지고 콜레스테롤 수치의 증가에 영향을 주는 rs36217263(-744A>del)의 경우, 낮은 klotho 발현 수준을 갖는 것을 알 수 있었고, 실시예 3과 관련하여 klotho의 활성 감소가 콜레스테롤 수준의 증가를 야기한다는 것을 알 수 있었다.
실시예
4:
웨스턴
블랏
분석
Klotho 활성의 감소가 콜레스테롤 수준의 증가를 야기함을 확증하기 위해, klotho 억제제인 D-saccharic acid 1,4-lactone으로, HMG-CoA 환원 효소의 활성과 발현수준의 변화를 각각 분석하였다.
HMG-CoA 환원 효소는 간세포주인 HepG2 세포안의 콜레스테롤 합성의 주요 효소이다. HMG-CoA 환원 효소의 mRNA 수준은 인슐린 단독 혹은 인슐린과 D-saccharic acid 1,4-lactone을 같이 처리한 경우에 따라 다르지 않았다.
그러나, 세포에 인슐린 단독으로 처리했을 때보다, 인슐린(1㎍)과 D-saccharic acid 1,4-lactone(100μM)을 같이 처리한 경우, HMG-CoA 환원 효소의 활성형인 포스포-HMG-CoA 환원효소(p-HMGCR)가 증가함을 웨스턴 블랏 결과로 알 수 있었다(도 3). 이때, β-액틴은 내부 대조군으로 사용하였다. 도 3은 간세포주 HepG2안에서 klotho 억제제 여부로 인한 phospho HMG CoA 환원효소의 발현양의 차이를 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타내는 그림이다.
도 3에서 보듯이, klotho의 수준의 감소나 활성의 감소가 HMG-CoA 환원효소의 활성을 조절하여 콜레스테롤 합성이 증가할 수 있음을 알 수 있었다.
상술한 바를 종합하면, klotho 유전자 중, rs36217263(-744A>del) 타입 유전자형을 갖는 SNP는 콜레스테롤이 더 많이 축적되어 동맥경화, 심근경색 등의 심혈관계 질환을 일으킬 위험도가 상대적으로 높음을 확인하였으므로, 본 발명의 rs36217263(-744A>del)은 동맥경화, 심근경색 등의 심혈관계 질환의 예측에 있어서 유용한 DNA 표지로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
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- 서열번호 3의 염기서열을 갖는 rs36217263에서 SNP 위치인 27 번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 -744번째 염기)가 A이거나 결실되고, 27번 위치를 포함하는 20-51개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 포함하는, 한국인의 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 키트.
- 제3항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 키트.
- 서열번호 3의 염기서열을 갖는 rs36217263에서 SNP 위치인 27 번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 -744번째 염기)가 A이거나 결실되고 27번 위치를 포함하는 20-51개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국인의 심혈관계 질환 발병 위험도 예측용 마이크로어레이.
- (a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 3의 27번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 -744번째 염기)의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하고, 이에 따라 심혈관계 질환 발병 위험도를 분석하는 단계를 포함하는, 한국인의 심혈관계 질환 발병 위험에 대한 정보를 제공하는 방법.
- 제6항에 있어서,
(c) 단계에서 확인된 서열번호 3의 27번째 염기가 A인 경우 심혈관계 질환의 발병 위험도가 27번째 염기가 결실된 경우보다 낮은 것으로 판단하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서,
(c) 단계에서 확인된 서열번호 3의 27번째 염기가 결실된 경우 심혈관계 질환의 발병 위험도가 27번째 염기가 A인 경우보다 높은 것으로 판단하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 심혈관계 질환은 심근경색증, 협심증, 죽상경화증, 고혈압, 심부전, 동맥류, 동맥경화증, 색전증, 뇌졸중 및 혈전증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제6항에 있어서,
서열번호 4의 염기서열을 갖는 rs3752472에서 SNP 위치인 27번째 염기(klotho 유전자의 전사시작점으로부터 +38816번째 염기)를 확인하고, 이에 따라 심혈관계 질환 발병 위험도를 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 서열번호 4의 27번째 염기가 C인 경우 심혈관계 질환의 발병 위험도가 27번째 염기가 T인 경우보다 낮은 것으로 판단하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 서열번호 4의 27번째 염기가 T인 경우 심혈관계 질환의 발병 위험도가 27번째 염기가 C인 경우보다 높은 것으로 판단하는 것인 방법.
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| Nephrol. Dial. Trantplant., Vol. 25, pp. 3348-3355 (2010.) * |
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