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KR101245071B1 - 폴리에틸렌 글리콜(ｐｅｇ) 단백질 결합을 증가시키기 위한방법 - Google Patents

폴리에틸렌 글리콜(ｐｅｇ) 단백질 결합을 증가시키기 위한방법 Download PDF

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KR101245071B1
KR101245071B1 KR1020067021545A KR20067021545A KR101245071B1 KR 101245071 B1 KR101245071 B1 KR 101245071B1 KR 1020067021545 A KR1020067021545 A KR 1020067021545A KR 20067021545 A KR20067021545 A KR 20067021545A KR 101245071 B1 KR101245071 B1 KR 101245071B1
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지지안 양
싱후아 쑨
유잉 탄
시게오 야기
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Abstract

본 발명은 고도 결합 단백질과 그러한 단백질을 제조하기 위한 여러 가지 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 단백질을 변성시키지 않고 활성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커와의 결합을 위해 하나의 단백질에 여러 개의 결합부를 추가로 결합하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 면역원성이 감소하고 혈중 반감기가 증가하는 고도 결합 단백질에 관한 것이다.
고도 결합 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)

Description

폴리에틸렌 글리콜(ＰＥＧ) 단백질 결합을 증가시키기 위한 방법{METHODS FOR INCREASING PROTEIN POLYETHYLENE GLYCOL (PEG) CONJUGATION}
관련 출원건에 대한 교차 참조
[0001] 본 출원건은 2004년 3월 17일 제출된 가출원 60/554,310에 관한 것이다. 본 문건의 내용은 참고상 본문에 함께 수록되었다.
기술적 영역
[0002] 본 발명은 단백질 치료제 특히 고도로 결합된 단백질의 영역과 그러한 단백질을 제조하기 위한 방법들에 관한 것이다.
배경 기술
[0003] 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 단백질 치료제의 결합은 혈청 반감기 증가 및 항원성 감소 등 중요한 치료학적 이점들을 제공하는 것으로 밝혀지고 있다(Kozlowski, A., et al., J. Controlled Release (2001) 72:217-224). PEG의 산화 에틸렌 단위는 제각기 3개의 물 분자와 결합하며 그 결과 비슷한 분자량의 단백질보다 5~10 배 정도 커진 것처럼 반응하는 분자가 형성된다(Kozlowski, A., supra). PEG화 단백질의 제거율은 분자량에 역비례한다(Yamaoka, T., et al., J. Pharm. Sci. (1994) 83:601-606). 분자량이 약 20,000 이하일 때 이러한 분자는 소변을 통해 제거된다. 분자량이 더 높은 PEG 단백질은 소변 및 대변 내에서 더욱 느 린 속도로 제거된다(Yamaoka, T., supra). PEG 화 단백질은 용해도를 높이고 항원성을 감소시키며 단백질 분해를 감소시키고 신장 청소율을 감소시키는 한편, 선택적인 종양 표적화를 증가시키는 효과가 있다.
[0004] 현재 PEG화 형태로 된 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase), 아스파라기나제(asparaginase), a-IFN 및 성장 호르몬 길항제가 규제 승인을 받은 상태에 있다. (Maeda, H., et al. Advances in experimental medicine and biology(실험 의학 및 생물학의 발전): polymer drugs in the clinical stage(임상 단계에서의 폴리머 약제) (2003) Vol. 519, Dordrecht, The Netherlands: 출판: Kluwer Academic/Plenum Publishers). PEG-α의 경우, 2가지 종류의 성분이 C형 간염 치료용으로 승인되었다 (Kozlowski, A. supra and Gilbert, C.W. et al., U.S. Patent 5,951,974 (1999)). 난치성 또는 재발성이 있는 급성 림프구성 백혈병(ALL)을 앓고 있는 환자들은 PEG- 아스파라기나제 및 메토트렉세이트(methotrexate), 빙크리스틴(vincristine) 및 프레드니손(prednisone)을 조합한 약제로 치료되고 있다(Aguayo, A., et al., Cancer (1999) 86:1203-1209). 몇몇 연구 결과에 따르면, PEG-ADA 성분은 아데노신 데아미나아제(ADA) 결핍증을 앓고 있는 환자들의 면역 체계를 상당한 정도까지 강화시킨 것으로 밝혀졌는데, 이들 환자는 면역 체계의 발달이 억제된 이유 때문에 거의 모든 종류의 감염에 취약한 특성을 보이고 있다. (Pool, R., Science (1990) 248:305; and Hershfield, M.S., Clin. Immunol. Immunopathol. (1995) 76:S228-S232). PEG화 단백질은 바람직한 치료학적 특성들을 보이는 반면, PEG와 단백질을 결합하기 위한 방법은 결합 에 사용되는 단백질 표면에 존재하는 결합 부위의 수와 그 분포에 따라 제한된다.
본 발명의 내용
[0005] 본 발명은 고도 결합 단백질과 그러한 단백질을 제조하기 위한 여러 가지 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 산화 폴리알킬렌(polyalkylene oxides)을 치료용 단백질에 화학적으로 결합함으로써 면역원성은 감소되면서 혈중 반감기는 증가되는 고도 결합 단백질의 생성에 관한 것이다.
[0006] 한편 본 발명은 비 단백질 폴리머 사슬을 통해 단백질을 변형하기 위한 방법들에 관한 것으로서 다음과 같은 과정으로 구성된다. a) 1개 이상의 비단백질 폴리머 사슬을 갖는 1차 변형 단백질을 형성하기 위해 비단백질 폴리머와 단백질을 서로 결합, b) 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 변형 단백질을 형성하기 위해 적어도 2개 이상의 아미노기를 갖는 다관능 아민(polyfunctional amine)과 1개 이상의 비 단백질 폴리머를 갖는 1차 변형 단백질을 서로 결합, 그리고 c) 1차 변형 단백질보다 더 많은 비 단백질 폴리머 사슬을 갖는 2차 변형 단백질을 형성하기 위해 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 변형 단백질을 또 다른 비 단백질 폴리머와 함께 결합.
[0007] 일례로 비 단백질 폴리머는 N 말단 아미노기(N-terminal amino group)와 함께 반응을 일으킬 수 있는 작용기와 함께 유도된다. 예를 들면, 비단백질 폴리머는 N-하이드록시석시니미드(N-hydroxysuccinimide)를 통해 유도될 수 있다. 일례로 비 단백질 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 같은 폴리옥시알킬렌(polyoxyalkylene)으로 존재한다. 또 다른 예에서 기능화된 비 단백질 폴리머는 MEGC-PEG(methoxypolyethylene glycol succinimidyl glutarate)으로 존재한다. 일반적으로 비 단백질 폴리머는 분자량이 약 5000에 이른다.
[0008] 단계 a)에서 1차 변형 단백질은 비 단백질 폴리머 내에 있는 에스테르 기와 단백질 내 함유된 N-말단 아미노 기가 서로 결합하는 과정에서 형성될 수 있다. 단계 2에서 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 변형 단백질은 1차 변형 단백질 내 함유된 C-말단 카르복실 기와 다관능 아민 내 함유된 아미노기가 서로 결합하는 과정에서 형성될 수 있다. 다관능 아민은 디아미노부탄(diaminobutane)으로 존재할 수 있다. 일례로 카르복실은 카로보다이이미드(carbodiimide) 같은 촉매가 존재할 때 다관능 아민과 결합한다. 또 다른 예에서 카르복실은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카로보다이이미드가 존재할 때 다관능 아민과 결합한다. 한편 변형 단백질은 1차 변형 단백질 간의 교차 결합 없이 2차 결합 단계에서 형성된다.
[0009] 일례로 1차 결합시 단백질 대 비단백질 폴리머의 비율은 1:15가 된다. 또 다른 예에서 2차 결합 시 1차 변형 단백질 대 비단백질 폴리머의 비율은 1:60이 된다.
[0010] 또한 본 발명은 앞서 설명한 방법들에 따라 변형된 단백질을 제공한다. 일례로 단백질은 고도로 결합된 메티오니나아제(methioninase)로 존재한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬과 함께 2번 변형된 단백질을 제공하는데 여기서 1차 변형은 1차 PEG 화 단백질을 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 유도체와 단백질 내 함유된 N-말단 아미노 기가 서로 결합되는 과정 그리고 폴리에틸렌 글리콜 사슬과 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 1차 변형 단백질을 형성하기 위해 적어도 2개 이상의 아미노기를 갖는 다관능 아민과 1차 PEG 화 단백질의 C-말단 카르복실 기가 서로 결합되는 과정으로 진행된다. 또한 2차 변형은 1차 변형 단백질보다 더 많은 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 갖는 2차 변형 단백질을 형성하기 위해 또 다른 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 유도체와 2차 변형 단백질 내 함유된 1개 이상의 추가 아미노기가 서로 결합되는 과정으로 진행된다. 또한 본 발명은 발명된 변형 단백질과 제약학적으로 수용할 수 있는 부형제로 구성된 제약학적 조성을 제시하고 있다.
[0011] 뿐만 아니라, 본 발명은 종양 반응을 조절하기 위한 방법들을 제시하고 있는데 이는 그러한 방법을 필요로 하는 피실험자에게 본 발명의 변형된 단백질 또는 본 발명의 제약학적 조성을 치료학적으로 유효한 양만큼 투여하는 과정으로 구성된다. 피실험자는 인간 또는 동물일 수 있다.
[0012] 본 특허 건에서 사용된 "다관능 아민(polyfunctional amine)"이라는 용어는 적어도 1개 이상의 작용성 아미노기를 갖는 아민을 가리킨다. 일례로 지방족 다관능 아민(aliphatic polyfunctional amines) 특히 디아민(diamines)은 결합제로 사용된다. 3개 이상의 작용성 아미노기를 갖는 지방족 다관능 아민과 방향성 다관능 아민 역시 결합제 용도로 사용된다. 지방족 다관능 아민의 예로는 1,4 - 디아미노부탄, 1,2-디아미노-2-메틸프로판, 1,5-디아미노펜탄, 2,2-디메틸-1,3-프로판디아민, 1,6-헥산디아민, 디에틸렌트리아민 및 트리에틸렌테트라아민을 들 수 있으며 이에 국한되지 아니한다. 일례로 1,4-디아미노부탄은 결합 시약으로 사용된다. 방향성 다관능 아민의 예로는 p-페닐렌디아민, p-톨루일렌디아민 및 디아미노나프탈렌을 들 수 있으며 이에 국한되지 아니한다.
[0013] 본 특허 건에서 사용된 "결합제 (coupling agent)"라는 용어는 2개의 시약 간에 하나의 결합 고리를 형성할 수 있는 여하한 성분을 가리킨다. 일례로 카르보다이이미드(carbodiimide)는 에스테르나 산 같은 카르보닐 기와 아미노 기를 결합하는 용도로 사용된다. 카르보다이이미드의 예로는 1-에틸-3 - (3-디메틸아미노프로필)카르보다이이미드, 디시클로헥실 카르보다이이미드, 디이소프로필 카르보다이이미드, 비스(트리메틸실릴)카르보다이이미드 또는 N-시클로헥실-N'-(β-[N-메틸모르폴리노]에틸)카르보다이이미드 p-톨루엔술폰산을 들 수 있으며 이에 국한되지 아니한다. 일례로 1-에틸-3 - (3-디메틸아미노프로필)카르보다이이미드는 에스테르나 산 같은 카르보닐 기와 단백질의 N-말단 아미노 기를 서로 결합하는 용도로 사용된다.
[0014] 본 특허 건에서 사용된 "활성 폴리에틸렌 글리콜(activated polyethylene glycol)" 또는 "활성 PEG(activated PEG)"이라는 용어는 비교적 반응성이 강한 작용기를 통해 유도된 폴리에틸렌 글리콜을 가리킨다. 또 다른 예에서 활성 폴리에틸렌 글리콜은 단백질의 리신 또는 N-말단 아미노기와 반응을 일으킬 수 있는 작용기를 통해 유도된 것이다. 폴리에틸렌 글리콜을 활성화하는 방법은 이러한 기술에 숙련된 자라면 누구나 알고 있는 내용에 속한다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 활성 PEG 에스테르를 형성하기 위해 N-하이드록시석시니미드로 에스테르화 될 수 있다.
본 발명의 실시 형태
[0022] 본 발명은 고도 결합 단백질과 그러한 단백질을 제조하기 위한 여러 가지 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 단백질을 변성시키지 않고 활성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커와의 결합을 위해 하나의 단백질에 여러 개의 결합부를 추가로 결합하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 면역원성이 감소하고 혈중 반감기가 증가하는 고도 결합 단백질에 관한 것이다.
[0023] PEG을 단백질에 결합하기에 앞서 하이드록실 말단을 대체로 단백질의 리신과 N-말단 아미노기와 함께 반응을 일으킬 수 있는 하나의 작용기로 전환하면 폴리머가 1차로 활성화된다(Kozlowski, A., supra). PEG 변형은 단백질 내 남아 있는 리신 잔류물의 ε아미노기와 PEG의 활성 에스테르 간 반응을 기반으로 하기 때문에 단백질에 대하여 PEG 변형이 미치는 영향은 주로 PEG 부착 부위의 수와 그 분포에 따라 달라진다(Hershfield, M.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:7185-7189). PEG 화 작용을 위해 활용할 수 있는 부착 부위의 수를 늘리기 위한 한 가지 방법으로 부착 부위에 의해 유도된 돌연 변이를 들 수 있는데 이는 단백질 내 특정 아미노산을 리신으로 치환하는 역할을 한다(Hershfield, M.S., supra; and He, X.H., et al., Life Sci. (1999) 65:355-368). 또는 화학적 결합법을 활용할 수 있다 (Davis, F.F., et al., U.S. patent 4,179,337 (1979); Veronese, F.M., Biomaterials (2001) 22:405-417; and Kimura, M., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1988) 188:364-369).
[0024] 단백질 내 PEG 화 부위를 추가로 형성하기 위한 화학적 결합법들은 단백질 내 카르복실 기가 다관능 아민의 추가 아미노기와 반응을 일으킬 수 있게 해주는 수용성 카르보다이이미드를 매개로 한 반응을 기반으로 하고 있다. 따라서 이 방법을 사용하면 PEG 화에 적합한 반응성 아미노기를 단백질의 카르복실 기에 첨가할 수 있다. 그러나 이러한 접근법은 카르복실 아미드화 반응을 일으킨 단백질 또는 펩티드의 중합 형태를 생성하는 원인이 되는 교차 결합 반응에 의해 제약을 받고 있다(Davis, F.F., supra).
[0025] 본 발명의 방법들을 사용하면 단백질을 변성시키지 않고 활성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커와의 결합을 위해 하나의 단백질에 여러 개의 결합부를 추가로 결합할 수 있다. (Li et al., Anal. Biochem. 330:264-271 (2004), 참고상 본 명세서에 포함). 고도 결합 단백질은 면역원성이 감소하는 대신 반감기가 늘어나는 결과를 보이는 것으로 밝혀지고 있다. (Yang et al., Cancer Res. 64:6673-6678 (2004), 참고상 본 문서에 포함). 또한 고도 결합 단백질의 혈중 반감기는 보조 인자인 피리독살-5'-인산염에 따라 선량이 크게 달라지는 결과를 보이는 것으로 밝혀졌다. (Yang et al., Cancer Res. 64:5775-5778 (2004), 참고상 본 문서에 포함).
[0026] 일반적으로 이 방법은 다음의 과정으로 구성된다. a) 1개 이상의 비단백질 폴리머 사슬을 갖는 1차 변형 단백질을 형성하기 위해 비단백질 폴리머와 단백질을 서로 결합, b) 1개 이상의 아미노 기를 추가로 갖는 변형 단백질을 형성하기 위해 적어도 2개 이상의 아미노 기를 갖는 다관능 아민(polyfunctional amine)과 1개 이상의 비 단백질 폴리머를 갖는 1차 변형 단백질을 서로 결합, 그리고c) 1차 변형 단백질보다 더 많은 비 단백질 폴리머 사슬을 갖는 2차 변형 단백질을 형성하기 위해 1개 이상의 아미노 기를 추가로 갖는 변형 단백질을 또 다른 비 단백질 폴리머와 함께 결합.
[0027] 본 발명의 방법들은 재조합 단백질 모형인 l-메티오닌-α-디아미노-γ-메르캅토메탄 리아제(rMETase)로 설명된다. 그러나 본 발명의 방법들은 rMETase의 결합에만 국한되지 않으며 그 밖의 단백질에 적용 가능한 경우가 일반적이다. rMETase는 대부분의 단백질에서 발생하는 이러한 아미노산의 정상 빈도보다 훨씬 낮은 단량체 1개 당 398개의 아미노산으로부터 9개의 리신 잔류물만을 형성한다. 이와는 대조적으로 아단위 rMETase에는 PEG 화 반응을 목적으로 아미노기를 추가로 결합하기 위해 카르복실 기가 37개씩 존재한다.
[0028] 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 발생원으로 하는 L-메티오닌 α-디아미노-γ-메르캅토메탄 리아제(METase) [EC 4.4.1.11]는 일찍이 대장균(Escherichia coli)에서 복제 및 생성된 바 있다(Tan Y., et al., Protein Expr. Purif. (1997) 9:233-245; Inoue, H., et al., J. Biochem. (1995) 117:1120-1125; and Hori, H., et al., Cancer Res. (1996) 56:2116-2122). 재조합 메티오니나아제(rMETase)는 인간 암의 임상 전 마우스 모델에서 활성을 띠는 효소의 일종이다. rMETase의 효능은 대체로 메티오닌 요구량이 비정상적으로 높은 종양의 경우에 해당되는 아미노산의 일종인 혈장 메티오닌의 결핍에서 비롯된다. 뿐만 아니라, 일시적인 메티오닌 결핍은 몇몇 화학 요법제에 반응하는 종양의 민감도를 현저히 높이는 결과를 가져온다(Tan, Y., et al., Clin. Cancer Res. (1999) 5:2157-2163; Yoshioka, T., et al., Cancer Res. (1998) 2583-2587; and Kokkinakis, D.M., et al., Cancer Res. (2001) 61:4017-4023).
[0029] 이전 연구에서는 혈중 반감기를 연장시킴으로써 생체 내 혈장 및 종양 메티오닌의 결핍 기간을 늘리기 위해 rMETase를 메톡시폴리에틸렌 글리콜 석시니미딜글루타레이트-5000 (MEGC-PEG-5000)과 결합한 바 있다. 어떤 아단위 rMETase는 PEG : rMETase의 몰 비가 각각 30:1, 60:1 및 120:1인 조건에서 rMETase가 PEG 화 되었을 때 분자 수가 약 4, 6 및 8개인 PEG 분자에 의해 변형되었다. PEG-rMETase (120:1)의 경우, 혈청 반감기가 20배 정도 늘어났으며 메티오닌 결핍 시간은 변형되지 않은 rMETase에 비해 12배 정도 늘어났다. 생체 내 반감기의 증가는 rMETase의 PEG 화 정도에 따라 달라졌다. 또한 PEG 화는 rMETase의 면역원성을 감소시켰다. 면역원성의 감소 정도는 PEG 화 잔류물의 수에 따라 달라졌다(Sun, X., et al., Cancer Research (2003) 63:8377-8383).
[0030] 도 1은 1차 PEG화, 카르복실 아미드화 반응 및 과 PEG 화를 동반하면서도 rMETase 분자의 교차 결합이 없는 과 PEG화 rMETase의 3단계 조제 과정을 보여준다. 첫째, rMETase는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 석시니미딜글루타레이트(MEGC-PEG-5000)와 함께 1차로 PEG 화 된다. 특정 실시예에서 1차 PEG 화는 PEG와 rMETase를 15:1 비율로 조합해 실시되고 있다.
[0031] 둘째, 1차 PEG 화된 단백질의 카르복실 기는 이후 디아미노부탄(DAB) 같은 다관능 아민과 함께 결합되어 카르복실 아미드화 반응을 일으킨다. 특정 실시예에서 카르복실 아미드화 반응은 수용성 카르보다이이미드 같은 촉매가 존재하는 조건에서 이루어진다. 본 발명은 결합 메커니즘에 의해 제약을 받지는 않지만, 카르복실 아미드화 반응이 진행되는 동안 rMETase 분자 간에 이루어지는 교차 결합은 단백질과 이미 결합된 PEG 사슬에 의해 형성된 입체 구조적 간섭에 의해 억제될 수 있다.
[0032] 셋째, 카르복실 아미드화 반응을 거친 PEG 화 rMETase는 카르복실 아미드화 반응을 거친 PEG 화 rMETase의 아미노기를 메톡시폴리에틸렌 글리콜 석시니미딜굴루타레이트(MEGC-PEG-5000)과 추가로 결합함으로써 과 PEG 화 상태를 보였다. 특정 실시예에서 과 PEG 화 반응은 PEG와 PEG-rMETase를 60:1 비율로 조합한 조건에서 이루어졌다. 생화학 분석 결과, 13개의 PEG 사슬은 카르복실 아미드화 반응을 거치지 않은 PEG-rMETase에 부착된 6~8개의 PEG 사슬과 비교할 때 과 PEG 화 반응 후 아단위의 rMETase와 하나씩 결합된 것으로 확인되었다. PEG 화 반응을 거치지 않은 rMETase 반응의 약 15~20%는 과 PEG 화 분자에서 그대로 유지되고 있었다. 과 PEG-rMETase의 면역원성은 PEG-rMETase와 rMETase에 비해 크게 떨어졌다. 1차 실험 결과는 과 PEG 화가 단백질 생물제제의 PEG 화에 대한 새로운 방법이 될 수 있음을 보여준다.
[0033] 표 1은 각각의 반응 단계가 rMETase의 특이 활성도에 미치는 영향을 보여준다. 표 1에서 시발 재료는 rMETase 200 mg이었으며 특이 활성도는 56 U/mg이었다. naked rMETase의 특이 활성도와 변형된 rMETase를 하나씩 비교해본 결과를 기준으로 하면 회수율을 계산할 수 있다. 표 1에서 보는 바와 같이 카르복실 아미드화 반응은 가장 심한 정도의 특이 활성도 손실을 일으켰다.
Figure 112006074910315-pct00001
상이한 반응 조건들이 rMETase의 카르복실 아미드화 반응에 미치는 영향
[0034] 도 2는 N-하이드록시석시니미드와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보다이이미드(NHS/EDC)의 몰 비가 rMETase의 카르복실 아미드화 반응 정도에 미치는 영향을 보여준다. rMETase의 카르복실 아미드화 반응은 NHS : EDC의 비율이 상이한 조건에서 이루어졌다. 카르복실 아미드화 반응의 정도는 플루오르사민(fluorescamine) 법을 통해 평가했다. 475 nm의 여기 및 방사 조건에서 형광 강도를 측정하면 단백질 내 유리 아미노기의 수를 알 수 있다. 겔(삽입된 그림 참조)은 카르복실 아미드화 반응으로 인해 rMETase의 MW가 증가했음을 보여준다. rMETase와 디아미노부탄 (DAB)의 비율 그리고 rMETase와 EDC의 비율은 각각 1:600 및 1:800을 적용했다. 카르복실 아미드화 반응을 거친 rMETase의 형광 강도와 전기 영동 유동성에서 나타나는 차이는 rMETase의 경우와 비교했다.
[0035] NHS와 EDC의 비율을 0.2:1로 했을 때 DAB가 rMETase에 결합되는 정도를 최대한 높일 수 있었다. DAB의 비율이 증가하거나 감소할수록 결합 정도는 떨어졌다. NHS는 EDC에 의해 매개되는 카르복실 아미드화 반응을 강화시켰다. 그러나 이러한 반응 강화의 최적 효율은 NHS와 EDC의 최적비에 따라 달라졌다. 본 연구에서 얻은 결과들은 여타 연구자들이 각자의 연구에서 얻은 결과들과 내용상 비슷했다(Kuijpers, A.J., et al., J. Biomater. Sci. Polym. (2000) 11:225-243).
[0036] EDC와 rMETase의 비율이 카르복실 아미드화 반응에 미치는 효과는 DAB의 농도를 9.4 mg/ml로 고정하고 NHS와 EDC의 비율을 0.2:1로 유지한 조건에서 측정되었다. 측정 결과는 DAB에 의해 rMETase가 결합되는 정도는 EDC와 rMETase의 비율에따라 달라졌다는 사실을 입증하고 있다 (도 3 참조). rMETase의 카르복실 아미드화 반응은 EDC와 rMETase의 몰 비가 변동하는 조건에서 진행되었다. 카르복실 아미드화 반응을 거친 rMETase는 플루오르사민(fluorescamine) 법 및 native PAGE를 이용해 분석되었다(도 2 참조). NHS와 EDC의 몰 비는 0.2:1을 적용했고, rMETase와 DAB의 몰 비는 1:600을 적용했다. 카르복실 아미드화 반응을 거친 rMETase의 형광 강도와 전기 영동 유동성에서 나타나는 차이들은 rMETase의 경우와 비교했다. EDC와 rMETase의 몰 비가 증가할수록 rMETase의 카르복실 아미드화 반응 정도도 증가했다. 특정 실시예에서 EDC와 rMETase의 몰 비는 800:1을 초과하지 않는다.
[0037] 도 4는 DAB와 rMETase의 몰 비가 카르복실 아미드화 반응의 정도에 미치는 영향을 보여준다. rMETase의 카르복실 아미드화 반응은 EDC와 rMETase의 몰 비가 변동하는 조건에서 진행되었다. NHS와 EDC의 몰 비 그리고 rMETase와 EDC의 몰비는 각각 0.2:1 및 1:800을 적용했다 카르복실 아미드화 반응을 거친 rMETase는 플루오르사민(fluorescamine) 법 및 native PAGE를 이용해 분석했으며 rMETase의 경우와 비교했다 DAB와 rMETase의 비율이 600:1로 증가했을 때 카르복실 아미드화 반응의 정도는 정체된 상태에 이른 것처럼 보였다. 특정 실시예에서 카르복실 아미드화 반응에 사용된 DAB와 rMETase의 몰 비는 600:1을 초과하지 않고 있다.
[0038] EDC에 의해 매개된 rMETase의 카르복실 아미드화 반응은 30분 이내에 완료되었다. 이러한 반응을 통해 PEG와 카르복실 아미드화 PEG-rMETase의 몰 비를 60:1로 한 조건에서 과 PEG-rMETase가 생성될 수 있었다(도 5 참조). 따라서 특정 실시예에서는 이전 연구에서 보고한 바와 같이 장시간 동안 반응계 내에서 단백질을 유지할 필요가 없다(Kimura, M., supra). 오히려 열악한 반응 조건으로 인한 rMETase 활성도의 손실을 줄이기 위해 배양 시간을 짧게 적용할 수 있다.
과 PEG화 PEG-rMETase의 특성 분석
[0039] Native rMETase, PEG-rMETase 및 과 PEG 화 rMETase는 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분석했다. 도 5는 새로운 과 PEG 화 rMETase가 가장 낮은 유동성과 가장 높은 분자량을 갖고 있었음을 보여준다. 도 5에서 1번째, 2번째 및 3번째 줄은 각각 native rMETase, 과 PEG-rMETase 및 PEG-rMETase와 관계가 있다. 10% SS 겔은 Coomassie brilliant blue(CBB) 색소로 염색했다. 이들 데이터는 과 PEG 화 PEG-rMETase가 PEG-rMETase에 비해 더 많은 PEG 사슬과 결합되었음을 보여준다.
[0040] 비색 분석법을 적용해(Li, S., et al., Anal. Biochem. (2003) 313:335-337) PEG-rMETase 및 과 PEG-rMETase의 최종 생성물 내 함유된 유리/결합 PEG 함량을 정량했다. 약 13개의 PEG 사슬이 아단위 과 PEG-rMETase와 하나씩 결합되었는데(표 2 참조) 이는 PEG-rMETase와 결합된 PEG 사슬이 약 7개인 것과 비교되었다. 이들 결과는 카르복실 아미드화 반응을 통해 아미노기가 추가로 유도되었음을 보여준다.
[0041] 대조군인 rMETase는 중간에 카르복실 아미드화 반응 단계가 진행되지 않는 조건에서 크게 2단계로 PEG 화 되었다. 과 PEG-rMETase는 PEG:rMETase의 몰 비가 15:1인 조건에서 1차 PEG 화가 진행된 다음, 카르복실 아미드화 반응이 진행되고 마지막으로 PEG:rMETase의 몰 비가 60:1인 조건에서 과 PEG 화가 진행되는 과정을 통해 조제되었다. 표 2에서 보는 바와 같이, 이러한 반응이 진행된 결과 rMETase 아단위 당 6개의 PEG만 생성되었는데 이는 카르복실 아미드화 반응이 rMETase의 과 PEG 화에 영향을 미친다는 사실을 입증한다.
Figure 112006074910315-pct00002
카르복실 아미드화 반응에서 1차 PEG 화가 rMETase의 교차 결합을 감소시키는데 미치는 영향
[0042] 변형되지 않은 rMETase가 1차 PEG 화 없이 DAB와 직접 반응을 일으켰을 때 rMETase는 교차 결합으로 인해 반응 용액 속에 침전된 것이 확인되었으며 결국 rMETase의 활성도가 크게 떨어졌다. 따라서 카르복실 아미드화 반응을 이용해 단백질에 아미노기를 첨가하는데 있어 중대한 걸림돌이 되는 것은 반응 단백질의 교차 결합인 셈이 된다. 1차 PEG 화는 카르복실 아미드화 반응이 진행되는 동안 교차 결합을 크게 감소시켰다. 1차 PEG 화 조건에서는 모든 PEG 사슬을 제거하기 위한 알칼리성 가수분해 작용이 끝난 후 PEG-rMETase와 과 PEG-rMETase 간의 분자량은 차이가 없었다. Native rMETase와 PEG-rMETase의 rMETase는 알칼리성 가수분해를 거친 후10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다.
[0043] 도 6에서 1~4번째 줄은 각각 다음에 열거한 성분에 해당된다. 1번째 줄 - native rMETase; 2번째 줄 - PEG 화 되지 않은 rMETase의 카르복실 아미드화 반응이 끝난 후 과 PEG-rMETase; 3번째 줄 - 1차 PEG 화, 카르복실 아미드화 반응 및 과 PEG 화의 3단계 과정을 통해 조제된 과 PEG-rMETase; 4번째 줄 - 대조군 PEG-rMETase. native rMETase를 포함해 검사된 모든 표본들은 100 ㎕의 희석수에 4 mg/ml만큼 함유되어 있었다. 각각의 표본에 수산화 나트륨(10N)을 2 ㎕만큼 첨가했다. 30분 후, 1.8 ㎍의 HCl (10N)을 첨가해 알칼리성 가수분해 반응을 중단시켰다. 약 12 ㎍의 rMETase를 겔이 담긴 용기에 각각 적하했다.
[0044] 이들 데이터는 카르복실 아미드화 반응이 진행되는 동안 눈에 띌 정도의 교차 결합이 전혀 발생하지 않았음을 보여준다. 이와는 대조적으로, 카르복실 아미드화 반응이 일어나기 전에 1차 PEG 화 되지 않은 과-PEG-rMETase 결합은 상당한 정도의 교차 결합을 일으켰는데 이는 겔 상단에 교차 결합된 rMETase가 남아 있는 상태에서 알칼리성 가수분해 및 SDS PAGE 후에 관찰되었다(도 6, 2번째 줄). 본 발명의 방법들을 실제로 적용할 경우, 카르복실 아미드화 반응이 진행되는 동안 교차 결합의 1차 PEG 화를 이용한 예방 메커니즘이 반드시 필요한 것은 아니지만 활성화된 PEG는 rMETase 분자 표면에서 가장 쉽게 접근할 수 있는 아미노기와 반응을 일으키는 것으로 판단되며, 여타 rMETase 분자의 카르복실 기와 반응을 일으킬 가능성은 현저하게 줄어들고 있다. 또한 PEG 사슬은 배제 용적이 매우 크기 때문에(Knoll, D., et al., J. Biol. Chem. (1983) 258:5710-5715) 1차 PEG 화 된 rMETase와의 반응으로부터 나머지 다른 거대 분자들을 억제하는 작용을 한다. 따라서 1차 PEG 화 과정에서 rMETase에 부착된 PEG 사슬들은 이어지는 카르복실 아미드화 반응에서 교차 결합을 예방할 수 있다.
rMETase, PEG-rMETase 및 과-PEG-rMETase의 면역 반응성 비교
[0045] PEG 화의 가장 중요한 특징 중 하나는 PEG 화된 단백질의 항원성 및 면역원성이 감소한다는 점이다. 항원-항체(Ag-Ab) 인지의 정도는 단백질의 면역원성을 가늠하는 중요한 척도가 된다. 따라서 마우스의 항 rMETase 혈청을 이용한 결합능을 통해 naked rMETase, PEG-rMETase 및 과-PEG-rMETase의 면역 반응성을 평가해 보았다.
[0046] 도 7은 농도와 함수 관계를 이루고 있는 native rMETase의 항체 결합능과 PEG화된 rMETase 2종의 항체 결합능을 그래프로 보여주고 있다. 샌드위치 포맷의 효소 면역 측정법(ELISA)을 통해 면역 반응 분석을 실시했다. 토끼의 항 rMETase 항혈청은 마이크로 플레이트를 도포하는 용도로 사용되었다. Native rMETase, PEG-rMETase 및 과-PEG-rMETase를 포획한 다음 이들 성분을 마우스의 항 rMETase 항혈청과 반응시켰다. 마우스의 결합된 항 rMETase 항혈청은 서양 고추 냉이에서 추출된 과산화효소와 결합된 염소의 다가 면역 글로불린을 이용해 검출되었다. OD492 nm의 흡광도 값을 통해 native 또는 PEG-rMETase와 항 rMETases 항체의 결합능을 계산했다. 계산 결과는 3단계의 희석 농도 조건 즉, (◆) Native rMETase; (■) PEG-rMETase; (▲) 과 PEG-rMETase를 조건으로 서로 비교했다.
[0047] 데이터를 분석한 결과, PEG-rMETase와 항 rMETase 간의 결합능은 일정한 정도까지 감소된 것으로 확인되고 있다. 과 PEG-rMETase와 항 rMETase 혈청 간의 결합능은 정상 PEG-rMETase보다 훨씬 낮게 나타났다. 이들 결과를 살펴보면 과-PEG-rMETase가 항원성을 감소시켰음을 알 수 있다. 항원성의 유의미한 감소는 카르복실 아미드화 반응을 통해 rMETase의 PEG화가 증가한 데 따른 효과를 확증한 셈이 된다. 향후 실험에서는 과-PEG-rMETase의 생체 내 효능을 측정할 예정이다.
[0015] 도 1은 과 PEG-rMETase를 조제하는 방법에 대해 설명하고 있다.
[0016] 도 2는 NHS : EDC의 몰 비가 rMETase의 카르복실 아미드화 반응 정도에 미치는 영향을 보여준다.
[0017] 도 3은 EDC : rMETase의 몰 비가 rMETase의 카르복실 아미드화 반응 정도에 미치는 영향을 보여준다.
[0018] 도 4는 디아미노부탄(DAB) : rMETase의 몰 비가 rMETase의 카르복실 아미드화 반응 정도에 미치는 영향을 보여준다.
[0019] 도 5는 rMETase 및 PEG화 rMETase의 SDS-PAGE를 보여준다.
[0020] 도 6은 rMETase의 카르복실 아미드화 반응이 진행되는 동안 교차 결합이 1차 PEG 화 작용에 미치는 영향을 보여준다.
[0021] 도 7은 native rMETase (u ), PEG-rMETase (n) 및 과 PEG-rMETase ( ~ )의 면역 반응을 서로 비교하고 있다.
[0048] 다음에 열거한 실시예들은 본 발명의 내용을 설명할 목적으로 제시한 것이며 본 발명의 범위를 제한할 목적은 없다. 다음의 실시예에서 재조합 메티오니나 아제(rMETase)는 E. coli 의 발효를 통해 생성되었다(Tan, Y., supra). Sephacryl S-300, Sephadex G-25는 Amersham Pharmacia Biotech (소재지: Piscateway, N.J.)사제품으로 사용했다. 프리캐스트 Tris-GLycine 겔은 NOVEX(소재지: San Diego, CA)사 제품으로 사용했다 rMETase에 대항하는 토끼 항혈청은 H.T.I Bio-Products, Inc. 사 (소재지: San Diego, CA)제품으로 사용했다. 염소 항 마우스 다가 면역 글로불린과 서양 고추 냉이의 과산화효소는 Sigma 사(소재지: St. Louis, MO) 제품으로 사용했다. 플루오르사민(Fluorescamine), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보다이이미드 (EDC), 1,4-디아미노부탄 (DAB) 디하이드로클로라이드, N-하이드로석시니미드 및 티오시안산 암모늄은 Fisher Scientific 사 (소재지: Fairlawn, NJ) 제품으로 사용했다. 마지막으로 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 석시니미딜 글루타레이트-5000 (MEGC-5000) PEG는 NOF corporation 사(소재지: Tokyo, Japan)가 기증한 것으로 사용했다.
실시예 1
rMETase 내 카르복실 아미드화 반응군의 반응도를 추정하기 위한 플루오르사민(Fluorescamine) 법
[0049] 플루오르사민 법은 일반적으로 활성화된 PEG 화의 정도를 추정하는 용도로 사용되는데 그 원리는 PEG에 의한 아미노기의 결합 현상으로 인해 형광 강도가 감소하는 현상을 토대로 하고 있다. 여기서 플루오르사민 법은 rMETase가 디아미노부탄(DAB)과 결합한 후 형광 강도의 증가를 검출함으로써 rMETase의 카르복실 아미드화 반응 정도를 추정하는 목적으로 활용되었다. 분석 절차는 기본적으로 Stocks 가 설명한 방법에 따랐다(Stocks, S.J., et al., Anal. Biochem. (1986) 154:232-234). 간단히 설명하자면, 0.1 M의 인산 나트륨 완충액(pH 8.0) 2 ml 속에 침전된 다양한 양의 rMETase 및 PEG 화 rMETase를1 ml의 플루오르사민 용액(0.3 mg/ml; 아세톤으로 희석)과 혼합한 후, 5분간 실온 상태로 유지했다. 그런 다음, 각각의 표본을 390 nm의 여기 및 475 nm의 방사 조건에서 형광 분광 광도계를 통해 분석했다. 분석 결과는 rMETase의 농도에 대한 형광 강도의 함수 관계(그래프)로 나타냈는데 여기서 직선의 기울기는 선형 회귀를 통해 계산했다.
[0050] 형광 강도의 증가율(%)은 다음의 식으로 계산했다. [(DAB와 결합 후 형광 강도의 기울기 - naked rMETase의 형광 강도 기울기)/naked rMETase의 형광 강도 기울기] x 100.
단백질 함량의 측정
[0051] Native rMETase의 단백질 농도는 사용 설명서에 따라 Wako 단백질 분석 키트(제조사: Wako Pure Chemical, Osaka, Japan)를 이용해 측정했다. 소 혈청 알부민(BSA)은 표준 단백질로 사용했다. PEG-rMETase 결합체의 단백질 함량은 280 nm의 자외선(UV) 흡광도를 통해 측정했다. Naked rMETase는 표준 곡선을 생성할 목적으로 사용되었다.
폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기 영동법 (PAGE)
[0005] 모든 전기 영동 실험은 사용 설명서의 내용에 따라 10% NOVX 프리캐스트 겔을 이용하는 Xcell II 시스템으로 진행했다. SDS-PAGE를 수행하기 위해 SDS가 함유된 tris-glycine 전기 영동용 완충액을 사용했다. 겔에 함유된 단백질은 Coomassie brilliant blue(CBB) 색소로 염색했다. 변형된 모든 rMETase는 naked rMETase와 비교했다.
실시예 2
r-METase의 카르복실 아미드화 반응을 위한 제반 조건
A. N-하이드록시석시니미드(NHS) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)
카르보다이이미드 (EDC) 비의 최적화.
[0053] rMETase:DAB의 몰 비와 rMETase:EDC의 몰 비를 각각 1:600 및 1:800으로 유지하면서 NHS : EDC의 최적 몰 비를 측정했다. NHS의 양이 4.0 mg, 2.7 mg, 1.3 mg 및 0 mg으로 각각 변동하는 조건에서(따라서 NHS/EDC의 비율은 각각 0.6, 0.4, 0.2, 0으로 변동한 것과 같다) DAB (14.1 mg)를 희석수로 용해시켰다. 각 용액의 pH는 0.5 N의 NaOH를 이용해 6.5로 조정했으며 그 결과 얻은 최종 용적은 1 ml였다. 이들 용액은 다시 조직 배양용 플레이트 4 곳으로 옮겼다. 그런 다음, 0.2 M의 인산 나트륨 완충액(pH 6.5) 0.5 ml에 25mg의 rMETase를 침전한 것을 각각의 플레이트 용기에 첨가했다. 22.2 mg의 EDC를 첨가하여 카르복실 아미드화 반응을 일으켰다. 실온 상태에서 4시간 정도 교반한 후, 각 생성물을 0.1 M pH 7.4의 PBS로 평형 상태가 된 Sephadex G-25 컬럼에 가하여 소 분자 불순물을 제거했다. 그런 다음, rMETase와 DAB 간의 결합 정도를 PAGE 및 플루오르사민 법을 이용해 평가했다.
B. rMETase/EDC와 rMETase/DAB 비율 최적화
[0054] EDC가 카르복실 아미드화 반응에 미치는 효과는 앞서 언급한 실험 A로부터 측정된 NHS/EDC의 최적 몰 비 0.2와 rMETase/DAB의 몰 비인 1:600을 적용해 측 정했다. rMETase/EDC의 몰 비가 각각 1:200, 1:400, 1:600, 1:800 및 1:1000인 조건에서 변동량의 EDC를 각각의 플레이트 용기에 첨가했는데 그에 앞서 플레이트 용기는 각각 25 mg rMETase, 14.1 mg DAB 및 1.3 mg NHS를 함유하고 있는 PBS 혼합물 1.5 ml(0.2 M, pH 6.5)를 담고 있었다. 기타 반응 조건, 처리 그리고 최종 결합된 생성물에 대한 평가 방법은 실험 A와 동일했다. rMETase/DAB의 최적 몰 비를 얻기 위해 NHS/EDC 몰 비를 0.2로 유지하고 rMETase/EDC의 계산된 최적 몰 비를 1:800으로 유지한 조건에서 상기와 동일한 절차에 따라 실험을 진행했다.
C. 카르복실 아미드화 반응의 경과
[0055] 시간 경과에 따른 반응 실험에서는 NHS/EDC의 비가 0.2, rMETase/DAB의 비가 1:800 그리고 rMETase/EDC의 비가 1:800인 조건에서 2 ml의 PBS(0.2 M, pH 6.5)에 침전된 33 mg의 rMETase를 사용했다. EDC를 첨가해 반응을 일으킨 후, 0.4 ml의 반응물을 다양한 시간 간격을 두고 제거한 뒤 정제했다. rMETase와 DAB 간의 결합 정도는 앞서 설명한 바와 같이 분석했다.
실시예 3
과 PEG 화 rMETase의 조제
[0056] 카르복실 아미드화 반응을 거치지 않은 rMETase로 얻은 것보다 더 많은 수의 PEG 사슬을 가진 과 PEG 화 rMETase는 도 1에서 보는 바와 같이 3단계의 절차에 따라 조제되었다. rMETase 분자들 간의 교차 결합 없이 1차 아민을 추가로 유도하기 위해 native rMETase부터 우선 PEG 화했으며 그 결과 교차 결합 없이 카르복실 아미드화 반응을 일으킬 수 있었다. 마지막으로 카르복실 아미드화 반응을 거친 r-METase를 "과" PEG 화 시켰다. 1차 PEG화 단계에서는 PBS (0.1M, pH 7.4)에 침전된 2 ml (200 mg)의 rMETase를 0.5N의 NaOH를 이용해 pH 8.5로 조정한 뒤 실온 상태에서 1시간 동안 교반을 통해 87.2 mg의 MEGC-5000 PEG (PEG:rMETase의 몰비는 15:1)와 반응을 일으켰다.
[0057] 1차 PEG 화를 거친 rMETase의 카르복실 기에 DAB를 결합하기 위해 21.3 mg의 NHS (NHS/EDC의 몰 비는 0.2), 149.8 mg의 DAB (rMETase/DAB의 몰 비는 1:600) 그리고 178.3 mg의 EDC (rMETase/EDC의 몰 비는 1:800)을 함유한 8 ml의 혼합물에 대한 반응물을 4 ml의 PBS (0.2 M, pH 6.5)를 이용하여 희석시켰다. 30분간 교반한 후, 유리 PEG 및 기타 소 분자 불순물을 제거하기 위해 PBS(0.05 M, pH 7.4)로 희석된 Sephacryl S-300 컬럼 (26 x 60)에 혼합물을 투입했다. 이후 카르복실 아미드화 반응을 거친 PEG-rMETase는 아래에 설명한 바와 같이 과 PEG 화 되었다.
[0058] 과 PEG 화를 위해 새로 첨가된 1차 아민을 함유하고 있는 152 mg의 PEG-rMETase을 2 ml로 농축시켰다. 과-PEG화 반응을 일으키기 위해 0.2 ml의 붕산염 완충액(1 M, pH 9.0)을 pH를 8.5로 조정한 265.1 mg의 MEGC-PEG-5000 (PEG:PEG-rMETase의 몰 비는 60:1)와 함께 첨가했다. 정제 및 농축을 실시한 후, 112 mg의 과 PEG-rMETase를 얻었다. 대조군인 PEG-rMETase 역시 카르복실 아미드화 반응을 생략한 것 외에는 상기와 동일하게 PEG-rMETase의 몰비를 15:1 및 60:1로 각각 유지한 2단계 방식을 통해 조제되었다
실시예 4
rMETase의 PEG 화 정도에 대한 측정
[0059] rMETase의 PEG 화 정도는 rMETase 아단위 별 평균 PEG 함량으로 측정되었다. 최종 정제된 PEG-rMETase 결합체의 PEG 함량은 Li, S., et al., supra.가 설명한 알칼리성 가수분해 비색 분석법을 이용해 정량했다. 간단히 정리하자면, 우선 분석 대상인 PEG-rMETase를 크게 2개의 표본으로 나누었다. 1개의 표본은 30분간 알칼리성 가수분해를 거친 후, rMETase와 결합된 PEG를 방출했다. PEG-rMETase의 또 다른 표본은 알칼리성 가수분해를 거치지 않았다. 그런 다음, 각 표본을 1 ml의 클로르포름과 1 ml의 티오시안산 암모늄으로 구성된 2상계 혼합물에 투입했다. 30분간 활발한 보텍스 교반을 실시한 후 3분간 3500 g의 가속도로 원심 분리를 진행한 뒤, 클로르포름의 아래 층을 분리했다. 510 nm의 흡광도를 적용한 상태에서 표준 곡선을 이용해 클로르포름 층에서 유리 또는 방출된 PEG의 양을 측정했다. PEG-rMETase 조제 시 유리 PEG의 양은 알칼리성 가수분해 처리를 생략한 조건에서 표본으로부터 측정되었다. PEG-rMETase에 함유된 PEG의 총량은 알칼리성 가수분해를 거친 표본에서 측정했다. rMETase와 결합된 PEG의 양은 PEG의 총량에서 유리 PEG의 양을 뺀 결과 얻을 수 있었다(Li, S., supra).
실시예 5
rMETase, PEG-rMETase 및 과 PEG화 rMETase의 면역 반응성
[0060] Naked rMETase 및 PEG화 rMETase의 면역 반응성은 항 rMETase 항혈청에 대한 결합능을 통해 측정했다. 효소 면역 측정법(ELISA) 및 샌드위치 포맷을 이용 해 면역 반응 분석을 실시했다. 0.1 M의 탄산나트륨 코팅 완충액(pH 9.5)으로 희석된 100 ㎕의 토끼 항 rMETase 항혈청을 마이크로 플레이트 용기에 각각 첨가한 후, 섭씨 4도의 온도에서 밤새도록 배양했다. 이후, 플레이트는 0.05% Tween-20을 함유한 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 뒤, 10% FBS를 함유한 pH 7.4의 PBS 분석 완충액 200 ㎕를 이용해 실온 상태에서 2시간 동안 외부와 차단한 다음, 다시 한 번 더 세척했다. 100 ㎕의 rMETase, PEG 화된 rMETase 그리고 PBS 분석 완충액을 통해 25 ㎍/ml에서 0.25 ㎍/ml로 희석된 과 PEG 화 rMETase를 마이크로 플레이트의 해당 용기에 첨가한 후, 실온 상태에서 1 시간 동안 배양했다. 플레이트를 세척한 후, 100 ㎕의 마우스 항 rMETase 항혈청을 플레이트의 용기에 각각 첨가한 후, 실온 상태에서 1시간 동안 배양한 다음, 세척을 실시했다. 100 ㎕의 염소 항 마우스 다가 면역 글로불린과 서양 고추 냉이의 과산화효소를 최적으로 희석한 결합체를 각각의 플레이트 용기에 첨가했다. 이후 플레이트를 실온 상태에서 1시간 동안 배양한 다음, 3회에 걸쳐 세척했다. 100 ㎕의 기질 용액(O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 + 과산화수소)을 각각의 플레이트 용기에 첨가한 뒤, 실온 상태에서 30분간 배양을 실시했다. 50 ㎕의 2N 황산을 플레이트 용기에 각각 첨가해 발색 반응을 중단시켰다. 각 플레이트 용기의 흡광도는 492 nm의 조건에서 측정되었다.
[0061] 앞서 상술한 내용 및 그에 수반된 실시예들은 단지 설명 목적으로만 제시한 것이며 본 발명의 적용 범위에 대한 제약 조건으로 간주되어서는 안 된다. 공개된 실시예에 대한 각종 변경 및 수정 사항들은 본 발명의 기술에 정통한 자들에게 명확히 전달하기로 한다. 화학적 구조, 치환기, 유도체, 중간물, 합성물, 조성 및/ 또는 발명의 사용 방법을 포함하는 그러한 변경 및 수정 사항들은 본 발명의 진의 및 적용 범위 내에서 실질적으로 반영할 수 있다. 여기서 인용된 미국 특허 및 간행물들은 참고 목적으로 수록된 것임을 밝힌다.

Claims (22)

  1. 비 단백질 폴리머 사슬을 이용해 단백질을 변형하기 위해 사용되며 아래의 과정으로 진행되는 방법:
    a) 1개 이상의 비 단백질 폴리머 사슬들을 갖는 1차 변형 단백질을 형성하기 위해 하나의 단백질을 비 단백질 폴리머와 결합;
    b) 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 변형 단백질을 형성하기 위해 1개 이상의 비단백질 폴리머 사슬을 갖는 1차 변형 단백질 그리고 적어도 2개 이상의 아미노기를 갖는 다관능 아민을 서로 결합;
    c) 1차 변형 단백질보다 더 많은 수의 비 단백질 폴리머 사슬을 갖는 2차 변형 단백질을 형성하기 위해 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 상기의 변형 단백질과 또 다른 비 단백질 폴리머를 서로 결합.
  2. 제1항에 있어서, 비 단백질 폴리머가 상기 단백질의 N 말단 아미노기(N-terminal amino group)와 함께 반응을 일으킬 수 있는 작용기와 함께 유도되는 것이 특징인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기의 비 단백질 폴리머가 폴리옥시알킬렌인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기의 폴리옥시알킬렌이 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기의 작용기가 N-하이드록시석시니미드인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기의 비 단백질 폴리머가 메톡시폴리에틸렌 글리콜 석시니미딜 글루타레이트(MEGC-PEG)인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기의 비 단백질 폴리머가 5000의 분자량을 갖는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기의 다관능 아민이 디아미노부탄인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 청구항 1의 단계 a)에서 언급한 1차 변형 단백질이 그 단백질에 함유된 N-말단 아미노기와 상기의 비 단백질 폴리머에 함유된 에스테르 기의 결합을 통해 형성되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 상기의 변형 단백질이 상기의 1차 변형 단백질 내 함유된 C-말단 카르복실 기와 상기의 다관능 아민 내 함유된 아미노기가 서로 결합하는 과정을 통해 형성되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기의 카르복실이 촉매가 있는 조건에서 상기의 아미노기와 결합되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기의 촉매가 카르보다이이미드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기의 카르보다이이미드가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보다이이미드인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 단계 b)에서 1차 변형 단백질 간의 교차 결합 없이 상기의 변형 단백질이 형성되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 단백질과 비단백질 폴리머의 비율이 1차 결합 단계에서 1:15가 되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 1차 변형 단백질과 비 단백질 폴리머의 비율이 2차 결합 단계에서 1:60이 되는 방법.
  17. 제1항의 방법에 따라 변형된 단백질-비 단백질 폴리머 결합물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단백질이 메티오니나아제인 단백질-비 단백질 폴리머 결합물.
  19. 1차 변형은 1차 PEG 화 단백질을 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 유도체와 단백질 내 함유된 N-말단 아미노 기가 서로 결합되는 과정 그리고 폴리에틸렌 글리콜 사슬과 1개 이상의 아미노기를 추가로 갖는 1차 변형 단백질을 형성하기 위해 적어도 2개 이상의 아미노기를 갖는 다관능 아민과 1차 PEG 화 단백질의 C-말단 카르복실 기가 서로 결합되는 과정으로 진행되며, 2차 변형은 1차 변형 단백질보다 더 많은 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 갖는 2차 변형 단백질을 형성하기 위해 또 다른 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 유도체와 2차 변형 단백질 내 함유된 1개 이상의 추가 아미노기가 서로 결합되는 과정으로 진행되는 동안, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬과 함께 2번 변형된 단백질-폴리에틸렌 글리콜 결합물.
  20. 제19항의 결합물에서 상기 단백질이 l-메티오닌-α-디아미노-γ-메르캅토메탄 리아제(rMETase)인 결합물 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하여 이루어진 신장암, 대장암, 폐암, 전립선암, 흑색종 및 중추신경계암으로 이루어진 군에서 선택된 암을 치료하기 위한 조성물.
  21. 제19항에 따른 결합물 또는 그의 약학적 조성물의 치료적 유효량을, 그러한 성분을 필요로 하는 비인간 피실험자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 종양 반응 조절을 위한 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 피실험자가 인간이 아닌 동물인 방법.
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