KR101200176B1 - 풀루란 유도체?폴리에틸렌이민 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents
풀루란 유도체?폴리에틸렌이민 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 소수성이 부여된 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체는 치료를 목적으로 하는 유전자와 이온결합 및 소수성 결합을 통해 접합체와 유전자 간의 결합을 더욱 안정하게 유지할 수 있는 효과가 있어 기존의 이온결합만을 이용한 약물 전달체 보다 생체 내에서 더욱 안정하며 합성된 고분자 접합체는 고분자의 가수분해로 인해 세포내에서 쉽게 분해되므로 세포독성이 낮아 생체 적합성이 우수하며, 나아가 치료 목적의 유전자를 동물 세포내로 효율적으로 전달할 수 있는 효과가 있어 암을 포함하는 다양한 질병의 치료를 위한 용도로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 풀루란 유도체와 폴리에틸렌이민의 접합체를 이용한 생리활성 물질 전달체 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 소수성이 부여된 풀루란유도체 및 분지형 폴리에틸렌이민과의 접합체가 치료를 목적으로 하는 물질을 체내로 안정하게 전달할 수 있는 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유전자 치료란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 유전자를 세포내로 전달하기 위해서 바이러스성 벡터 또는 고분자나 나노입자를 이용한 비바이러스성 벡터가 연구되고 있다. 바이러스성 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus) 또는 아데노바이러스(Adenovirus) 등을 유전자 전달체로 이용한 것으로서 세포 내로의 높은 전달 효율을 갖는다는 장점 때문에 기존에 광범위하게 사용되어 왔으나, in vivo 안정성에서 문제점을 지니고 있다.
상기와 같은 바이러스성 벡터의 안정성 문제를 극복하기 위하여, 다양한 양이온성 중합체를 유전자 전달체로 이용하는 비바이러스성 벡터가 개발되어 왔다. 양이온성 중합체는 유전자와 중합체-유전자 복합체를 형성하여 진핵세포의 트랜스펙션을 유도하게 된다. 그 구체적인 메커니즘은 중합체-유전자 복합체 표면의 양전하와 세포 표면의 음전하의 전기적 상호작용에 의하여 복합체가 세포 표면에 결합한 후 엔도좀(endosome) 으로부터 세포질로 유전자가 방출되는 것으로 생각된다. 이러한 양이온성 중합체의 구체적 예로서, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리L-리신, 폴리아미도아민과 같은 양이온성 단일중합체 및 폴리에틸렌글라이콜(PEG)-블록-폴리L-리신 및 PEG-PEI 와 같이 상기의 단일중합체에 기초한 양이온성 블록 공중합체 또는 그래프트 공중합체 등을 들 수 있다. 이들 가운데 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethylenimine,PEI)은 음하전을 갖는 특징이 있는 핵산 물질을 압축하여 콜로이드 입자로 만들며, 세포내의 라이소좀 내에서도 pH 완충능력을 보유하여 플라스미드 데옥시리보 핵산을 다양한 세포에 전달하는 것이 보고된 바 있다[Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7297-7301; Godbey et al., J. Controlled Release 60 (1999)149-160].
그러나 세포 내 유전자 전달 효율 및 세포독성 관련 문제점들이 아직 남아있어서, 이를 해결하기 위한 많은 연구들이 계속적으로 진행되고 있으나 만족할 만한 결과들을 얻지 못하고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 동물세포 내로 질환의 치료를 목적으로 하는 유전자의 전달효율이 우수하고 세포독성이 낮아 체내에 안정한 신규한 유전자 전달체를 개발하려고 연구하던 중 생분해성 고분자인 풀루란에 소수성 잔기를 부여한 후, 폴리에틸렌이민을 결합시킨 접합체가 체내로 유전자를 효과적으로 전달시킬 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 풀루란 유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 생리활성 물질 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 생리활성 물질 전달체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료제를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 풀루란 유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 풀루란 유도체의 풀루란은 분자량이 5,000 Da ~ 1,000,000 Da인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 풀루란 유도체는 풀루란에 메칠기, 담즙산, 콜레스테롤 및 비이온성 폴리 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 도입한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 풀루란 유도체는 상기 풀루란에 피리딘 및 무수아세테이트를 첨가하여 수득한 풀루란아세테이트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민은 가지형이고, 분자량이 400Da ~ 10,000 Da의 무독성 단위체인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합체는 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 1 : 0.1 내지 1 : 10의 중량비로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체의 크기는 10nm ~ 300nm인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체에 이온결합 및 소수성 결합으로 결합된 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
풀루란을 아세틸화시켜 소수성 풀루란 유도체를 합성하는 단계;
상기 소수성 풀루란 유도체와 가교제를 중합시켜 중합체를 합성하는 단계; 및
상기 중합체를 폴리에틸렌이민과 중합시켜 양이온성 고분자 접합체를 합성하는 단계를 포함하는, 생리활성 물질 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합체에 목적하는 유전자를 결합시킬 경우, 이온결합 및 소수성 결합으로 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 풀루란 유도체와 가교제를 중합하는 단계는 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride), 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide) 또는 테트라하이드로푸란 (Tetrahydrofuran)에 용해된 소수성 풀루란 유도체 용액에 가교제를 첨가한 다음, 디에틸에테르(Diethyl Ether)에 침전시키거나 투석을 통해 수득하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가교제는 N,N'-carbonyldiimidazole(CDI), Dicyclohexyl carbodiimide (DCC) 및 N-(2-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodidimide(EDC) 으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항바이러스제, 항생제, 항진균제, 항대사제 및 항암제로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 생리활성 물질 전달체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자를 이용한 치료 대상이 암일 수 있다.
본 발명에 따른 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체는 치료를 목적으로 하는 유전자와 이온결합 및 소수성 결합을 통해 접합체와 유전자 간의 결합을 더욱 안정하게 유지할 수 있는 효과가 있어 기존의 이온결합만을 이용한 약물 전달체 보다 생체 내에서 더욱 안정하며 합성된 고분자 접합체는 고분자의 가수분해로 인해 세포내에서 쉽게 분해되므로 세포독성이 낮아 생체 적합성이 우수하며, 나아가 치료 목적의 유전자를 동물 세포내로 효율적으로 전달할 수 있는 효과가 있어 암을 포함하는 다양한 질병의 치료를 위한 용도로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 수소 핵자기 공명 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 / pDNA 복합체의 크기를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 / pDNA 복합체의 표면전하를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민과 플라스미드 유전자와의 복합체 형성을 확인하기 위한 다양한 전하비(N/P)에 따른 전기영동 사진이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 세포독성 측정결과이다. 대조군은 분자량 25,000 의 폴리에틸렌이민이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 시간 변화에 따른 세포독성 측정결과이다. 대조군은 분자량 25,000 의 폴리에틸렌이민이다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리엔틸렌이민의 유전자 전달 효율이다. 대조군은 분자량 25,000의 폴리에틸렌이민과 분자량 1,800의 폴리에틸렌이민이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 / pDNA 복합체의 크기를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 / pDNA 복합체의 표면전하를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민과 플라스미드 유전자와의 복합체 형성을 확인하기 위한 다양한 전하비(N/P)에 따른 전기영동 사진이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 세포독성 측정결과이다. 대조군은 분자량 25,000 의 폴리에틸렌이민이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 시간 변화에 따른 세포독성 측정결과이다. 대조군은 분자량 25,000 의 폴리에틸렌이민이다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 합성된 풀루란유도체-폴리엔틸렌이민의 유전자 전달 효율이다. 대조군은 분자량 25,000의 폴리에틸렌이민과 분자량 1,800의 폴리에틸렌이민이다.
본 발명은 동물세포내로 질병의 치료를 목적으로 하는 유전자의 전달 효율을 높임과 동시에 유전자 전달 후, 낮은 세포독성을 나타내는 생리활성 물질 전달체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 풀루란 유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에 따른 상기 생리활성 물질 전달체는 다음과 같이, 풀루란을 아세틸화시켜 소수성 풀루란 유도체를 합성하는 단계; 상기 소수성 풀루란 유도체와 가교제를 중합시켜 중합체를 합성하는 단계; 및 상기 중합체를 폴리에틸렌이민과 중합시켜 양이온성 고분자 접합체를 합성하는 단계를 포함하여 제조될 수 있는데, 보다 구체적인 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.
제1단계:
풀루란을
아세트화
시키는 단계
본 발명에서는 생리활성 물질 전달체의 제조를 위해 고분자 물질로 생분해성이 우수한 풀루란을 사용하였는데 풀루란은 친수성 고분자인 특징이 있다.
한편 본 발명에서는 본 발명의 생리활성 물질 전달체가 생체내 생리활성 물질에서 안정하게 치료 용도의 유전자를 전달하도록 상기 풀루란에 소수성 잔기를 부여하였다.
즉, 상기 풀루란에 소수성 잔기를 부여하는 것은 상기 풀루란에 메칠기, 담즙산, 콜레스테롤 및 비이온성 폴리 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 도입함을 통해 부여할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 풀루란에 피리딘 및 무수아세테이트를 첨가하여 소수성이 부여된 플루란아세테이트를 수득하였다.
상기 본 발명에서 사용한 풀루란은 아우레오바시디움 풀루란스 균주가 생산하는 포도당인 -(1-4) 또는 (1-6)으로 연결된 중성이면서 선형인 세포외 다당류로서, 하기의 구조식을 갖는다.
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 풀루란은 분자량이 5,000Da~1,000,000Da인 풀루란을 사용하는 것이 바람직하며, 소수성이 부여된 풀루란의 경우 메틸렌 클로라이드 용매에 더 잘 용해되는 경향을 갖는다.
<풀루란의 구조>
본 발명의 일실시예에서는 풀루란에 소수성을 부여하기 위해 먼저 풀루란을 포름아마이드에 용해시키고 이후 피리딘 및 무수아세트산을 첨가하여 반응시킨 후 물을 가하여 침전시킴으로써 소수화 된 풀루란, 즉 풀루란아세테이트를 수득하였고, 그 구조식은 하기에 기재된 바와 같다.
<풀루란아세테이트의 구조>
제2단계:
풀루란유도체와
가교제를
중합하는 단계
제1단계를 통해 소수성이 부여된 풀루란유도체가 합성되면 여기에 가교제를 첨가하여 중합체를 합성한다.
이때 상기 가교제로는 시중에서 판매되고 있는 가교제라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 N,N'-carbonyldiimidazole(CDI), Dicyclohexyl carbodiimide (DCC) 및 N-(2-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodidimide(EDC) 중에서 선택된 것을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 N,N'-carbonyldiimidazole (CDI)을 사용할 수 있으며 그 구조는 하기에 나타낸 바와 같다.
<가교제인 N,N'-carbonyldiimidazole(CDI)>
본 발명에서 상기 풀루란유도체에 가교제를 첨가하여 중합체를 합성하는 과정은 풀루란유도체의 -OH 반응기와 폴리에틸렌이민의 -NH2 반응기와의 카바메이트(carbanate)본드 형성을 위하여 풀루란유도체와 CDI를 중합시킨 것으로서, 풀루란유도체에 가교제를 첨가한 용액을 디에틸에테르(Diethyl ether) 용액하에 침전시키거나 또는 투석을 통해 반응물을 회수할 수 있으며, 그 과정은 하기 화학식과 같다.
<풀루란유도체와 가교제의 중합반응>
제3단계:
풀루란유도체와
가교제의
중합체를 폴리에틸렌이민과 중합시키는 단계
제2단계를 통해 풀루란유도체와 가교제가 결합된 중합체가 합성되면 폴리에틸렌이민과 중합시켜 양이온성 고분자 접합체를 합성한다.
일반적으로 가지형 폴리에틸렌이민의 가지사슬은 주사슬 질소 원자의 3?3.5 개당 하나 정도 존재하는 것으로 알려져 있으며, 가지형 폴리에틸렌이민의 독성은 LD50이 3g/kg 정도이며, 직접적인 식품 접촉물에 활용되는 것은 FDA에 의해 승인되어 있다. 현재, 루파졸(Lupasol) 또는 폴리이민(Polyimin)(제조사: BASF) 또는 여러 유도체들이 판매되고 있으며 그 구조는 하기 구조식과 같다.
<폴리에틸렌이민(상기 식에서, n은 7-2,300이고, p는 9-700임)>
특히 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)은 가지형 (branch) 일 수 있으며 그 분자량은 100 내지 10100 Da일 수 있고, 이때 분자량이 100 미만인 것을 사용할 경우에는 제조된 전달체가 유전자와 잘 결합할 수 없는 문제점이 있으며, 반면 분자량이 10100보다 클 경우에는 신장을 통해 몸 밖으로 배출되기 힘든 문제점이 있다. 따라서 상기 범위에 해당하는 폴리에틸렌이민을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 가지형의 분자량이 400Da ~10,000Da인 무독성 단위체를 사용할 수 있다.
또한, 상기 양이온성 고분자 접합체는 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 1:0.1~1:10의 중량비로 첨가하여 반응시킬 수 있으며, 본 발명에 따라 합성된 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민의 접합체는 그 크기가 10nm~300nm 일 수 있다.
상기 제2단계에서 합성된 풀루란아세테이트와 가교제인 CDI의 중합체와 폴리에틸렌이민을 반응시키는 과정은 하기 구조식에 나타낸 바와 같으며, 즉 풀루란유도체의 -OH 반응기와 폴리에틸렌이민의 -NH2 반응기가 카바메이트(carbamate) 본드 형성에 의해 중합됨을 통해 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 전달체를 합성할 수 있다.
또한, 상기 소수성 풀루란 유도체와 가교제를 중합하는 단계는 바람직하게는 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride), 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide) 또는 테트라하이드로푸란 (Tetrahydrofuran)에 용해된 소수성 풀루란 유도체 용액에 가교제를 첨가한 다음, 디에틸에테르(Diethyl Ether)에 침전시키거나 투석을 통해 수득할 수 있으며, 본 발명의 일실시예서는, 풀루란유도체, 즉 풀루란아세테이트와 가교제, 즉 CDI의 중합은 메틸렌클로라이드에 용해된 소수성 풀루란유도체 용액에 CDI를 첨가한 다음, 디에틸에테르에 침전시키는 과정을 통해 수득하였다.
<풀루란유도체-CDI와 폴리에틸렌이민의 결합 과정>
제4단계: 상기
양이온성
고분자 접합체를 플라스미드 유전자와 실온에서
정전기적
결합에 의해 복합체를 형성시키는 단계
나아가 상기 제3단계를 통해 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 전달체, 즉 양이온성 고분자 접합체는 추가로 질병의 치료를 위한 목적 유전자들과의 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있는데, 이때 상기 접합체에 유전자를 결합시키는 방법은 이온결합 및 소수성 결합을 통해 결합시킬 수 있다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 양이온성 고분자 접합체에 pCMV-루시페라제(pCMV-Luc)의 유전자를 HEPES 버퍼 상에서 30분간 상온에서 반응시킴으로써 이온결합 및 소수성 결합에 의해 복합체를 형성하였다.
한편, 상기 기술된 본 발명의 방법에 따라 제조된 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체는 질병 치료를 위한 유전자와 복합체를 형성하여 세포내로 상기 유전자를 효과적으로 전달시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포내에서 상기 접합체는 생분해되어 세포독성이 낮은 특징이 있어 생체에 적합하다.
그러므로 본 발명은 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민의 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체를 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 생리활성 물질 전달체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 또한, 본 발명에서 치료 대상인 질병으로는 바람직하게 암일 수 있다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유전자 치료제를 유효성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 전달체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 본 발명의 전달체의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 치료를 목적으로 하는 유전자의 종류는 이에 제한되지는 않으나, DNA, RNA, siRNA, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 포함될 수 있으며, 궁극적으로 본 발명에 따른 생리활성 물질 전달체를 이용하여 체내로 효율적으로 전달하고자 하는 상기 생리활성 물질로는 생체 내에서 목적하고자 하는 약리 효과를 나타낼 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있으며, 그 예로는 이에 제한되지는 않으나, DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항바이러스제, 항생제, 항진균제, 항대사제 및 항암제로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1>
풀루란아세테이트
-폴리에틸렌이민의 합성
<1-1>
풀루란아세테이트의
합성
풀루란(분자량 100,000 Da, Tokyo Chemical Industry) 1g 을 10ml의 포름아마이드(Formamide)에 넣고 50℃ 에서 강하게 교반하여 용해시킨 다음, 이 용액에 피리딘(Pyridine) 1.7 ml 와 무수아세트산(Acetic Anhydride) 2 ml 을 각각 첨가하여 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후 용액은 증류수 200ml에 침전하여 불순물을 제거하였으며, 이러한 과정을 3회 반복 실시하여 불순물을 제거하한 다음, 침전된 물질, 즉 풀루란아세테이트를 여과하여 회수하였다.
<1-2>
풀루란아세테이트의
하이드록시
(-
OH
) 그룹의 활성화
상기 <1-1>에서 수득한 풀루란유도체 1g 을 15ml의 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride)에 첨가한 후 37℃ 에서 강하게 교반하여 용해시켰다. 이후 상기 반응물에 N,N-carbonyldiimidazole(CDI, Sigma-Aldrich)를 10mmole의 농도로 첨가하고 3시간 동안 교반하였다. 반응 후 용액은 200ml 디에틸에테르(Diethyl Ether, Samchun Chemical)에 침전하여 미반응 물질과 불순물을 제거하였다. 이와 같은 과정을 3회 반복 실시하여 불순물을 제거하였고, 반응물은 진공건조기에서 건조하여 회수하였다.
<1-3>
풀루란아세테이트
-폴리에틸렌이민의 합성
상기 <1-2>의 반응으로 얻어진 반응물 50mg을 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, Sigma-Aldrich) 10ml에 용해시킨 후, 상기 용액을 1g의 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(분자량 1800 Da, Alfa Aesar)이 20ml의 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, Sigma-Aldrich)에 용해된 용액에 한 방울씩 떨어뜨려 반응 시켰으며, 이러한 반응을 24시간 동안 수행한 후 증류수로 3일간 투석(Dialysis membrane with MWCO 10,000 Da)하여 미반응 된 폴리에틸렌이민은 제거한 후 동결건조 하여 풀루란아세테이트-폴리에틸렌이민의 합성반응물을 수득하였다.
<
실시예
2>
풀루란유도체
-폴리에틸렌이민 합성 검증
상기 실시예 1에서 제조된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 합성이 제대로 합성되었는지 확인하기 위하여 1H-NMR(Avancek 500,Bruker,Germany)을 통해 확인하였으며 그 결과는 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1 에 나타낸 것과 같이, 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 합성구조는 그 화학구조가 명확히 분석되었으며, 풀루란유도체에 대한 폴리에틸렌이민의 결합 정도는 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, Sigma-Aldrich)방법으로 계산하였는데, 풀루란유도체(풀루란아세테이트)-폴리에틸렌이민 합성 비율은 하기 표 1에 기재된 바와 같으며, 각 비율에 따라 제조된 풀루란아세테이트-폴리에틸렌이민을 PA-PEI 1, PA-PEI 2, PA-PEI 3이라고 하였다.
| 합성고분자 코드 | Pullulan Acetate ( wt %) | Polyethyleneimine ( wt %) |
| PA-PEI 1 | 43.6 | 56.4 |
| PA-PEI 2 | 50.6 | 49.4 |
| PA-PEI 3 | 73.7 | 26.3 |
<
실시예
3>
풀루란유도체
-폴리에틸렌이민/유전자 복합체 입자 특성 및 표면 전하 분석
상기 실시예에서 제조한 본 발명에 따른 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체(PA-PEI 1, PA-PEI 2, PA-PEI 3)가 유전자를 전달시킬 수 전달체로서 사용될 수 있는지를 확인하기 위해, DNA가 결합된 복합체를 제조하였는데, 즉, 풀루란유도체-폴리에틸렌이민/pDNA 복합체는 풀루란유도체-폴리에틸렌이민과 플라스미드 유전자(pCMV-루시페라제)를 N/P 비 10의 비율로 HEPES 버퍼(25mM, pH 7.4)하에 혼합시켜 형성하였고, 상온에서 30분간 방치함으로써 이온결합을 통한 복합체를 형성하였고, Dynamic Light Scattering으로 형성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민/pCMV-루시페라제(pDNA) 복합체의 크기 및 표면 전하를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민/pCMV-루시페라제(pDNA) 복합체의 크기는 10~300nm의 크기를 갖는 것으로 나타났다.
<
실시예
4>
풀루란유도체
-폴리에틸렌이민 /
pDNA
복합체를 확증하기 위한 겔 지체 검사
풀루란유도체-폴리에틸렌이민과 pDNA와의 복합체의 형성을 보다 확실히 증명하기 위해, 겔 지체 검사를 수행하였는데, 이를 위해 대조군으로는 분자량 1800Da, 25000Da의 폴리에틸렌이민을 사용하였다. 즉, N/P 비율이 0.5/1 내지 2/1 하에서 형성되는 복합체의 복합체화 능력을 평가하기 위하여 pDNA와 결합시켰고, 이들 복합체는 1% 아가로오스 겔에서 100mV에서 15분간 전기영동 시켰다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 1,2,3, 즉 PA-PEI 1, PA-PEI 2, PA-PEI 3가 모두 pDNA와 이온결합을 통한 복합체를 형성한다는 사실을 알 수 있었다.
<
실시예
5>
자궁경부암 세포주에서의 전달체에 의한 세포 독성 평가
본 발명에서 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체가 질병 치료를 위한 수단으로 사용할 수 있는 지를 확인하기 위해, 한국세포주 은행에서 구입한 HeLa 세포주를 10%(v/v) 우태아 혈청(Gibco, USA)와 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, USA)을 포함하는 Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI 1640, Welgene)에 배양한 다음, 본 발명에 따른 풀루란유도체-폴리에틸렌이민의 세포 독성에 관한 평가를 위해 MTT 방법을 사용하였다. 즉, 96well Plate에 세포를 웰 당 3× 104 으로 분주하고 24시간 배양한 후 풀루란유도체-폴리에틸렌이민을 우태아혈청이 없는 RPMI 1640 배지에서 100ng/ml 내지 500㎍/ml의 농도로 처리하였다. 대조군으로는 분자량 25000Da의 폴리에틸렌이민을 단독으로 처리한 것을 사용하였다. 4시간 경과 후 우태아혈청이 포함된 RPMI 1640 배지로 교체한 후 24시간동안 더 배양하였다. 24시간 경과 후 MTT 용액을 웰 당 20㎕씩 첨가하고 4시간 더 배양 한 후 상층액을 제거하고 DMSO 용액을 100㎕ 씩 첨가한 후에 엘라이져 리더(ELISA reader)를 이용하여 570nm 에서 그 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 제조된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체(PA-PEI 1, PA-PEI 2, PA-PEI 3)는 폴리에틸렌이민을 단독으로 처리한 대조군과 거의 유사한 세포독성을 보임에 따라 상기 접합체들을 비교적 세포독성이 낮다는 사실을 알 수 있었고, 특히 PA-PEI 3는 PA-PEI 1 및 PA-PEI 2에 비해 세포 독성이 현저히 낮은 것으로 나타났다(도 4 참조).
<
실시예
6>
시간에 따른 자궁경부암 세포주에서의 전달체에 의한 세포 독성 평가
상기 실시예에서 제조한 본 발명의 풀루란유도체-폴리에틸렌이민이 자궁경부암 세포주에 대하여 세포 독성이 있는지를 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 풀루란유도체-폴리에틸렌이민을 PBS 버퍼에 용해시킨 후 37℃가 유지되는 항온수조에 넣어 둔 다음, 매일 10일간 적정량 채취해 상기 실시예 5 와 같은 방법으로 세포독성을 테스트 하였다. 이때 대조군으로는 분자량 1800Da의 폴리에틸렌이민과 분자량 25000Da의 폴리에틸렌이민을 단독으로 처리한 군을 사용하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 제조된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체(PA-PEI 1, PA-PEI 2, PA-PEI 3)는 자궁경부암 세포주에 대해 처리 농도가 증가할수록 세포 독성을 유발하여 세포 생존율이 감소되는 것으로 나타났으나, 이러한 세포 독성은 대조군과 거의 유사한 값을 보임으로써 유의한 차이는 없는 것으로 나타났고(도 5 참조), 특히 PA-PEI 3를 처리한 군은 대조군으로 사용한 분자량 25000Da의 폴리에틸렌이민만을 처리한 군에 비해 오랜 시간동안에도 세포에 독성을 유발시키지 않는 것으로 나타났다(도 6 참조).
따라서 본 발명에 따른 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체는 세포에 대해 큰 독성을 유발하지 않는다는 사실을 알 수 있었다.
<
실시예
7>
자궁경부암 세포주에서의 플라스미드 유전자 전달 효능 평가
나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체가 유전자의 전달체로서 세포내로 목적하는 유전자(예컨대, 질병 치료를 위한 유전자)를 안정하게 전달하여 그 효과를 유발시킬 수 있는지를 조사하기 위해, 자궁경부암 세포주를 대상으로 풀루란유도체-폴리에틸렌이민/pDNA 복합체를 처리하여 세포 내로의 pDNA의 전달 효능을 분석하였는데, 이때 상기 pDNA로 플라스미드 pCMV-루시페라제(pCMV-Luc)를 사용하였다. 이를 위해 실험 전날 HeLa 세포주를 6웰 플레이트에 웰 당 세포를 5× 105씩 분주하였고, 각 플레이트에 세포가 70%정도 균일하게 성장했을 때 풀루란유도체-폴리에틸렌이민과 pCMV-Luc이 각각 5:10 N/P 비율로 혼합하여 복합체를 형성한 후 상온에서 30분간 방치한 다음 각 웰에 처리하였다. 이때 대조군으로는 분자량이 25000Da 및 1800Da인 폴리에틸렌이민을 단독으로 각각 처리한 것을 사용하였다. 4시간 배양 후 우태아혈청이 포함된 RPMI 1640배지로 교환해 준 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 DPBS로 2번 세척한 후 1× 용해 완충액(Promega, Madison, WI)을 이용하여 용해시켰다. 루시페라제 활성은 화학발광측정기를 이용하여 상대적 발광 단위(relative light unit, RLU)로 측정하였으며, 루시페라제의 최종 수치는 RLU/mg단백질로 기록하였다. 전체 단백질 검사는 BCA 단백질 검사 키트(Thermo scientific,USA)을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 분자량이 1800Da의 폴리에틸렌이민을 처리한 대조군의 경우 유전자의 전달 효율은 매우 낮은 것으로 나타난 반면, 본 발명에서 합성된 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체는 분자량이 1800Da의 폴리에틸렌이민에 비해 유전자의 전달 효율이 매우 우수한 것으로 나타났고, 그 전달 효율은 분자량 25000Da의 폴리에틸렌이민을 사용한 것과 비슷한 효율로 나타났다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (15)
- 풀루란 유도체와 폴리에틸렌이민이 결합된 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체로서, 상기 풀루란 유도체는 풀루란에 메칠기, 담즙산, 콜레스테롤 및 비이온성 폴리 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 도입한 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 풀루란 유도체의 풀루란은 분자량이 5,000 Da ~ 1,000,000 Da인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 풀루란 유도체는 풀루란에 피리딘 및 무수아세테이트를 첨가하여 수득한 풀루란아세테이트인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체. - 제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌이민은 가지형이고, 분자량이 400Da ~ 10,000 Da의 무독성 단위체인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체. - 제1항에 있어서,
상기 접합체는 풀루란유도체와 폴리에틸렌이민이 1 : 0.1 내지 1 : 10의 중량비로 결합된 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체. - 제1항에 있어서,
상기 풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체의 크기는 10nm ~ 300nm인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체. - 제1항에 있어서,
풀루란유도체-폴리에틸렌이민 접합체와 이온결합 및 소수성 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체. - 풀루란을 아세틸화시켜 소수성 풀루란 유도체를 합성하는 단계;
상기 소수성 풀루란 유도체와 가교제를 중합시켜 중합체를 합성하는 단계; 및
상기 중합체를 폴리에틸렌이민과 중합시켜 양이온성 고분자 접합체를 합성하는 단계를 포함하는, 생리활성 물질 전달체의 제조방법. - 제9항에 있어서,
상기 접합체에 목적하는 유전자를 결합시킬 경우, 이온결합 및 소수성 결합을 통해 복합체를 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체의 제조방법. - 제9항에 있어서,
상기 소수성 풀루란 유도체와 가교제를 중합하는 단계는 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride), 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide) 또는 테트라하이드로푸란 (Tetrahydrofuran)에 용해된 소수성 풀루란 유도체 용액에 가교제를 첨가한 다음, 디에틸에테르(Diethyl Ether)에 침전시키거나 투석을 통해 수득하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 가교제는 N,N'-carbonyldiimidazole(CDI), Dicyclohexyl carbodiimide (DCC) 및 N-(2-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodidimide(EDC)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항바이러스제, 항생제, 항진균제, 항대사제 및 항암제로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 생리활성 물질 전달체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료제.
- 제14항에 있어서,
상기 유전자를 이용한 치료 대상이 암인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제.
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