KR101177375B1

KR101177375B1 - Ｍｉｃ?１ 유전자 또는 그의 발현 단백질을 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101177375B1
Application number: KR1020100015177A
Authority: KR
Inventors: 이한수; 박이하; 이재섭; 진영준; 이정형; 오구택; 김영명
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-02-19
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2012-08-27
Anticipated expiration: 2030-02-19
Also published as: KR20110095611A; WO2011102574A1

Abstract

본 발명은 MIC-1을 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1) 유전자 또는 그의 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, MIC-1은 VEGF와 유사하게 저산소 조건에서 발현이 유도되고 상처치료에 효과를 나타내나, VEGF와 달리 염증반응을 촉발하지 않고 혈관누수를 유도하지 않기 때문에, 급성 또는 만성 상처치료를 위한 유전자 치료제 및 피부외용제로서 사용될 수 있다.

Description

ＭＩＣ?１ 유전자 또는 그의 발현 단백질을 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical compositions for wound healing comprising MIC-1 gene or protein}

본 발명은 MIC-1을 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 급성 또는 만성 상처치유 효과를 나타내는 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1) 유전자 또는 그의 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체를 보호하는 방어막 역할을 한다. 피부가 손상을 입게 되면 손상부위가 노출되어 외부 균의 침입을 받을 수 있다. 따라서 신속한 상처치료가 되어야 감염(infection)을 막을 수 있고 또한 그로 인한 과도한 염증반응 (inflammation)을 막을 수 있다. 과도한 염증반응은 치유기간을 연장시킬 뿐 아니라 흉터의 원인이 되기도 한다.

상처치유(wound healing)란 임상적으로 피부가 완전하게 봉합되는 것을 의미하며, 만성상처(chronic wound)가 아닌 일반적인 상처는 대략 3-14일 안에 완전히 치유된다. 상처치유는 각질세포(keratinocyte), 섬유모세포(fibroblast), 혈관내피세포(endothelial cell), 대식세포(macrophage), 혈소판(platelet) 등 여러 종류의 세포가 상호작용하며 조절하는 복잡한 과정으로, 크게 세 단계로 이루어진다: 염증기(inflammation phase), 증식기(proliferation phase) 그리고 재형성기(remodeling phase). 각각의 과정은 많은 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine) 그리고 케모카인(chemokine)이 조절하는 복잡한 신호전달망(signaling network)에 의해 조절된다.

염증기: 상처가 생기면 상피층(epithelial layer)이 훼손되고, 각질세포가 저장되어 있던 IL-1(interleukin-1)을 분비한다. 이것은 방어막이 훼손되었음을 전달하는 첫 번째 신호가 된다. 또한, 상처부위를 통해 빠져나온 혈액성분은 혈액응고(blood clotting) 과정을 촉진시키는데, 혈소판이 분비하는 과립에는 EGF(epidermal growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor) 그리고 TGF-β(transforming gtowth factor-β) 등의 성장인자가 있다. PDGF와 IL-1은 중성구(neutrophil)를 상처부위로 유도하는 역할을 한다. TGF-β에 의해 단핵구(monocyte)는 대식세포(macrophage)로 전환되며, 대식세포는 IL-1 및 IL-6 등의 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 분비하여 염증반응을 강화하는 데 중요한 역할을 한다. 염증기의 특징은 기존의 손상된 조직을 분해하고 세포, 세포외부 그리고 병원균 잔해를 제거하는 것이다.

증식기: 혈소판이 분비한 VEGF(vascular endothelial growth factor)와 FGF(fibroblast growth factor)에 의해 혈관내피세포의 증식이 촉진된다. 또한 EGF, TGF-α(transforming growth factor-α) 그리고 FGF에 의해 상피세포 (epithelial cell)의 증식과 이동성이 촉진되어 재상피화(re-epithelialization)가 시작된다. 이 과정에 의해 상처의 표면이 각질세포층으로 덮이게 된다. 각질세포는 층화(stratification)와 분화(differentiation) 과정을 거쳐 방어막을 재건하게 된다.

재형성기: 재상피화가 끝나면 조직재건이 이루어진다. 이 과정은 TGF-β에 의해 새로운 콜라겐(collagen)이 합성되며, PDGF에 의해 기존의 콜라겐이 분해되는 과정을 포함한다. 이 과정의 결과물이 흉터(scar)이다. 또한 이 과정에서 섬유모세포와 각질세포의 수가 줄어들게 되며 흉터로 가는 혈액의 흐름도 줄어들게 된다. 세포외기질의 합성과 기존 기질의 분해가 정상적이지 않을 경우 심한 흉터가 남을 수도 있다.

상처는 빠르게 치료해야 2차 감염의 위험을 줄일 수 있다. 또한, 상처치료 과정에서 염증반응이 지속되면 염증기에서 증식기로의 진행이 이루어지지 않아 정상적인 상처치유가 지연된다. 이러한 이유로 염증반응을 유도하지 않는 상처치료제의 개발이 활발하게 진행되고 있다.

염증의 수준은 염증성 세포(inflammatory cell), 단핵구(monocoyte), 성상세포(astrocyte), 호중구(neutrophil), 비만세포(mast cell), 호염기성 세포(basophil)의 밀도를 측정함으로써 알 수 있다. 호중구 활성, 비만세포 탈과립화, 히스타민(histamine) 농도 또는 반응성 산소종(reactive oxygen species)의 수준 등의 인자도 염증 수준의 척도로서 사용될 수 있다. 염증의 수준은 상처조직 또는 혈장에서 염증성 사이토카인인 IFN-α(interferon-α), IFN-β(interferon-β), IFN-γ(interferon-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IL-23, IL-27, CD4, CD28, CD80, CD86, MHC11 및 iNOS 수준을 측정하여 간접적으로 확인할 수도 있다.

만성상처는 만성염증(chronic inflammation) 상태에 머물러 있어, 염증성 사이토카인인 IL-1β, TNF-α 수준이 높아지며, 감염의 기회가 높아 염증이 더 지속된다. 이들 사이토카인이 MMP(matrix metalloproteinase)들의 합성을 증가시킴으로서 세포외기질이 분해되고, 결과적으로 세포이동성과 콜라겐 축적이 저해되는 것으로 여겨진다. MMP들은 또한 성장인자와 그 수용체(receptor)를 분해시킴으로써 상처치료를 지연시킨다.

MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1, 또는 GDF-15, PLAB, PDF, NAG-1 및 PTGFB로도 불림)은 TGF-β superfamily의 한 일원으로서, 대식세포 활성화에 의해 그 발현이 증가하는 것이 알려져 있다. 정상적인 생체 환경에서는 태반(placenta)에서 많이 발현되며, 그 이외에도 전립선(prostate), 중추신경계(central nervous system)의 상피세포에서 발현되는 것이 알려져 있으나, 대부분의 상피세포에서는 발현하지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나 수술(operation), 항암제 처리(chemotherapy), 염증(inflammation), 암(cancer) 등에 의해 그 발현이 촉진된다고 보고되어 있다.

MIC-1의 기능은 암과 연관되어 많이 연구되어 있다. 가장 많이 연구된 기능은 암발생 억제기능(anti-tumorigenic activity)이다. 암세포에 인위적으로 MIC-1을 발현시키면, 세포자멸사(apoptosis)가 유발되어 암세포 성장이 억제되는 것이 시험관(in vitro)과 생체내(in vivo)에서 모두 관찰되었다. 또한 혈관신생을 억제하는 것도 보고되어 있다. 그러나 이와 정반대로 MIC-1을 발현시키면 암세포 성장이 촉진되는 것이 보고된 바 있다. 또한 암이 진행될수록 MIC-1의 발현이 증가하는 것이 알려졌다. 이러한 암과 연관된 정반대의 기능은 다른 TGF-β family에서도 잘 알려져 있다. 또한 MIC-1은 산소농도가 아주 낮은 조건에서 발현이 증가한다고 보고되어 있다.

한편, 상처치료의 성공여부는 성장인자, 사이토카인, 케모카인 등 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드(polypeptide)가 복잡한 신호를 어떻게 통합하여 세포반응을 잘 조율하는 가에 달려있다. 이들 폴리펩타이드는 세포 표면의 수용체(receptor)나 세포외기질(extracellular matrix)에 결합하여 신호를 전달하게 되고, 결국 세포 분열, 이동성, 분화에 관여하는 유전자 전사를 촉진하여 상처치료에 영향을 준다.

따라서 여러 성장인자나 사이토카인의 상처치료제로서의 가능성은 매우 높다. 하지만 만성상처는 복합장애를 수반하거나 나이 등의 영향을 받기 때문에 임상에서 성공한 경우는 많지 않다. 그렇지만 여전히 성장인자 치료법(일반적인 상처치료와 병행한)이 만성상처 치료법으로 가장 효과적이다.

EGF(epidermal growth factor)는 혈소판, 대식세포, 섬유모세포에서 분비되며, 각질세포의 이동성을 증가시켜 재상피화를 촉진한다 (Rheinwald JG et al. Nature 1997: 265: 421). 또한 EGF는 세포 증식 신호와 관련된 케라틴(keratin) K6, K16의 발현도 증가시키는 것으로 보고되었다 (Jiang CK et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993: 90: 6786). EGF는 만성상처 임상시험에서 외용제로 사용할 때 상피화(epithelialization)를 촉진시켜 피부이식 후 치료기간을 단축시키며, 정맥궤양(venous ulcer), 당뇨성 족부궤양(diabetic foot ulcer)에서도 치료기간을 단축시키는 것으로 보고되었다 (Martin P. Science 1997: 276: 75; Rheinwald JG et al. Nature 1997: 265: 421; McCawley LJ et al. J. Cell Physiol 1998: 176: 255). 그러나 만성궤양(chronic ulcer)에서는 MMP가 증가하면서 EGF와 EGF 수용체가 분해되는 것이 알려져 있어, 이런 상처의 경우 EGF가 쉽게 분해되는 문제를 안고 있는 것으로 여겨진다 (Mast BA et al. Wound Repair Regen 1996: 4: 411; Robson MC Wound Repiar Regen 1997: 5:12).

FGF(fibroblast growth factor)는 각질세포, 섬유모세포, 혈관내피세포, 평활근세포(smooth muscle cell), 연골세포(chondrocyte), 비만세포(mast cell)에서 분비하며, 이 중 FGF-2와 bFGF(basic fibroblast growth factor)는 급성상처에서 증가하며 육아조직(granulation tissue) 형성, 재상피화(re-epithelialization), 조직 재형성(tissue remodeling)에 역할을 한다. 만성상처에서 FGF-2의 수준이 낮아진다. FGF-2는 당뇨성 족부궤양에 대한 임상시험에서 효과를 보이지 않았는데, 이는 FGF-2가 활성을 유지하지 못했기 때문으로 여겨진다 (Grellner W et al. Foresic Sci Int 2000: 113: 251). 그러나 압박궤양(pressure ulcer)에서는 상처회복 속도를 증가시키는 것으로 나타났다 (Robson MC et al. Ann Surg 1992: 216: 401).

TGF-β(transforming frowth factor-β) family는 TGF-β1-3, BMP(bone morphogenic proteins), activin, MIC-1 등 여러 단백질을 포함하며, 대식세포, 섬유모세포, 각질세포, 혈소판에서 분비된다. TGF-β1-3이 주를 이루나, 포유류에서 피부 상처치료에는 TGF-β1이 가장 많은 관여하는 것으로 알려져 있다. TGF-β1은 염증, 재상피화, 결체조직 재건 등에 중요하며, 상처가 나면 바로 발현이 증가한다 (Kane CJ et al. J Cell Physiol 1991: 148: 157). 그러나 TGF-β1은 콜라겐 합성을 너무 강하게 유도하여, 켈로이드 섬유모세포(kelloid fibroblast) 활성화를 촉진하고 유지시킴으로써 섬유화(fibrosis)를 일으킬 수 있는 문제를 가지고 있다 (Wang Z et al. J Plast Reconstr Aesthet Surg 2007: 60: 1193). 화상상처에 TGF-β1을 활성화시키고 계속 분비되도록 했을 때 재상피화가 저해되고 섬유화가 증가한 것이 보고되었다 (Yang L et al. Am J Pathol 2001: 159: 2147). 따라서 실제 상처치유 시 이러한 문제점 없이 효과적으로 사용할 수 있는 성장인자 또는 사이토카인의 탐색이 필요하다.

PDGF(platelet derived growth factor)는 혈소판, 대식세포, 혈관내피세포, 섬유모세포, 각질세포에서 분비되며, 상처치료의 각 단계마다 작용한다. 상처가 나면 PDGF는 탈과립 혈소판에서 분비되어 상처액(wound fluid)에 존재하며 (Trengove NJ et al. Wound Repair Regen 2000: 8: 13), 이것은 다시 중성구, 대식세포 섬유모세포, 평활근세포가 상처부위로 이동하게 만든다 (Heldin CH et al. Physiol Rev 1999: 79: 1283). 또한 대식세포가 TGF-β와 같은 성장인자를 합성분비 하도록 자극한다. PDGF는 IGF-1과 thrombospondin-1 합성을 유도하여 재상피화 과정에서도 역할을 하며 (Rabhi-Sabile S et al. FEBS Lett 1996: 386: 82), 섬유모세포의 증식을 도와 세포외기질의 합성을 촉진한다 (Lin H et al. Biomateials 2006: 27: 5708). 조직재형성기에는 MMP를 증가시켜 기존 콜라겐의 분해를 돕는다. 만성상처에서 PDGF의 수준이 낮아지는데, 이는 MMP에 의해 분해되기 때문으로 여겨진다 (Mast BA et al. Wound Repair Regen 1996: 4: 411; Robson MC Wound Repair Regen 1997: 5: 12). 인간 PDGF의 재조합 변이체, PDGF-BB는 만성상처 치료제로 유일하게 미국식품의약국(FDA) 승인을 받았으며, 당뇨성 궤양, 압박궤양에서 성공적으로 이용되고 있다 (Margolis DJ et al. Hum Gene Ther 2004: 15: 1003; Margolis DJ et al. Wound Repair Regen 2000: 8: 480).

GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor)는 상처난 피부의 표피에서 증가하며, 상처부위에 중성구를 증가시켜 상처치료의 염증기에 중요하다. 또한 GM-CSF는 각질세포의 증식을 유도하여 재상피화를 촉진시키며, 혈관내피세포의 증식과 이동성을 증가시킨다는 보고도 있다. 당뇨성 족부궤양 환자에 GM-CSF를 피하주사한 결과 셀룰라이트(cellulite)가 빨리 용해되었으며 (Gough A et al. Lancet 1997: 350: 855), 만성상처에 국부적으로 처리하였을 때 뚜렷한 효과를 보였다 (Bianchi L et al. J Eur Acad Dermatol Venereol 2002: 16: 595).

VEGF(vascular endothelial growth factor) family는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PLGF(placental growth factor)를 포함한다. VEGF-A는 혈관내피세포, 각질세포, 섬유모세포, 평활근세포, 혈소판, 중성구, 대식세포에서 만들어지며, 혈관내피세포막에 존재하는 수용체인 Flt-1과 KDR에 결합하여 혈관내피세포의 증식, 분화, 이동성을 조절한다 (Senger DR et al. Am J Pathol 1996: 149: 293; Morbidelli L et al. Am J Pathol 1996: 270: H411). 특히 VEGF-A는 저산소 조건에서 발현이 유도된다 (Silver IA Prog Repair Res 1969: 3: 124). 동물실험에서는 VEGF-A가 당뇨성 상처의 재상피화를 촉진하는 것으로 나타났다 (Galiano RD et al. Am J Pathol 2004: 164: 1935). 그러나 이러한 점에도 불구하고 VEGF를 외용제로 쓸 경우, 지속적인 혈관누수(vascular leakage), 무질서한 혈관형성, 기능을 못하는 림프관 형성 등의 문제점을 나타냈다 (Nagy JA et al. J Exp Med 2002: 196: 1497).

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, MIC-1은 종래 상처치유에 효과가 있는 것으로 알려진 성장인자 또는 사이토카인과 비교하여 과도한 염증반응 유발 및 혈관누수와 같은 문제점 없이 상처치료에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 염증반응 및 혈관누수를 유도하지 않으면서 급성상처 또는 만성상처의 치료에 효과가 있는 MIC-1 유전자 또는 그의 발현 단백질을 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1) 유전자 또는 그의 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1)은 TGF-β superfamily의 한 일원으로서, 대식세포 활성화에 의해 그 발현이 증가하는 것이 알려져 있다. 정상적인 생체 환경에서는 태반에서 많이 발현되며, 그 이외에도 전립선, 중추신경계의 상피세포에서 발현되는 것이 알려져 있으나, 대부분의 상피세포에서는 발현하지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나 수술, 항암제 처리, 염증, 암 등에 의해 그 발현이 촉진된다고 보고되어 있다.

본 발명의 MIC-1은 종래에 암발생 억제와 관련하여 그 기능이 알려져 있지만 상처 치료능에 대하여 연구된 바는 없다. 본 발명자들은 이러한 MIC-1 단백질의 다양한 기능을 연구하고 있었으며, 그 중 MIC-1 단백질이 급성 상처 또는 만성 상체의 치유에 효과가 있음을 발견하였고, 이를 상처 유도된 마우스를 이용하여 검증하였다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 MIC-1 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 6의 염기서열이다. 상기 서열번호 2는 프로-형(pro-form) MIC-1 단백질의 아미노산 서열이고, 상기 서열번호 7은 성숙형(mature-form) MIC-1 단백질의 아미노산 서열이다. 또한 상기 “유전자”는 일반적으로 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 MIC-1 유전자는 동물 세포 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 상기 MIC-1 유전자는 상처 부위에 지속적이고 국부적으로 공급할 수 있도록 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스-심플렉스 바이러스 벡터 또는 동물 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드 또는 바이러스에 포함된 형태로 제공될 수 있고, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 세포주를 형질감염 또는 형질도입시켜 수득되는 재조합 세포주의 형태로 제공될 수 있다. 동물 세포에서의 발현을 위하여 상업적으로 시판되는, 재조합 유전자 제조를 위한 벡터 또는 바이러스 제조 시스템의 예는 다음과 같다: pCR3.1 (Invitrogen), AdEasy Adenoviral Vector System (Stratagene), pSMPUW-IRES-GFP Lentivirus Expression Vector (Cell Biolabs), pMXs-IRES-GFP Retroviral Vector (Cell Biolabs).

본 발명의 약학적 조성물은 MIC-1 유전자의 치료적 이용에 관계된다. 상기 MIC-1 유전자는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에게 공지인 표준적인 클로닝 방법으로 얻을 수 있다. 또한 MIC-1 유전자는 화학적 합성 기술로 DNA 형태로 클로닝될 수 있다. DNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 단일가닥 DNA는 코딩 가닥 또는 센스 가닥이거나, 또는 비코딩 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 치료적 이용을 위하여, 상기 유전자는 치료되어질 환자의 상처 부위에서 기능적인 MIC-1 단백질을 발현시킬 수 있는 형태이다. 상기 유전자는 또 다른 치료적 측면에서, 투여를 위한 MIC-1 단백질의 실험실적 생산을 위하여 사용될 수도 있다.

본 발명의 유전자 치료적 측면에서의 응용을 위한 유전자는 그 자체로, 또는 발현벡터와 같은 그 예가 당업계에 잘 알려진 벡터의 일부로서 제공될 수 있다. MIC-1 유전자는 MIC-1 단백질의 생산을 인도할 수 있는 형태 또는 그 자체로 생물학적으로 활성인 단편인 형태로 상처 부위 또는 치유를 필요로 하는 다른 조직에 유전자를 투여하는 것인 유전자 치료의 방법을 통하여 치료적으로 사용될 수 있다.

바람직하게는 유전자 치료 시 MIC-1 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자를 발현을 조절하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결한 형태, 예를 들어 발현벡터의 형태로 치료대상 환자에게서 이것이 발현되도록 상기 유전자를 투여한다. 상기 벡터는 따라서 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터 부위를 포함하는 적당한 전사 조절 신호를 포함하고, 상기 프로모터는 치료되어질 환자에서 작동가능한 것일 것이다. 따라서, 인간 유전자 치료용으로, RNA 폴리머라제를 전사 개시 부위로 인도하는데 필요한 서열뿐만 아니라, 적당하다면 인헨서를 포함하는 다른 작동 서열 또는 조절 서열들을 포함하는 용어인 프로모터는, 바람직하게는 인간 유전자로부터의 인간 프로모터 서열 또는 일반적으로 인간에게서 발현되는 유전자로부터의 인간 프로모터 서열, 예를 들어 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 프로모터이다. 이러한 관점에서 적당한 공지된 진핵 프로모터 중에서 CMV 초기 프로모터, HSV 티미딘키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 루 육종 바이러스(RSV)의 것들과 같은 레트로바이러스 LTR 프로모터, 및 생쥐 메탈로티오네인-1 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터가 적합하다.

상기 벡터는 또한 MIC-1 코딩 서열의 3'에 위치하는 전사 조절 서열, 및 인간 치료로 사용될 때 SV40 바이러스와 같은 바이러스로부터의 상응하는 서열과 같이 치료되어질 환자에게서 인식가능한 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 기타 전사 조절 서열이 이 기술분야에 잘 알려져 있고 이용가능하다. 상기 발현벡터는 또한 상기 벡터가 전파될 수 있도록 항생제 저항성과 같은 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 그 자체로 MIC-1을 합성할 수 있는 발현 벡터들을 물리적 방법으로 직접적으로 상처 부위에 도입시킬 수 있다. 이들의 예로는 예를 들어 인산 완충 염수(PBS)와 같은 제약학적으로 허용되는 부형제 중의 용액내에 적당한 비히클 내의 “네이키드” 핵산 벡터를 국부적으로 적용하는 것, 또는 당업계에 알려진 방법에 따라 “유전자 총” 기술로도 알려진 입자 총알과 같은 물리적 방법으로 벡터를 투여하는 것을 포함한다.

“유전자 총” 기술은 미국특허번호 제5371015호에 기술된 바와 같이, 추진 장치로부터의 고압력하에서 방출시키는 방법으로, 벡터로 코팅된 금 비드와 같은 불활성 입자를 상처 부위, 예를 들어 피부 세포의 표면을 통과할 수 있을 정도로 충분한 속력으로 가속하는 것이다.

또한 유전자를 직접 수용체에 투여하는 기타 물리적 방법으로는 초음파, 전기적 자극, 전기투과 및 마이크로시딩(microseeding) 등이 있다. 특히 바람직한 것은 마이크로시딩 유형의 수송법이다. 이는 유전 물질을 환자의 세포내로 그 자체로 전달하는 시스템이다. 상기 방법은 미국특허 제5,697,901호에 기재되어 있다.

본 발명의 치료적 사용을 위한 MIC-1 유전자는 또한 수송 벡터의 수단으로 투여될 수 있다. 그 예로는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 수송 벡터와 같은 당업계에 공지인 바이러스성 수송 벡터 등이 있다. 기타 비바이러스성 수송 벡터로는 당업계에 알려진 리포좀 수송 벡터 등을 포함하는 지질 수송 벡터가 있다.

MIC 유전자는 또한 형질전환된 숙주 세포의 수단으로 상처 부위에 투여될 수 있다. 세포는 환자로부터 수거된 세포를 포함하며, 상기 유전자를 이 세포내로 당업계에 공지인 유전자 도입 방법에 의해 도입하여 형질전환된 세포를 배양액 중에 성장시켜 환자에게 이식한다.

상기 기술한 바와 같은 발현 구조체를 본 발명의 치료에 다양한 방법으로 사용할 수 있다. 따라서, 상기 발현 구조체들은 환자의 상처 부위에 직접 투여될 수 있고, 또는 상처 부위에 투여될 수 있는 단백질 자체를 생산하는데 사용될 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 MIC-1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 프로-형(pro-form)이거나, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 성숙형(mature-form)일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 MIC-1 단백질은 MIC-1이 삽입된 발현벡터로부터 발현될 수 있으며, 바람직하게는 상기 발현벡터는 도 9의 개열지도를 가질 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, MIC-1 단백질을 분리하기 위하여 피키아(효모) 시스템을 이용하는데, 성숙형 MIC-1 유전자를 pPIC9 벡터에 EcoRI과 NotI 제한효소를 이용하여 도입하고 형질도입된 피키아 콜로니로부터 분비되는 MIC-1을 수득할 수 있었다.

본 발명에서 이용되는 MIC-1 유전자 및 그의 발현 단백질은 단독으로 또는 치료를 위한 화합물과 같은 다른 화합물과 함께 사용될 수 있다. 약학적 조성물은 상처 부위로의 표적화에 효과적인 임의의 효과적이고 편리한 방법, 예를 들어 무엇보다도 국부적, 정맥내, 근육내, 비내 또는 피하 경로로의 투여를 포함하는 방법으로 투여될 수 있다. 일반적으로 상기 조성물은 상처 또는 관련된 상태에 국부적으로 가해질 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은, 액제, 크림제, 로숀제, 겔제 또는 에어로졸제의 형태로 국부적으로 응용되도록 제제화될 수 있고, 이는 적합한 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있다. 상기 국부 제제는 또한 상용가능한 통상적 담체, 예를 들어, 크림 또는 연고 베이스, 및 로션용으로는 에탄올 또는 올레일 알코올을 함유할 수 있다. 상기 담체는 제제의 약 1 내지 약 98%를 구성할 수 있고, 더욱 일반적으로는 제제의 약 80% 까지를 구성할 것이다.

포유동물, 특히 인간 투여용으로는, 활성 제제의 일일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 전형적으로는 약 1 mg/kg일 것으로 예상된다. 어떤 경우에든 의사가 개인에게 가장 적합한 실제 투여량을 결정할 것이고, 이는 연령, 체중 및 특정 개인의 응답에 따라 달라질 것이다. 상기 복용량은 평균의 경우의 예시적인 것이다. 물론 더 많은 투여 및 더 적은 투여가 좋은 개인의 경우가 있을 것이나, 이러한 경우도 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명의 MIC-1 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 상처부위에 국부적으로 사용되는 외용제인 경우에는 상처 치료에 일반적으로 사용되는 화합물, 예컨대 항생제, 항염증제, 피부치료용 조제, 마취제 및 진통제 등을 더 포함할 수 있다. 일반적으로, 상처부위의 감염을 방지하거나 감염으로 인한 상처의 악화를 방지하기 위하여 상처부위에 항생제, 항균제 등의 약제를 공급할 수 있고, 또한 통증의 완화를 위하여 국소 마취제 및 진통제 등을 공급할 수 있으며, 상처 치유시 과도한 염증반응을 방지하기 위하여 항히스타민제와 같은 항염증제를 공급할 수 있다. 통상적으로 사용될 수 있는 항생제의 예로는 네오마이신 설페이트(Neomycin sulfate), 벤잘코늄 클로라이드(Benzalkonium chloride), 실버 설파다이아진(Silver sulfate diazine) 등 및 이들의 유사물질을 들 수 있다. 그 외에도 필요에 따라 피부치료용 조제 등의 기능성 약제를 공급할 수 있다. 이러한 기능성 약제들은 피부에 직접 바르는 외용제에 함유시켜 공급함으로써 사용상의 편리성을 도모하고, 효율적인 상처치유에 도움이 되는 환경을 조성함으로써 상처치유 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 MIC-1 유전자를 상처치료 목적으로 이용될 수 있음을 유전자이전 마우스를 이용하여 증명하였다. 본 발명의 실시예 4는, MIC-1을 과발현하는 유전자이전 마우스가 야생형 마우스에 비해 상처회복 속도가 현저하게 빠른 것을 보여준다.

또한 본 발명의 MIC-1 단백질을 상처에 직접 도포한 경우에도 상처치료 효과가 있음을 증명하였다. 본 발명의 실시예 5는, MIC-1 단백질을 피부 상처부위에 직접 도말하는 방법으로도 상처회복에 도움을 줄 수 있음을 보여준다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 MIC-1 유전자 또는 그의 발현 단백질은 염증반응(inflammation) 및 혈관누수(vascular leakage)를 유도하지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예 4에서 MIC-1 유전자가 도입된 마우스에서 상처 치유시 염증반응을 유도하지 않음을 확인하였으며 (도 4 참조), 실시예 6에서 누드마우스의 피하에 MIC-1을 주사하여 혈관 투과성을 조사한 결과 MIC-1은 처리한 농도와 관계없이 혈관투과성에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다 (도 7 참조). 이러한 MIC-1의 상처치유 특성은, 상처회복에 효과가 있는 것으로 알려진 VEGF가 상처회복을 촉진시킬 수 있으나 과도한 염증반응을 유도하여 치유기간 연장, 흉터 생성 등의 문제점을 갖고 있는 것과 달리, MIC-1은 염증반응을 유도하지 않아 효과적인 상처치료제로 사용될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 상처는 자상, 수술상처와 같은 급성상처 또는 당뇨성 하지궤양, 욕창과 같은 만성 상처인 것을 특징으로 한다.

상기 급성상체에 대한 효과를 확인하기 위하여 본 발영의 실시예 5에서, 상처를 유발시킨 마우스를 이용하여 MIC-1의 상처치유 효과를 검증하였으며 MIC-1이 양성대조군인 VEGF 및 EGF와 유사한 상처회복 속도를 나타냄을 확인하였다 (도 6 참조).

상기 만성 상처는 만성염증(chronic inflammation) 상태에 머물러 있어, 염증성 사이토카인인 IL-1β, TNF-α 수준이 높아지며, 감염의 기회가 높아 염증이 더 지속된다. 이들 사이토카인이 MMP(matrix metalloproteinase)들의 합성을 증가시킴으로서 세포외기질이 분해되고, 결과적으로 세포이동성과 콜라겐 축적이 저해되는 것으로 여겨진다. 따라서 혈관내피세포의 이동성을 증가시키게 되면 상처치유에 도움이 될 수 있다.

본 발명의 실시예 3에서는, MIC-1 처리로 인하여 혈관내피세포의 이동성을 효과적으로 증가시키는 것을 확인하였다 (도 2 참조). 따라서 본 발명의 MIC-1이 혈관내피세포의 이동성에 영향을 주어 상처치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 상처 부위 또는 상처 조직 주변에 상술한 방법들을 이용하여 투여될 수 있으나, 바람직하게는 상처 주변의 피부에 직접 도포하여 국부 적용함으로써 상처 치료 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 피부 국부에 적용되는 외용제로서 MIC-1의 효과를 야생형 마우스의 피부를 제거하여 상처를 낸 후 상처부위에 직접 MIC-1 단백질을 도포하여 상처치유 효과를 입증하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 MIC-1은 VEGF와 유사하게 저산소 조건에서 발현이 유도되고 상처치료에 효과를 나타내나, VEGF와 달리 염증반응을 촉발하지 않고 혈관누수를 유도하지 않기 때문에, 유전자 치료제 및 피부외용제로서 상처치료, 특히 만성상처 치료에 성공적으로 이용될 가능성이 매우 크다는 것을 보여준다.

도 1a는 인간배꼽정맥혈관내피세포를 저산소 조건 또는 CoCl₂를 처리한 후, VEGF와 MIC-1의 발현수준을 웨스턴 블롯팅 방법으로 확인한 사진이다.
도 1b는 인간배꼽정맥혈관내피세포를 저산소 조건 또는 CoCl₂를 처리한 후, VEGF와 MIC-1의 발현수준을 RT-PCR 방법으로 확인한 사진이다.
도 1c는 인간배꼽정맥혈관내피세포를 저산소 조건 또는 CoCl₂를 처리한 후, MIC-1의 프로모터의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 인간배꼽정맥혈관내피세포의 화학주성 이동성(chemotactic motility)(A)과 튜브 형성(tube formation)에 MIC-1이 미치는 영향(B)을 나타내는 사진과 그래프이다.
도 3은 MIC-1 유전자이전 마우스와 야생형마우스에 일정 크기의 상처를 내고 상처치료 속도를 나타내는 사진과 그래프이다. WT: 야생형마우스, MIC-1 TG: MIC-1 유전자이전마우스.
도 4는 MIC-1 유전자이전마우스와 야생형마우스에 상처를 내고 12일 후, 상처와 주변조직을 분리하고 대식세포, 단핵구, 과립백혈구의 표지자를 면역형광 염색한 결과를 나타낸다. WT: 야생형마우스, MIC-1 TG: MIC-1 유전자이전마우스.
도 5는 MIC-1 유전자이전마우스와 야생형마우스에 상처를 내고 12일 후, 상처와 주변조직을 분리하고 염증관련 단백질 발현수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과(B)이다. WT: 야생형마우스, MIC-1 TG: MIC-1 유전자이전마우스.
도 6은 MIC-1 유전자이전 마우스와 야생형마우스에 일정 크기의 상처를 내고, 상처부위에 직접 MIC-1, VEGF, EGF를 도말하여 상처회복속도를 나타내는 그림과 그래프이다.
도 7은 누드마우스의 피부에서 MIC-1에 의한 혈관투과성의 변화를 나타내는 사진(좌), 및 이를 정량화한 그래프(우)이다.
도 8은 MIC-1이 혈관투과성에 미치는 영향을 인간배꼽정맥혈관내피세포에서 VCAM-1과 ICAM-1 발현수준을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 피키아(효모) 시스템에서 MIC-1 발현을 위한 MIC-1 유전자가 삽입된 재조합벡터의 개열지도이다.
도 10은 MIC-1 유전자이전 마우스를 제조하는 데 사용한 재조합벡터의 개열지도이다.
도 11은 MIC-1 유전자이전 마우스와 야생형 마우스를 판별하기 위한 PCR 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 저산소 조건에서의 MIC-1의 발현확인

1) 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)

MIC-1이 VEGF와 유사하게 저산소 조건(hypoxic condition)에서 발현이 유도되는지 확인하기 위하여, 인간배꼽정맥혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)를 5%의 산소농도를 유지하는 저산소 조건에 두거나, 또는 저산소 조건과 유사한 반응을 유도하는 CoCl₂를 200 nM 농도로 처리한 후, 각각 12시간, 24시간 경과하였을 때 세포를 파쇄하고 단백질을 추출하였다. 항-MIC-1, -VEGF, -actin 항체 (각각 Santa Cruz Biotechnology, Thermo Scientific, Sigma-Aldrich)를 이용하여 각 단백질의 발현정도를 측정하였다. 양성대조군은 혈관내피세포가 저산소 조건에서 발현하며, 혈관내피세포의 성장 및 이동성을 촉진하는 것으로 알려진 VEGF를 처리하여 사용하였다.

웨스턴 블로팅 결과, 도 1a에서, MIC-1이 VEGF와 유사하게 저산소 조건에서 발현이 유도됨을 확인하였다.

2) RT-PCR

MIC-1의 전사(transcription)가 저산소 조건에서 촉진되는지 알아보기 위하여 인간배꼽정맥혈관내피세포를 웨스턴 블롯팅에서와 같이 처리하고 세포에서 전체 RNA를 분리하였다. 역전사효소와 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 mRNA를 주형으로 역전사(reverse transcription)하고, 합성된 cDNA를 PCR의 주형으로 이용하였다. 이용된 프라이머는 다음과 같다. 하기 MIC-1 프라이머로 증폭된 cDNA의 서열을 서열번호 1, 상기 cDNA 서열이 코딩하는 pro-form MIC-1 단백질 아미노산 서열을 서열번호 2로 나타내었다.

VEGF: GAGAATTCGGCCTCCGAAACCATGAACTTTCTGT (sense)

GAGCATGCCCTCCTGCCCGGCTCACCGC (antisense)

HIF-1α: CAGAAGATACAAGTAGCCTC (sense)

CTGCTGGAATACTGTAACTG (antisense)

MIC-1: GTGCTCATTCAAAAGACCGACACCG (sense: 서열번호 3)

ATACACAGTTCCATCAGACCAGCCCC (antisense: 서열번호 4)

RT-PCR 결과, 도 1b에서, 저산소 조건 또는 CoCl₂ 처리 12시간, 24시간 후 MIC의 전사가 촉진되었음을 확인하였다. 따라서 저산소 조건에서의 MIC-1 발현은 전사 단계에서 조절됨을 알 수 있다.

3) 프로모터 활성 측정 (Promoter-reporter assay)

MIC-1 프로모터(1.5 kb; 서열번호 5)를 pGL3 벡터(Invitrogen)에 삽입한 DNA를 인간전립선암 세포주인 LNCaP 세포에 도입하고 하루 동안 안정화시킨 후, 웨스턴 블롯팅에서와 같이 저산소 조건을 주었다. 세포를 파쇄시킨 후 정보제공유전자(reporter gene)인 루시퍼라제(luciferase)의 효소 활성을 측정(Promega luciferase assay system)하여 MIC-1 프로모터의 활성을 조사하였다.

루시퍼라제 효소 활성 측정결과, 도 1c에서, MIC-1의 프로모터가 저산소 조건에서 활성화되는 것을 확인하였다.

실시예 2. MIC-1의 분리 정제

성숙한 형태(mature form) MIC-1 (13-15 kDa)(서열번호 7)의 N-말단에 his와 flag 태그를 붙인 단백질을 효모의 일종인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현시키기 위해, 발현 단백질을 배지로 분비하는 pPIC9 벡터(Invitrogen)에 his와 flag 태그가 결합된 성숙형 MIC-1 유전자(서열번호 6)를 EcoRI과 NotI 제한효소로 절단한 후 도입하여 도 9의 pPIC-his.flag-MIC-1 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 pPIC-his.flag-MIC-1 재조합 벡터를 피키아에 전기천공(electroporation)법을 이용하여 형질도입하였다. Pichia 세포는 YPD(Yeast extract, Peptone, Dextrose; BD Biosciences) 배지에서 키운 후, 1 M sorbitol을 이용하여 전기천공적격(electrocompetent) 상태로 만들고, MIC-1 발현 pPIC-his.flag-MIC-1 재조합 벡터는 PmeI 제한효소를 이용하여 직선형으로 만들었다(linearize). 전기천공적격 피키아 세포와 DNA를 혼합하여 0.2 cm 전기천공용 큐벳(cuvette)에 넣고 1500 V의 전기충격을 주어 전기천공을 실시한 후, MD(minimal dextrose) 플레이트에 도말하여 형질도입된 피키아 콜로니를 분리하였다. 배양한 효모를 모아 BMMY(Buffered Methanol-complex Medium Yeast extract: 1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate, pH 6.0, 1.34% YNB (Invitrogen), 0.5% methanol) 배지에 접종한 후, 5일간 30℃에서 배양하면서 매일 메탄올(methanol; 배지 1 L에 메탄올 5 ml)을 배지에 첨가하여 MIC-1의 발현을 유도하였다. 발현된 MIC-1이 his 태그를 가지고 있어서 니켈친화크로마토그래피(Nickel Affinity Chromatography)를 수행하여 분리하였다. 발현된 MIC-1이 배지로 분비되기 때문에 배양액을 원심분리한 후, 상층액을 니켈아가로스(Ni-NTA Agarose, Invitrogen)에 결합시키고 세척하였다. 이 후 150 mM 이미다졸(imidazole) 완충용액을 이용하여 MIC-1을 컬럼에서 분리하였다. 발현된 MIC-1은 항-flag 항체(Sigma-Aldrich)를 이용한 웨스턴 블로팅을 통해 크기와 발현정도를 확인하였다. 또한 MIC-1을 SDS-PAGE를 통해 분리한 후 젤을 코마시 블루(Coomassie Blue) 염료를 이용한 단백질 염색을 하여 발현정도를 확인하고 정제하였다.

MIC-1의 효과를 확인하기 위하여 MIC-1 유전자이전 마우스를 이용하는 방법 외에, 성숙형 MIC-1 사이토카인을 직접 세포 또는 상처 조직에 투여하는 방법을 이용하는데, 이를 위해 MIC-1을 다량 순수 분리하는 것이 필요하다. 많은 양의 MIC-1을 분리하기 위하여 피키아 시스템을 이용하였다. 발현된 MIC-1의 크기는 13-15 kd이었으며, 5일간의 발현 유도와 니켈친화크로마토그래피 후 정제된 MIC-1의 수율은 BMMY 배지 1 ml 당 대략 1 μg이었다.

실시예 3. MIC-1의 혈관내피세포의 이동성 촉진

1) 혈관내피세포의 이동성(motility) 조사

MIC-1이 인간배꼽정맥혈관내피세포의 화학주성 이동성(chemotactic motility)을 촉진할 수 있는지 확인하기 위하여 트랜스웰(Transwell; Corning Coastar)을 이용하였다. 트랜스웰 막의 아래쪽 면을 젤라틴(gelatin)으로 도장하고 트랜스웰 아래쪽에 VEGF(10 ng/ml), 그리고 각각 다른 농도의 MIC-1(5, 10, 20, 100 ng/ml)이 들어있는 M199 배지를 넣었다. 세포를 트랜스웰에 주입하고 4시간 동안 배양한 후, 4% 포름알데하이드(formaldehdyde) 용액에서 고정시켰다. 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액으로 염색하여 트랜스웰의 구멍을 통과하여 아래쪽 면으로 이동한 혈관내피세포의 수를 측정하였다.

도 2에서, MIC-1은 5 - 20 ng/ml의 농도에서 혈관내피세포의 이동성을 효과적으로 증가시키는 것을 확인하였다. 양성대조군으로 이용한 VEGF는 10 ng/ml의 농도로 처리하였다. 이러한 결과는 시험관 내에서 MIC-1이 혈관내피세포의 이동성에 영향을 주어 상처치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 4. MIC-1 유전자이전 마우스의 상처치료능력 측정

1) MIC-1 유전자이전 마우스 제조

전신발현 프로모터를 가지고 있는 pCBA 벡터(BCCM: Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms)에 EcoRI과 BamHI을 이용하여 MIC-1 cDNA (서열번호 1)를 넣은 발현벡터를 제조하고 (도 10), SalI과 HindIII 제한효소로 절단한 후 C57BL/6N 마우스의 배아줄기세포(embryonic stem cell)에 도입하여 안정적으로 MIC-1을 발현하는 배아줄기세포를 골라내어 포배기 배아에 심은 후 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 새끼들을 얻었다. 새끼 중 MIC-1을 발현하는 마우스를 하기 2)의 방법으로 검증하고 발현 마우스를 교배시켜 MIC-1 유전자이전 마우스(MIC-1 transgenic mice) 라인을 확립하였다.

2) MIC-1 유전자이전 마우스의 검증

3-4 주령 유전자이전 마우스의 꼬리 1-2 mm를 절단하여 0.4 mg/ml의 단백질분해효소 K(protease K)가 녹아있는 DirectPCR Lysis Reagent(Viagen)에 넣고 55℃에서 5-6 시간가량 배양하고, 다시 85℃에서 45분간 단백질분해효소 K 불활성화시켰다. 원심분리 후 상층액을 수거하여 PCR의 주형으로 활용하였다. 하기 프라이머(1+2, 및 2+3 프라이머 조합)로 PCR을 수행하여, 각각 583 bp와 880 bp 크기의 PCR 산물을 확인하여 유전자이전 마우스를 판별하였다 (도 11). 프라이머 #1과 #2는 MIC-1 특이적 프라이머이며, 프라이머 #3는 MIC-1 유전자이전 마우스를 제조할 때 이용한 벡터(도 10)에 존재하는 염기서열로서, 프라이머 #1과 #2에 의해 증폭된 DNA는 MIC-1 유전자 일부이며, 프라이머 #2와 #3에 의해 증폭된 부분은 유전자이전 마우스 제조에 사용된 벡터와 MIC-1 유전자 사이의 DNA로서, 유전자이전 마우스는 두 가지 조합의 PCR에서 모두 원하는 크기의 DNA가 증폭되어야 한다.

프라이머 #1: GCTGTCCGGATACTCAGTCC

프라이머 #2: TAAGAACCACCGGGGTGTAG

프라이머 #3: GTGCTGGTTGTTGTGCTGTC

3) MIC-1 유전자이전 마우스의 피부상처치료 능력 측정

야생형과 MIC-1 유전자이전 마우스를 마취시킨 후 등쪽의 털을 제거하고, 지름 0.5 mm 크기로 피부층을 제거하였다. 이 후 3일마다 상처의 크기를 측정하였다.

도 3에서, MIC-1이 상처회복을 촉진할 수 있는지를 MIC-1 사이토카인을 과발현하는 유전자이전 마우스를 이용해 확인하고자 하였다. MIC-1 유전자이전 마우스는 0.5 mm 크기의 상처가 약 9일 후 절반 크기로 감소하였으나 야생형 마우스는 9일 후에도 크기에 큰 변화가 없었으며, MIC-1 유전자이전 마우스는 약 9-12일에 거의 치유되었으나 야생형 마우스는 상처 유도후 12일에도 상처가 완전히 치유되지 않았다. 이러한 결과는 MIC-1 유전자이전 마우스가 야생형 마우스에 비해 상처회복 속도가 현저하게 빠른 것을 보여준다.

4) 대식세포, 단핵구 및 과립백혈구의 생성 정도 조사

상처를 내고 12일 후, 야생형과 MIC-1 유전자이전 마우스의 상처부위와 인접한 조직 3 mm를 분리하고 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액에서 고정시켰다. 이 조직을 이용하여 파라핀절편(paraffin section)을 만든후, 대식세포, 단핵구 및 과립백혈구의 표지분자에 대한 항체(각각 AbD Serotec, DINona Inc., BD Biosciences)를 이용하여 면역형광염색하여 각각 상처조직 내에 잔존하는 염증성백혈구의 존재를 조사하였다.

도 4에서, MIC-1 유전자이전 마우스의 상처회복 조직에서는 야생형과 비교하여 염증성 세포의 수가 크게 차이나지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 상처회복에 효과가 있는 것으로 알려진 VEGF가 상처회복을 촉진시킬 수 있으나 과도한 염증반응을 유도하여 치유기간 연장, 흉터 생성 등의 문제점을 갖고 있는 것과 달리, MIC-1은 염증반응을 유도하지 않아 효과적인 상처치료제로 사용될 수 있음을 의미한다.

5) 웨스턴 블롯팅을 이용한 염증의 수준 조사

상기 4)에서와 같이 상처조직을 분리하고 조직을 분쇄하여 단백질추출물을 만든 후, 항MIC-1, VEGF, IL-1β, iNOS 항체(각각 Santa Cruz Biotechnology, Thermo Scientific, Santa Cruz Biotechnology, BD Biosciences)를 이용하여 각 단백질수준을 조사하였다.

도 5는 상처회복 조직을 분쇄하여 IL-1β, iNOS 등의 염증성 사이토카인 또는 단백질의 수준을 확인한 결과로서, 이 역시 야생형과 비교하여 큰 차이가 없는 것을 보여준다. 이러한 결과는 MIC-1의 과발현이 염증반응을 유도하지는 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 5. MIC-1, VEGF, EGF의 외용제로서 상처치료 효과 측정

MIC-1이 외용제로서 상처치료에 효과가 있는지를 확인하기 위하여 C57BL/6N 야생형 마우스의 피부를 제거하여 상처를 낸 후, 상처부위에 직접 MIC-1(실시예 2에서 분리, 정제한 MIC-1을 사용)을 도포하였다. 양성대조군으로 상처치료에 효과가 있는 것으로 알려진 VEGF와 EGF (각각 Millipore와 Promega에서 구입)를 이용하였다. MIC-1, VEGF, EGF는 10 ng을 5 μl의 PBS에 희석하여 매일 상처위에 직접 도포하였다. 음성 대조군은 PBS만을 도포하였다.

측정 결과, 도 6에서와 같이, MIC-1이 양성대조군인 VEGF 및 EGF와 유사한 상처회복 속도를 나타내었으며, 음성대조군인 PBS에 비해서는 빠른 상처회복 속도를 나타내었다. 이는 MIC-1을 피부 상처부위에 직접 도말하는 방법으로도 상처회복에 도움을 줄 수 있음을 나타낸다.

실시예 6. 혈관누수 측정

1) 혈관투과성 측정

에반스 블루(Evans blue) 염료를 8주된 누드마우스(nude mouse)의 꼬리정맥에 주사하고, 10분 후 MIC-1(50, 100, 200 ng)과 VEGF(20 ng)를 PBS에 희석한 용액 10 μl을 마우스 등에 피하주사 하였다. 20분 후, 마우스의 등쪽 피부를 분리하여 피부 안쪽의 약물을 주사한 부분의 사진을 찍고 일정한 크기로 오려내어 포름아마이드(formamide) 용액에 염료를 녹여냈다. 4일간 녹여낸 후, 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. MIC-1이나 VEGF를 주사한 부위에서 혈관의 투과성이 증가하게 되면, 그 부위에는 더 많은 염료가 혈관으로부터 빠져나와 피부에 착색하게 된다.

도 7은 누드마우스의 피하에 MIC-1과 VEGF를 주사하고 혈관 투과성에 이들이 미치는 영향을 직접 조사한 것으로, MIC-1은 처리한 농도와 관계없이 혈관투과성에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다. 그러나 양성대조군인 VEGF는 20 ng을 주사하였을 때 혈관투과성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

2) 혈관내피세포의 세포 간 유착에 관여하는 단백질의 웨스턴 블롯팅

혈관내피세포의 투과성에 MIC-1이 어떤 영향을 주는지 확인하기 위하여 인간배꼽정맥혈관내피세포에 MIC-1(20, 50, 100 ng/ml), VEGF(20 ng/ml), 및 혈관내피세포의 투과성을 강력하게 증가시키는 것으로 알려진 TNF-α(20 ng/ml)을 4시간 또는 8시간 동안 처리하였다. 세포를 파쇄한 후 혈관내피세포의 투과성을 증가시키는데 관여하는 것으로 알려진 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 및 ICAM-1(Inter-Cellular Adhesion Molecule-1) 단백질의 발현수준을 웨스턴 블롯팅 방법으로 확인하였다.

확인결과, 도 8에서, MIC-1은 VEGF나 TNF-α에 비해 VCAM-1 및 ICAM-1 분자의 발현을 유도하는 정도가 매우 낮은 것으로 나타났다. MIC-1, VEGF, TNF-α를 각각 20 ng/ml 농도로 처리한 결과를 보면, 혈관누수를 유도하는 강력한 사이토카인인 TNF-α는 VCAM과 ICAM 분자의 발현을 모두 현저하게 증가시키며, VEGF 역시 두 분자의 발현을 유도하나, MIC-1은 4시간 또는 8시간 처리에서 VCAM과 ICAM 발현에 별다른 영향을 주지 않는 것을 알 수 있다.

이상의 결과는 MIC-1이 VEGF와 유사하게 저산소 조건에서 발현이 유도되고 상처치료에 효과를 나타내나, VEGF와 달리 염증반응을 촉발하지 않고 혈관누수를 유도하지 않기 때문에, 유전자 치료법을 통해 발현을 증가시키거나 또는 상처부위에 직접 도말하여 상처를 치료하는 방법으로 상처치료, 특히 만성상처 치료에 성공적으로 이용될 가능성이 매우 크다는 것을 보여준다.

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Claims

서열번호 2 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1) 유전자 또는 그의 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 MIC-1 유전자는 재조합 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 재조합벡터는 도 10의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 MIC-1 단백질은 발현벡터에서 발현되는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 9의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 MIC-1 유전자 또는 그의 발현 단백질은 염증반응(inflammation) 및 혈관누수(vascular leakage)를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 상처는 급성상처 또는 만성 상처인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부에 국부 적용되는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 액제, 크림제, 로숀제, 겔제 또는 에어로졸제인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.