KR101220635B1 - 신규한 항-ｉｇｆ-ｉｒ 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 인슐린-유사 성장인자 I 수용체 IGF-IR에 특이적으로 결합할 수 있으며 및/또는 상기 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있는 신규의 항체, 특히 마우스, 키메라 및 인간 기원의 모노클로날 항체는 물론 이들 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IGF-IR을 과발현하는 암 또는 상기 수용체의 과발현과 관련된 임의의 병리학의 예방 및/또는 치료용 약제로서는 물론, IGF-IR의 과발현과 관련된 질병의 진단 방법 또는 키트(kit)에서의 이들 항체의 용도를 포함한다. 그 외에 본 발명은 항-EGFR 항체 및/또는 항-VEGF 항체 및/또는 종양 진행 또는 전이와 관련된 다른 성장 인자에 대한 항체 및/또는 화합물 및/또는 항암제 또는 독소와 관련된 약제와 조합되는 이러한 항체들을 포함하는 생성물 및/또는 조성물, 및 특정한 암의 예방 및/또는 치료를 위한 그의 용도를 포함한다.

IGF-IR, 항체, 티로신 키나제 활성, 모노클로날 항체

Description

신규한 항-ＩＧＦ-ＩＲ 항체 및 그의 용도{NOVEL ANTI-ＩＧＦ-ＩＲ ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 인간 인슐린-유사 성장인자 I (insulin-like growth factor I) 수용체 IGF-IR에 특이적으로 결합할 수 있으며 및/또는 상기 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있는 신규의 항체, 특히 마우스, 키메라 및 인간 기원의 모노클로날 항체는 물론 이들 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IGF-IR을 과발현하는 암 또는 상기 수용체의 과발현과 관련된 임의의 병리학의 예방 및/또는 치료용 약제로서는 물론, IGF-IR의 과발현(overexpression)과 관련된 질병의 진단 방법 또는 키트(kit)에서의 이들 항체의 용도를 포함한다. 마지막으로, 본 발명은 항-EGFR 항체 및/또는 항-VEGF 항체 및/또는 종양 진행 또는 전이와 관련된 다른 성장 인자에 대한 항체 및/또는 화합물 및/또는 항암제 또는 독소와 결합된 약제와 조합되는 이러한 항체들을 포함하는 생성물 및/또는 조성물, 및 특정한 암의 예방 및/또는 치료를 위한 그의 용도를 포함한다.

IGF-IR로 불리우는 인슐린-유사 성장인자 I 수용체는 인슐린 수용체 IR과 70% 상동성(homology)을 갖는 티로신 키나제 활성으로 잘 알려진 수용체이다. IGF-IR은 약 350,000의 분자량을 갖는 당단백질이다.

이것은 이황화 가교(disulfide bridges)에 의해 각각 절반-연결된(half-linked) 헤테로-테트라머 수용체(hetero-tetrametric receptor)로서, 세포외 α-서브유닛과 막관통(transmembrane) β-서브유닛으로 구성된다. IGF-IR은 IGF1 및 IGF2에 매우 높은 친화성 (Kd#1 nM)으로 결합하지만, 100 내지 1000배 더 적은 친화성(affinity)으로 인슐린에 동등하게 결합할 수 있다. 역으로, IR은 인슐린에 매우 높은 친화성으로 결합하지만, IGF들은 오직 100배 더 적은 친화성으로 인슐린 수용체에 결합할 뿐이다. IGF-IR의 및 IR의 티로신 키나제 영역(domain)은 매우 높은 서열 상동성을 갖지만, 더 약한 상동성 영역들은 각각 α-서브유닛에 위치한 시스테인-풍부 부위(cysteine-rich region) 및 β-서브유닛의 C-말단부에 관한 것이다. α-서브유닛에서 관찰된 서열 차이는 리간드의 결합 영역(binding zone)에 위치하며, 따라서 IGF들 및 인슐린에 대한 IGF-IR과 IR의 각각의 상대 친화성의 원인이 된다. β-서브유닛의 C-말단부의 차이는 상기 두 개의 수용체의 신호 경로의 이탈, 즉 IGF-IR 매개 분열촉진(mitogenic), 분화 및 항세포소멸 효과를 초래하는 반면, IR의 활성화는 주로 대사 경로 수준에서의 효과를 수반한다 (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332:F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253:1-6, 1999).

세포질 티로신 키나제 단백질들은 상기 수용체의 세포외 영역에 대한 리간드의 결합에 의해 활성화 된다. 키나제의 활성화는 차례로 IRS-1, IRS-2, Shc 및 Grb 10을 포함한 상이한 세포내 기질의 자극을 수반한다 (Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). IGF-IR의 두 개의 주요 기질은 IRS 및 Shc인데, 이것들은 다수의 이펙터 하류(effectors downstream)의 활성화에 의해 이 수용체에 대한 IGF들의 부착과 관련된 대부분의 성장 및 분화 효과들을 매개한다. 따라서 기질의 유용성은 IGF-IR의 활성화에 관련된 최종적인 생물학적 효과를 지시하는 것으로 나타날 수 있다. IRS-1이 우세한 경우, 세포들은 증식 및 변형(transform)하는 경향이 있다. Shc가 우세한 경우, 세포들은 분화하는 경향이 있다 (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem. 274:12423-12430, 1999). 세포소멸(apoptosis)에 대한 보호 효과에 주로 관련되는 경로는 포스파티딜-이노시톨 3-키나제 (PI 3-키나제) 경로이다 (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31:80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125;166-173, 1999).

발암현상에서 IGF 시스템의 역할은 최근 10년간 집중연구의 대상이 되어 왔다. 이러한 관심은 분열촉진 및 항 세포소멸 특성 외에도 IGF-IR이 변형된 표현형(transformed phenotype)의 제작 및 유지에 필요한 것으로 보인다는 사실의 발견을 수반하였다. 사실, IGF-IR의 과발현 또는 구성적 활성화(constitutive activation)는 매우 다양한 세포에서, 우태아 혈청이 없는 배지에서 지지체와 독립적인 세포의 성장 원인이 되며 또한 누드 마우스(nude mice)에서 종양 형성의 원인이 되는 것으로 잘 알려져 있다. 이것 자체는, 과발현된 유전자의 다양한 생성물이 다수의 성장인자 수용체를 포함하는 세포를 변형할 수 있기 때문에, 독특한 특성이 아니다. 그러나 변형(transformation)에 있어서 IGF-IR에 의해 수행되는 주요 역할을 분명히 입증한 중요한 발견은, IGF-IR을 코딩하는 유전자가 비활성화된 R- 세포인 경우, 일반적으로 세포들, 예를 들어 소과 유두종 바이러스의 E5 단백질, EGFR 또는 PDGFR의 과발현, SV40의 T 항원, 활성화된 라스(ras) 또는 이들 두 가지 마지막 인자들의 조합 등을 변형시킬 수 있는 다른 약제에 의한 변형에는 전적으로 내성이 있다는 것이다 (Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11217-11221, 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14:3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69:5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595, 1994; DeAngelis T. et al., J. Cell. Physiol., 164:214-221, 1995).

IGF-IR은 매우 다양한 종양 및 종양세포주에서 발현되며, 또한 IGF들은 IGF-IR에의 부착을 통해 종양 성장을 증폭시킨다. 암생성에서의 IGF-IR의 역할을 지지하는 다른 논거들은, 상기 수용체에 지시되는 마우스의 모노클로날 항체를 사용한 연구 또는 IGF-IR의 음성 우성(negative dominants)을 사용하는 연구들로부터 나온다. 사실상 IGF-IR에 대해 지시되는 마우스의 모노클로날 항체는 배양되는 다수의 세포주의 증식 및 생체내에서 종양세포의 성장을 억제한다 (Arteaga C. et al., Cancer Res., 49:6237-6241, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196:92-98, 1993; Zia F. et al., J. Cell. Biol., 24:269-275, 1996; Scotlandi K. et al., Cancer Res., 58:4127-4131, 1998). 지앙(Jiang) 등의 연구 (Oncogene, 18:6071-6077, 1999)에서도 마찬가지로, IGF-IR의 음성 우성이 종양 증식을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

암 병리학은 조절되지 않은 세포성장을 특징으로 한다. 여러 가지 암에서, 성장인자들은 그들의 수용체와 특이적으로 결합한 다음 성장, 변형 및/또는 생존 신호를 종양 세포에 전달한다. 종양 세포 표면에서의 성장 인자 수용체들의 과발현은 많이 알려져 있다 (Salomon D.S. et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 1995, 19:183; Burrow S. et al., J. Surg. Oncol., 1998, 69:21; Hakam A. et al., Hum. Pathol., 1999, 30:1128; Railo M.J. et al., Eur. J. Cancer, 1994, 30:307; Happerfield L.C. et al., J. Pathol., 1997, 183:412). 세포 성장 조절 메카니즘의 직접적인 교란의 원인이 되는 이러한 과발현 또는 비정상적 활성화는, 또한 종래의 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유도된 세포소멸에 대한 세포 민감성에 영향을 미칠 수 있다.

지난 몇 년 동안, 인간화된 항체(herceptin®) 또는 키메라 항체(C225) 들을 각각 이용한, 종양 세포 표면 상에서 과발현된 EGFR 또는 Her2/neu와 같은 성장 인자 수용체의 표적화(targeting)는, 환자에게서 종양 성장의 현저한 억제를 초래하며 또한 종래의 화학요법 치료의 효능을 현저히 증가시키는 것으로 나타났다 (Carter P., Nature Rev. Cancer, 2001, 1(2):118; Hortobagyi G. N., Semin. Oncol., 2001, 28:43; Herbst R.S. et al., Semin. Oncol., 2002, 29:27). IGF-IR 또는 VEGF-R(맥관 내피 성장 인자 수용체) 같은 다른 수용체는 몇몇 전임상 연구에서 가능성 있는 표적으로 확인되었다.

보다 구체적으로, IGF-IR은 티로신 키나제 수용체의 일부이다. 이것은 두 개의 이소형들(isoforms) A 및 B 로 존재하는 인슐린 수용체 (IR)에 높은 상동성을 갖는다.

IR, 이소형들 A 및 B의 서열들은 NCBI 유전자 은행에 각각 기탁번호 X02160 및 M10051로 등록되어 있다. 제한적이지 않지만 IR에 관한 다른 데이터는 여기에 인용에 의해 도입된다 (Vinten et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:249-252; Belfiore et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, 277:39684-39695; Dumesic et al., 2004, The Journal of Endocrinology & Metabolism, 89(7):3561-3566).

IGF-IR 및 IR은 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 세포외 α- 및 두 개의 막관통(transmembrane) β-서브유닛으로 구성된 테트라머 당단백질이다. 리간드-결합 부위를 포함하는 각각의 α-서브유닛은 대략 130- 내지 135-kDa이며, 반면 티로신 키나제 영역을 포함하는 각각의 β-서브유닛은 대략 90- 내지 95-kDa이다. 이들 수용체들은 50% 이상의 전체 아미노산 유사성 및 티로신 키나제 영역에서 84%의 유사성을 갖는다. 리간드 결합 후, 인산화된 수용체들은, 다른 세포내 매개체의 활성화를 유도하는 인슐린 수용체 기질-1 단백질군 (IRS1), Gab1 및 Shc (Avruch, 1998, Mol. Cell. Biochem., 182, 31-48; Roth et al., 1988, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 53, 537-543; White, 1998, Mol. Cell. Biochem., 182, 3-11; Laviola et al., 1997, J. Clin. Invest. 99, 830-837; Cheatham et al., 1995, Endocr. Rev. 16, 117-142)를 포함한 도킹 단백질들(docking proteins)을 보급(recruitment)하여 인산화한다. 그러나 IR 및 IGF-IR이 둘 다 유사하게 주요 신호 경로를 활성화한다 하더라도, 두 개의 수용체 간의 특정한 도킹 단백질 및 세포내 매개체의 보급(recruitment) 면에서 차이가 존재한다 (Sasaoka et al., 1996, Endocrinology 137, 4427-4434; Nakae et al., 2001, Endocr. Rev. 22, 818-835; Dupont and Le Roith 2001, Horm. Res. 55, Suppl. 2, 22-26; Koval et al., 1998, Biochem. J. 330, 923-932). 이 차이점들은 IR 활성화에 의해 유도된 지배적인 대사 효과 및 IGF-IR 활성화에 의해 유도된 지배적인 분열촉진의(mitogenic), 변형의(transforming) 및 항-세포사멸의 효과들의 기본이 된다 (De Meyts et al., 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci., 766, 388-401; Singh et al., 2000, Prisco et al., 1999, Horm. Metab. Res. 31, 80-89; Kido et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 972-979). 인슐린은 IR에 높은 친화성으로 결합(IGF-IR에 대해서보다 100배 더 높은 친화성)하는 반면, 인슐린-유사 성장인자들 (IGF1 및 IGF2)은 IR보다 IGF-IR에 100배 더 높은 친화성으로 결합한다.

인간 IR(human IR)은 IR α-서브유닛의 카르복시-말단에서 작은 엑손 (엑손 11)에 의해 코딩되는 12개의 아미노산 잔기를 제외하거나 또는 이를 포함하는 IR 유전자의 교대 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생산된 두 개의 이소형들, IR-A 및 IR-B 내에 존재한다. IR 이소형들의 상대적인 풍부함은 조직 특이적인 미지의 인자들에 의해 조절된다 (Moller et al., 1989, Mol. Endocrinol., 3, 1263-1269; Mosthaf et al., 1990, EMBO J., 9, 2409-2413). IR-B는 인슐린 대사효과를 위한 주요 표적 조직인 정상 성인 조직(지방 조직, 간 및 근육)에서 우세한 IR 이소형이다 (Moller et al., 1989; Mosthaf et al., 1990). IR-A는 태아 조직에서 우세한 이소형이며 IGF2에 대한 반응에서 태아 성장을 매개하며 (Frasca et al., 1999, Mol. Cell. Biol., 19, 3278-3288), 이는 또한 유전자 도입 마우스(transgenic mice)에서 수행된 유전 연구에 의해 제안되었다 (DeChiara et al., 1990, Nature 345, 78-80; Louvi et al., 1997, Dev. Biol. 189, 33-48). 더욱이, 세포가 변형하여 악성이 되어버린 경우, 탈분화는 흔히 증가된 IR-A의 상대적인 풍부함과 연관되어 있다 (Pandini et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, N^o 42, pp39684-39695).

상동성이 높으므로, 인슐린 반-수용체 및 IGF-I 반-수용체 (IGF-I half-receptors) (하나의 α- 과 하나의 β-서브유닛으로 구성된)은 헤테로 이량화하여 인슐린/IGF-I 하이브리드 수용체들 (하이브리드-R)의 형성을 유도할 수 있다 (Soos et al., 1990, Biochem J., 270, 383-390; Kasuya et al., 1993, Biochemistry 32, 13531-13536; Seely et al., 1995, Endocrinology 136, 1635-1641; Bailyes et al., 1997, Biochem J. 327, 209-215).

두 개의 IR 이소형들은 동등하게 IGF-IR과 하이브리드를 형성할 수 있다. 그러나 하이브리드-R(hybrid-R)은 상이한 기능 특성을 갖는다. 하이브리드-RsB는 IGF1 그리고 특히 IGF2에 대해 감소된 친화성을 갖는다. 대조적으로, 하이브리드-RsA는 IGF1에 대해 높은 친화성을 가지며 또한 생리학적인 농도범위에서 IGF2 및 인슐린에 결합한다. 하이브리드-RsA의 발현은 i) (하이브리드-RsB와 함께 발생하지 않는) IGF1 및 IGF2에 의한 (높은 친화성의) 결합 및 활성화, ii) 인슐린 결합 후 IGF-IR 경로의 활성화라는 두 개의 상이한 메카니즘에 의해 IGF 시스템을 상향 조절한다. 하이브리드-RsA에 결합하는 인슐린은 IGF-IR β-서브유닛을 인산화하며, IGF-IR 특이적 기질 (CrkII)을 활성화시켜서 하이브리드-RsA가 인슐린을 IGF- IR 신호로 이동하게 한다 (Pandini et al., 2002).

간, 비장 또는 태반 같은 여러 가지 조직에서, 하이브리드-R은 IGF-IR 보다 더 많이 나타난다 (Bailyes et al., 1997). 종양 조직은 IGF-IR 및 IR-A 둘 다를 과발현하거나 또는 비정상적으로 활성화하기 때문에 (Frasca et al., 1999; Sciacca et al., 1999, Oncogene 18, 2471-2479; Vella et al., 2001, Mol. Pathol., 54, 121-124), 하이브리드-RsA 또한, 생리학적인 농도에서 인슐린 뿐만 아니라 IGF1 및/또는 IGF2에 의한 자극 이후의 타입 IGF-IR 신호전달(signalisation)에 의해 작용할 수 있는 악성세포에 선택적 성장 이점을 제공하는 갑상선 및 유방암을 포함한 다양한 인간 악성종양에서 과발현될 수 있다 (Bailyes et al., 1997; Pandini et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5, 1935-1944; Belfiore et al., 1999, Biochimie (Paris) 81, 403-407; Frasca et al., 1999, Sciacca et al., 1999; Vella et al., 2001).

두가지 수용체를 동시에 봉쇄할 수 있는 “치료 도구”의 실현은 이들이 동일한 종양에서의 IGF-IR 및 하이브리드-R의 발현, 또는 비정상 활성화에 의해 매개된 이탈 현상(escape phenomena)을 회피하는 것을 가능하게 하기 때문에 특히 관심을 받고 있다.

IGR-IF 및, 보다 구체적으로는, IGF-IR에 결합하거나 또는 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 억제할 수 있는 모노클로날 항체에 대한 증가되는 관심과 관련하여, 출원인들은 7C10 또는 h7C10 (코드 F50035)로 불리우는 인간 모노클로날 항체를 이미 개발하여 특징화 하였다. 이 항체 및 그의 용도에 관한 국제특허출원 PCT/FR03/00178호가 출원되어 2003년 7월 24일 공개번호 WO 03/059951호로 공개되었다. 이 특허출원의 내용은 여기에 인용에 의해 도입된다.

본 발명의 목적은 IGF-IR을 특이적으로 인식할 수 있고 큰 친화성을 가질 수 있는 이용 가능한 마우스의 모노클로날 항체, 바람직하게는 키메라 또는 인간화 항체(chimerized or humanized antibodies)를 가질 수 있는 것이다. 이들 항체는 IR과 거의 상호작용하지 않거나 또는 전혀 상호작용을 하지 않을 것이다. 이들의 부착(attachment)은 IGF1/IGF-IR 및 IGF2/IGF-IR 상호작용 도중 활성화되는 신호 전달 경로들과 주로 상호작용함으로써 IGF-IR을 발현하는 종양의 성장을 생체 외로 억제할 수 있다. 이들 항체는 에스트로겐-의존성 유방 종양 및 전립선 종양을 포함하는, IGF-IR을 발현하는 모든 타입의 종양에서 생체내 활성일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 두 개의 수용체에 결합할 수 있으며 또한 IGF1, IGF2 또는 인슐린에 의한 이들의 활성화를 봉쇄할 수 있는 높은 친화성의 화합물, 및 보다 구체적으로는 항체들을 생성시킴으로써 하이브리드-R 및 IGF-IR 활성을 함께 봉쇄시키는 것을 허용한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 분리된 항체들, 또는 그의 단편(fragment)의 용도에 관한 것이며, 상기 항체들 또는 단편은 i) 인간 IGF-IR에 결합할 수 있으며, 및/또는 그의 자연 리간드, 바람직하게는 IGF1 및/또는 IGF2의 결합을 억제할 수 있으며, 및/또는 또한 상기 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있으며 및/또는 ii) 하이브리드-R에 결합할 수 있으며, 및/또는 그의 자연 리간드, 바람직하게는 IGF1, IGF2 및/또는 인슐린의 결합을 억제할 수 있으며, 및/또는 또한 상기 하이브리드-R의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있다.

또 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체들은 암 요법, 특히 유방암 요법에 사용된다.

실제로, 유방 종양 세포는 그의 표면 IGF-IR 뿐만 아니라 상당수의 인슐린 수용체들 및, 그 결과, 상당수의 하이브리드-R에 특이적으로 존재하는 것으로 알려져 있다 (Frasca et al., 1999; Sciacca et al., 1999; Vella et al., 2001).

보다 구체적으로, 본 발명은 4개의 상이한 항-IGF-IR 모노클로날 항체에 관한 것이다.

첫 번째 양상에서, 본 발명의 대상은 분리된 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나이며, 상기 항체 또는 그의 상기 단편들의 하나는 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 필요하다면 바람직하게는 IGF-IR의 리간드들 IGF1 및/또는 IGF2의 자연 부착(natural attachment)을 억제할 수 있으며 및/또는 상기 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있고, 이것은 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열의 상보적 결정 부위 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 1, 2 및 3의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성(identity)을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경사슬(light chain)을 포함하거나, 또는 서열번호 4, 5 및 6의 아미노산 서열의 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 4, 5 및 6의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중사슬(heavy chain)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서 및 상응하는 실시예에서, 이 항체는 13F5로서 언급될 것이다.

본 명세서 설명에서 용어 “결합하다(to bind)"와 “부착하다(to attach)"는 동일한 의미를 가지며, 또한 서로 바꿔 사용할 수 있다.

본 명세서 설명에서, 항체 화합물 또는 이들의 서열에 부착된 폴리펩티드, 폴리펩티드 서열, 펩티드 및 단백질이란 용어는 서로 바꿔 사용할 수 있다.

본 발명은 자연 형태의 항체에 관한 것이 아니며, 즉 이들은 자연환경에 존재하지 않지만 자연적인 근원으로부터 정제에 의해 분리 또는 수득될 수 있으며, 그렇지 않으면 유전자 재조합에 의해, 또는 화학 합성에 의해 수득될 수 있으며, 또한 이들은 이후에 더 설명되는 바와 같은 비자연 아미노산들(unnatural amino acids)을 함유할 수 있는 것으로 이해되어야 할 것이다.

CDR 부위들 또는 CDR(들)은 카바트(Kabat) 등 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, 및 그 후 간행본)에 의해 정의된 바와 같은 면역 글로불린의 중사슬 및 경사슬들의 고도가변성 부위들(hypervariable regions)을 나타내는 것으로 의도된다. 세 가지 중사슬 CDR들 및 3개의 경사슬 CDR들이 존재한다. 용어 CDR 또는 CDR들은 경우에 따라 이들 부위 중의 하나, 또는 그것이 인식하는 에피토프(epitope) 또는 항원에 대한 항체의 친화성에 의한 결합에 관여하는 아미노산 잔기의 대부분을 함유하는 이들 부위의 여러 개, 또는 심지어 전부를 나타내는 것을 의도하기 위하여 여기서 사용된다.

본 발명의 의미에서 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 “동일성 퍼센트”는 최선의 배열 (최적 배열) 후에 얻어진, 비교 대상인 두 개의 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 퍼센트를 나타내는 것으로 의도되며, 이 퍼센트는 순수하게 통계적이며 또한 두 개의 서열 간의 차이는 불규칙적으로 및 그의 전체 길이에 걸쳐 분포된다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 서열의 비교는 통상적으로 최적 방법으로 이들을 배열한 후에 이들 서열을 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 단편 또는 “비교 창”(comparison window)에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열들의 최적 배열은 수작업으로 수행하는 것 이외에도, 스미스 및 워터만 (1981) [Ad. App. Math. 2:482]의 국부 상동성 알고리즘에 의하여, 네들레만 및 운쉬 (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]의 국부 상동성 알고리즘에 의하여, 피어슨 및 리프만 (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)의 유사성 검색방법에 의하여, 이들 알고리즘(위스콘신 제네틱 소프트웨어 패키지, 유전자 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI에서 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 그 외 BLAST N 또는 BLAST P 비교 소프트웨어)을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어에 의하여, 수행할 수 있다.

두 개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 최적 방법으로 배열된 이들 두 개의 서열을 비교하여 결정되며, 또한 여기서 비교 대상인 상기 핵산 또는 아미노산 서열은 이들 두 개의 서열 간의 최적 배열을 위한 참조 서열에 대하여 부가 또는 삭제를 포함할 수 있다. 동일성 퍼센트는 두 개의 서열 간에 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 동일한 동일 위치의 수를 결정하고, 이 동일 위치의 수를 비교창 내의 총 위치 수로 나누고, 또한 이들 두 개의 서열 간의 동일성 퍼센트를 얻기 위하여 얻어진 결과를 100으로 곱함으로써 계산된다.

예를 들어, 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html에서 이용 가능한 BLAST 프로그램, “BLAST 2 서열” (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)을 사용할 수 있으며, 사용된 파라미터들은 디폴트(default)로 주어진 파라미터이며 (특히 인자 "오픈 갭 페널티(open gap penalty)": 5, 및 "연장 갭 페널티(extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들어 프로그램에 의해 제안된 매트릭스 "BLOSUM 62"임), 비교 대상인 두 개의 서열 간의 동일성 퍼센트는 상기 프로그램에 의해 직접적으로 계산된다.

참조 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 참조 서열에 대하여 특정한 변형, 특히 적어도 하나의 아미노산의 삭제(deletion), 첨가 또는 치환, 절단(truncation) 또는 신장을 갖는 것이 바람직하다. 하나 이상의 연속 또는 불연속 아미노산(들)의 치환의 경우에, 그 치환은 치환되는 아미노산들이 “균등한(equivalent)” 아미노산들로 대체되는 것이 바람직하다. 여기에서 “균등한 아미노산들”이라는 표현은 상응하는 항체들의 생물학적 활성을 본질적으로 변형하는 일 없이, 또한 이후에 특히 실시예에 정의되는 바와 같은 기본 구조의 아미노산의 하나로 치환될 수 있는 임의의 아미노산을 나타내는 것을 의도한다. 이들 균등한 아미노산들은 이들이 대체하는 아미노산과의 구조적 상동 관계에 의존하여, 또는 수행 가능한 상이한 항체들 간의 생물학적 활성의 비교 시험의 결과에 의해 결정할 수 있다.

실시예를 통하여, 상응하는 변형 항체의 생물학적 활성을 크게 변형시키는 일 없이 수행될 수 있는 치환의 가능성이 언급된다. 따라서 류신을 발린 또는 이소류신으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 글루타민을 아스파라긴으로, 아르기닌을 라이신 등으로 치환할 수 있으며, 상기의 역 치환 또한 동일 조건하에서 당연히 생각될 수 있다.

제2 양상에서, 본 발명의 대상은 분리된 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나이며, 상기 항체 또는 그의 상기 단편들의 하나는 인간 인슐린-유사 성장인자 I 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 필요하다면 바람직하게는 IGF-IR의 리간드들 IGF1 및/또는 IGF2의 자연 부착을 억제할 수 있으며 및/또는 상기 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있으며, 이것은 서열번호 7, 8 및 9의 아미노산 서열의 상보적 결정 부위 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 7, 8 및 9의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경사슬(light chain)을 포함하거나, 또는 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열의 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 10, 11 및 12의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중사슬(heavy chain)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이어지는 명세서 설명에서 이 항체는 12D5로 언급된다.

제3 양상에서, 본 발명의 대상은 분리된 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나이며, 상기 항체 또는 그의 상기 단편들의 하나는 인간 인슐린-유사 성장인자 I 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 필요하다면 바람직하게는 IGF-IR의 리간드들 IGF1 및/또는 IGF2의 자연 부착을 억제할 수 있으며 및/또는 상기 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있으며, 이것은 서열번호 13, 14 및 15의 아미노산 서열의 상보적 결정 부위 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 13, 14 및 15의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경사슬(light chain)을 포함하거나, 또는 서열번호 16, 17 및 18의 아미노산 서열의 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 16, 17 및 18의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중사슬(heavy chain)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이어지는 명세서 설명에서, 이 항체는 2D10으로 언급될 것이다.

마지막으로, 또 하나의 양상에서, 본 발명의 대상은 인간 인슐린-유사 성장인자 I 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 필요하다면 바람직하게는 IGF-IR의 리간드들 IGF1 및/또는 IGF2의 자연 부착을 억제할 수 있으며 및/또는 상기 IGF-IR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있는 분리된 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나이며, 이것은 이후에 언급되는 CNCM에서 등록되고 21E3으로 불리우는 항체로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체들, 즉 13F5, 12D5, 2D10 및 21E3은 바람직하게는 특히 마우스, 키메라 또는 인간 기원의 특이적 모노클로날 항체이며, 이것들은 당업계의 기술자에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 얻어질 수 있다.

일반적으로, 특히 마우스 기원의 모노클로날 항체 또는 그의 기능성 단편들의 제조를 위하여, 특히 매뉴얼 “Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)에 기술되어 있는 기술을 참고하거나, 또는 콜러 및 밀스타인(Kohler and Milstein) (Nature, 256:495-497, 1975)에 의해 기술된 하이브리도마 유래의 제조기술을 참고하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는, 예를 들어 IGF-IR, 또는 본 발명에 따른 상기 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프(epitope)를 함유하는 그의 단편들의 하나에 대항하여 면역화 된 동물세포로부터 얻을 수 있다. 상기 IGF-IR, 또는 그의 상기 단편들의 하나는 특히 통상의 작업 방법에 따라, IGF-IR을 코딩하는 cDNA 서열에 함유된 핵산 서열로 출발하는 유전적 재조합에 의해, 또는 IGF-IR의 펩티드 서열에 포함되는 아미노산의 서열로부터 시작하는 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 예를 들어 IGF-IR, 또는 본 발명에 따른 상기 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 함유하는 그 단편들의 하나가 이미 고정되어 있는 친화성 칼럼 상에서 정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 모노클로날 항체는 단백질 A 및/또는 G상에 크로마토그래피 한 다음, 잔류 단백질 오염물은 물론 DNA 및 LPS를 제거하기 위해 이온교환 크로마토그래피를 하거나 또는 하지 않거나, 이량체 또는 다른 다량체의 존재로 인한 잠재적 응집물을 제거하기 위하여 세파로스 겔 상에 배제 크로마토그라피를 하거나 하지 않음으로써 정제될 수 있다. 더욱 바람직한 방법으로 이들 기술 전체가 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

키메라 또는 인간화 항체가 또한 본 발명에 따른 항체에 포함된다.

키메라 항체(chimeric antibody)는, 소정의 종에 상기 종과 이종인 종의 항체의 경사슬 및 중사슬 불변 부위들(constant regions)을 조합시켜 얻은 항체로부터 유래된 자연 가변성 (경사슬 및 중사슬) 부위를 함유하는 항체를 나타내는 것으로 의도된다.

본 발명에 따른 키메라 타입의 항체들 또는 그의 단편들은 유전적 재조합 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 키메라 항체는 비인간, 특히 마우스의 가변성 부위(variable region)를 코딩하는 서열 및 프로모터를 함유하는 재조합 DNA, 본 발명에 따른 모노클로날 항체, 및 인간 항체의 불변 부위를 코딩하는 서열을 클로닝함으로써 생산할 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 본 발명의 키메라 항체는, 예를 들어 마우스-사람 키메라이며, 이 항체의 특이성은 마우스 DNA 유래의 가변성 부위 및 인간 DNA 유래의 불변 부위에 의해 결정된 그것의 이소형에 의해 결정된다. 키메라 항체의 제조방법으로서, 예를 들어 문헌 베로인(Verhoeyen) 등을 언급할 수 있다 (BioEssays, 8:74, 1988).

인간화 항체는 비인간 기원의 항체로부터 유래된 CDR 부위들을 함유하는 항체를 나타내는 것으로 의도되며, 상기 항체 분자의 다른 부분들은 하나의 (또는 여러 개의) 인간 항체들(human antibodies)로부터 유래된다. 또한, (FR로 불리우는) 골격의 단편의 잔기들 약간은 결합의 친화성을 보존하기 위하여 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

본 발명에 따른 인간화 항체들 또는 그의 단편들은 당업계의 기술자에게 알려진 기술(예를 들어, 문헌 Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992에 기재된 기술들)에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 인간화 항체는 시험관내 진단방법, 또는 생체내 예방 및/또는 치료 용도로 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 항체의 기능성 단편(functional fragment)은, 특히 Fv, scFv (단일 사슬에 대한 sc), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 단편들 또는 디아바디(diabodies) 등의 항체 단편, 또는 반감기가 화학적 변화, 예를 들어 폴리(에틸렌)글리콜 (“PEG화”) (Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG 또는 Fab'-PEG로 불리우는 페길화 단편) (폴리(에틸렌)글리콜에 대한 “PEG")의 부가에 의해, 또는 리포좀 내로의 혼입에 의해 증가되는 단편을 나타내며, 상기 단편들은 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 6, 7 내지 12 또는 13 내지 18의 서열의 특징적인 CDR들 중 적어도 하나를 가지며, 또한 특히, 이것이 유래되는 항체의 부분적인 활성, 예를 들어 특히 IGF-IR을 인식하고 이에 결합하며, 또한 필요하다면 IGF-IR의 활성을 억제할 수 있는 능력을 일반적인 방법으로 발휘할 수 있다.

바람직하게, 상기 기능성 단편들은 그것들이 유래되는 항체의 중 또는 경 가변성 사슬의 부분 서열로 구성되거나 이를 포함할 것이며, 상기 부분 서열은 그것이 유래되는 항체와 동일한 결합 특이성 및 IGF-IR에 대한 충분한 친화성, 바람직하게는 그것이 유래되는 항체의 친화성의 적어도 1/100, 보다 바람직하게는 적어도 1/10에 해당하는 친화성을 유지하기에 충분하다. 이러한 기능성 단편은 그것이 유래되는 항체의 최소 5개의 아미노산, 바람직하게는 10개, 15개, 25개, 50개 및 100개의 연속적인 아미노산 서열을 함유할 것이다.

바람직하게, 이들 기능성 단편은 Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, F(ab'), scFv-Fc 타입 단편 또는 디아바디(diabodies)일 것이며, 이들은 일반적으로 그것이 유래되는 항체와 동일한 결합 특성을 가질 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 단편들은, 펩신 또는 파파인 등의 효소 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합(disulfide bridges)의 절단에 의한 소화 등의 방법에 의해, 상술한 바와 같은 항체들로부터 출발하여 얻어질 수 있다. 또 하나의 방법에서, 본 발명에 포함되는 항체 단편들은 당업계의 기술자에게 잘 알려진 유전적 재조합 기술에 의해 또는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템사 등에서 공급하는 것들과 같은 자동 펩티드 합성기를 사용하는 펩티드 합성에 의해 얻어질 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 유전적 재조합 또는 화학적 합성에 의해 얻어진 본 발명에 따른 항체들, 또는 그들의 기능성 단편들, 특히 키메라 또는 인간화 항체들을 포함한다.

제1 접근법에 따르면, 상기 항체는 그의 중사슬 서열에 의해 정의될 것이다.

제1 바람직한 방법에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나에 관한 것이며, 이것은 서열번호 4 내지 6의 서열의 세 개의 CDR들 또는 세 개의 CDR들 중 적어도 두 개, 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열의 세 개의 CDR들 또는 세 개의 CDR들 중 적어도 2개를 포함하는 중사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다.

제2 바람직한 방법에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나에 관한 것이며, 이것은 서열번호 10 내지 12의 서열의 세 개의 CDR들 또는 세 개의 CDR들 중 적어도 두 개, 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열의 세 개의 CDR들 또는 세 개의 CDR들 중 적어도 2개를 포함하는 중사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다.

세 번째 바람직한 방법에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나에 관한 것이며, 이것은 서열번호 16 내지 18의 서열의 세 개의 CDR들 또는 세 개의 CDR들 중 적어도 두 개, 또는 각각 서열번호 16 내지 18의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열의 세 개의 CDR들 또는 세 개의 CDR들 중 적어도 두 개를 포함하는 중사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다.

제2 접근법에 따르면, 상기 항체는 그것의 경사슬 서열에 의해 정의될 것이다.

또한 바람직한 제1 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 1 내지 3의 서열의 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 1 내지 3의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 경사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다.

제2 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 7 내지 9의 서열의 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 7 내지 9의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 경사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다.

제3 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 13 내지 15의 서열의 CDR들로부터 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 그 서열이 서열번호 13 내지 15의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 경사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다.

제3 접근법에 따르면, 상기 항체는 그의 경사슬 서열 및 그의 중사슬 서열 둘 다에 의해 정의될 것이다.

제1 바람직한 방법에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 4 내지 6의 서열의 세 개의 CDR들, 또는 서열번호 4 내지 6의 서열과 최적 배열 후 적어도 80% 동일성을 갖는 서열의 세 개의 CDR들을 포함하는 중사슬을 포함하며, 또한 서열번호 1 내지 3의 서열의 세 개의 CDR들, 또는 서열번호 1 내지 3의 서열과 최적 배열 후 적어도 80% 동일성을 갖는 서열의 세 개의 CDR들을 포함하는 경사슬을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

제2의 바람직한 방법에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 10 내지 12의 서열의 세 개의 CDR들, 또는 서열번호 10 내지 12의 서열과 최적 배열 후 적어도 80% 동일성을 갖는 서열의 세 개의 CDR들을 포함하는 중사슬을 포함하며, 또한 서열번호 7 내지 9의 서열의 세 개의 CDR들, 또는 서열번호 7 내지 9의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열의 세 개의 CDR들을 포함하는 경사슬을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

제3의 바람직한 방법에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 16 내지 18의 서열의 세 개의 CDR들, 또는 서열번호 16 내지 18의 서열과 최적 배열 후 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열의 3개의 CDR들을 포함하는 중사슬을 포함하며, 또한 서열번호 13 내지 15의 서열의 세 개의 CDR들, 또는 서열번호 13 내지 15의 서열과 최적 배열 후 적어도 80% 동일성을 갖는 서열의 3개의 CDR들을 포함하는 경사슬을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 바람직한 구현예에서, 13F5로 불리우는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중사슬을 포함하며, 또한 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경사슬을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 바람직한 구현예에서, 12D5로 불리우는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중사슬을 포함하며, 또한 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경사슬을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 바람직한 구현예에서, 2D10으로 불리우는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중사슬을 포함하며, 또한 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경사슬을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일부가 되는 또 하나의 가능성은, 중사슬의 3개의 CDR들이 13F5, 12D5 및 2D10 각각의 CDR들을 포함하는 그룹에서 임의로 선택되며, 또한 경사슬의 3개의 CDR들이 13F5, 12D5 및 2D10 각각의 CDR들을 포함하는 그룹에서 임의로 선택되는 항체이다.

또 하나의 양상에 따르면, 본 발명의 대상은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나이며, 이것은 인간 인슐린 수용체 IR에 부착되지 않거나 이에 현저한 방식으로 부착되지 않음을 특징으로 한다.

바람직한 방법에서, 본 발명에 따른 상기 기능성 단편들은 Fv, scFv, Fab, (Fab')₂, Fab', scFv-Fc 단편들 또는 디아바디(diabodies), 또는 반감기가 화학적 변화, 특히 PEG화, 또는 리포좀 내로의 혼입에 의해 증가된 임의의 기능성 단편으로부터 선택될 것이다.

또 하나의 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 모노클로날 항체를 분비할 수 있는 마우스의 하이브리도마, 특히 국립 미생물 배양센터(CNCM, National Center of Microorganism Culture)(프랑스 파리 파스퇴르 연구소)에 기탁된 마우스 기원의 하이브리도마에 관한 것이다.

여기에서 13F5로 불리우는 모노클로날 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나는, 상기 항체가, 물론 본 발명의 일부인 2004년 3월 25일 CNCM에 번호 I-3193으로 기탁된 하이브리도마에 의해 분비되는 것을 특징으로 한다. 이 하이브리도마는 면역화된 마우스의 스플레노사이트(mouse splenocytes)와 골수종 세포선(Sp20 Ag14)의 세포내 융합을 일으키는 마우스의 하이브리도마(murine hybridoma)이다.

여기에서 12D5로 불리우는 모노클로날 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나는, 상기 항체가, 물론 본 발명의 일부인 2004년 4월 8일 CNCM에 번호 I-3195로 기탁된 하이브리도마에 의해 분비되는 것을 특징으로 한다. 이 하이브리도마는 면역화된 마우스의 스플레노사이트와 골수종 세포선(Sp20 Ag14)의 세포내 융합을 일으키는 마우스의 하이브리도마이다.

여기에서 2D10으로 불리우는 모노클로날 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나는, 상기 항체가, 물론 본 발명의 일부인 2004년 5월 13일 CNCM에 번호 I-3214로 기탁된 하이브리도마에 의해 분비되는 것을 특징으로 한다. 이 하이브리도마 또한 면역화된 마우스의 스플레노사이트와 골수종 세포선(Sp20 Ag14)의 세포내 융합을 일으키는 마우스의 하이브리도마이다.

여기에서 21E3으로 불리우는 모노클로날 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나는, 상기 항체가, 물론 본 발명의 일부인 2004년 7월 1일 CNCM에 번호 I-3249에 의해 분비되는 것을 특징으로 한다. 이 하이브리도마 또한 면역화된 마우스의 스플레노사이트와 골수종 세포선(Sp20 Ag14)의 세포내 융합을 일으키는 마우스의 하이브리도마이다.

또한 특별한 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나에 관한 것으로, 상기 항체는 마우스에 이종인 종, 특히 사람의 항체로부터 유래된 경사슬 및 중사슬 불변 부위들(constant regions)을 더욱 포함하며, 또한 바람직한 방법에서 인간 항체로부터 유래된 경사슬 및 중사슬의 불변 부위들은 각각 카파(kappa) 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 영역이다.

신규한 양상에 따르면, 본 발명은 분리된 핵산에 관한 것으로, 그것은 다음의 핵산으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다: a) 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA; b) a)에 정의된 바와 같은 핵산의 상보적 핵산(complementary nucleic acid).

본 발명에서 광범위하게 사용되는 용어인 핵산, 핵 또는 핵산 서열, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 서열, 뉴클레오타이드 서열은, 비자연 뉴클레오타이드를 함유하거나 함유하지 않는, 핵산의 단편 또는 부위를 한정시키며, 또한 상기 DNA의 전사 산물에 관한 이중나선 DNA, 단일나선 DNA에 상응할 수 있는, 변형 또는 비변형된 뉴클레오타이드의 정확한 결합을 나타내는 것으로 의도된다.

또한 여기서 본 발명은 그의 자연 염색체 환경에서, 다시 말하면 자연 상태에서의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 분리 및/또는 정제된 서열, 다시 말하면 직접 또는 간접적으로, 예를 들면 복사에 의해 선택된 서열에 관한 것이며, 그의 환경은 적어도 부분적으로 변형된 것이다. 따라서 또한 여기서 본 발명은 화학적 합성 또는 숙주 세포(host cells)의, 예를 들면 유전적 재조합에 의해 얻어진 분리된 핵산을 나타내는 것으로 의도된다.

높은 엄격함(high stringency)의 조건 하에서의 혼성화(hybridization)는, 온도 조건 및 이온 강도 조건이 상보적 DNA의 2개의 단편 사이의 혼성화를 유지시키기에 충분하도록, 선택되는 것을 의미한다. 예시 목적으로, 상술한 폴리뉴클레오타이드 단편들을 한정하기 위한 혼성화 단계의 높은 엄격함의 조건은 유리하게는 다음과 같다.

DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 가지 단계로 수행된다: (1) 5 x SSC (1 x SCC는 0.15M NaCl + 0.015M 구연산 나트륨 용액에 상응함), 50%의 포름아마이드, 7%의 도데실 황산 나트륨 (SDS), 10 x 덴하르쯔(Denhardt's), 5%의 황산 덱스트란 및 1%의 연어 정액 DNA를 함유하는 인산 완충제 (20mM, pH 7.5)에서 3시간 동안 42℃에서 예비 혼성화; (2) 프로브의 크기에 의존하는 온도(예를 들어, 프로브 크기 ＞100 뉴클레오타이드인 경우, 42℃)에서 20시간 실제 혼성화 후, 2 x SSC + 2%의 SDS로 20℃에서 20분간 2회 세척, 0.1 x SSC + 0.1%의 SDS로 20℃에서 20분간 1회 세척에 의해 수행한다. 마지막 세척은 프로브 크기 ＞100 뉴클레오타이드인 경우 60℃에서 30분간 0.1 x SSC + 0.1%의 SDS 중에서 수행한다. 정해진 크기의 폴리뉴클레오타이드에 대해 상술한 높은 엄격함의 혼성화 조건은, 샘브룩(Sambrook) 등의 교시에 따라 더 크거나 더 작은 크기의 올리고뉴클레오타이드에 대해 당업계의 기술자에 의해 채용될 수 있다 (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 특히 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터를 목적으로 한다.

본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 소정의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열을 발현 및/또는 분비시키는 요소(elements)를 포함한다. 따라서 상기 벡터는 포로모터, 번역의 개시 및 종료 신호는 물론 전사를 조절할 적절한 부위들을 포함하여야 한다. 이것은 숙주세포에서 안정한 방법으로 유지될 수 있어야 하며 또한 선택적으로 번역된 단백질의 분비를 특정하는 특별한 신호를 가질 수 있다. 이들 상이한 요소들은 사용된 숙주 세포의 기능에 따라 당업계의 기술자에 의해 선택되고 최적화된다. 이러한 효과를 위해, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들은 선택된 숙주에서 자가 복제 벡터로 삽입되거나 또는 선택된 숙주의 통합 벡터들(integrative vectors)일 수 있다.

이러한 벡터들은 당업계의 기술자에게 현재 사용되는 방법에 의해 제조하며, 또한 그 결과 수득된 클론은 표준 방법, 예를 들어 리포펙션(lipofection), 전기 천공법, 열 충격 또는 화학적 방법에 의해 적절한 숙주 내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터들은, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스성 기원의 벡터들이다. 이들은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하거나 발현하기 위하여 숙주 세포를 변형하는데 유용하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터에 의해 변형되거나 또는 이를 포함하는 숙주세포들을 포함한다.

숙주세포는 원핵생물 또는 진핵생물 시스템, 예를 들어 박테리아 세포는 물론 효모세포 또는 동물세포, 특히 포유동물로부터 선택할 수 있다. 또한 숙주세포로서 곤충 세포 또는 식물세포를 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 사람을 제외한 동물에 관련되며, 상기 동물은 본 발명에 따른 변형된 적어도 하나의 세포를 포함한다.

또 하나의 양상에 따르면, 본 발명의 대상은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나를 제조하는 방법으로, 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다: a) 본 발명에 따른 숙주세포의 배지 및 적절한 배양조건에서 배양; 및 b) 배양 배지 또는 상기 배양된 세포들로부터 출발하여 생성된 상기 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나의 회수(recovery).

본 발명에 따라 변형된 세포들은 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드의 제조 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 재조합 형태로 제조하는 방법은, 본 발명에 따른 벡터에 의해 변형된 세포 및/또는 벡터를 사용함을 특징으로 하며, 그 자체로 본 발명에 포함된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터에 의해 변형된 세포는 상기 폴리펩티드를 발현시키는 조건 하에서 배양되고, 상기 재조합 펩티드는 회수된다.

상술한 바와 같이, 숙주세포는 원핵생물 또는 진핵생물 시스템으로부터 선택할 수 있다. 특히 원핵생물 또는 진핵생물 시스템에서 분비를 촉진하는, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들을 확인할 수 있다. 따라서 이러한 서열을 운반하는 본 발명에 따른 벡터는 분비 대상인 재조합 단백질의 제조에 유리하게 사용될 수 있다. 실제로, 이들 재조합 단백질의 정제는 숙주세포의 내부에서 보다 세포 배양의 상청액(supernatant)에서 존재한다는 사실에 의해 촉진될 것이다.

또한 화학적 합성에 의해 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 제조방법은 또한 본 발명의 대상이다. 당업계의 기술자는 화학적 합성방법, 예를 들어 단편의 축합에 의해 또는 용액 중 종래 합성에 의해 상기 고형 상 (특히 Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed. 참고) 또는 부분 고형 상을 이용하는 기술을 알고 있다. 화학합성에 의해 수득되며 또한 상응하는 비자연 아미노산을 함유할 수 있는 폴리펩티드도 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 또한 본 발명에 포함된다.

제2 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 추가 설명한 바와 같은 본 발명에 따른 항체에 관한 것으로, 인간 표피 성장 인자 수용체 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있으며 및/또는 상기 EGFR의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있음을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 활성성분으로서(by way of active principle) 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나로 이루어진 화합물을, 바람직하게는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체(vehicle)와 혼합되게 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 하나의 보충 구현예는 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 조합 생성물(combination product)로서, 세포독성제/세포증식억제제 및/또는 IGF-I 및/또는 EGF에 대한 수용체 각각의 티로신 키나제 활성 억제제를 더욱 포함하는 상술한 조성물에 있다.

“동시 사용(simultaneous use)”은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 단일 및 동일 약제 형태로 투여함을 의미하는 것으로 이해된다.

“분리 사용(separate use)”은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 별개의 약제 형태로 동시에 투여함을 의미하는 것으로 이해된다.

“순차적 사용(sequential use)”은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 각각 별개의 약제 형태로 연속적 투여함을 의미하는 것으로 이해된다.

일반적인 방법에서, 본 발명에 따른 조성물은 암의 치료효능을 현저하게 증가시킨다. 다시 말하면, 본 발명에 따른 항-IGF-IR 항체의 치료효과는 세포독성제의 투여에 의해 예상치 못한 방식으로 증가된다. 본 발명에 따른 조성물에 의해 생기는 또 하나의 주요한 후속적 이점은 활성성분을 더 낮은 유효 용량으로 사용하여 부수적 효과, 특히 세포독성제 효과의 출현 위험을 피하거나 감소시키는 가능성에 관한 것이다.

그 외에 본 발명에 따른 이 조성물은 예상되는 치료효과를 더욱 신속하게 달성시키는 것이다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합 생성물로서의 상기 조성물은, 상기 세포독성/세포증식억제제가 DNA, 항대사물, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제들, 또는 그 밖의 스핀들 억제제(spindle inhibitor) 또는 안정화제 또는 화학요법에 사용될 수 있는 기타 임의의 약제와 상호작용하는 약제들로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 상술한 부류의 세포독성제 각각에 대하여, 이러한 세포독성/세포증식억제제는 예를 들면 암학 및 혈액학 칼럼 “Cytotoxics"에 부착된 화합물에 관한 페이지에서 VIDAL의 2001 간행본에 인용되어 있으며, 이 문헌과 관련하여 인용된 이들 세포독성 화합물은 바람직한 세포독성제로서 여기에 인용된다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합 생성물로서의 상기 조성물은, 상기 세포 독성제가 동시 사용을 위하여 상기 항체에 화학적으로 결합되는 것을 특징으로 한다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 조성물은 상기 세포독성/세포증식억제제가 스핀들 억제제 또는 안정화제, 바람직하게는 비노렐빈(vinorelbine) 및/또는 빈플루닌(vinflunine) 및/또는 빈크리스틴(vincristine)으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 상기 항체와 상기 세포독성제 사이의 결합을 촉진하기 위하여, 특히 결합 대상인 2개의 화합물 사이에 스페이서 분자(spacer molecules), 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 같은 폴리(알킬렌)글리콜, 또는 기타 아미노산들을 도입할 수 있으며, 또는 또 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 항체와 작용할 수 있는 기능이 도입된 상기 세포독성제의 활성 유도체를 사용할 수 있다. 이들 결합기술은 당업계의 기술자에게 잘 알려져 있으며 또한 본 설명에서 확장하지 않을 것이다.

또 하나의 바람직한 구현예에서, IGF-I에 대한 수용체의 티로신 키나제 활성의 상기 억제제는 유도된 자연약제들(derived natural agents), 디아닐리노프탈이미드(dianilinophthalimides), 피라졸로-(pyrazolo-) 또는 피롤로피리도피리미딘(pyrrolopyridopyrimidines) 또는 기타 퀴나질린(quinazilines)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이러한 억제제는 당업계의 기술자에게 잘 알려져 있으며 또한 문헌에 기술되어 있다 (Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1, 25-32).

본 발명의 또 하나의 구현예에 따르면, 상술한 바와 같은 조성물은 암, 특히 유방암과 같은, 상기 HER2/neu 수용체 및 수용체 IGF-IR를 과발현하는 암을 예방 및 치료할 목적으로 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 조합 생성물로서, HER2/neu 수용체의 세포외 영역(extracellular domain)에 대한 또 하나의 항체 화합물을 포함한다.

본 발명에 따른 항-IGF-IR과 항-HER2/neu 항체를 조합하는데 있어서 예상되지 않은 관심을 정당화하는 자료가 특히 알바네(Albanell) 등의 문헌 (J. of the National Cancer Institute, 93(24):1830-1831, 2001) 및 루(Lu) 등의 문헌 (J. of the National Cancer Institute, 93(24):1852-1857, 2001)들에 특별히 언급되어 있다.

구체적인 방법에서, 본 발명에 따른 조성물의 상기 항-HER2/neu 항체는 Trastuzumab로 불리우는 항체 (또한 Herceptin으로 불리움)이다.

또 하나의 양상에서 본 발명은 상기 항체들의 적어도 하나 또는 그의 기능성 단편들의 하나가 세포 독소 및/또는 방사성 원소와 컨쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 독소 또는 상기 방사성 원소는 IGF-IR을 발현하는 세포들의 적어도 하나의 세포 활성을 억제할 수 있으며, 보다 바람직한 방법으로는, 상기 세포의 성장 또는 증식을 방지할 수 있고, 특히 상기 세포를 전체적으로 비활성화할 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 독소는 장내세균 독성, 특히 슈도모나스 외독소 A(Pseudomonas exotoxin A)이다.

치료요법에 사용되는 항체에 바람직하게 컨쥬게이트되는 방사성 원소 (또는 방사성 동위원소)는 감마선 및 바람직하게 이오딘¹³¹, 이트리움⁹⁰, 금¹⁹⁹, 팔라듐¹⁰⁰, 구리⁶⁷, 비스무트²¹⁷ 및 안티몬²¹¹을 방출하는 방사성 동위원소이다. 베타 및 알파 선을 방출하는 방사성 동위원소는 또한 치료요법에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 적어도 하나의 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나에 컨쥬게이트된 독소 또는 방사성 원소는, 특히 연결 분자(linking molecule)를 도입하거나 또는 도입하지 않고, 두 개 화합물 간의 공유 결합에 의해, 상기 독소 또는 상기 방사성 원소가 상기 적어도 하나의 항체에 결합하게 하는 임의의 수단을 나타내는 것으로 의도된다.

컨쥬게이트의 구성성분의 전부 또는 일부를 화학(공유), 정전기 또는 비공유 방법으로 결합시키는 약제들 중에서, 벤조퀴논, 카보디이미드(carbodiimide) 및 보다 구체적으로 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]-카보디이미드 염화수소), 디말레이미드, 디티오비스니트로벤조산 (DTNB), N-숙신이미딜 S-아세틸 티오-아세테이트 (SATA), 자외선(U.V.)과 작용하는 하나 이상의 페닐아지드 그룹을 갖는 가교제(bridging agents) 및 바람직하게 N-[-4-(아지도살리실아미노)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)-프로피온아미드 (APDP), N-숙신이미드-일 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 6-히드라지노-니코틴아미드(HYNIC)를 특별히 언급할 수 있다.

특히 방사성 원소에 대한 결합의 또 하나의 형태는 이기능성 이온 킬레이터(bifunctional ion chelator)의 용도이다.

이들 킬레이트물질 중에서, 금속, 특히 방사성 금속 및 면역 글로불린을 결합하기 위해 개발된 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산)으로부터 유래된 킬레이트를 언급할 수 있다. 따라서 DTPA 및 그의 유도체는 리간드-금속 착화합물의 안정성 및 견고성을 증가시키기 위하여 탄소사슬 상에서 상이한 그룹으로 치환될 수 있다 (Krejcarek et al., 1977; Brechbiel et al., 1991; Gansow, 1991; 미국특허 4,831,175호).

예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 및 그의 유도체는 그의 자유형태(free form)로 또는 금속이온과의 착화합물 형태로 오랜 시간 동안 의학 및 생물학에서 널리 사용되어 왔으며, 이들은 암 요법에서 방사면역 컨쥬게이트의 개발을 위한 항체와 같은 치료 또는 예방 목적의 단백질과 결합되며 또한 금속이온과 안정한 킬레이트를 형성하는 현저한 특성을 가진다 (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990).

또한 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 컨쥬게이트를 형성하는 상기 적어도 하나의 항체는 그의 기능성 단편들, 특히 scFv 단편들과 같은 Fc 성분의 절단된 단편들로부터 선택된다.

본 발명은 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도를 더욱 포함한다.

보다 구체적으로, 또 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 IGF-I 수용체의 과발현 및/또는 비정상적인 활성화에 의해 유도되며 및/또는 IGF-IR과 1-IGF1 또는 IGF2의 상호작용에 의해 매개되는 신호의 전달 경로(transduction pathway)의 과활성화(hyperactivation)와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위해 의도된 약제의 제조를 위한 조성물, 및/또는 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나의 용도에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 용도는, 상기 약제의 투여가 인슐린 수용체 IR의 억제, 다시 말하면 상기 약제의 존재로 인한 IR과 그의 자연 리간드 간의 상호작용의 억제, 특히 IR에 대한 상기 약제의 부착과 관련된 경쟁적 억제와 관련되는, 부수적 효과(secondary effects)를 유발하지 않거나 또는 오직 약간의 부수적 효과만을 유발하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 정상 세포가, 바람직하게는 IGF-의존성, 특히 IGF1- 및/또는 IGF2-의존성인 종양특성을 갖는 세포로 변형(transformation)하는 것을 억제하기 위해 의도된 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 바람직하게는 인간화된, 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나의 용도를 더욱 포함한다.

본 발명은 또한 바람직하게는 IGF-의존성, 특히 IGF1- 및/또는 IGF2-의존성인 종양세포의 성장 및/또는 증식을 억제하기 위해 의도된 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 바람직하게는 인간화된, 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나의 용도를 더욱 포함한다.

일반적 방법에서 본 발명의 대상은 바람직하게는 IGF-IR을 발현하는 암 및/또는 바람직하게 IGF-IR과 IGF1 또는 IGF2의 과활성화, 예를 들어 IRS1의 과발현에 의해 매개되는 신호의 전달경로의 과활성화를 갖는 암을 예방 또는 치료하기 위해 의도된 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 바람직하게는 인간화된, 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나의 용도이다.

또한 본 발명의 대상은 건선(psoriasis)을 예방 또는 치료하기 위해 의도된 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 바람직하게는 인간화된, 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나의 용도이며, 여기서 건선의 표피 과증식(epidermal hyperproliferation)은 IGF-IR의 발현 또는 과발현과 및/또는 IGF-IR과 그의 자연 리간드의 상호작용에 의해 매개되는 신호의 전달 경로의 과활성화와 관련될 수 있다 (Wraight C.J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18(5):521-526. Reversal of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulin-like growth factor Ｉ receptor antisense oligonucleotides). 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 목적은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 예방 또는 치료하기 위해 의도된 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 바람직하게는 인간화된, 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나의 용도이다.

예방 및/또는 치료할 수 있는 암 중에서, 전립선 암, 골육종, 폐암, 유방암, 자궁내막암 또는 결장암(colon cancer) 또는 IGF-IR을 과발현하는 임의의 다른 암이 바람직하다.

또 하나의 양상에 따르면, 본 발명의 대상은 IGF-I 수용체의 비정상적인 존재가 의심되는 생물학적 시료로부터 출발하는 IGF-I 수용체의 과발현 또는 소발현(underexpression), 바람직하게는 과발현과 관련된 질병의 진단방법, 바람직하게는 시험관내 진단방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 생물학적 시료는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나와 접촉되며, 상기 항체는 필요하다면 표지될 수 있음을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 진단방법에서 IGF-I 수용체의 과발현과 관련된 상기 질병은 암일 것이다.

또 하나의 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 또한 IGF-IR의 과발현은 물론 하이브리드-R의 과발현과 관련된 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 항체는 하이브리드-R, 이소형(들) A 및/또는 B에 결합할 수 있고, 또한 바람직하게는 여기에서 IGF1 및/또는 IGF2 및/또는 인슐린으로 지정된 그의 자연 리간드의 결합을 억제할 수 있으며, 및/또는 상기 하이브리드-R의 티로신 키나제 활성을 특이적으로 억제할 수 있음을 특징으로 한다.

상기 항체, 또는 그의 기능성 단편의 하나는 검출 가능한 및/또는 정량 가능한 신호를 얻기 위하여 면역컨쥬게이트(immunoconjugate) 형태, 또는 표지된 항체 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따라 표지된 항체들 또는 그의 기능성 단편들은, 예를 들어 퍼옥시다제, 알카리성 포스파타제, α-D-갈락톡시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코스 아밀라제, 카르보닉 안하이드라제, 아세틸콜린에스테라제, 리소자임, 말레이트 디하이드로게나제 또는 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 등의 효소와 함께, 또는 바이오틴, 디그옥시게닌(digoxygenin) 또는 5-브로모데옥시유리딘(5-bromodeoxyuridine) 등의 분자에 의해 컨쥬게이트될 수 있는 면역컨쥬게이트(immunoconjugates)라 불리우는 항체를 포함한다. 형광 표지는 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편에 컨쥬게이트될 수 있으며, 특히 플루오레세인(fluorescein) 및 그의 유도체, 플루오로크롬(fluorochrome), 로다민(rhodamine) 및 그의 유도체, GFP ("녹색 형광 단백질"에 대한 GFP), 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone) 등을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트에서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편은 당업계의 기술자에게 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다. 이들은 효소 또는 형광표지에 직접 결합되거나 또는 글루타르알데히드, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세트산(DPTA) 같은 폴리알데히드 등의 결합 그룹 또는 스페이서 그룹(spacer group)의 매개에 의해, 또는 치료 컨쥬게이트에 대해 상술한 바와 같은 결합제의 존재 하에 제조할 수 있다. 플루오레세인 타입의 표지를 함유하는 컨쥬게이트는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조할 수 있다.

다른 컨쥬게이트는 또한 루미놀 및 디옥세탄 등의 화학발광표지, 루시페라제 및 루시페린 등의 생-발광표지(bio-luminescent labels), 또는 요오드¹²³, 요오드¹²⁵,요오드¹²⁶,요오드¹³³, 브롬⁷⁷, 테크네튬^99m, 인듐¹¹¹, 인듐^113m, 갈륨⁶⁷, 갈륨⁶⁸, 루테늄⁹⁵, 류테늄⁹⁷, 루테늄¹⁰³, 루테늄¹⁰⁵, 수은¹⁰⁷, 수은²⁰³, 레늄^99m, 레늄¹⁰¹, 레늄¹⁰⁵, 스칸듐⁴⁷, 텔루륨^121m, 텔루륨^122m, 텔루륨^125m, 툴륨¹⁶⁵, 툴륨¹⁶⁷, 툴륨¹⁶⁸, 플로린¹⁸, 이트륨¹⁹⁹, 요오드¹³¹ 등의 기타 방사활성 표지를 포함한다. 항체에 치료학적 방사성 동위원소를 직접적으로 또는 상술한 EDTA, DTPA 등의 킬레이트제를 통해 결합시키기 위해 존재하는 당업계의 기술자에게 알려진 방법은, 진단에 사용될 수 있는 방사성 원소에 사용할 수 있다. 클로라민 T 방법 [Hunter W. M. and Greenwood F. C., 1962, Nature 194:495]에 의해 Na[I¹²⁵]로 표지하거나 또는 크록포드(Crockford) 등의 기술(미국특허 4,424,200)에 의해 테크네튬^99m으로 표지하거나 또는 나토위치(Hnatowich) (미국특허 4,479,930호)에 기술된 바와 같은 DTPA를 통해 부착하는 것을 언급할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 항체들, 또는 그의 기능성 단편들은 생물학적 시료에서 IGF-I 수용체의 과발현 또는 소발현, 바람직하게는 과발현의 탐지(detection) 및/또는 정량화 방법에 사용할 수 있으며, 다음의 단계들을 포함함을 특징으로 한다: a) 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나와 접촉시키는 단계; 및 b) 가능하게 형성되는 IGF-IR/항체 복합체(IGF-IR/antibody complex)를 입증하는 단계.

구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 항체들, 또는 그의 기능성 단편들은 생물학적 시료에서 IGF-I 수용체의 탐지 및/또는 정량화 방법, IGF-의존성 암 또는 기타 건선 또는 죽상동맥경화증의 예방 및/또는 치료의 효능을 모니터링하는 방법에 사용할 수 있다.

더욱 일반적으로, 본 발명에 따른 항체들, 또는 그의 기능성 단편들은 IGF-I 수용체의 발현이 정성적 및/또는 정량적 방법으로 관찰되어야 하는 임의의 상황에서 유리하게 사용할 수 있다.

바람직하게, 생물학적 시료는 생물학적 유체, 예를 들어 인간 기원의 혈청, 전혈(whole blood), 세포들, 조직시료 또는 생체조직검사에 의해 형성된다.

이러한 탐지 및/또는 투여량을 수행하기 위하여 임의의 절차 또는 통상적인 시험이 사용될 수 있다. 상기 시험은 경쟁 또는 샌드위치 시험, 또는 항체-항원 타입의 면역복합체(immune complex)의 형성에 의존하는 분야의 기술자에게 알려진 임의의 시험일 수 있다. 본 발명에 따른 적용 이후에, 항체 또는 그의 기능성 단편들의 하나는 고정화 또는 표지화 할 수 있다. 이 고정화는 당업계의 기술자에게 알려진 다수의 지지대에서 수행할 수 있다. 이들 지지대는 특히 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 또는 자연 또는 변형된 세포를 포함할 수 있다. 이들 지지대는 가용성 또는 불용성일 수 있다.

실시예를 통하여, 바람직한 방법은 면역형광, 또는 방사성 면역평가 (RIA) 기술 또는 이의 균등기술에 의해 ELISA 기술에 따라 면역효소 공정을 수행한다.

따라서, 본 발명은 또한 IGF-I 수용체의 과발현 또는 소발현에 의해 유도된 질병의 진단방법을 수행하거나 또는 생물학적 시료에서 IGF-I 수용체의 과발현 또는 소발현, 바람직하게는 상기 수용체의 과발현의 탐지 및/또는 정량화를 수행하는데 필요한 키트 또는 세트를 포함하며, 여기서 상기 키트 또는 세트는 다음 인자의 포함함을 특징으로 한다: a) 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나; b) 선택적으로, 면역반응에 유리한 배지(medium)의 형성을 위한 시약; c) 선택적으로, 면역반응에 의해 생산된 IGF-IR/항체 복합체를 입증하게 하는 시약.

본 발명은 또한 암, 특히 상기 세포 독성제 또는 상기 항-HER2/neu 항체가 일반적으로 처방되는 암 및, 특히, 종양세포가 IGF-I 수용체를 발현 또는 과발현하는 암을 예방 또는 치료하기 위해 의도된 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 조합 생성물로서의 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 대상은 또한 IGF-I 수용체를 발현하거나 또는 과발현하는 세포에 생물학적으로 활성인 화합물(biologically active compound)의 특이 표적화를 위해 의도된 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

여기서 생물학적으로 활성인 화합물은 세포 활성, 특히 그의 성장, 그의 증식, 전사 또는 유전자 번역을 조절, 특히 억제할 수 있는 임의의 화합물을 나타내는 것으로 의도된다.

본 발명의 대상은 또한 바람직하게는 표지된, 특히 방사성 표지된, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능성 단편들의 하나를 포함하는 생체내 진단시약, 및 IGF-I 수용체의 세포에 의한 발현 또는 과발현과 관련된 암의 의학적 영상화(medical imaging), 특히 암의 탐지에서의 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약제로서, 본 발명에 따른, 조합 생성물로서의 조성물 또는 항-IGF-IR/독소 컨쥬게이트 또는 방사성 원소에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 컨쥬게이트 또는 조합 생성물로서의 상기 조성물은 부형제 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable vehicle)와 혼합될 것이다.

본 명세서 설명에서, 약제학적으로 허용되는 담체는, 부수적 반응을 일으키지 않고 약제학적 조성물에 도입되는 화합물 또는 화합물의 조합을 나타내는 것으로 의도되며, 이는 예를 들어 활성화합물(들)의 투여를 촉진시키고, 체내에서 그것의 수명 및/또는 효능을 증가시키며, 용액 중에 그의 용해도를 증가시키거나 또는 기타 보존성을 향상시킨다. 이들 약제학적으로 허용되는 담체는 잘 알려져 있으며 또한 선택된 활성화합물(들)의 투여 양상 및 성질의 기능에 따라 당업계의 기술자에 의해 적절히 채용될 것이다.

바람직하게, 이들 화합물은 전신 경로, 특히 정맥내 경로, 근육내, 진피내, 복강내 또는 피하 경로, 또는 경구 경로에 의해 투여될 것이다. 보다 바람직한 방법에서, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물은 순차적인 방법으로 여러 번 투여될 것이다.

이들의 투여방법, 투여량 및 최적 약제학적 형태는 예를 들어 환자의 나이 또는 체중, 환자의 일반증상의 심도, 치료 내성 및 나타난 부작용과 같은 환자에 적용된 치료 시 일반적으로 고려되는 기준에 따라 결정할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 실시예 및 도면을 참조하여 설명할 것이다.

도 1은 MCF-7 모델에서 항 IGF-1R 항체의 시험관내 평가를 나타낸다.

도 2 및 3은 DU145에 대한 항 IGF-1R 항체의 생체내 평가를 나타낸다.

도 4는 IGF-IR을 발현하는 완전한 세포(intact cell)에 대한 [¹²⁵I]-IGF-1의 변위(displacement)를 나타낸다.

도 5는 면역캡처(immunocapture) 된 HR-A에 대한 [¹²⁵I]-IGF-1의 변위를 나타낸다.

도 6은 면역캡처 된 HR-B에 대한 [¹²⁵I]-IGF-1의 변위를 나타낸다.

도 7은 IR-A를 발현하는 완전한 세포에 대한 [¹²⁵I]-INS의 변위를 나타낸다.

도 8은 IR-B를 발현하는 완전한 세포에 대한 [¹²⁵I]-INS의 변위를 나타낸다.

실시예 1: IGF-1R 에 대한 모노클로날 항체들의 생성

SP2/0-Ag14 골수종 세포라인 및 가용성 α2-β2 헤테로테트라머 재조합 인간 IGF-1R (R & D 시스템, 미네폴리스, 미국)로 면역된 BALB/c 마우스 유래의 스플레노사이트(splenocytes)의 융합에 의해 하이브리도마를 생성하였다. 수득한 마우스의 항체를 먼저 MCF-7 세포들에 대한 ELISA 및 FACS 분석에 의해 스크리닝하였다. 그 다음,IGF-1 및 IR을 둘 다 인식하는 항체를 제거하기 위하여, Sf9-IGF-1r 대 Sf9-IR 세포들에 대한 최종 스크리닝을 수행하였다. 선택된 MAbs (MCF-7 세포에 대한 야생형 수용체를 인식하며 ELISA에 양성임)를 복수액(ascitic fluids)으로서 생산하였으며 또한 표 1에 요약된 바와 같이 시험관내 및/또는 생체내 시험을 하기 전에 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

항-IGF-IR 모노클로날 항체의 선택

	FACSCAN 분석			이소타입 (Isotype)	시험관내 활성	생체내 활성
	MCF-7	Sf9 IGF-1R+	Sf9 IR+		MCF-7	DU145
2 D10	+	+	-	IgG1κ	+	+
2F2	+	-	-	IgG1κ	+/-	+/-
6E5	+	+	-	IgG1κ	+/-	+
7A4	+	+	-	IgG1κ	-	-
7 G3	+	-	-	IgG1λ	-	-
9E5	+	+	-	IgG1κ	+/-	-
9F5	+	+	+	Nd	Nd	Nd
10B7	+	-	-	Nd	Nd	Nd
11 H6	+	+	-	IgE	Nd	-
12B1	+	+	-	IgG1κ	+	-
12D5	+	+	-	IgG1κ	+	Nd
12D8	+	Nd		Nd	Nd	Nd
13F5	+	+	Nd	IgG1κ	+	+
13G10	+	+/-	-	IgG1λ	+/-	Nd
15B9	+	+	-	IgG1κ	+/-	-
16A12	+	-	+	IgG1κ	+/-	-
9D5	+	Nd	-	IgG1κ	Nd	Nd
14 H1	-	Nd	+	IgG1κ	Nd	Nd
15 H1	-	Nd	Nd	IgG1κ	Nd	Nd
18B5	Nd	Nd	Nd	Nd	Nd	Nd
20D1	Nd	Nd	Nd	IgG1κ	Nd	-
21B3	-	-	-	Nd	Nd	Nd
13F10	Nd	Nd	Nd	Nd	Nd	Nd
14A1	-	Nd	Nd	Nd	Nd	Nd
2B10	+	-	-	IgG1κ	-	-
3A9	+	+/-	-	IgG1κ	Nd	Nd
3 C9	+	+	-	IgG1κ	-	-
4 G4	+	+	-	IgG1κ	+	Nd
6F4	+	-	-	IgG1κ	+/-	-
9 E10	+	+/-	-	IgG1λ	+/-	Nd
14 D7	+	+	-	IgG1κ	Nd	Nd
21E3	+	-	-	IgG2a	+/-	nd

실시예 2: 항-IGF-1R 항체들의 시험관내 활성

방법

ATCC로부터 배양받은 MCF-7 세포들을 페놀 레드 유리-RPMI 배지 (인비트로겐 코포레이션, 스코틀랜드, 영국), 10% FCS (인비트로겐 코포레이션), 1% L-글루타민 (인비트로겐 코포레이션) 중에서 일상적으로 배양하였다. MCF-7 세포는 혈청 유리 배지 중에서 5 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직 배양판 내에서 평판 배양하였다. 24시간 후 IGF1을 1 내지 50 ng/ml 범위의 투여량으로 최종 농도가 5 ㎍/ml인 각 시험 대상 항체의 부재 하에 또는 존재 하에 배지에 첨가하였다. 3일 후에 세포를 0.5 μCi의 [³H]티미딘 (아머샴 바이오사이언스 AB, 웁살라, 스웨덴)으로 16시간 동안 펄스(pulse) 하였다. 트리클로로 아세트산-불용성 DNA에 혼입된 [³H]티미딘의 크기를 액체 섬광 계수기로 정량하였다. 그 결과를 증식 지수로 표현하였다 (세포 + IGF1 + 항체의 cpm/세포 + 항체 단독의 cpm).

결과

시험관내 평가는 분열촉진 활성 면에서 Mabs의 1차 스크리닝이었다. 이들 평가를 위해, 복수액으로서 생성된 항체를 IGF1과 동시에 MCF-7 세포에 첨가하고, 상업적으로 입수가능한 αIR3 Mab와 비교하여 적어도 이 항체만큼 효능이 있는 항체를 선택하고자 하였다. 이전의 응답의 표 2^*에서 (+)로서 기재된 양성 Mabs (5 Mabs)는, 세포를 IGF1의 최고 투여량 (50 ng/ml)으로 자극하였을 때 증식지수 ＜ 5를 제공하는 것이다. 도 1은 6개의 강한 시험관내 억제제 중에서 4개(2D10, 12D5, 12B1, 13F5)의 시험관내 활성을 보여준다. 2F2 및 21E3 Mabs는 (± )^* Mab (IGF1의 최고농도에 대해 5＜증식지수＜15)로 간주되었으며, 또한 7G3 및 2B10은 비-중화 항체 (증식지수＞ 15)로 간주되었다. 21E3이 IgG2 이소타입(isotype)의 유일한 Mab임을 주목하면 흥미롭다.

실시예 3: 항-IGF-1R 항체들의 생체내 활성

방법

ATCC로부터 배양받은 DU145 세포들은 DMEM 배지(인비트로겐 코포레이션, 스코틀랜드, 영국), 10% FCS (인비트로겐 코포레이션), 1% L-글루타민 (인비트로겐 코포레이션) 중에서 일상적으로 배양하였다. 세포들은 이들이 급격한 성장 상에 있도록 생착(engraftment) 전에 2일간 분할하였다. 2백만 개의 DU145 세포들을 PBS 중에서 스위스 누드 마우스(Swiss nude mice)에 생착하였다. 이식(implantation) 하루 후에, 동물들을 6 개의 쥐 그룹으로 나누었다. 마우스는 시험 대상인 각 항체 200㎍으로 종양의 반대 측에 피하로 일주일에 3회 처리하였다. 대조군은 1차 스크리닝에서 마우스의 이소타입 대조군(EC2)으로 처리하거나 또는 다음 스크리닝에서 PBS로 처리하였다. 그 이유는 첫 번째 실험에서는 이들 2개의 마우스 그룹 간에 종양성장의 차이가 관찰되지 않았기 때문이다. 종양 부피는 일주일에 한번 측정하였으며, 또한 식: π/6 X 길이 X 폭 X 높이로 계산하였다.

결과

3개의 생체내 실험들은 Mabs의 패널을 시험하기 위해 수행하였다. 도 2 및 3은 13F5, 2D10 및 6E5가 DU 145세포의 생체내 성장을 현저하게 억제함을 보여준다. 통계분석 (Mann and Whitney test)은 표 2에 나타낸다.

생체내 데이터의 통계분석

1차 스크리닝	D16	D23	D29	D36	D43
PBS /13F5 Mann-Whitney (Wilcoxon)	p=0,47	p=0,086	p=0,046	p=0,015	p=0,023

2차 스크리닝	D12	D20	D26	D30
PBS /2 D10 Mann-Whitney (Wilcoxon)	p=0,0041	p=0,0017	p=0,0027	p=0,0027
PBS /6 E5 Mann-Whitney (Wilcoxon)	p=0,027	p=0,013	p=0,0092	p=0,019
PBS /12B1 Mann-Whitney (Wilcoxon)	p=0,11	p=0,11	p=0,067	p=0,11
PBS /2F2 Mann-Whitney (Wilcoxon)	p=0,18	p=0,067	p=0,050	p=0,14

3차 스크리닝	D12	D20	D26	D33
PBS/16A12 Mann-Whitney (Wilcoxon)	p=0,063	p=0,087	p=0,19	p=0,11

실시예 4: IGF-IR 및 하이브리드-R에 결합하는 2D10, 12D5, 13F5 능력의 평가

이 연구에 사용된 세포는 다음과 같다:

-R+: IGF-I 수용체 (IGF-IR) cDNA로 안정하게 형질도입된 R-섬유아세포;

-R-/IR-A: 인슐린 수용체 이소형 A (IR-A) cDNA로 안정하게 형질도입된 R-섬유아세포;

-R-/IR-B: 인슐린 수용체 이소형 B (IR-B) cDNA로 안정하게 형질도입된 R-섬유아세포;

-R+/IR-A: IGF-I 및 인슐린 수용체 이소형 A cDNA로 안정하게 공-형질도입되고, 따라서 하이브리드 수용체 A (하이브리드-RsA)를 발현하는 R-섬유아세포;

-R+/IR-B: IGF-I 및 인슐린 수용체 이소형 B cDNA로 안정하게 공-형질도입 되고, 따라서 하이브리드 수용체 A (하이브리드-RsB)를 발현하는 R-섬유아세포.

실시예 4-1: 2D10, 12D5, 13F5 및 αIR-3에 의한 IGF-IR에 대한 [ ¹²⁵ I]IGF1의 변위분석

[¹²⁵ I]IGF1 (20,000 cpm)을 미표지된 리간드 (IGF1, IGF2 또는 인슐린) 또는 항체들 (2D10, 12D5, 13F5)의 증가하는 농도의 존재 하에 또는 부재 하에 4℃에서 16시간 동안 R+ 완전한 세포(intact cell)에 결합시켰다. 결과는 최대 특이성 결합의 %로서 구성하여 도 4에 나타내었다.

2D10 및 13F5는 둘 다 참조 항체 αIR3 (IC₅₀:0.05 nM)에 비하여, IGF1을 서브-나노몰(sub-nanomolar)의 친화성으로, 또한 이 실시예에서는 각각 0.15 및 0.20 nM의 IC₅₀으로, 효과적이고 충분하게 변위하였다. 이 친화성은 자연 IGF-IR 리간드 IGF1 (이 실시예에서 2.2nM) 및 IGF2 (이 실시예에서 15nM)의 친화성보다 더 높은 것이다.

실시예 4-2: 2D10, 12D5, 13F5 및 47-9에 의한 하이브리드-RsA에 대한 [ ¹²⁵ I]IGF1의 변위분석

R+/IR-A 세포 용출액으로부터 수득한 하이브리드-RsA를 항 IR 항체 83-7로 피복된 Maxisorb 플레이트에서 면역 캡처하였다.

이어서 [¹²⁵ I]-IGF1 (도 5)을 미표지된 리간드 (IGF1, IGF2 또는 인슐린) 또는 항체들 (2D10, 12D5, 13F5, 47-9, 9G4)의 증가하는 농도의 존재 하에 또는 부재 하에 면역 캡처된 수용체에 결합시켰다. 결과는 최대 특이성 결합의 %로 구성하여 도 5에 나타내었다.

2D10 및 13F5는 표지된 IGF1을 매우 유사한 서브나노몰의 친화성으로, 또한 이 실시예에서는 각각 0.2 및 0.35 nM의 친화성으로, 효과적으로 충분하게 변위하였다. 비교하면, 47-9는 0.18 nM의 IC₅₀ 값을 나타내었다 (도 5).

이들 친화성은 자연 하이브리드-RsA 리간드 IGF1 (이 실시예에서 2.0 nM) 및 IGF2 (이 실시예에서 12 nM)의 친화성보다 더 높은 것이다.

실시예 4-3: 2D10, 12D5, 13F5 및 47-9에 의한 하이브리드-RsB에 대한 [ ¹²⁵ I]IGF1의 변위분석

R+/IR-B 세포 용출액으로부터 수득한 하이브리드-RsB를 83-7 항체로 피복된 Maxisorb 플레이트에서 면역 캡처하였다.

이어서 [¹²⁵ I]-IGF1 (도 6)을 IGF1, IGF2, 인슐린 또는 항체 (2D10, 12D5, 13F5, 47-9, 9G4)의 증가하는 농도의 존재 하에 또는 부재 하에 면역 캡처된 수용체에 결합시켰다. 결과는 최대 결합의 %로서 구성한다.

2D10 및 13F5는 표지된 IGF1을 매우 유사한 서브나노몰의 친화성으로, 또한 이 실시예에서는 각각 0.04 및 0.15 nM의 친화성으로 효과적이고 충분하게 변위하였다. 비교하면, 47-9는 0.40 nM의 IC₅₀ 값으로 덜 효과적이었다 (도 6).

실시예 4-4: 2D10, 12D5, 13F5 및 MA-10에 의한 인슐린 수용체 A (IR-A) 및 B (IR-B) 이소형에 대한 [ ¹²⁵ I]인슐린의 변위분석

[¹²⁵ I]인슐린 (40,000 cpm)은 미표지된 리간드 (IGF1, IGF2 또는 인슐린) 또는 항체 (2D10, 12D5, 13F5)의 증가하는 농도의 존재 하에 또는 부재 하에 4℃에서 16시간 동안 R^-/IR-A 또는 R^-/IR-B 완전한 세포(intact cells)에 결합시켰다. 결과는 최대 특이성 결합의 %로 구성하여 IR-A 및 IR-B에 대해 각각 도 7 및 도 8로 나타내었다.

2D10 또는 12D5 또는 13F5 모두 참조 항체 MA-10 (IC₅₀: IR-A (도 7) 및 IR-B (도 8)에 대해 각각 0.90 및 1.5 nM)과 대조적으로 인슐린을 변위하지 않았다.

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof <130> D22514 <140> PCT/IB2005/002619 <141> 2005-07-27 <150> US 60/591 932 <151> 2004-07-29 <150> FR 04/08379 <151> 2004-07-29 <160> 26 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Arg Ser Ser Gln Thr Ile Ile His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Leu Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asp Gln Asn Phe Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Val Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Asn Val Ala 1 5 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<213> Mus musculus <400> 18 Glu Gly Gly Leu Val Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Ile His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gln Ala Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asp Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Val Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys His Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 22 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Glu Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr His Ser Pro Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys His Glu Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 23 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Glu Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr His Ser Pro Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys His Glu Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Leu Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Lys Met Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Ile Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Gly Ser Ala Gly Tyr Ile His Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Gly Gly Leu Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Val Ile Trp Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr His Ser Pro Leu Lys Ser 1 5 10 15

Claims (27)

1. 분리된 항체, 또는 그의 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 상기 단편은 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 IGF-IR에 결합할 수 있으며, 하이브리드-R, 이소형 A 또는 B에 결합할 수 있고, 상기 항체는:

   (a)서열번호 1, 2 및 3의 서열의 상보적 결정 부위 CDR들을 포함하는 경사슬 및 서열번호 4, 5 및 6의 서열의 CDR들을 포함하는 중사슬을 포함하는 항체;

   (b) 서열번호 7, 8 및 9의 서열의 상보적 결정 부위 CDR들을 포함하는 경사슬 및 서열번호 10, 11 및 12의 서열의 CDR들을 포함하는 중사슬을 포함하는 항체;

   (c) 서열번호 13, 14 및 15의 서열의 상보적 결정 부위 CDR들을 포함하는 경사슬 및 서열번호 16, 17 및 18의 서열의 CDR들을 포함하는 중사슬을 포함하는 항체,

   로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 분리된 항체, 또는 그의 결합 단편.
2. 청구항 1에 있어서,

   (a) 13F5로 불리우며, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중사슬 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경사슬을 포함하는 항체,

   (b) 12D5로 불리우며, 서열번호 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중사슬 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경사슬을 포함하는 항체,

   (c) 2D10으로 불리우며, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중사슬 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경사슬을 포함하는 항체,

   로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
3. 청구항 1에 기재된 항체를 분비할 수 있는 마우스의 하이브리도마(murine hybridoma).
4. 청구항 2에 기재된 항체를 분비할 수 있는 마우스의 하이브리도마(murine hybridoma).
5. (a)2004년 3월 25일 파리 파스퇴르 연구소 국립 미생물 배양 센터 (CNCM, Institut Pasteur, Paris)에 번호 I-3193으로 기탁된 마우스의 하이브리도마,

   (b)2004년 4월 8일 파리 파스퇴르 연구소 국립 미생물 배양 센터 (CNCM, Institut Pasteur, Paris)에 번호 I-3195로 기탁된 마우스의 하이브리도마,

   (c)2004년 5월 13일 파리 파스퇴르 연구소 국립 미생물 배양 센터 (CNCM, Institut Pasteur, Paris)에 번호 I-3214로 기탁된 마우스의 하이브리도마, 및

   (d)2004년 7월 1일 파리 파스퇴르 연구소 국립 미생물 배양 센터 (CNCM, Institut Pasteur, Paris)에 번호 I-3249로 기탁된 마우스의 하이브리도마,

   로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 마우스의 하이브리도마.
6. 항체 또는 그의 결합 단편으로서, 그것이 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 IGF-IR, 및 하이브리드-R, 이소형 A 또는 B에 결합할 수 있고, 상기 항체가 청구항 5에 기재된 하이브리도마에 의해 분비되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 결합 단편.
7. 청구항 1, 2, 또는 6 중 어느 한 항에 기재되거나, 또는 청구항 3, 4, 또는 5 중 어느 한 항에 따른 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하고 암을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 암은 전립선암인 것인 약학 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 조합 생성물로서, 항체, 세포독성제/세포증식억제제 또는 티로신 키나제 활성 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
9. 청구항 1, 2, 또는 6 중 어느 한 항에 기재되거나, 또는 청구항 3, 4, 또는 5 중 어느 한 항에 따른 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 약학 조성물로서, IGF-I 수용체의 과발현 또는 비정상적인 활성화와 관련된, 또는 IGF1 또는 IGF2와 IGF-IR의 상호작용에 의해 매개되는 신호의 전달경로의 과활성화와 관련된 질병을 치료하기 위한 약학 조성물이고, 상기 질병은 전립선암인 것인 약학 조성물.
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