KR101283857B1 - Ａｂｃ 수송체 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물, 상기 유전자 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 식물체로 도입하는 단계를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

ＡＢＣ 수송체 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물{COMPOSITION FOR INCREASING SEED SIZE, OR CONTENT OF STORAGE LIPID IN SEED, COMPRISING THE ABC TRANSPORTER PROTEIN-CODING GENE}

본 발명은 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물, 상기 유전자 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 식물체로 도입하는 단계를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

모든 식물은 기름이나 지방을 대부분 종자에 저장하며, 대부분 식물의 대표적인 저장 기름은 트리아실글리세롤이다. 식물은 최초 에너지산물을 탄수화물 형태로 저장하며, 나중에 이를 보다 밀집된 형태인 트리아실글리세롤 형태로 저장하게 된다. 식물의 발아시 이 저장 기름 1g은 2.7g의 탄수화물로 바뀌어 발아시 에너지원으로 사용된다.

식물성 기름의 경우 동물성 기름에 비해 불포화 지방산이 많고, 식물의 경우 동물에서 합성할 수 없는 18:2, 18:3 지방산과 이로부터 파생된 다중불포화 지방산을 만든다. 이러한 지방산들은 체내에서 합성할 수 없으므로 식품으로만 섭취가 가능하므로 필수 지방산으로 불린다. 식물성 기름은 식품으로서의 중요성뿐만 아니라, 최근에는 화석 연료의 고갈에 따른, 바이오 디젤의 원료로 주목받으면서 식물성 지방의 대체 에너지원으로서의 중요성 또한 대두되고 있는 상황이다.

전세계 지방종자 생산의 경우 2001년 기준으로 31억9천만 메트릭톤에 달했다. 이 중 일부는 식품으로 바로 이용되기도 하나, 대부분은 기름 추출에 사용된다. 평균적으로 지방종자의 기름 함량은 전체 종자 무게의 약 26% 정도를 차지한다. 전세계적으로 동물성 지방의 경우 1970년대를 기준으로 소비량이 줄어들거나 유지되는 정도이나, 식물성 오일의 소비는 1980년대와 2000년 사이에 2배 이상 증가하였으며 (약 6억 7천만톤), 그 소비 추세가 가파르게 증가하고 있다(USDA food disappearance records의 “U.S. PUFA Consumption, 1909-2005” 참조).

이처럼 식물성 지방의 수요는 날이 갈수록 늘어나고 있으나, 그 공급은 수요를 따라가지 못하고 있다. 지속적인 육종과 교잡 개량으로 현재 지방종자의 기름 생산량은 최대치에 이르렀으며, 현재까지의 육종과 교잡 방법으로는 한정된 재배 면적에서 수요를 따라갈 수 없을 것으로 예상된다. 이러한 한계성을 극복하기 위해 최근 대두되는 것이 유전자변형 작물이다. 전세계적으로 막대한 수요가 예상되는 식물성 지방의 생산을 위해서는 기름 생산량이 높아진 유전자변형 작물의 개발이 필수적이라 예상된다. 이와 관련하여 종자 단위 무게당 기름 함량과 전체 생산량을 높이기 위해 전세계적으로 많은 학자들이 연구하고 있으나, 식물 저장 기름의 대부분을 차지하는 종자 내 트리아실글리세롤의 합성과 그 과정의 조절에는 여러 유전자가 복잡하게 관여하고 있어서, 이 목표는 쉽게 달성되지 않고 있다.

식물 종자의 저장 기름을 향상시키기 위해 Monsanto, Dupont과 같은 거대 다국적 기업들이 연구하고 있다. 그러나 종자의 저장 지방이 늘어나도 식물의 전체 성장과 종자 꼬투리 수의 감소 등으로 인하여 전체적인 생산성은 줄어드는 경우가 많아, 아직 큰 성과가 보고되어 있지 않다. 식물 지방의 대부분을 저장하고 있는 종자에서 저장 기름이 증가하면서도 종자의 크기나 꼬투리의 수가 변하지 않거나, 또는 더욱 이상적으로, 종자의 크기와 꼬투리 수를 모두 증가시킬 수 있는 유전자의 발굴이 시급하다. 이런 기술이 개발되면 식물지방에 관해 개발된 다른 기술들과 같이 적용하여 더욱 큰 가치를 창출할 수 있다. 예를 들어 오메가-3 지방산이나 토코페롤을 생산하는 식물, 또는 특정 유용 지방 / 지방산을 생산하는 식물에 종자의 크기와 꼬투리 수를 증가시키는 기술을 함께 적용하면, 유용 지방을 더욱 많이 생산할 수 있다.

이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 식물의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein) 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 식물의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein)을 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 식물체로 도입하는 단계를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들이 연구한 결과 식물의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein)을 암호화하는 유전자를 식물체에 삽입하여 상기 유전자를 과발현시킬 경우, 형질전환된 식물체에서 종자의 크기 증가뿐만 아니라, 종자 내 저장 지방 함량 자체 또한 증가함으로써 결과적으로 종자 내 저장 지방의 함량이 현저히 증가되며, 이에 따라 종자 및/또는 종자 내 저장 지방의 생산성을 매우 높일 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 식물의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein) 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 식물의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein)을 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 식물체로 도입하는 단계를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 따라 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량이 증가된 식물체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 따라 크기 또는 저장 지방의 함량이 증가된 종자를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 식물의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein) 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물이 제공된다.

본 발명에서 “ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein)”은 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인으로 구성되고 지질 이중층으로 구성된 생체막을 관통하여 위치하는 단백질로서, ATP를 분해하여 나온 에너지를 사용하여 물질을 운반하는 수송체로서 세포 내로 영양분을 흡수하거나, 독성 물질을 세포 밖으로 운반하는 역할을 하며, 특히 식물 지방(또는 기름)의 합성을 위한 전구체의 수송에 직접 또는 간접적으로 관여하는 단백질을 의미한다.

본 발명에서 ‘과발현’은, 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 본 발명의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein)을 암호화하는 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미하며, 과발현시키는 방법은 특별히 제한되지 않고 다양한 공지된 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대 구조 유전자로부터 상부스트림에 위치한 리보솜 결합 부위 또는 프로모터 및 조절영역을 돌연변이 시키거나 도입하여 적절한 유전자의 복제수를 증가시킴으로써 수행할 수 있고, 구조 유전자로부터의 상부스트림이 도입된 발현 카세트가 동일한 방식으로 작용할 수 있다. 또한 본 발명의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein)을 암호화하는 유전자 유도성 프로모터가 발현을 증가시킬 수 있으며, mRNA의 수명을 연장시키는 방법 또한 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 배지의 조성 및/또는 배양 기술을 변화시킴으로써 상기 유전자를 과발현시킬 수도 있다.

본 발명에서 ‘형질전환’은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 본 발명에서 형질전환은 상기 유전자가 과발현 프로모터와 함께 식물체 내로 삽입되는 것을 의미한다.

상기 ‘식물체’는 식물, 식물의 조직, 세포 및 종자로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명에서 ‘형질전환체’는 상기 형질전환에 의해 유전형질이 변화된 상기 식물체를 의미한다.

상기 ‘식물 세포’는 어떤 식물 세포도 가능하다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 가능하다.

상기 ‘식물 조직’은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명에서 ‘식물 종자의 크기 증가’는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 식물 종자의 크기 증가는 물론이고 종자의 무게, 부피, 꼬투리의 수, 꼬투리의 크기의 증가 및 이로 인한 종자 수확량 내지는 생산성의 증가를 모두 포함하며, 또한 “종자 내 저장 지방의 함량 증가”는 식물의 종자에 저장되어 있는 지방(또는 기름)의 함량을 증가시키는 것을 의미하며, 이러한 종자 내 저장 지방의 함량 증가는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 저장 지방 자체의 함량 증가는 물론이고 상술한 종자의 크기 증가를 통하여 결과적으로 발생하는 종자 내 저장 지방의 함량 증가 및 이로 인한 식물 지방(또는 기름)의 생산성 증가를 모두 포함하는 의미이다.

상기 종자 내 저장 지방의 대표적인 예로 트리아실글리세롤이 있다. 트리아실글리세롤(Triacylglycerol; Triacylglyceride; Triglyceride)은 한 개의 글리세롤을 골격으로 하여 3개의 지방산이 붙은 구조로서, 식물 지방과 동물 지방의 주요 성분이다. 이러한 트리아실글리세롤은 동물에서는 탄수화물 부족 시 에너지원으로 변환되어 사용되며, 식물의 경우 종자(씨앗)에 주로 저장되어 종자의 발아시 영양분으로 사용되는 대표적인 저장 지방이다.

본 발명의 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물은 식물의 ABC 수송체 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 ABC 수송체 단백질은 이에 제한되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드(AtABCA9/AtATH11)가 될 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 상동성을 갖는 서열로 구성되는 폴리펩타이드가 될 수 있으며, 상기 상동성을 갖는 서열은 바람직하게는 서열번호 1과 65% 내지 99%, 더욱 바람직하게는 80% 내지 99%, 특히 바람직하게는 90% 내지 99%, 가장 바람직하게는 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%의 상동성을 갖는 서열이 될 수 있다.

또한 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 이에 제한되지 않지만 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 AtABCA9/AtATH11 유전자가 될 수 있다.

상기 조성물은 바람직하게는 상기 유전자, 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터가 삽입된 형질전환 벡터 또는 상기 형질전환 벡터로 형질전환된 미생물을 포함할 수 있다.

상기 형질전환 벡터는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 상기 적정 핵산 서열은 프로모터가 될 수 있으며, 그 외에도 추가적으로 인핸서, 전사종결자 및 폴리아데닐레이션 신호 등을 더 포함할 수 있다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 전사종결자 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

상기 프로모터로는 식물발현용 프로모터로 CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터, 아그로박테리움 튜메팩시엔스 Ti 플라스미드(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid)의 NOS(nopaline synthase) 프로모터, OCS(octopine synthase) 프로모터 및 MAS(mannopine synthase) 프로모터를 비롯하여 그 외 공지된 프로모터를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 전사종결자는, 통상의 전사종결자를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 합성효소(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜메팩시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 형질전환 벡터는 상기 유전자의 발현을 확인하거나 형질전환체를 선별할 수 있는 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 표지 유전자로는 카나마이신, 스펙티노마이신 등의 항생제에 대하여 내성을 나타내는 유전자나 GUS(β-glucuronidase)를 암호화하는 유전자를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 마커는 상기 벡터와 함께 식물에 전달되어, 특정한 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 형질전환체의 선별을 가능케 한다.

상기 형질전환 벡터는 상기 유전자의 염기서열이 삽입되어 식물 세포로 직접 도입될 수 있거나 식물에 감염을 유발하는 미생물 내부로 도입될 수 있는 식물 발현 벡터일 수 있다.

상기 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜메팩시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 이러한 조작에 사용될 수 있는 아그로박테리움의 스트레인(strain)은 다수가 있으며 본 업계에 공지되어있다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다.

Ti-플라스미드 벡터의 또 다른 바람직한 형태는 EP0 120516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 상기 발현벡터의 가장 바람직한 예는 cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S 프로모터를 가진 pCAMBIA1302 벡터일 수 있다.

특히 바람직하게는 pCAMBIA1302::AtABCA9/AtATH11가 될 수 있으며, 상기 pCAMBIA1302::AtABCA9/AtATH11은 35S 프로모터, AtABCA9/AtATH11 유전자 및 노팔린 합성효소 전사종결자를 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 미생물은 식물에 감염을 유발시키는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있고, 예컨대 다양한 종류의 바이러스 또는 박테리아 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물들에서 근두암종병(crown gall disease)을 일으키는 토양 세균인 아그로박테리움 튜메팩시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

상기 식물은 예컨대 초본(herbaceous plant) 및/또는 목본식물로, 화훼작물(flowering plants), 원예작물(garden plants), 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 팥, 귀리, 수수, 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채(Brassica campestris, B. napus), 자작나무(Betula platyphylla), 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무(Betula schmidtii) 등이 될 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예는 식물의 ABC 수송체 단백질(ATP-binding cassette transporter protein)을 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 식물체로 도입하는 단계를 포함하는 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 ABC 수송체 단백질은 이에 제한되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드(AtABCA9/AtATH11)가 될 수 있다.

또한 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 이에 제한되지 않지만 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 AtABCA9/AtATH11 유전자가 될 수 있다.

상기 유전자를 식물체 내로 삽입하는 방법은 바람직하게는 아그로박테리움 튜메팩시엔스-매개 DNA 전이(Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transfer)법을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 전기충격(electroporation), 미세 입자 주입 방법(micro-particle injection) 및 유전자 총(gene gun) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 제조된 재조합 아그로박테리움을 침지방법 방법을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않고 다양한 공지의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법에 따라 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량이 증가된 식물체를 제공한다.

상기 식물체는 바람직하게는 식물, 식물의 조직, 세포 및 종자로 이루어진 군에서 선택된 것이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법에 따라 크기 또는 저장 지방의 함량이 증가된 종자를 제공한다.

이처럼 본 발명의 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물 및 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법을 통해 식물 종자의 크기 증가는 물론이고 종자의 무게, 부피, 꼬투리의 수, 꼬투리의 크기의 증가 및 이로 인한 종자 수확량 내지는 생산성을 증가시킬 수 있으며, 또한 식물의 종자에 저장되어 있는 지방(또는 기름)의 함량 자체의 증가는 물론이고 상술한 바와 같이 식물 지방의 주요 저장 기관인 종자의 크기 증가를 통하여 종자 내 저장 지방의 함량을 더욱 증가 시킬 수 있어 제한된 공간에서 식물 지방(또는 기름)의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다. 따라서 전 세계적으로 급증하고 있는 바이오 디젤, 식용 식물 지방(또는 기름)의 수요에 효과적으로 부응할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시 예 1에 따른 3종류의 돌연변이체를 나타낸 것으로, 도 1a는 AtABCA9/AtATH11 돌연변이 애기장대 식물을 만들기 위해 T- DNA가 들어간 3개의 서로 다른 대립형질(alleles)(abca9 -1/ ath11 -1. abca9 -2/ ath11 -2, abca9 -3/ath11-3)을 나타낸 것이고, 도 1b는 T-DNA의 삽입에 의한 녹아웃(knockout) 여부를 확인하기 위해 실시 예 1에 따라 유전자 특이적 PCR(a) 및 T-DNA 특이적 PCR(b)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(WT: 야생종; 1^st: abca9 -1, 2^nd: abca9 -2, 3^rd: abca9-3).
도 2는 본 발명의 실시 예 2-1에 따라 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 3 종류의 돌연변이체와 야생종의 발아율을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2-2에 따라 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 3 종류의 돌연변이체와 야생종의 성장을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 본 발명의 실시예 3에 따라, 야생종과 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 3종류의 돌연변이체의 종자를 비교한 것이고, 도 4b는 본 발명의 실시 예 3에 따라 꽃이 핀 후 4일 간격으로 (4일, 8일, 12일, 16일, 및 20일, DAF; 개화 후 날짜(Day After Flowering)) 야생종과 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 3 종류의 다른 돌연변이체 (1^st: abca9 -1, 2^nd: abca9 -2, 3^rd: abca9 -3)의 종자 꼬투리 속 종자를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 본 발병의 실시 예 5에 따라 AtABCA9/AtATH11의 발현을 조직별로 나누어서 (WS: 전체 묘목(whole seedling), L: 잎, S: 줄기, F: 꽃, S1: 4 내지 6 DAF의 꼬투리, S2: 10 내지 12 DAF의 꼬투리, 및 S3: 16 내지 18 DAF의 꼬투리, DAF: 개화 후 날짜(Day After Flowering)) quantitative RT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이고, 도 5b는 실시 예 5에 따라 과발현 형질전환체의 발현 정도를 quantitative RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다(WT: 야생형, T1~T12 : 과발현 형질전환체).
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 실시 예 6에 따라 종자 내 저장 지방을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시 예 7에 따라 야생종과 AtABCA9/AtATH11을 과발현시킨 형질전환체 식물들의 성장을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다(WT: 야생형, T5, T7, T9, T11 및 T12 : 과발현 형질전환체).
도 8은 본 발명의 실시 예 7에 따라 야생종과 AtABCA9/AtATH11을 과발현시킨 형질전환체 식물의 종자 꼬투리 숫자 및 꼬투리 내 종자의 숫자를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다(WT: 야생형, T5, T7, T9, T11 및 T12 : 과발현 형질전환체).
도 9a 내지 도 9c는 각각 본 발명의 실시 예 7에 따라 야생종과 과발현 형질전환체의 종자 꼬투리 내 종자(도 9a), 종자의 무게(도 9b) 및 종자의 트리아실글리세롤(TAG)의 함량(도 9c)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다(WT: 야생형, T1~T12 : 과발현 형질전환체).
도 10은 본 발명의 ABC 수송체 단백질을 구성하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 유전자를 구성하는 서열번호 2의 염기서열을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참조 예 1: genomic DNA ( gDNA ) 분리

식물의 genomic DNA는 2주간 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에서 재배한 애기장대(야생종(Columbia-0, SALK institute) 및 돌연변이체)의 잎으로부터 DNA 추출용 버퍼(50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1%(v/v) SDS, 10 mM β-mercaptoethanol)를 사용하여 추출하였다.

구체적으로 상기 애기장대의 잎을 액체질소를 사용하여 고르게 분쇄한 후, 상기 분쇄된 시료 1g에 750㎕의 상기 DNA 추출용 버퍼를 넣어 볼텍싱으로 잘 섞어 준 후 65℃에서 30분 동안 배양하였다. 이후 5M Potassium acetate 250㎕를 첨가한 후 흔들어 주고, 20분 동안 ice에서 식혀준 후 12000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 700㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 가볍게 흔들어 주었다. 12000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 버리고 생긴 펠렛을 80%(v/v) 에탄올로 가볍게 씻어낸 후 말렸다. 50㎕ TE 버퍼에 녹여 genomic DNA를 분리하여 PCR 등에 사용하였다.

실시 예 1: AtABCA9 / AtATH11 을 발현하지 못하는 애기장대 돌연변이체 발굴

AtABCA9/AtATH11 유전자에 T-DNA가 삽입되어 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 돌연변이체를 찾기 위해 SALK Institute (http://signal.salk.edu/)에서 3개의 서로 다른 위치에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체를 주문하였다(도 1a). 주문한 3개의 돌연변이체는 각각 SALK_058070: abca9-1, SALK_084342:abca9-2, SALK_023744:abca9-3이며, 상기 3개의 돌연변이체들과 야생종(Columbia-0, SALK institute) 애기장대를 각각 카나마이신이 포함된 1/2 MS배지(Murashige and Skoog, 1962)에서 2주간 키운 후 각각의 genomic DNA 를 추출하여 유전자의 녹아웃 여부를 확인하였다.

구체적으로 상기 참조 예 1의 방법으로 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여 유전자(AtABCA9/AtATH11) 특이적 PCR(gene(AtABCA9/AtATH11) specific PCR)과 T-DNA 특이적 PCR(T-DNA specific PCR) 반응을 수행하였으며, PCR 반응에는 다음과 같은 프라이머를 사용하였다.

<사용된 프라이머 목록>

1. pROKLBb1(서열번호 3: 5'-GCGTGGAACCGCTTGCTGCAACT-3')

2. SALK_058070LP (서열번호 4: 5’-CTACATATGGCTCGTGGGAAC-3’)

3. SALK_058070RP (서열번호 5: 5’-AAAGAGGTGGAGGTGCTCTTC-3’)

4. SALK_084342LP (서열번호 6: 5’-ATGACTCTGCGAGAAGGCTT-3’)

5. SALK_084342RP (서열번호 7: 5’-GAAAGAGACCAAACCACACC-3’F)

상기 목록에서 1. pROKLBb1 프라이머는 T-DNA에 특이적인 프라이머이고, 2 부터 5까지 기재된 프라이머들은 모두 유전자(AtABCA9/AtATH11)에 특이적인 프라이머이다.

SALK_058070: abca9-1의 유전자 특이적 PCR을 위해서는 상기 목록 중 2를 정방향 프라이머로, 3을 역방향 프라이머로 사용하였고, T-DNA 특이적 PCR을 위해서는 1을 정방향 프라이머로, 3을 역방향 프라이머로 사용하였다. SALK_084342: abca9-2의 유전자 특이적 PCR을 위해서는 상기 목록 중 4를 정방향 프라이머로, 5를 역방향 프라이머로 사용하였고, T-DNA 특이적 PCR을 위해서는 1을 정방향 프라이머로, 5를 역방향 프라이머로 사용하였다. SALK_023744: abca9-3의 유전자 특이적 PCR을 위해서는 상기 목록 중 2를 정방향 프라이머로, 3을 역방향 프라이머로 사용하였고, T-DNA 특이적 PCR을 위해서는 2를 정방향 프라이머로, 1을 역방향 프라이머로 사용하였다.

상술한 바와 같이 각각의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행(95℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35 사이클)함으로써 AtABCA9/AtATH11 유전자 내 T-DNA가 동형접합체(homozygote)로 들어간 돌연변이체를 발굴하였다. (도 1a 및 도 1b). 구체적으로 유전자(AtABCA9/AtATH11)에 특이적인 프라이머쌍을 사용하여 유전자 특이적 PCR 을 수행한 결과, 야생종(WT)에서만 PCR이 된 밴드를 확인하였고(도 1b의 (a) 참조), 각 유전자에 특이적인 RP 또는 LP 프라이머(abca9-1, abca9-2: RP, abca9-3: LP) 와 T-DNA에 특이적인 프라이머를 사용하여 T-DNA 특이적 PCR을 수행한 결과, 녹아웃 라인에서만 PCR이 된 밴드를 확인하여 T-DNA가 동형접합체(homozygote)로 들어간 돌연변이체를 발굴하였다(도 1b의 (b) 참조).

실시 예 2: AtABCA9 / AtATH11 유전자의, 발아율 및 식물의 성장에 대한 영향 측정

실시예 2-1. 발아율에 대한 영향 측정

실시 예 1에서 발굴된 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 애기장대 돌연변이체(abca9-1, abca9-2, abca9-3)와 야생종(Columbia-0, SALK institute)의 발아율을 측정하기 위해 각각의 종자를 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 심어 48시간 이후부터 12시간 간격으로 광학현미경으로 관찰하였다. 발아율은 씨앗의 어린 뿌리가 나오는 것을 기준으로 관찰하였다.

관찰 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 야생종의 경우 종자를 배지에 심은 48시간 후 약 98%가 발아한 반면, AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 돌연변이체의 경우 작고 찌그러진 종자로 인하여 야생종에 비해 발아가 늦고 발아되더라도 약 20-40% 만이 발아하며, 이후에도 돌연변이체의 약 20%는 시간이 지나도 끝까지 발아하지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2-2. 성장에 대한 영향 측정

실시 예 1에서 발굴된 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 애기장대 돌연변이체(abca9-1, abca9-2, abca9-3)와 야생종(Columbia-0, SALK institute)의 성장율을 측정하기 위해 각각의 종자를 1/2 MS 배지(Murashige et al., 1962, Duchefa)에 sucrose가 함유된 rich media 및 sucrose가 함유되지 않은 배지에 각각 심어 3주간 재배한 후에 성장정도를 관찰하여 애기장대의 성장에 미치는 영향을 측정하였다.

측정 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 1%의 sucrose가 함유된 rich media에서는 야생종과 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 3종류의 돌연변이체간 차이가 없지만, sucrose가 없어 온전히 씨앗에 있는 양분을 이용하여 발아 및 성장해야 할 경우에는 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 돌연변이체들이 야생종에 비해 성장이 느리고 잘 자라지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

실시 예 3: AtABCA9 / AtATH11 유전자의 종자에 대한 영향 측정

실시 예 1에서 발굴된 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 애기장대 돌연변이체(abca9-1, abca9-2, abca9-3)의 종자를 관찰한 결과 야생종(Columbia-0, SALK institute)에 비해 작고 찌그러진 종자를 훨씬 더 많이 생산하는 것을 확인할 수 있었으며 (도 4a), 꽃이 핀 후 4일 간격으로(4일, 8일, 12일, 16일, 20일, DAF; 개화 후 날짜(Day After Flowering)) 야생종과 상기 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 3 종류의 다른 돌연변이체의 종자 꼬투리 속 종자를 관찰하였을 때, 야생종에 비해 AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 3 종류의 돌연변이체는 종자를 생성하는 이른 시기부터 작고 연한 색깔의 종자를 형성하여 결국에는 작고 찌그러진 종자를 많이 생산한다는 것을 확인할 수 있어, AtABCA9/AtATH11 유전자가 실제 종자를 형성하는 종자 꼬투리의 초기 시기부터 영향을 주는 것을 알 수 있었다(도 4b).

실시 예 4 : AtABCA9 / AtATH11 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대의 제조

AtABCA9/AtATH11 유전자를 상기 참조 예 1의 방법으로 야생종 애기장대(Columbia-0, SALK institute)로부터 추출한 gDNA를 주형으로 하여 AtATH11-ATG (서열번호 8: 5'-ACTAGTATGACTCTGCGAGAAGGCTT-3') 프라이머와 AtATH11-Stop (서열번호 9: 5'-ACTAGTTTAATTGTTAGATTCATAATCA-3') 프라이머를 사용하여. PCR로 증폭한 후(95℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 2분 30초, 25 사이클), T-blunt vector(Solgent, http://www.solgent.co.kr/)에 넣고, SpeI 제한 효소(Roche, http://www.roche.co.kr/portal/kr)를 사용하여 pCAMBIA1302 바이너리(binary) 벡터(Cambia, http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)에 재조합하였다. pCAMBIA1302 벡터는 형질전환 애기장대의 제조를 위한 식물 발현 벡터로 사용되었으며, 이것은 CaMV 35S 프로모터(promoter)와 다수의 클로닝 장소와 노팔린 합성효소 전사종결자(nopaline synthetase terminator)를 가지고 있다.

화아침지법 (Floral dipping, Clough and Bent, 1988)을 사용하여 pCAMBIA1302:AtABCA9/AtATH11 유전자를 가지고 있는 아그로박테리움 (GV3101) (콜리플라워 모자이크 바이러스CaMV로부터 수득됨)을 사용하여 애기장대로 형질전환 하였다. 형질전환된 종자는 50 ug/L의 카나마이신 항생제가 포함된 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에서 선발되었으며, 생존한 식물들로부터 종자를 채취하였다. 3세대의 동질 접합 종자들이 표현형 분석을 위하여 사용되었다.

실시 예 5 : Quantitative RT - PCR

실시예 5-1 : RNA 분리 및 cDNA 합성

<애기장대 시료의 준비>

1) AtABCA9 / AtATH11 의 조직별 발현을 측정하기 위한 시료

AtABCA9/AtATH11의 조직별 발현을 측정하기 위해 애기장대 야생종(Columbia-0, SALK institute)의 각 조직별(WS: 배지에서 2주간 키운 전체 묘목(whole seedling), L: 배지에서 2주, 흙에서 2주간 키운 잎, S: 배지에서 2주, 흙에서 3주간 키운 줄기, F: 배지에서 2주, 흙에서 3주간 키운 꽃, S1: 4 내지 6 DAF의 꼬투리, S2: 10 내지 12 DAF의 꼬투리, 및 S3: 16 내지 18 DAF의 꼬투리, DAF: 개화 후 날짜(Day After Flowering))로 샘플링하여 RNA 분리 및 cDNA 합성에 사용하였다.

2) 과발현 형질전환체의 발현을 측정하기 위한 시료

과발현 형질전환체의 발현을 측정하기 위해, 애기장대 야생종 및 상기 실시예 4의 방법으로 제조된 애기장대 형질전환체를 6주간 재배한 후 각각의 종자 꼬투리를 샘플링하여 total RNA 분리 및 cDNA 합성에 사용하였다.

< RNA 분리 및 cDNA 합성>

상기 1) 및 2)의 애기장대 시료 각각 100mg을 액체질소를 사용하여 고르게 분쇄한 후, 상기 분쇄된 시료를 2㎖ 튜브에 담고 800㎕의 RNA 추출 버퍼(p-aminosalicylic acid 2.7g, triisopropyl naphthalene sufonic acid 0.45g, 1.25M Tris HCl pH 9.0, 1.25M NaCl, 0.25M EDTA, β-mercaptoethanol 1㎖, acidic phenol 1.2㎖, DEPC water 36㎖)와 400 ㎕의 산성 페놀(acidic phenol)을 넣고 잘 섞는다. 400㎕의 클로로포름을 넣고 잘 섞은 뒤 10분 동안 ice에 놓아둔다. 6000rpm, 4℃, 10분간 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 200㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하였다. 6000rpm, 4℃, 15분간 원심분리 후 상층액을 버린 후 펠렛(pellet)을 말렸다. 말린 펠렛에 DNase(Roche, http://www.roche.co.kr/portal/kr) 처리 후 50㎕의 RNase 제거 초순수물(RNase-free water)을 튜브에 넣어 펠렛을 녹여 RNA를 수득하였다.

상기 얻어진 2㎍의 RNA에 cDNA를 Powerscript RT(reverse transcription)-kit (BD Bioscience Clontech)와 oligo dT 프라이머를 사용하여 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다.

실시 예 5-2 : Quantitative RT - PCR

AtABCA9/AtATH11 유전자의 조직별 발현 양상과 과발현 형질전환체의 발현 정도를 알기 위해서 상기 실시예 5-1의 방법에 의하여 얻어진 야생종과 형질전환체 각각의 cDNA를 주형으로 하고 AtABCA9/AtATH11 F1 프라이머 (서열번호 10: 5'-ATGACTCTGCGAGAAGGCTT-3'), AtABCA9/AtATH11 R1 프라이머 (서열번호 11: 5'-CATGGAAGAATCGGAAGAGA-3')를 사용하여 quantitative RT-PCR을 수행(94℃ 30초, 56℃ 15초, 15℃ 초, 45 사이클)하였다.

AtABCA9/AtATH11의 조직별 (WS, 전체 묘목(whole seedling); L, 잎; S, 줄기; F, 꽃; S1, 4~6DAF; S2, 10~12DAF; 및 S3, 16~18DAF, DAF; 개화 후 날짜(Day After Flowering)) 발현 양상을 측정한 결과, AtABCA9/AtATH11이 다른 조직에 비해 종자 꼬투리에서 발현이 가장 높은 것을 확인하였고(도 5a), 과발현 형질전환체의 발현 정도를 측정한 결과에 따르면, 과발현 형질전환체(도 5b의 T1~T12)에서 AtABCA9/AtATH11 유전자의 발현이 야생종(도 5b의 WT)에 비해 현저히 높다는 것을 확인할 수 있었다(도 5b). 대조구로는 유비퀴틴1(AY059080) 을 사용하였다.

실시 예 6: 종자 내 저장 지방 측정

실시 예 1에서 발굴된 AtABCA9/AtATH11를 발현하지 못하는 돌연변이체와 야생종(Columbia-0, SALK institute)의 씨앗 내 저장 기름을 측정하기 위해 각각 300개의 씨앗으로부터 저장 기름을 추출하였다. 300개의 씨앗을 1-mL의 2-프로판올(propanol)에 넣고 80℃에서 5분간 끓인 후 차갑게 식힌 후 2-mL의 클로로포름(chloroform)을 넣고 Polytron Homogenizer로 곱게 갈아주었다. 이후, 상온에서 10분간 3000rpm으로 원심분리 후 위의 상층액을 딴 후 0.9%(v/v)의KCl을 넣고 흔들어준 후 다시 상온에서 10분간 3000rpm으로 원심분리하였다.

하층액을 딴 후 용매를 날려주면 기름만 남게 되는데, 이것의 무게를 측정하여 전체 기름의 무게를 측정하고 (도 6a), 이를 클로로포름으로 녹인 후 1mg의 기름을 TLC 플레이트(Merck 1.05721)에 로딩하였다. 씨앗의 주요 중성 지방인 트리아실글리세롤을 보기 위해 유리 용해로(glass tank)에 중성 지방을 분리하기 위한 용제(solvent)로 헥산 90 ㎖, 디에틸에테르 7.5㎖, 아세트산 1 ㎖을 넣어준 후 샘플을 로딩한 TLC 플레이트를 넣어 전개하였다. 전개 후 프리뮬린(primuline)으로 TLC 플레이트를 염색한 후 UV하에서 트리아실글리세롤을 관찰하였다. 전개한TLC 플레이트로부터 해당 트리아실글리세롤을 긁어내어 3㎖의 헥산에 녹인 후 기체 크로마토그래피(Gas-chromatography)를 사용하여 씨앗의 주요 기름 성분인 트리아실글리세롤의 양을 측정하였다 (도 6b).

도 6a 및 6b에 나타난 바와 같이, AtABCA9/AtATH11을 발현하지 못하는 돌연변이체의 경우 야생종에 비해 종자의 전체 무게 및 전체 지방(또는 기름) 무게는 감소하였으나 단백질의 양은 차이가 나지 않았으며(도 6a), 종자의 주요 저장 지방 (또는 기름)인 트리아실글리세롤의 경우 야생종에 비해 돌연변이체에서 약 35% 감소함을 확인할 수 있었다 (도 6b). 따라서 AtABCA9/AtATH11이 종자의 저장 지방에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

실시 예 7: 과발현 형질전환체의 생산성 측정

실시 예 4에서 제조된 AtABCA9/AtATH11 유전자를 과발현하는 형질전환체의 생산성을 비교하기 위해, 야생종 애기장대(Columbia-0, SALK institute) 종자 및 형질전환된 애기장대 종자를 에탄올과 락스를 이용하여 표면 살균하여 4℃ 암 상태에서 2일간 보관한 후, 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 치상하였다. 배지는 수평으로 2주간 배양 (16h light/8h dark, 22℃/18℃)한 후, 흙으로 옮겨 4주간 키워 야생종과 형질전환체에서 생장 속도, 꼬투리의 숫자, 꼬투리 내의 종자 숫자, 꼬투리 내의 종자 크기, 종자의 무게 및 종자의 TAG 양을 측정하여 비교하였다. 종자의 TAG 양 측정은 상기 실시예 6에 기재된 방법에 따라 야생종과 과발현체의 종자를 이용하여 TAG를 추출하여 측정하였다.

그 결과 식물의 성장은 야생종(WT)과 과발현 형질전환체(T5, T7, T9, T11 및 T12)간 유사하거나 형질전환체가 약간 더 높은 성장을 나타냈으며 (도 7), 꼬투리의 숫자와 꼬투리 내 종자의 숫자를 비교하였을 때 과발현 형질전환체에서 종자 꼬투리 숫자가 평균적으로 6.2% 정도 증가하면서도 꼬투리 내 종자의 숫자는 차이가 없었다 (도 8).

또한, 과발현 형질전환체(T5 및 T8)의 경우 꼬투리 내 종자의 크기가 야생종(WT)에 비하여 훨씬 커졌으며 (도 9a), 종자의 무게는 특히 형질전환체 T8이 야생종에 비해 최대 123% 증가하였고 (도 9b), 종자의 주요 저장 지방인 트리아실글리세롤(TAG)의 함량 또한 형질전환체, 특히 T9가 야생종에 비해 최대 132% 증가를 나타내었다 (도 9c).

결과적으로, 본 발명의 AtABCA9/AtATH11 유전자를 과발현하는 형질전환체의 경우 야생종에 비하여 종자 꼬투리의 수, 종자 꼬투리 내 종자의 크기 및 종자의 저장 지방인 TAG의 양이 현저히 증가하였으며, 다만 종자 꼬투리 내 종자 숫자는 차이가 나지 않아, 전체적인 생산성 및 저장 지방이 크게 증가하였음을 확인할 수 있었다.

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Claims (14)

1. 식물의 ABC 수송체 단백질 A (ATP-binding cassette transporter protein A) 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물로서,
   상기 ABC 수송체 단백질 A는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드이고,
   상기 식물은 배추, 무, 브로콜리, 갓, 애기장대 및 유채로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 유전자, 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터가 삽입된 형질전환 벡터 또는 상기 형질전환 벡터로 형질전환된 미생물을 포함하는 것인,
   식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 종자 내 저장 지방은 트리아실글리세롤인,
   식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물.
6. 삭제
7. 식물의 ABC 수송체 단백질 A (ATP-binding cassette transporter protein A)를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 식물체로 도입하는 단계를 포함하는, 식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법으로서,
   상기 ABC 수송체 단백질 A는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드이고,
   상기 식물은 배추, 무, 브로콜리, 갓, 애기장대 및 유채로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제7항에 있어서, 상기 종자 내 저장 지방은 트리아실글리세롤인,
    식물 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량을 증가시키는 방법.
11. 삭제
12. 제7항의 방법에 따라 종자의 크기 또는 종자 내 저장 지방의 함량이 증가된 식물체.
13. 제12항에 있어서, 상기 식물체는 식물의 조직, 세포, 및 종자로 이루어진 군에서 선택된 것인, 식물체.
14. 제7항의 방법에 의해 제조된 크기 또는 저장 지방의 함량이 증가된 종자.
    

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