KR101228409B1

KR101228409B1 - 알츠하이머 질환의 예방 및 치료 방법

Info

Publication number: KR101228409B1
Application number: KR1020077002209A
Authority: KR
Inventors: 프랑크 마트너; 발터 슈미트
Original assignee: 아피리스 아게
Priority date: 2004-07-13
Filing date: 2005-07-06
Publication date: 2013-01-31
Anticipated expiration: 2025-07-06
Also published as: CN103263664A; TWI353848B; WO2006005707A3; JP5179866B2; AT413946B; TW200602071A; JP2008506666A; US20090004210A1; EP1765390A2; AU2005261688B2; WO2006005707A2; ATA11842004A; US8022180B2; CN101043901A; CA2573424A1; KR20070032033A; AU2005261688A1

Abstract

본 발명은 알츠하이머 질환(AD)에 대한 백신을 제조하기 위한 하기 아미노산 서열을 포함하는 화합물의 용도에 관한 것으로, 상기 화합물은 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 대해 특이적인, 항체에 대해 결합 능력을 지니며, 이의 5량체는 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 특이적인, 상기 항체에 대해 결합능력을 지닌다:

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇

상기 서열에서, X₁은 C를 제외한 아미노산이고, X₂는 C를 제외한 아미노산이고, X₃는 C를 제외한 아미노산이고, X₄는 C를 제외한 아미노산이고, X₅는 C를 제외한 아미노산이고, X₆은 존재하지 않거나, 임의의 아미노산이고, X₇은 존재하지 않거나, 임의의 아미노산이나, 단, X₁X₂X₃X₄X₅X₆는 DAEFRH가 아니다.

Description

알츠하이머 질환의 예방 및 치료 방법 {METHOD FOR PREVENTING AND TREATING ALZHEIMER'S DISEASE}

본 발명은 알츠하이머 질환(AD)을 예방하고 치료하는 방법에 관한 것이다.

아밀로이드-β 펩티드(Aβ)는 알츠하이머 질환의 신경병리에 중추적인 역할을 한다[참조: Roher et al 1993: "β-Amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer disease" PANS 90: 10836]. 상기 질환의 가족형은 아밀로이드 전구 단백질 (APP) 및 프레세닐린 유전자에서의 돌연변이와 관련된다. 이러한 유전자에서의 질환 연관된 돌연변이는 상기 펩티드의 42-아미노산형(Aβ42)의 생성 증가를 초래하는데, 이러한 아미노산형은 알츠하이머 질환의 아밀로이드 플라크에서 발견되는 가장 우세한 형태이다. 상기 질환에 대한 동물 모델은 구입할 수 있다. 돌연변이 사람 APP(여기서, 717 위치에서 아미노산이 V 대신 F임)를 과발현시키는 PDAPP 유전자이식 마우스는 연령 및 뇌 의존적 방식으로 알츠하이머 질환의 다수의 신경병리학적 특징을 점진적으로 발전시킨다[참조: Games et al 1995: "Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F β-amyloid precursor protein" Nature 373:523].

미모토프(mimotope) 기재 백신이 아닌 "정상"에 의한 백신화 연구는 이미 수행되었다. 유전자이식 동물을 AD 타입 신경병리 상태의 발병 (6주) 이전에 또는 보다 높은 연령(11개월)에서 응집화된 Aβ42로 면역화시켰다: 어린 동물의 면역화는 플라크 형성, 신경염 위축 및 성상교세포증의 진행을 억제하였다. 보다 높은 연령의 동물의 치료에서는 AD 형 신경병리상태를 현저히 감소시켰다. 이러한 실험적 백신화 방법이 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있고, 아밀로이드 플라크를 공격할 수 있는 Aβ42에 대한 항체의 개발을 유도하였다[참조: Schenk et al 1999:" Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PD-APP mouse" Nature 400:173]. 상기 플라크는 이후 Fc 수용체 매개된 식세포작용을 포함하는 다수의 메카니즘에 의해 제거된다[참조; Bard et al 2000: "Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease" Nature Med 6: 916]. 또한, 이러한 백신은 기억력 결핍을 지연시킬 수 있다[참조: Janus et al 2000: "Aβ peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease" Nature 408:979].

AD에 대해 매우 유망한 면역화 치료법은 1999년 말부터 임상 시험이 이루어져왔다. 면역화는 기초가 되는 정확한 메카니즘이 보다 자세히 특징화될 필요가 있기는 하지만, 면역 시스템이 플라크를 공격하여 병에 걸린 사람의 뇌로부터 이러한 침착물을 제거하는 것으로 추정된다.

상기 임상 실험은 제약 회사인 엘란(Elan)과 협력 업체인 어메리칸 홈 프로덕츠(American Home Products)(치료 백신 AN-1792, 애주번트로서 QS21)에 의해 수행되었다. 제 I 단계 실험은 2000년에 성공적으로 종결되었다. 제 II 단계 실험은 2001년 말에 시작되어 경도에서 중등도 수준의 AD를 앓고 있는 환자 패널의 효능을 시험하였다.

이제 이러한 제 II 단계 시험은, 여러 환자들의 뇌의 염증반응(neuroinflammation)으로 인해 완전히 중단되었다[참조: Editorial 2002 "Insoluble problem?" Nature Med 8:191]. 이러한 증상은 전세계적 실험의 즉각적인 중단을 이끄는 무균성 수막뇌염을 포함한다. 최악의 시나리오의 경우, 감염된 환자들은 많은 면역치료법에서 고유한 위험인 자가면역 반응을 일으킬 것으로 나타날 것이다. 자가면역질환 합병증은 APP의 편재성의 경우에 예측할 수 있으며, 이것이 단백질분해적 생성물과 공통적으로 항원성 결정인자를 지님은 물론이다. 보다 최근에, 응집된 Aβ42 면역화 유도된 항체(사람 및 마우스에서)의 특성에 대한 추가 연구가 집중되어 대부분의 항체가 Aβ42의 아미노산 4와 10(Aβ4-10) 사이의 작은 도메인을 인식한다는 것을 밝혀냈다. 마우스 항체는 Aβ원섬유형성(fibrillogenesis)을 블록킹할 수 있으며, 기존 Aβ 섬유를 분열시킨다[참조: McLaurin et al 2002: "Therapeutically effective antibodies against amyloid-β peptide target amyloid-β residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis" Nature Med 8":1263]. 그 중에서도 특히, 상기 사람 항체는 세포 또는 상기 전구체의 임의의 다른 비응집된 단백질 분해 생성물의 표면에 노출된 APP 과 반응하지 않는다[참조: Hock et al 2002: "Generation of antibodies specific for β-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease" Nature Med 8: 1270]. 사람과 마우스 혈청 간에는 분명한 차이가 관찰되었다: 사람 항체와 대조적으로, 마우스 항체는 모노머성, 올리고머성, 및 섬유성 Aβ를 검출한다. 이는 사람 안티-Aβ에 의해 인식되지 않은 Aβ의 작은 올리고머가 질병에 있어서 주요한 독성 역할체라는 증거가 늘어나는 것이기 때문에 중요하며, 치료적 효능에 대한 전제 조건일 수 있다[참조: Walsh et al 2002: "Naturally secreted oligomers of amyloid β protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo" Nature 416:535]. 따라서, 유효한 새로운 전략은 β-아밀로이드 아미노산 4-10(응집된 Aβ42 대신에)을 함유하는 백신으로 면역화하는 것이다. 미공지된 효능에도 불구하고, 이러한 전략은 또한 환자가 (선형 B 세포) "자기(self)" 에피토프에 의해 직접적으로 면역화되어야 하기 때문에 자가면역 문제에 직면할 수 있다.

최근 AD 백신화 전략에서 이러한 실망스러운 개발에도 불구하고, Aβ 백신은 여전히 AD를 구제하는 가장 유망한 방식으로서 간주된다. 그러나, AD 백신화에서의 개선 및 새로운 전략이 시급하다. 특히, 이러한 백신은 자가반응성 T 및/또는 B 세포를 유도하지 않아야 한다. 알츠하이머 질환(AD)에 대한 백신을 제조하기 위한, 항체에 대해 결합능력을 지니며, 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 대해 특이적인 미모토프 펩티드, 및 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 특이적인, 상기 항체에 대해 결합능력을 지닌, 상기 미모토프 펩티드의 5량체는 PCT/EP04/00162(본원에서 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다. 이 출원에서 바람직한 미모토프는 하기 아미노산 서열

X₁X₂X₃X₄X₅X₆

[상기 서열에서,

X₁은 G, 또는 히드록시기를 지닌 아미노산 또는 음하전된 아미노산, 바람직하게는, E, Y, S 또는 D이고,

X₂는 소수성 아미노산, 또는 양하전된 아미노산, 바람직하게는, I, L, V, K, W, R, Y, F 또는 A이고,

X₃는 음하전된 아미노산, 바람직하게는, D 또는 E이고,

X₄는 방향족 아미노산 또는 L, 바람직하게는, Y, F 또는 L이고,

X₅는 H, K, Y, F 또는 R, 바람직하게는, H, F 또는 R이고,

X₆은 S, T, N, Q, D, E, R, I, K, Y 또는 G, 바람직하게는, T, N, D, R, I 또는 G이다],

특히, EIDYHR, ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR, DLDYRR, DVDYRR, DKELRI, DWELRI, YREFRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG, DRELRI, DKELKI, DRELKI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT, DKELR 또는 SFEFRG을 포함한다.

추가로, 천연 L- 또는 D-아미노산은 비천연 L- 또는 D-아미노산에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, L, I 또는 V는 Nle, Nva, Cha 또는 다른 선형 또는 고리형 지방족 측쇄를 지닌 알파 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, W 또는 F는 방향족 아미노산에 의해 치환될 수 있고, R 및 K는 오르니틴 또는 호모아르기닌과 같은 염기성 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 세린 및 트레오닌은 말단 OH 기를 지닌 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산에 의해 치환될 수 있다.

본 발명은 AD에 대한 백신화에 사용되는 미모토프 펩티드(유사 DAEFRH)를 추가로 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 화합물은 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 특이적인 항체를 지닌 펩티드 라이브러리를 스크리닝하므로써 제공된다. 바람직하게는, 상기 라이브러리내 펩티드는 알츠하이머 질환(AD)에 대한 백신을 제조하기 위한, 하기의 아미노산 서열을 지니거나 포함하며, 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 대해 특이적인 항체에 대해 결합 능력을 지니며, 상기 펩티드의 5량체는 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 특이적인 상기 항체에 대해 결합능력을 지닌다:

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇

상기 서열에서, X₁은 C를 제외한 아미노산이고,

X₂는 C를 제외한 아미노산이고,

X₃는 C를 제외한 아미노산이고,

X₄는 C를 제외한 아미노산이고,

X₅는 C를 제외한 아미노산이고,

X₆은 존재하지 않거나, 임의의 아미노산이나, 바람직하게는 C는 제외되며,

X₇은 존재하지 않거나, 임의의 아미노산이나, 바람직하게는 C는 제외되고,

단, X₁X₂X₃X₄X₅X₆는 DAEFRH가 아니다.

본 발명에 따르면, Aβ42 미모토프는 AD에 대한 백신화에 사용된다: 이 미모토프는 Aβ42에 대해 항체의 생성을 유도하지만, 원래의 APP에 대해서는 항체의 생성을 유도하지 않는다. 미모토프는 (모노클론성) 항체 및 (시판되는) 펩티드 라이브러리(예를 들어, 문헌(Reineke et al. 2002: "Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated sequences" J Immunol Methods 267:37)에 따름)로 확인될 수 있다. APP를 인식하지 못하나 아미노-말단 아스파르트산을 지닌 상이한 Aβ 종 만 검출하는 (단일클론성) 항체가 사용된다(예를 들어, 이러한 항체는 문헌(Johnson-Wood et al 1997: "Amyloid precursor protein processing and Aβ42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease" PNAS 94:1550)에 개시되어 있다). 이러한 항체는, 본 발명의 과정에서 백신 적합성 미모토프를 확인하기 위한 이상적인 도구인 것으로 입증되었다. 이러한 모노클론성 항체가 마우스에 직접 투여되는 경우에 AD의 마우스 모델에 있어서 유리한 효과를 갖는 것으로 나타났지만(Bard et al 2000: "Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease" Nature Med 6: 916), 이들 항체를 AD 백신 화합물을 분리시키기 위한 미모토프 조사 도구로서 사용하는 것은 결코 제안된 바 없다.

종래 기술에서, 모든 노력은 천연 Aβ 펩티드에 집중되었다. 상기 언급된 바와 같이, Aβ 펩티드 백신 임상 실험은 뇌의 염증반응 경우로 인해 중단되었다. 실제로, T 세포 에피토프 예측 프로그램(클래스 I-제한 에피토프에 대해 BIMAS 및 클래스 II-제한 에피토프에 대해 TEPITOPE)은 서열내 높은 등급 (자기) 에피토프를 제안한다. 이는, 신경염증 발병이 일반적인 적용에 대해 부적합한 백신이 되게 하는 자가면역 반응으로 인한 것임을 내포할 수 있다.

종래 기술에서 제안된 이러한 Aβ 백신과 대조적으로, 본 발명에 따른 미모토프 확인을 위해 사용된 (모노클론성) 항체는 APP를 인식하지 않고, 미모토프 서열이 지금까지 실험되어 왔던, 또는 미래의 실험에 사용될 Aβ42 유도된 자기 서열과 상이하기 때문에, 본 발명에 따른 미모토프를 함유하는 백신으로 처리하는 동안에 어떠한 자가면역 반응을 일으키지 않을 것으로 예상된다.

본 발명에 따른 미모토프 확인을 위해 사용되는 항체는 유리 아미노-말단 아스파르트산을 지닌 Aβ 유래된 아미노산 서열 DAEFRH(= 기원 에피토프)를 검출하고, 이에 따라 원래의 APP를 인식하지 않는다. 이러한 항체는 모노클론성 또는 폴리클론성 항체 제제이거나 임의의 항체 일부 또는 이의 유도체일 수 있으며, 유일한 전제 조건은 항체 분자가 DAEFRH 에피토프를 특이적으로 인식하는 것이다. 즉, 아밀로이드 전구 단백질의 천연 N-말단 연장된 형태에 결합하지 않는 것이며, 이는 DAEFRH 에피토프에 대한 결합 능력이 APP 분자에 대한 것보다 100배 이상, 보다 바람직하게는 1000배 이상, 더욱 더 바람직하게는 10⁵ 배 이상 높다는 것을 의미한다. 항체는 상기 문헌(Johnson-Wood et al., 1997)에서 기술된 항체로서 DAEFRF 서열과 동일하거나 보다 높은 결합 능력을 보여주는 항체일 수 있다. 물론, 보다 높은 결합 능력이 보다 바람직하기는 하지만, 보다 낮은 결합 능력을 지닌 항체도 사용될 수 있다(상기 존슨-우드 등의 항체의 결합 능력의 10% 초과, 50% 초과 또는 80% 초과).

본 발명에 따른 화합물은 DAEFRH 서열에 필적하는 특이성을 지닌 그러한 항체에 결합한다.

바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은

X₁이 G, 또는 히드록시기를 지닌 아미노산 또는 음하전된 아미노산, 바람직하게는, G, E, Y, S 또는 D이고,

X₂가 소수성 아미노산, 또는 양하전된 아미노산, 바람직하게는, N, I, L, V, K, W, R, Y, F 또는 A이고,

X₃가 음하전된 아미노산, 바람직하게는, D 또는 E이고,

X₄가 방향족 아미노산 또는 소수성 아미노산, 바람직하게는, Y, F 또는 L이고,

X₅가 H, K, Y, F 또는 R, 바람직하게는, H, F 또는 R이고,

X₆가 P를 제외한 임의의 아미노산 또는 X₇이 존재할 경우에는 C를 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는, S, T, N, Q, D, E, R, I, K, Y 또는 G, 특히 T, N, D, R, I 또는 G인 펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다.

이때, 20개의 천연 아미노산은 이들의 화학적 유사체에 의해 또는 D-아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 예를 들어, L은 Nle, Nva 또는 Cha에 의해 치환될 수 있다. 이러한 치환의 작용성은 본 발명의 실시예 부분에 기술된 시험 모델을 사용하여 용이하게 시험될 수 있다. 또한, 입체적 고려사항은 펩티드에 대한 항체의 결합에 대해 컴퓨터 모델을 통해 계산될 수 있다.

특히 바람직한 펩티드는 하기 서열을 포함한다: DAEFRWP, DNEFRSP, GSEFRDY, GAEFRFT, SAEFRTQ, SAEFRAT, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP, SSEFRVS, DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, SLEFRF, GPEFRW, GKEFRT, AYEFRH, DKE(Nle)R, DKE(Nva)R 또는 DKE(Cha)R, 특히 DAEFRWP, DNEFRSP, SAEFRTQ, SAEFRAT, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP, SSEFRVS, DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, SLEFRF, GPEFRW 또는 GKEFRT.

본 발명에 따른 화합물(미모토프)는 바람직한 5 내지 15개의 아미노산 길이를 지닌다. 이러한 화합물은 분리된 (펩티드) 형태로 백신에 제공되거나, 약제학적 담체 물질 또는 폴리펩티드, 지질 또는 탄수화물 구조물과 같이 다른 분자에 착화되거나 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 미모토프는 (최소) 길이가 5 내지 15, 6 내지 12개, 특히 9 내지 11의 아미노산 잔기이다. 그러나, 이러한 미모토프는 비특이적 링커 또는 담체, 특히 펩티드 링커 또는 단백질 담체에 (공유 또는 비공유적으로) 커플링될 수 있다. 추가로, 상기 펩티드 링커 또는 단백질 담체는 T 세포 헬퍼 에피토프로 구성되거나 함유할 수 있다.

바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체는 KLH, 파상풍 독소, 알부민 결합 단백질, 우태아 혈청, 덴드리머(MAP; Biol. Chem. 358:581) 뿐만 아니라 문헌(Singh et al., Nat. Biotech. 17(1999), 1075-1081(특히 본 서류의 표 1에 기재된 것들), 및 O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9)(2003), 727-735(특히, 고유 면역 유효화 화합물 및 여기서 개시된 전달 시스템))에 개시된 애주번트 물질, 및 이들의 혼합물이다. 추가로, 백신 조성물은 수산화알루미늄을 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물(미모토프) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신은 임의의 적합한 투여 형태, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 비강내, 경우, 피하 등에 의해, 그리고 임의의 적합한 전달 기구로 투여될 수 있다[참조: O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9)(2003), 727-735]. 일반적으로, 백신은 본 발명에 따른 화합물을 0.1ng 내지 10mg, 바람직하게는 10ng 내지 1mg, 특히 100ng 내지 100㎍, 또는 다르게는 예를 들어 100fmol 내지 10μmol, 바람직하게는 10pmol 내지 1μmol, 특히 100pmol 내지 100nmol의 양으로 함유한다. 또한, 백신은 일반적인 보조 물질, 예를 들어, 완충제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 적합한 5량체의 분리는 5개의 아미노산 변수를 지닌 라이브러리에 적합한, 상기 기재된 방식으로 달성될 수 있으며, 바람직하게는, 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 변수 X₁ 내지 X₅을 지닌 라이브러리를 스크리닝하므로써, 또는 6량체-라이브러리에서 스크리닝된 포지티브 구성원에서의 적합한 5량체를 확인하므로써 수행될 수 있다(상기 참조). 또한, 동일한 방식으로, 7량체, 8량체, 9량체, 10량체 ...... 라이브러리가 이에 따라 본 발명의 항체-타입에 결합하는 적합한 서열에 대해 스크리닝하는 데 적용될 수 있다. 이러한 보다 긴 서열의 적합한 항체-결합 단편은 예를 들어, 본 발명의 항체에 결합하기 위한 5, 6, 7, 8, 9, ...개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 이들 단편을 시험함으로써 발견될 수 있다.

이러한 방법은 본 발명에 따른 Aβ 미모토프를 제공하기에 성공적인 것으로 밝혀졌다.

바람직하게는, 상기 펩티드는 상기 라이브러이에 개별화된 형태로, 특히 예를 들어 멀티핀(MULTIPIN)™ 펩티드 기술로 가능한 것과 같은 단단한 표면 상에 고정되어 제공된다. 또한, 상기 라이브러리는 펩티드 혼합물로서 제공될 수 있으며, 항체:펩티드 복합물은 항체 결합 후에 분리될 수 있다. 다르게는, 항체는 고정될 수 있고, 이후 펩티드 라이브러리(현탁액 또는 용액으로)가 고정된 항체와 접촉한다.

바람직하게는, 스크리닝 항체(또는 펩티드 라이브러리의 구성원)는 항체 또는 라이브러리의 펩티드에 결합된 경우의 항체:펩티드 복합물의 검출 또는 분리를 가능하게 하는 적합한 마커를 포함한다. 적합한 마커 시스템(예를 들어, 비오티닐화, 형광, 방사선활성, 자성 마커, 색상 전개 마커, 제 2 항체)은 당업자들에게 용이하게 입수될 수 있다.

라이브러리는 천연 Aβ 서열(예를 들어, DAEFRH)을 제외시키고 구성되어야 하는 데, 그 이유는 이러한 서열에 의한 백신화는 본 발명에서 명백히 제외되기 때문이다.

본 발명에 따른 에피토프를 분리시키는 추가의 적합한 방법은 예를 들어, WO 03/020750에 기술된 바와 같은 파지-펩티드 라이브러리에서 스크리닝하는 것이다.

또한, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 (임의로 단일 유효 성분으로서) 안티 N-말단 Aβ42-항체-결합 펩티드(또는 특정 바람직한 경우에, 이러한 항원을 포함하는 보다 큰 분자(예를 들어, 담체 또는 전달 분자에 결합된 펩티드))를 포함하는 조성물, 바람직하게는 이러한 항원을 포함하는 알츠하이머 질환에 대한 백신에 관한 것이다. 적합한 항원으로는 DAEFRWP, DNEFRSP, GSEFRDY, GAEFRFT, SAEFRTQ, SAEFRAT, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP, SSEFRVS, DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, SLEFRF, GPEFRW, GKEFRT, AYEFRH, DKE(Nle)R, DKE(Nva)R 또는 DKE(Cha)R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 또한, 이러한 펩티드는 약제 조성물의 제조에, 특히 AD 백신의 제조에 사용되기에 특히 적합한 본 발명에 제시된 그 밖의 펩티드이다. 이러한 서열은 완전히 합성 Aβ-미모토프이다. 이들 펩티드는 백신화를 목적으로 하여 적합한 담체에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 커플링될 수 있으며, 그 밖의 화합물 또는 부분, 예를 들어, 애주번트, 펩티드 또는 단백질 담체 등과 함께 펩티드 화합물 또는 복합물로서 제공되어 적합한 방식으로 투여될 수 있다[참조예: O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9)(2003), 727-735].

본 발명은 하기 실시예 및 도면에서 추가로 기술될 것이나, 이로 제한되지 않아야 한다.

도 1은 본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 라이브러리 4의 개별화된 펩티드 구성원을 나타낸 것이다.

도 2는 DAEFRH에 대한 미모토프로의 억제 검정을 도시한 것이다.

도 3은 DAEFRH에 대한 다른 미모토프로의 또다른 억제 검정을 도시한 것이다.

도 4 및 5는 본 발명에 따른 미모토프 펩티드로 수행된 억제 검정의 결과를 도시한 것이다.

도 6 내지 9는 각각의 미모토프 펩티드, 4011-4018, 4019-4025, 4031-4038 및 4061-4064로 수행된 억제 검정의 결과를 도시한 것이다.

1. 유리 N-말단(N-말단에 유리 아스파르트산)을 지닌 Aβ42 유래된 펩티드 종을 검출하기 위한 모노클론성 항체(mAb)의 일반화

마우스를, CFA(최초 주입) 및 IFA(부스터 주입) 중에 에멀젼화된 단백질 우태아 혈청 알부민 BSA(합텐-담체-효과를 이용하기 위해)에 결합된 6량체 펩티드 DAEFRH(천연 N-말단 Aβ42 서열)로 백신화시켰다. DAEFRH-펩티드 특이적 항체 생성 하이브리도마를 ELISA(DAEFRH-펩티드 코팅된 ELISA 플레이트)에 의해 검출하였다. 펩티드 SEVKMDAEFRH(Aβ42 유래된 서열 DAEFRH를 함유하는, APP 유래된 천연 N-말단 연장된 서열)이 네가티브 대조군 펩티드로서 사용되었다: 연장된 펩티드를 인식하는 하이브리도마는, N-말단에 유리 아스파르트산을 지닌 Aβ42 유래된 펩티드와 유리 아스파르트산이 없는 APP 유래된 펩티드 DAEFRH 사이를 구분하지 못하기 때문에 제외된다.

2.: 펩티드 라이브러리의 구성:

본 발명의 미모토프는 라인케(Reinke, 2000) 등의 방법을 적용함으로써 아미노-말단 아스파르트산을 지닌 Aβ종에 특이적인 항체(바람직하게는 모노클론성 항체)에 결합하기 위한 펩티드 라이브러리를 스크리닝하므로써 발견되었다. 또 다른 방법은 멀티핀™ 펩티드 기술로서 통상적으로 입수할 수 있다.

멀티핀™ 펩티드 기술은 다수의 생물학적 검정에 대해 사용되는 표준 8 x 12 마이크로역가 플레이트에 적합한 포맷으로 블록 상에 구비된 특이적으로 제조된 폴리에틸렌 핀 상에서 펩티드를 합성하는 것을 포함한다. 핀 결합된 펩티드(핀에 공유 결합된 태로 존재하는 비분해성 펩티드) 및 액상 펩티드(핀 표면으로부터 제거된 펩티드) 둘 모두가 이러한 방법에 의해 생성될 수 있다. 멀티핀 합성 시스템에 근거하는 펩셋(PepSet)은 다수의 펩티드를 동시에 합성하고 스크리닝할 수 있게 한다.

펩셋은 96개의 개별적으로 합성된 펩티드의 블록으로 구성되며, 이 중 두개는 신중하게 선택되는 대조군 서열이다. 분해된 대조군은 역상 HPLC에 의해 순도가 평가되고, 펩티드 함량이 아미노산 분석에 의해 정량화된다. 포지티브 및 네가티브 비분해성 대조군은 표준 ELISA 기술에 의해 평가된다.

펩셋 펩티드는 아세틸화, 비오티닐화, 포스포릴화 및 고리화를 포함하는 다양한 화학적 변형으로 입수할 수 있다. 액상(분리된) 펩티드는 동결건조된 분말로 서 선적된다.

액상 펩티드의 제조를 위해, 의도되는 펩티드 적용에 따라 산 및 아미드를 포함하는 C-말단이 선택된다. 분해성 결합은 C-말단 아미노산의 사전형성된 에스테르 유도체로서, 또는 "링크(Rink)" 아미드 링커로 핀 표면 상에 혼입된다. 산 또는 아미드 말단기를 지닌 펩티드는 이후 핀 결합된 펩티드를 강산으로 처리하므로써 방출된다. 합성 규모에 대한 선택사항은 공칭값 1 마이크로몰 또는 5 마이크로몰 규모이다. 소수성 및 분해 효능과 같은 인자는 펩티드 회수율에 영향을 미치며, 따라서 예상된 펩티드 수율은 펩티드가 공칭값 1 마이크로몰 규모에 대해 합성되는 경우 0.5 내지 1 마이크로몰(15량체 펩티드의 대략 1mg), 또는 공칭값 5 마이크로몰 규모로 합성된 펩티드에 대해 2.5 내지 5마이크로몰의 수율이다.

비분해성 펩티드는 핀에 공유적으로 결합되어 남아있어, ELISA 기술을 사용하여 목적하는 펩티드를 신속하게 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이러한 펩티드는 항체 에피토프 스캐닝 및 구조-활성 관계(SAR) 연구를 위해 유용하다. 결합된 항체 또는 다른 단백질의 분리는 펩티드를 재생성하여, 추가 검정에서 다시 사용할 수 있도록 한다. 펩셋은 단백질 서열을 통한 스캐닝으로부터 생물학적으로 흥미로운 펩티드 선도물질의 확인, 펩티드 선도물질의 최적화, 및 새로운 유사체 생성 개발을 포함하는 다양한 적용에 사용된다. 스크리닝 절차에 사용되는 전반적인 전략에 있어서 융통성은 선도 후보물질을 완전히 특징화하는 체계화된 방법을 함께 제공하는 다양한 합성 설계를 사용하므로써 크게 개선된다.

체계화된(systematic) 펩티드 셋으로부터 얻은 포괄적인 결과는 목적하는 펩티드를 확인하는 것뿐만 아니라 중요한 잔기, 이들의 치환성 및 최적의 펩티드 길이를 나타낸다. 결과적으로, 관련된 펩티드의 범위가 이러한 결과치에 따라 등급화될 수 있다. L-아미노산의 D-아미노산 및 다른 특이적인 잔기로의 치환은 펩티드의 구조 및 형태를 조작하는 유력한 방법이다. 또한, 이러한 방법은 증가된 안정성을 갖는 길항제 및 펩티드와 같은 상이한 약리학적 특성을 지닌 새로운 유사체를 발견하는 신속한 방법이다.

공지된 단백질 서열로 시작하는 경우, 모든 순차적인 항체 에피토프는 멀티핀 방법을 사용하여 맵핑(mapping)될 수 있다. 순차적인 B 세포 에피토프를 맵핑하기 위한 몇몇의 또 다른 절차가 가능하다. 이러한 절차는 핀 결합된 펩티드, 마이크로역가 플레이트 상에 직접적으로 코팅된 액상 펩티드 및 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptabidin)으로 미리 코팅된 마이크로역가 플레이트 상에 포획된 비오티닐화된 펩티드를 포함한다.

그러나, 본 실시예에서, 실시예 1에 기술된 항체는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용되나, 존슨-우드 등(1997)에 의해 기술된 바와 같은 Aβ서열의 천연 N-말단 연장된 서열(예를 들어, MDAEFRH, KMDAEFRH, SEVKMDAEFRH 또는 완전한 아밀로이드(전구) 단백질, AAP)을 제외한 DAEFRH 서열을 특이적으로 인식하는 항체 제제도 사용된다.

4개의 라이브러리가 이러한 목적으로 구성되었다:

2.1.: 라이브러리 1: 본 6량체 라이브러리는 하기 서열(아미노산 위치 1 내지 6)을 지닌 펩티드를 함유한다:

위치 1: D, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 2: A, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 3: E, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 4: F, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 5: R, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 6: H, K, C 및 P를 제외한 모든 천연 아미노산 (16개 가능)

라이브러리 1은 헥사펩티드의 혼합물이다. 이론적으로, 17개의 상이한 아미노산을 함유하는 모든 가능한 펩티드(하기 참조)가 포함된다. 이러한 혼합물은 임의의 리신 및 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 추가로, 이러한 혼합물은

특이적 위치 1에서 아스파르트산을,

특이적 위치 2에서 알라닌을,

특이적 위치 3에서 글루탐산을,

특이적 위치 4에서 페닐알라닌을,

특이적 위치 5에서 아르기닌을, 그리고,

특이적 위치 6에서 히스티틴을 함유하지 않는다.

상기 합성은 0.25mmol의 합성 규모로, 패스트모크(FastMoc) 프로토콜을 따라 어플라이드 바이오시스템즈-431A-신디사이저(Applied Biosystems 431A-Synthesizer)에서 수행하였다.

합성은 모든 목적하는 아미노산(보호된 아미노기 및 측쇄)의 1mmol을 칭량하여 개시하였다. 이후, Asn, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val의 혼합물이 생성되었다. 위치 특이적인 하기 아미노산을 첨가하였다:

Ala, Glu, Phe, Arg, His(위치/혼합물 1),

Asp, Glu, Phe, Arg, His(위치/혼합물 2),

Asp, Ala, Phe, Arg, His(위치/혼합물 3),

Asp, Ala, Glu, Arg, His(위치/혼합물 4),

Asp, Ala, Glu, Phe, His(위치/혼합물 5), 및

Asp, Ala, Glu, Phe, Arg(위치/혼합물 6, Pro 없이).

하기 혼합물 6을 수지(2-클로로-트리틸클로라이드 수지, 1.49mmol/g, 알렉시스 저머니(Alexis Germany))를 로딩하는 데 사용하였다:

1mmol 아미노산 잔기 혼합물 6

611mg의 수지( = 0.91mmol 반응성 기)

15ml의 디클로로메탄

5.5 당량 = 5mmol 디이소프로필에틸아민 (871㎕)

혼합물을 1시간 동안 플라스크 안에서 진탕시켰다. 이후, 1ml의 메탄올을 첨가하고, 혼합물을 추가의 10분 동안 진탕시켰다. 로딩된 수지를 프릿(frit)을 통해 추출하고, 디메틸포름아미드, 디클로르메탄, 이소프로판올, 메탄올, 및 에테르(각각 30ml)로 2회 세척하였다. 고진공 하에서 밤새 건조를 수행하였다. 칭량된 양은 737mg이었다.

5.66mg의 분취액을 DMF 중의 20% 피페리딘 1ml로 30분 동안 처리하여 수지의 밀도를 정하였다. 이후, 이 혼합물을 원심분리하였다. 유리 Fmoc 보호기를 상청액 중에서 광도계로 측정하였다(301nm, 소멸 계수 = 7800 M (e-1)). 이에 따르면, 수지의 밀도는 0.49mmol/g이었다.

하기 모든 단계를 그 밖의 혼합물(5가지 상이한 카트리지에 두었음)을 사용하여 신써사이저에서 수행하였다. 515mg의 로딩된 수지를 사용하였다(0.25mmol에 상응함: 아미노산 혼합물은 4배 과량으로 사용하였음). N-말단 Fmoc 보호기를 합성 말기에 분리시켰다. 에탄올로 세척하고, 밤새 건조시킨 후, TFA/H₂O(95:5, v:v)에 의해 수지로부터 펩티드를 분리하였다. TFA 용액을 스피드 백(Speed Vac)에서 1/5 부피로 농축시키고, 침전시키고, 디에틸에테르로 세척하고 동결건조시켰다.

6량체 펩티드 EIDYHR, ELDYHR, 및 EVDYHR이 상기 실시예 1에 따라 생성된 모노클론성 항체에 의해 검출될 수 있는 미모토프에 대한 예이다.

2.2. : 라이브러리 2 : 본 6량체 라이브러리는 하기 서열(아미노산 위치 1 내지 6)을 지닌 펩티드를 함유한다:

위치 1: D (고정됨)

위치 2: A, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 3: E, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 4: F, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 5: R, K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

위치 6: H, K, C 및 P를 제외한 모든 천연 아미노산 (16개 가능)

펩티드 라이브러리 2를 라이브러리 1에 대해 상기 기술된 방법(2.1)에 따라 구성하였다.

6량체 펩티드 DIDYHR, DLDYHR, 및 DVDYHR이 상기 1.에 따라 생성된 모노클론성 항체에 의해 검출될 수 있는 미모토프의 예이다.

2.3.: 라이브러리 3: 제 3 펩티드 라이브러리를 추가의 방법에 사용하여 미모토프 서열을 규정하였다. 이 라이브러리는 기원 서열을 함유하여 기원 에피토프에 대해 보다 밀접하게 관련된 미모토프를 검출할 수 있도록 한다.

이러한 6량체 라이브러리는 하기 서열(아미노산 위치 1 내지 6)을 지닌 펩티드를 함유한다:

위치 1: K 및 C를 제 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 2: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 3: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 4: K 외한및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 5: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 6: K, C 및 P를 제외한 모든 천연 아미노산 (17개 가능)

펩티드 라이브러리 3을 라이브러리 1에 대해 상기 기술된 방법(2.1)에 따라 구성하였다.

6량체 펩티드, DIDYRR, DLDYRR, 및 DVDYRR은 상기 1(위치 1에서 D 및 위치 5에서 R은 기원 에피토프와 동일함)에 따라 생성된 모노클론성 항체에 의해 검출된다.

2.4.: 라이브러리 4: 본 펩티드 라이브러리 4는 5 x 18 = 90개의 펩티드로 구성되며, 미모토프스 엘티디.(Mimotopes Ltd.)(프랑스 파리 소재; 제조업자의 안내서 참조)로부터 구입할 수 있으며, 천연 N-말단 Aβ42 서열 DAEFRH에 따라 설계되었다.

위치 1: D (고정됨)

위치 2: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 3: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 4: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 5: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

위치 6: K 및 C를 제외한 모든 천연 아미노산 (18개 가능)

라이브러리 4의 개별화된 펩티드 구성원이 도 1에 도시된다. 펩티드 번호 1, 24, 48, 56 및 80은 Aβ42 N-말단 서열의 기원 서열을 지닌다. 그 밖의 모든 펩티드는 DAEFRH 결합 항체에 대한 결합 능력에 대해 시험된 후보 펩티드이다.

2.5. : 펩티드 라이브러리에 의한 ELISA:

상기 언급된 바와 같이, 펩티드 라이브러리 1, 2 및 3은 전통적인 Fmoc-화학방법에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 431A 펩티드 신써사이저로 생성되었다. 구입가능한 펩티드 라이브러리 4는 제조업자의 설명에 따라 생성되었다(상기 참조 및 www.mimotopes.com 참조). 90개의 펩티드가 핀에 C-말단으로 결합되었다.

펩티드 라이브러리 각각에 의한 ELISA를 하기 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.

펩티드 라이브러리를 100% DMSO에 용해시켰다(최종 농도 10mg/ml).

펩티드 용액을 추가로 PBS로 희석시켰다.

펩티드 혼합물을 500㎍/웰로 출발하여 ELISA 플레이트(눈크 막시소르프(Nunc Maxisorp), Germany) 상으로 밤새 (4℃) 코팅시키고, 100ng/웰로 적정하였다.

상기 플레이트를 PBS/트윈(Tween) 20(0.1% v/v)로 3회 세척하였다.

상기 플레이트를 PBS/BSA로 블록킹하였다(실온에서 2시간).

상기 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하였다.

상기 플레이트를 실온에서 4시간 동안 비오티닐화된 DAEFRH 특이적 mAb(PBS 중의 10㎍/ml)와 함께 인큐베이팅시켰다.

상기 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하였다.

상기 플레이트를 스트렙타비딘-양고추냉이-퍼옥시다제와 함께 인큐베이팅시켰다(실온에서 30분).

상기 플레이트를 PBS/트윈으로 5회 세척하였다.

상기 플레이트를 ABTS + H₂O₂(0.1% w/v; 10 내지 45분)와 함께 인큐베이팅시키고, 반응을 시트르산으로 중단시키고, 광도계 평가를 수행하였다(파장 405nm).

3.: 억제 검정에 의한 미모토프의 검증

3.1. 추가의 라이브러리

상기 기술된 4개의 라이브러리(2.1, 2.2, 2.3, 및 2.4 참조) 이외에, 제 5 라이브러리를 사용하여 미모토프 서열을 규정하였다. 이러한 6량체 라이브러리는 EMC 마이크로콜렉션스(EMC microcollections)(Tuebingen Germany)에서 구입할 수 있으며, 114개의 상이한 헥사펩티드 혼합물을 함유하며, 각 혼합물당 어느 한 위치는 C를 제외한 모든 천연 아미노산(19개 가능) 중 어느 하나로 규정되며, 나머지 5개의 위치는 변수이다.

혼합물 01 내지 06(한 위치는 고정됨, 알라닌 A, 나머지 5개는 변수, X임):

혼합물 01: AXXXXX

혼합물 02: XAXXXX

혼합물 03: XXAXXX

혼합물 04: XXXAXX

혼합물 05: XXXXAX

혼합물 06: XXXXXA

혼합물 07 내지 12(한 위치는 고정됨, 아르기닌 R, 나머지 5개는 변수, X임):

혼합물 07: RXXXXX

혼합물 08: XRXXXX

혼합물 09: XXRXXX

혼합물 10: XXXRXX

혼합물 11: XXXXRX

혼합물 12: XXXXXR

따라서, 혼합물 13 내지 114는 C 제외한 모든 천연 아미노산을 이용하여 설 계된다.

3.2. 억제 검정

도 2 및 3은 5개의 라이브러리(상기 기술됨)내 포함되거나 이로부터 수득된 미모토프 펩티드로 수행된 억제 검정 결과를 나타낸 것이다. 미모토프 펩티드는 모노클론성 항체에 의한 인식을 위해 기원 에피토프와 경쟁한다. 기원 에피토프 및 미모토프 펩티드는 단백질 담체에 커플링되기 위해(경우에 따라) C-말단에 추가의 C를 함유한다.

하기 펩티드가 사용된다;

펩티드 1737 DAEFRH

펩티드 3001 DKELRI

펩티드 3002 DWELRI

펩티드 3003 YREFFI

펩티드 3004 YREFRI

펩티드 3005 YAEFRG

펩티드 3006 EAEFRG

펩티드 3007 DYEFRG

펩티드 3008 ELEFRG

펩티드 3009 SFEFRG

펩티드 3010 DISFRG

펩티드 3011 DIGWRG

절차:

ELISA 플레이트(눈크 맥시소르프)를 0.1㎍/ml 펩티드-BSA(100㎕/웰, 12시간, 4℃)의 농도에서 기원 펩티드 에피토프 DAEFRH(C에 의해 C-말단 연장되고, 우혈청 알부민 BSA에 커플링됨)로 코팅시켰다. PBS-BSA 1%(200㎕/웰, 12시간, 4℃)로 블록킹시킨 후, 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하였다. 이후, 비오티닐화된 모노클론성 항체(1:2000, 50㎕/웰) 및 펩티드(50㎕/웰)를 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 및 0.0005㎍/ml로 20분 동안 37℃에서 첨가하였다. 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 표지된 스트렙타비딘(100㎕/웰, 30분, 실온)과 함께 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 PBS/트윈으로 5회 세척하고, ABTS + H₂O₂(0.1% w/v, 10 내지 45분)과 함께 인큐베이팅시키고, 반응을 시트르산으로 중단시킨 후, 광도계 분석을 수행하였다(파장 405nm).

도 2로 예상되고, 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 BSA 커플링된 플레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 경합하고, 이에 따라 모노클론성 항체에 의한 인식을 억제한다. 추가로, 펩티드 3003은 모노클론성 항체의 기원 에피토프로의 결합을 억제할 수 없는 것으로 보여진다. 대조적으로, 펩티드, 3001, 3002, 3004, 3005, 3006 및 3007(상이한 정도로)은 에피토프 인식을 블록킹한다. 펩티드 3004는 고농도 (50㎕/웰)에서 억제를 나타낼 뿐인 반면, 펩티드 3001, 3006, 및 3007은 0.5㎍/ml 미만의 IC₅₀을 갖는 강력한 억제성을 갖는다. 펩티드 3002 및 3005는 0.5㎍/ml 초과의 IC₅₀을 갖는 "중간정도"의 억제제이다.

도 3으로 예상되고, 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 추가로 수행되는 독립적인 실험에서 모노클론성 항체 인식을 위한 BSA 커플링된, 플레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 성공적으로 경합할 수 있다. 추가로, 펩티드 3010 및 3011은 시험된 농도에서 억제를 나타내지 않으나, 펩티드 3008 및 3009는 5㎍/ml 미만의 IC₅₀을 갖는 (비교적) 약한 억제제임을 보여준다.

표 1은 라이브러리(상기 기술된 바와 같음)에 포함되거나 이로부터 얻어지는 미모토프의 억제 능력을 간략하게 요약한 것이다.

표 1: 미모토프의 억제 능력:

펩티드 3001 DKELRI 강함

펩티드 3002 DWELRI 중간

펩티드 3003 YREFFI 없음

펩티드 3004 YREFRI 약함

펩티드 3005 YAEFRG 중간

펩티드 3006 EAEFRG 강함

펩티드 3007 DYEFRG 강함

펩티드 3008 ELEFRG 약함

펩티드 3009 SFEFRG 약함

펩티드 3010 DISFRG 없음

펩티드 3011 DIGWRG 없음

4. 본 발명에 따라 스크리닝된 추가의 미모토프에 대한 억제 검정

억제 검정

도 4 및 5는 5개의 라이브러리(상기 기술됨)에 포함되거나 이로부터 얻어진 미모토프 펩티드로 수행된 억제 검정의 결과를 나타낸다. 미모토프 펩티드는 모노클론성 항체에 의한 인식을 위해 기원 에피토프와 경합한다. 기원 에피토프 및 미모토프 펩티드는 단백질 담체에 커플링되기 위해 C-말단(위치 7)에서 추가의 C를 함유한다.

하기 펩티드가 사용된다.

펩티드 1737 DAEFRH(기원 에피토프 + C)

펩티드 1234 KKELRI

펩티드 1235 DRELRI

펩티드 1236 DKELKI

펩티드 1237 DRELKI

펩티드 1238 DKELR

펩티드 1239 EYEFRG

펩티드 1241 DWEFRDA

펩티드 4002 SWEFRT

펩티드 4003 GREFRN

펩티드 4004 WHWSWR

절차:

ELISA 플레이트(눈크 맥시소르프)를 0.1㎍/ml 펩티드-BSA(100㎕/웰, 12시간, 4℃)의 농도에서 기원 펩티드 에피토프 DAEFRH(C에 의해 C-말단 연장되고, 우혈청 알부민 BSA에 커플링됨)로 코팅시켰다. PBS-BSA 1%(200㎕/웰, 12시간, 4℃)로 블록킹시킨 후, 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하였다. 이후, 비오티닐화된 모노클론성 항체(1:2000, 50㎕/웰) 및 펩티드(50㎕/웰)를 상이한 농도에서 20분 동안 37℃에서 첨가하였다. 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 표지된 스트렙타비딘(100㎕/웰, 30분, 실온)과 함께 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 PBS/트윈으로 5회 세척하고, ABTS + H₂O₂(0.1% w/v, 10 내지 45분)와 함께 인큐베이팅시키고, 반응을 시트르산으로 중단시킨 후, 광도계 분석을 수행하였다(파장 405nm).

도 4로 예상되고, 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 BSA 커플링된 플레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 경합하고, 이에 따라 모노클론성 항체에 의한 인식을 억제할 수 있다. 추가로, 펩티드 4004는 기원 에피토프로의 모노클론성 항체의 결합을 억제할 수 없는 것으로 보여진다. 대조적으로, 펩티드 4002 및 4003(상이한 정도로)는 에피토프 인식을 블록킹한다. 펩티드 4003은 비교적 고농도 (10㎕/웰)에서 억제를 나타낼 뿐인 반면, 펩티드 4002는 0.4㎍/ml 미만의 IC₅₀을 갖는 강력한 억제성을 나타낸다.

도 5로 예상되고, 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 추가로 수행되는 독립적인 실험에서 모노클론성 항체 인식을 위한 BSA 커플링된, 플레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 성공적으로 경합할 수 있다. 추가로, 펩티드 1234는 시험된 농도에서 억제를 거의 나타내지 않으나, 펩티드 1235, 1236, 1237, 1238, 1239 및 1241(상이한 정도로) 에피토프 인식을 블록킹하는 것으로 보여진다. 펩티드 1235, 1238 및 1241은 0.5㎍/ml 미만의 IC₅₀을 갖는 강한 억제제인 반면, 펩티드 1236 및 1237은 5㎍/ml 초과의 IC₅₀을 갖는 (비교적) 약한 억제제이다. 펩티드 1239는 0.5㎍/ml 초과의 IC₅₀을 갖는 중간정도의 억제제이다.

표 2는 라이브러리(상기 기술된 바와 같음)에 포함되거나 이로부터 얻어진 미모토프의 억제 능력을 간단히 요약한 것이다.

표 2: 미모토프의 억제 능력:

펩티드 1234 KKELRI 없음

펩티드 1235 DRELRI 강함

펩티드 1236 DKELKI 약함

펩티드 1237 DRELKI 약함

펩티드 1238 DKELR 강함

펩티드 1239 EYEFRG 중간

펩티드 1241 DWEFRDA 강함

펩티드 4002 SWEFRT 강함

펩티드 4003 GREFRN 약함

펩티드 4004 WHWSWR 없음

도 4 및 5에서 제시된 결과는, 다양한 6량체 펩티드(본 실시예 및 이전의 실시예에서 보여진 것과 같음) 이외에, 5량체 펩티드(즉, 펩티드 1238 DKELR) 및 7량체 펩티드(즉, 펩티드 1241 DWEFRDA)는 미모토프 기재 알츠하이머 백신에서 에피토프로서 사용될 수 있음을 보여준다.

5. 스크리닝을 위한 독립된 신규 과정

라이브러리:

미모토프는 5 내지 15개의 아미노산의 바람직한 길이를 갖는다. 두개의 상이한 라이브러리를 ELISA 검정에 사용하여 미모토프 서열을 규정하였다.

라이브러리 1: 본 6량체 라이브러리는 하기 서열(아미노산 위치 1 내지 6)을 지닌 펩티드를 함유한다:

위치 1: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 2: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 3: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 4: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 5: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 6: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

라이브러리 2: 본 7량체 라이브러리는 하기 서열(아미노산 위치 1 내지 7)을 지닌 펩티드를 함유한다:

위치 1: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 2: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 3: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 4: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 5: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 6: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

위치 7: C를 제외한 모든 천연 아미노산 (19개 가능)

억제 검정

도 6 내지 8은 2개의 라이브러리(상기 기술된 바와 같음)에 포함되거나 이로부터 얻어진 미모토프 펩티드로 수행된 억제 검정의 결과를 도시한 것이다. 미모토프 펩티드는 모노클론성 항체에 의한 인식을 위해 기원 에피토프와 경합한다. 기원 에피토프 및 미모토프 펩티드는 단백질 담체에 커플링되기 위해(경우에 따라) C-말단(각각 위치 7 또는 위치 8)에 추가의 C를 함유한다.

하기 펩티드가 사용된다:

펩티드 1737 DAEFRH 기원 에피토프

펩티드 4011 DAEFRWP 7량체 s

펩티드 4012 DNEFRSP 7량체 s

펩티드 4013 GSEFRDY 7량체 m

펩티드 4014 GAEFRFT 7량체 m

펩티드 4015 SAEFRTQ 7량체 s

펩티드 4016 SAEFRAT 7량체 s

펩티드 4017 SWEFRNP 7량체 s

펩티드 4018 SWEFRLY 7량체 s

펩티드 4019 SWFRNP 6량체 -

펩티드 4020 SWELRQA 7량체 s

펩티드 4021 SVEFRYH 7량체 s

펩티드 4022 SYEFRHH 7량체 s

펩티드 4023 SQEFRTP 7량체 s

펩티드 4024 SSEFRVS 7량체 s

펩티드 4025 DWEFRD 6량체 s

펩티드 4031 DAELRY 6량체 s

펩티드 4032 DWELRQ 6량체 s

펩티드 4033 SLEFRF 6량체 s

펩티드 4034 GPEFRW 6량체 s

펩티드 4035 GKEFRT 6량체 s

펩티드 4036 AYEFRH 6량체 m

펩티드 4037 VPTSALA 7량체 -

펩티드 4038 ATYAYWN 7량체 -

추가로, 하기 5량체 펩티드(비천연 아미노산을 지님)가 억제 검정에 사용된다:

펩티드 4061 DKE(tBuGly)R 5량체 -

펩티드 4062 DKE(Nle)R 5량체 m

펩티드 4063 DKE(Nva)R 5량체 m

펩티드 4064 DKE(Cha)R 5량체 m

(s: 강한 억제, m: 중간 억제; -: 억제 없음)

절차:

도 6(펩티드 4011-4018을 나타냄)으로 예상되고, 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 BSA 커플링된 플레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 경합할 수 있고, 이에 따라 모노클론성 항체에 의한 인식을 억제한다. 추가로, 펩티드 4012 DNEFRSP, 4013 GSEFRDY, 및 4014 GAEFRFT는 기원 에피토프로의 모노클론성 항체의 결합을 중간정도로 억제할 수 있는 것으로 보여진다. 대조적으로, 펩티드 4011 DAEFRWP, 4015 SAEFRTQ, 4016 SAEFRAT, 4017 SWEFRNP 및 4018 SWEFRLY(상이한 정도로)는 에프토프 인식을 강력하게 블록킹한다.

도 7(펩티드 4019-4025를 나타냄)로 예상되고, 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 추가로 수행되는 독립적인 실험에서 모노클론성 항체 인식을 위한 BSA 커플링된, 플레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 성공적으로 경합할 수 있다. 추가로, 펩티드 4019 SWFRNP는 시험된 농도에서 억제를 거의 나타내지 않는 반면, 펩티드 4020 SWELRQA, 4021 SVEFRYH, 4022 SYEFRHH, 4023 SQEFRTP, 4024 SSERFVS 및 4025 DWEFRD는 (상이한 정도로) 에피토프 인식을 블록킹하는 것으로 보여준다. 펩티드 4021, 4022, 4023, 4024 및 4025는 0.5㎍/ml 미만의 IC₅₀을 갖는 강한 억제제인 반면, 펩티드 4020은 0.5㎍/ml 초과의 IC₅₀을 갖는 중간정도의 억제제이다.

도 8(펩티드 4031-4038)로 예상되고, 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 세번째 독립적인 실험에서 모노클론성 항체 인식을 위한 BSA 커플링된 플 레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 성공적으로 경합할 수 있다. 추가로, 펩티드 4037 VPTSALA 및 4038 ATYAYWN은 시험된 농도에서 억제를 거의 나타내지 않는 반면, 펩티드 4031 DAELRY, 4032 DWELRQ, 4033 SLEFRF, 4034 GPEFRW, 4035 GKEFRT 및 4036 AYEFRH는 (상이한 정도로) 에피토프 인식을 블록킹하는 것으로 보여진다. 펩티드 4031, 4032, 4033, 4034 및 4035는 0.5㎍/ml 미만의 IC₅₀을 갖는 비교적 강한 억제제인 반면, 펩티드 4036는 0.5㎍/ml 초과의 IC₅₀을 갖는 (비교적) 약한 억제제이다.

6. 규정된 5량체 펩티드: 비천연 아미노산에 의한 억제 검정

5량체 펩티드 1238 DKELR이 미모토프 기재 알츠하이머 백신에서 에피토프로서 사용될 수 있는 것으로 이미 밝혀졌다(참조: PCT/EP04/00162). 하기에서, 기원 5량체 에피토프의 아미노산은 비천연 아미노산으로 대체된다: L은 비천연 아미노산 tBuGly, Nle, NvA 또는 Cha로 대체된다.

도 9(펩티드 4061-4064 DKELR 변이체)로 예상되고, 제시되는 바와 같이, 펩티드 1737 DAEFRH는 네번째 독립적인 실험에서 모노클론성 항체 인식을 위한 BSA 커플링된 플레이트 결합된 펩티드 DAEFRH와 성공적으로 경합할 수 있다. 추가로, 펩티드 4061 DKE(tBuGly)R은 시험된 농도에서 억제를 나타내지 않는 것으로 보여진다. 흥미롭게도, 펩티드 4062 DKE(Nle)R, 4063 DKE((Nva)R, 및 4064 DKE(Cha)는 (상이한 정도로) 에피토프 인식을 블록킹하였다. 펩티드 4062, 4063 및 4064는 0.5㎍/ml 초과의 IC₅₀을 갖는 비교적 약한 억제제이다.

SEQUENCE LISTING <110> Mattner, Frank Schmidt, Walter <120> Method for preventing and treating Alzheimer's disease <130> r45797 <140> PCT/EP2005/053225 <141> 2005-07-06 <150> AT 1184/2004 <151> 2004-07-13 <160> 54 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 1 Glu Ile Asp Tyr His Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 2 Glu Leu Asp Tyr His Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 3 Glu Val Asp Tyr His Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 4 Asp Ile Asp Tyr His Arg 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 5 Asp Leu Asp Tyr His Arg 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 6 Asp Val Asp Tyr His Arg 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 7 Asp Ile Asp Tyr Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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Artificial <220> <223> Mimotope <400> 18 Asp Lys Glu Leu Lys Ile 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 19 Asp Arg Glu Leu Lys Ile 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 20 Gly Arg Glu Phe Arg Asn 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 21 Glu Tyr Glu Phe Arg Gly 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 22 Asp Trp Glu Phe Arg Asp Ala 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 23 Ser Trp Glu Phe Arg Thr 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 24 Asp Lys Glu Leu Arg 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mimotope <400> 25 Ser Phe Glu Phe Arg Gly 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 27 Asp Ala Glu Phe Arg Trp Pro 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 28 Asp Asn Glu Phe Arg Ser Pro 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 29 Gly Ser Glu Phe Arg Asp Tyr 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 30 Gly Ala Glu Phe Arg Phe Thr 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 31 Ser Ala Glu Phe Arg Thr Gln 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 32 Ser Ala Glu Phe Arg Ala Thr 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 33 Ser Trp Glu Phe Arg Asn Pro 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 34 Ser Trp Glu Phe Arg Leu Tyr 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 35 Ser Trp Glu Leu Arg Gln Ala 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 36 Ser Val Glu Phe Arg Tyr His 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 37 Ser Tyr Glu Phe Arg His His 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 38 Ser Gln Glu Phe Arg Thr Pro 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 39 Ser Ser Glu Phe Arg Val Ser 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 40 Asp Trp Glu Phe Arg Asp 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 41 Asp Ala Glu Leu Arg Tyr 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 42 Asp Trp Glu Leu Arg Gln 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 43 Ser Leu Glu Phe Arg Phe 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 44 Gly Pro Glu Phe Arg Trp 1 5 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 45 Gly Lys Glu Phe Arg Thr 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 46 Ala Tyr Glu Phe Arg His 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 47 Asp Lys Glu Xaa Arg 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 48 Asp Lys Glu Xaa Arg 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 49 Asp Lys Glu Xaa Arg 1 5 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 10 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mimotope <400> 51 Trp His Trp Ser Trp Arg 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mimotope <400> 52 Lys Lys Glu Leu Arg Ile 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> peptide <400> 53 Val Pro Thr Ser Ala Leu Ala 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> peptide <400> 54 Ala Thr Tyr Ala Tyr Trp Asn 1 5

Claims

알츠하이머 질환(AD)용 백신에 사용하기 위한,

(i) DAEFRWP, DNEFRSP, SAEFRTQ, SAEFRAT, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP 및 SSEFRVS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 7 내지 15개의 아미노산의 펩티드 화합물, 및

(ii) DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, SLEFRF, GPEFRW, GKEFRT 및 GKEFRT로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 6 내지 15개의 아미노산의 펩티드 화합물

로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 화합물로서, 상기 화합물이 약제학적으로 허용되는 담체에 커플링됨을 특징으로 하는 펩티드 화합물.
삭제
(i) DAEFRWP, DNEFRSP, SAEFRTQ, SAEFRAT, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP 및 SSEFRVS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 7 내지 15개의 아미노산의 펩티드 화합물, 및

(ii) DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, SLEFRF, GPEFRW, GKEFRT 및 GKEFRT로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 6 내지 15개의 아미노산의 펩티드 화합물

로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 화합물을 포함하는 알츠하이머 질환에 대한 백신.
제 3항에 있어서, 백신이 상기 화합물을 0.1ng 내지 10mg의 양으로 함유함을 특징으로 하는 백신.
제 3항에 있어서, 펩티드 화합물이 링커 또는 담체에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링됨을 특징으로 하는 백신.
제 5항에 있어서, 상기 선택된 펩티드가 C-말단에 추가의 시스테인 잔기, 및 상기 시스테인 잔기를 통해 상기 펩티드에 커플링되는 단백질 담체를 함유함을 특징으로 하는 백신.
제 6항에 있어서, 단백질 담체가 KLH임을 특징으로 하는 백신.
제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 수산화알루미늄을 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신.
삭제
제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 KLH임을 특징으로 하는 펩티드 화합물.
제 4항에 있어서, 백신이 상기 화합물을 10ng 내지 1mg의 양으로 함유함을 특징으로 하는 백신.
제 4항에 있어서, 백신이 상기 화합물을 100ng 내지 100㎍의 양으로 함유함을 특징으로 하는 백신.