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KR101169109B1 - 암 치료에 사용하기 위한 키메릭 아데노바이러스 - Google Patents

암 치료에 사용하기 위한 키메릭 아데노바이러스 Download PDF

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KR101169109B1
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폴 하덴
테리 허미스톤
아이린 쿤
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싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디.
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Abstract

본 발명은 치료학적 적용성을 갖는 종양세포용해성 아데노바이러스에 관한 것이다. 재조합 키메릭 아데노바이러스 및 그의 생산방법이 제공된다. 본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 서브그룹 B 내지 F로 분류되는 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열을 포함하고, 증진된 치료지수를 나타낸다.
키메릭 아데노바이러스, 종양세포용해성, 혈청형

Description

암 치료에 사용하기 위한 키메릭 아데노바이러스{CHIMERIC ADENOVIRUSES FOR USE IN CANCER TREATMENT}
본 출원은 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 2004년 5월 26일자 출원된 미국가특허출원 제 60/574,851 호의 이점을 청구한다.
본 명세서에 기술된 발명은 일반적으로 분자생물학의 분야에 관한 것이며, 더욱 특히는 치료학적 적용분야를 갖는 종양세포용해성 (oncolytic) 아데노바이러스에 관한 것이다.
암은 미국 및 다른 곳에서 사망의 주된 원인이다. 암은 타입에 따라서 일반적으로 수술, 화학요법 및/또는 방사선으로 치료된다. 이들 치료는 종종 실패를 하며, 단독으로 또는 고전적인 기술과 함께 사용되는 새로운 치료법이 필요한 것이 자명하다.
한가지 접근방법은 아데노바이러스를 단독으로, 또는 항암 치료학적 단백질을 종양세포에 송달할 수 있는 벡터로서 사용하는 것이다. 아데노바이러스는 약 36 킬로베이스 쌍의 선형 게놈을 갖는 비-인벨로프 20면체 이본쇄 (non-enveloped icosohedral double-stranded) DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 각각의 말단은 바이러스 복제에 필요한 도립된 말단반복부위 (inverted terminal repeat, 또는 ITR)로 알려진 짧은 서열을 갖는다. 현재까지 조사된 모든 인간 아데노바이러스 게놈은 동일한 일반적 체제를 가지며; 즉 특이적 기능을 코딩하는 유전자가 바이러스 게놈 상의 동일한 위치에 배치된다. 바이러스 게놈은 5개의 초기 전사단위 (early transcription unit)(E1A, E1B, E2, E3 및 E4), 2개의 지연된 초기 단위 (IX 및 Iva2), 및 5개의 후기 mRNAs의 패밀리 (family)(L1-L5)를 생성하도록 처리되는 하나의 후기 단위 (주후기 (major late))를 함유한다. 초기 유전자에 의해서 코딩된 단백질은 복제에 포함되는 반면에, 후기 유전자는 바이러스성 구조 단백질을 코딩한다. 바이러스 게놈의 일부분은 외래 기원의 DNA에 의해서 쉽게 치환될 수 있으며, 재조합 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고, 이것은 이들 바이러스를 유전자요법에 잠재적으로 유용하도록 만드는 특성이다 (참조: Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64).
현재, 임상적으로 유용한 아데노바이러스 요법을 생성시키기 위한 연구노력은 아데노바이러스 혈청형 Ad5에 집중되고 있다. 이러한 인간 아데노바이러스의 유전학은 잘 특정화되어 있으며, 그의 분자조작을 위한 시스템도 잘 기술되어 있다. 고효율 생산방법이 개발되어 임상적 적용을 지지하였으며, 약제를 사용한 일부의 임상적 경험을 이용할 수 있다 (참조: Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64). 암 치료에 인간 아데노바이러스 (Ad)를 사용하는데 관한 연구는 특정한 종양세포 타입에 더 큰 효력을 가지며, 그에 대해서 선택적으로 표적화된 Ad5-기본 아데노바이러스의 개발에 집중되고 있으며, 아데노바이러스 치료법이 임상적 상황에서 실제적인 적용성을 확인하기 위한 것이라면 더 강력한 종양세포용해성 바이러스의 생성에 대한 필요성이 존재한다.
Ad5는 단지, 그들의 적혈구응집반응 특성을 포함하는 다양한 속성을 기준으로 하여 서브그룹 A-F로 분류되는 51개의 현재 공지된 아데노바이러스 혈청형 중의 하나일 뿐이다 (참조: Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea., Lippincott, Willianms & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)). 이들 혈청형은 다양한 레벨에서, 예를 들어, 인간 및 설치류에서의 병리학, 부착을 위해서 사용된 세포 수용체에서 상이하지만, 이들 차이점은 더 강력한 종양세포용해성 아데노바이러스를 개발하기 위한 잠재적인 수단으로서는 대부분 무시되어 왔다 (섬유 변형은 제외됨; 참조: Stevenson et al. (1997) J. Virol. 71:4782-4790; Krasnykh et al. (1996) J. Virol . 70:6839-6846; Wickham et al. (1997) J. Virol . 71:8221-8229; Legrand et al. (2002) Curr. Gene Ther. 2:323-329; Barnett et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1-3:1-14; 미국특허출원 제 2003/0017138 호).
아데노바이러스 혈청형들 사이에서의 차이점의 이용은 증가된 선택성 및 효력을 갖는 신규한 아데노바이러스를 사용하여 더 효과적인 아데노바이러스-기본 치료법의 공급원을 제공할 수 있다. 이러한 개선된 아데노바이러스-기본 치료법에 대한 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 바이러스-기본 치료법에 유용한 신규의 키메릭 (chimeric) 아데노바이러스, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 제공한다. 특히, 본 발명은 E2B 영역을 포함하는 게놈을 갖는 키메릭 아데노바이러스, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 제공하는데, 여기서 상기 E2B 영역은 제 1 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열 및 제 2 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열을 포함하고; 상기 제 1 및 2 아데노바이러스 혈청형은 각각 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E 및 F로부터 선택되며 서로 상이하고; 상기 키메릭 아데노바이러스는 종양세포용해성이며, 종양세포에 대한 증진된 치료지수를 나타낸다.
한가지 구체예에서, 키메릭 아데노바이러스는 섬유, 헥손 및 펜톤 단백질을 코딩하는 영역을 더 포함하며, 여기서 상기 단백질을 코딩하는 핵산은 단지 동일한 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 변형된 E3 또는 E4 영역을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 키메릭 아데노바이러스는 결장, 유방, 췌장, 폐, 전립선, 난소 또는 조혈성 종양세포에서 증진된 치료지수를 나타낸다. 특히 바람직한 구체예에서, 키메릭 아데노바이러스는 결장 종양세포에서 증진된 치료지수를 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 키메릭 아데노바이러스의 E2B 영역은 서열 3을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 키메릭 아데노바이러스는 서열 1을 포함한다.
본 발명은 E2B 영역을 포함하는 게놈을 갖는 재조합 키메릭 아데노바이러스, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 제공하는데, 여기서 상기 E2B 영역은 제 1 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열 및 제 2 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열을 포함하고; 상기 제 1 및 2 아데노바이러스 혈청형은 각각 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E 및 F로부터 선택되며 서로 상이하고; 상기 키메릭 아데노바이러스는 종양세포용해성이며, 종양세포에 대한 증진된 치료지수를 나타낸다.
한가지 구체예에서, 본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 치료학적 단백질을 코딩하는 이종 유전자를 포함하며, 여기서 상기의 이종 유전자는 상기 아데노바이러스에 의해서 감염된 세포 내에서 발현된다. 바람직한 구체예에서, 치료학적 단백질은 사이토킨 및 케모킨, 항체, 프로드럭 전환효소 및 면역조절성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 치료학적 목적으로 본 발명의 키메릭 아데노바이러스를 사용하는 방법을 제공한다. 한가지 구체예에서는, 키메릭 아데노바이러스를 사용하여 암세포의 성장을 억제할 수 있다. 특정의 구체예에서, 서열 1을 포함하는 키메릭 아데노바이러스는 결장암 세포의 성장을 억제하는데 유용하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 세포에 치료학적 단백질을 송달하기 위한 벡터로서 유용하다.
본 발명은 (a) 아데노바이러스 서브그룹 B-F를 나타내는 아데노바이러스 혈청형을 모아서 아데노바이러스 혼합물을 생성시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 모은 아데노바이러스 혼합물을, 혈청형들 사이에서의 재조합을 촉진시키기에 충분히 높지만 조발성 세포사를 발생시킬 정도로 높지는 않은 세포당 입자비로 종양세포의 활발하게 성장하는 배양물 상에 통과시키는 단계; (c) 단계 (b)로부터의 상등액을 수거하는 단계; (d) 종양세포의 비활동성 배양물 (quiescent culture)을 단계 (c)에서 수거된 상등액으로 감염시키는 단계; (e) CPE의 어떠한 징후라도 나타나기 전에 단계 (d)로부터 세포배양물 상등액을 수거하는 단계; (f) 종양세포의 비활동성 배양물을 단계 (e)에서 수거된 상등액으로 감염시키는 단계; (g) 단계 (f)에서 수거된 상등액으로부터 플라크 정제 (plaque purification)에 의해서 키메릭 아데노바이러스를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 키메릭 아데노바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
도 1은 TMAE HPLC 칼럼 상에서의 Ad 체류시간 (retention time) 프로필을 나타낸 것이다. A)는 원래의 출발 바이러스 풀 (pool)을 생성시키는데 사용된 개개 Ad 혈청형에 대한 체류 프로필이다. B)는 각각 HT-20, Panc-1, MDA-231 및 PC-3 세포 라인 (cell line)으로부터 유도된 계대 20 풀의 체류 프로필이다.
도 2는 개개 바이러스 풀의 세포용해활성을 나타낸 것이다. A) HT-29, B) MDA-231, C) Panc-1 및 D) PC-3 세포는 100 내지 0.01의 세포당 VP비로 그들의 각각의 바이러스 풀로 감염시켰다. MTS 시험은 세포 라인에 따라서 감염후의 상이한 날에 (지시된 바와 같이) 수행되었다. 패널에서 각각의 데이타 포인트 (data point)는 4중으로 수행된 시험을 나타내며, 결과는 평균+/-SD로 표현된다. 패널은 하나의 대표적인 실험을 도시한 것이고, 모든 바이러스 풀은 표적 종양세포 라인에 대해서 적어도 3회 독립적으로 시험하였다 (도면 기호: -●- Ad5; -□- 초기 바이러스 풀; -■- 특정의 세포 유도된 풀, 계대 20).
도 3은 인간 종양세포 라인에 대한 ColoAd1 및 Ad5의 세포용해활성을 나타낸 것이다. MTS 시험은 그의 잠재적 효력 특이성을 결정하기 위하여 A) 인간 종양세포 라인의 광범위한 패널 및 B) 인간 결장암 세포 라인의 패널 상에서 시험하였다. MTS 시험은 세포 라인에 따라서 상이한 날에 수행되었다. 각각의 패널은 적어도 3회 반복 수행된 대표적인 실험이다. 패널에서 각각의 데이타 포인트는 4중으로 수행된 시험을 나타내며, 결과는 평균+/-SD로 표현된다 (도면 기호: -●- Ad5; -□- ColoAd1).
도 4는 정상세포의 패널에 대한 ColoAd1 및 Ad5의 세포용해활성을 나타낸 것이다. HS-27, HUVEC 및 SAEC 세포 (각각 원발성 섬유아세포, 내피, 및 상피세포)를 100 내지 0.01의 세포당 VP비로 ColoAd1 및 Ad5로 감염시켰다. MTS 시험은 세포에 따라서 감염후의 상이한 날에 수행되었으며, 각각의 패널은 적어도 3회 반복 수행된 대표적인 실험이다. 패널에서 각각의 데이타 포인트는 4중으로 수행된 시험을 나타내며, 결과는 평균+/-SD로 표현된다 (도면 기호: -●- Ad5; -□- ColoAd1).
도 5는 원발성 정상 내피세포 (HUVEC) 및 결장종양 세포 라인 (HT-29) 상에서 ColoAd1, Ad5 및 ONYX-015의 세포용해활성을 나타낸 것이다. 각각의 패널은 적 어도 3회 반복 수행된 대표적인 실험이다. 패널에서 각각의 데이타 포인트 (data point)는 4중으로 수행된 시험을 나타내며, 결과는 평균+/-SD로 표현된다 (도면 기호: -●- Ad5; -□- ColoAd1; -■- Onyx-015).
도 6은 정상 상피세포 라인 (SAEC) 및 인간 결장암 세포 라인 (HT-29) 상에서 ColoAd1, Ad11p 및 Ad5의 세포용해활성을 나타낸 것이다. 각각의 패널은 적어도 3회 반복 수행된 대표적인 실험이다. 패널에서 각각의 데이타 포인트 (data point)는 4중으로 수행된 시험을 나타내며, 결과는 평균+/-SD로 표현된다 (도면 기호: -●- Ad5; -□- Ad11p; -■- ColoAd1).
도 7은 재조합 바이러스의 세포용해활성을 나타낸 것이다. 4개의 바이러스 집단 (Adp11, ColoAd1, 좌측 말단 Ad11/우측 말단 ColoAd1 (ColoAd1.1) 및 좌측말단 ColoAd1/우측 말단 Ad11p (ColoAd1.2))을 나타내는 재조합 바이러스는 실시예 6에 기술된 바와 같이 구성되었다. HT29 세포에서 각각의 집단의 세포용해활성은 전술한 바와 같이 측정되었다 (도면 기호: -●- Ad5; -□- Ad11p; -■- ColoAd1; -υ- ColoAd1.1; -▲- ColoAd1.2).
발명의 상세한 설명
본 명세서에 언급된 특허 및 특허출원을 포함하는 모든 문헌들은 각각의 개개 문헌이 온전히 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 나타내는 것처럼 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
정의
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "아데노바이러스", "혈청형" 또는 "아데노바이러스 혈청형"은 현재 공지되어 있거나, 미래에 분리될 51개의 인간 아데노바이러스 혈청형 중의 어떤 것을 의미한다 (참조예: Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginseng, ea., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984)). 이들 혈청형은 표 1에 나타낸 바와 같이 서브그룹 A-F로 분류된다 (참조: Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)).
서브그룹 아데노바이러스 혈청형
A 12, 18, 31
B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 51
C 1, 2, 5, 6
D 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 50
E 4
F 40, 41
본 명세서에서 사용된 것으로, "키메릭 아데노바이러스"는 그의 핵산 서열이 적어도 두개의 상술한 아데노바이러스 혈청형의 핵산 서열로 구성된 아데노바이러스를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "어버이 (parent) 아데노바이러스 혈청형"은 키메릭 아데노바이러스의 게놈의 대부분이 유도된 혈청형을 나타내는 아데노바이러스 혈청형을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "상동성 재조합"은 각각 상동성 서열을 갖는 두개의 핵산 분자를 의미하며, 여기서 두개의 핵산 분자는 상동성 영역에서 교차하거나 재조합을 일으킨다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "효력"은 바이러스의 용해성 잠재력을 의미하며, 복제, 용해 및 확산하는 그의 능력을 나타낸다. 본 발명의 목적에 따라, 효력은 본 발명의 소정의 아데노바이러스의 세포용해활성을 동일한 세포 라인에서 Ad5의 활성과 비교한 값이며, 즉 효력 = AdX의 IC50/Ad5의 IC50, 여기서 X는 시험한 특정의 아데노바이러스 혈청형이고, Ad5의 효력은 1의 값이 주어진다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "종양세포용해성 바이러스"는 정상세포에 비해서 암세포를 선택적으로 사멸시키는 바이러스를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "치료지수" 또는 "치료창 (therapeutic window)"은 소정의 아데노바이러스의 종양세포용해성 잠재력을 나타내는 수를 의미하며, 암세포 라인에서 아데노바이러스의 효력을 정상 (즉, 비-암성) 세포 라인에서 동일한 아데노바이러스의 효력으로 나누어 줌으로써 결정된다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "변형된"은 천연적으로 존재하는, 즉 야생형 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 상이한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 갖는 분자를 의미한다. 변형된 분자는 야생형 분자의 기능 또는 활성은 보유할 수 있으며, 즉 변형된 아데노바이러스는 그의 종양세포붕괴활성을 보유할 수 있다. 변형은 이하에 기술하는 바와 같은 핵산에 대한 돌연변이를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 관련한 "돌연변이"는 각각 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 (예를 들어, 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 일차, 이차 또는 삼차 구조에 대한 천연적으로-존재하거나, 합성적이거나, 재조합되거나, 화학적인 변화 또는 차이를 의미한다. 돌연변이에는 예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환과 같은 변화가 포함된다. 이러한 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 본 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 단리되거나 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "결실"은 각각 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 존재하지 않는 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로 정의된다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "삽입" 또는 "부가"는 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하여, 각각 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 부가를 제공하는 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "치환"은 각각 상이한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의한 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산의 대체로 인한 것이다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "아데노바이러스 유도체"는 부가, 결실 또는 치환이 바이러스 게놈에 대해서, 또는 바이러스 게놈에서 이루어지도록 하거나, 생성된 아데노바이러스 유도체가 어버이 아데노바이러스에 비해서 더 큰 효력 및/또는 치료지수를 나타내거나, 또는 일부의 다른 방식으로 더 치료학적으로 유용하도록 (즉, 더 적은 면역원성, 개선된 청소 (clearance) 프로필) 변형된 본 발명의 아데노바이러스를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 아데노바이러스의 유도체는 바이러스 게놈의 E1A 또는 E2B 영역을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 바이러스 게놈의 초기 유전자 중의 하나에서 결실을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 관한 "변이체"는 각각 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 (예를 들어, 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여) 일차, 이차, 또는 삼차 구조에서 변화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열은 기준 아미노산 또는 핵산 서열과는 상이한 돌연변이 또는 변형을 함유할 수 있다. 일부의 구체예에서, 아데노바이러스 변이체는 상이한 이소형태 (isoform) 또는 다형성 (polymorphism)일 수 있다. 변이체는 본 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 단리되거나 생성된 천연적으로 존재하거나, 합성되거나, 재조합체이거나, 또는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 변이체의 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변화는 침묵 (silent)할 수 있다. 즉, 이들은 폴리뉴클레오타이드에 의해서 코딩된 아미노산을 변화시키지 않을 수 있다. 변형이 이러한 타입의 침묵성 변화 (silent changes)로 제한되는 경우에, 변이체는 기준 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩할 것이다. 대신으로, 변이체의 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 이러한 변화는 기준 폴리뉴클레오타이드에 의해서 코딩된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변형시켜 후술하는 바와 같이 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변화를 야기할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 변화는 기준 서열에 의해서 코딩된 폴리펩타이드에서의 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단을 제공할 수 있다. 다양한 제한부위를 생성하는 침묵성 변화와 같은 다양한 코돈 치환을 도입하여 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로의 클로닝 또는 특정한 원핵성 또는 진핵성 시스템에서의 발현을 최적화시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "아데노바이러스 변이체"는 그의 폴리뉴클레오타이드 서열이 상술한 바와 같은 기준 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 야생형 아데노바이러스와는 상이한 아데노바이러스를 의미한다. 그 차이는 어버이와 변이체의 폴리뉴클레오타이드 서열이 전체적으로 유사하고, 대부분의 영역에서는 동일하도록 제한된다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 두가지 서열의 비교가 이들이 약간의 서열 차이가 있음을 나타내는 경우에 (즉, 제 1 및 2 서열이 거의 동일한 경우), 제 1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제 2 서열과 "유사하다"고 말한다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 아데노바이러스 변이체와 기준 아데노바이러스 사이에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열 차이는 효력 및/또는 치료지수에서의 차이를 야기하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "보존적"은 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성을 갖는 상이한 아미노산 잔기로 치환시킨 것을 의미한다. 보존적 아미노산 치환에는 로이신을 이소로이신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 또는 트레오닌을 세린으로 대체하는 것이 포함된다. 삽입 또는 결실은 일반적으로 약 1 내지 5개의 아미노산의 범위이다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "비보존적"은 아미노산 잔기를 상이한 화학적 특성을 갖는 상이한 아미노산 잔기로 치환시킨 것을 의미한다. 비보존적 치환에는 아스파르트산 (D)을 글리신 (G)으로 대체시키거나; 아스파라긴 (N)을 라이신 (K)으로 대체시키거나; 알라닌 (A)을 아르기닌 (R)으로 대체시키는 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
아미노산 잔기에 대한 단일-문자 코드에는 다음이 포함된다: A = 알라닌, R = 아르기닌, N = 아스파라긴, D = 아스파르트산, C = 시스테인, Q = 글루타민, E = 글루탐산, G = 글리신, H = 히스티딘, I = 이소로이신, L = 로이신, K = 라이신, M = 메티오닌, F = 페닐알라닌, P = 프롤린, S = 세린, T = 트레오닌, W = 트립토판, Y = 타이로신, V = 발린.
폴리펩타이드는 종종, 통상적으로 천연적으로 존재하는 20 아미노산으로 불리는 20개의 아미노산이 아닌 아미노산을 함유하며, 말단 아미노산을 포함한 다수의 아미노산은 글리코실화 및 그 밖의 다른 해독후 변형과 같은 천연적 과정에 의해, 또는 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 화학적 변형기술에 의해 소정의 폴리펩타이드에서 변형될 수 있는 것으로 인식될 수 있다. 폴리펩타이드에서 천연적으로 일어나는 통상적인 변형조차도 본 명세서에서 총망라하여 열거하기에는 너무 많으며, 이들은 기본적인 텍스트 (text) 및 더 상세한 논문에서뿐만 아니라, 다수의 연구문헌에 잘 기술되어 있고, 이들은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에 존재할 수 있는 공지된 변형 중에는 몇가지 예를 언급하면 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴 부위의 공유적 부착, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유적 부착, 교차결합, 폐환, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유적 교차결합의 형성, 시스틴의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 당화 (glycation), 글리코실화, GPI 앵커 (anchor) 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 과정, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설페이트화, 아르기닐화화 같은 단백질에 대한 아미노산의 전이-RNA 매개된 부가, 및 편재화 (ubiquitination)가 있다.
이러한 변형은 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 과학문헌에 대단히 상세하게 기술되어 있다. 몇가지 특히 통상적인 변형, 예를 들어, 글리코실화, 지질 부착, 설페이트화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화는 대부분의 기본적인 텍스트 (예를 들어, I.E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties , 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York, 1993)에 기술되어 있다. 이 주제에 대하여 예를 들어, 문헌 (Wold, F., in Posttanslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol . 182:626-646, 1990, 및 Rattan et al., Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62)에 제공된 것과 같은 다수의 상세한 검토를 이용할 수 있다.
잘 알려져 있으며 상기에 언급한 바와 같이, 폴리펩타이드는 항상 완전히 선형은 아닌 것으로 인식될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 편재화의 결과로 분지될 수 있으며, 이들은 일반적으로 자연적인 처리 사건 (events) 및 자연적으로 일어나지 않는 인간의 조작에 의해서 유도되는 사건을 포함하는 해독후 사건의 결과로, 분지화 (branching)를 갖거나 갖지 않고 원형일 수 있다. 원형, 분지형, 및 분지된 원형의 폴리펩타이드는 비-해독성 천연적 과정에 의해서 및 마찬가지로, 완전히 합성적인 방법에 의해서 합성될 수 있다.
변형은 폴리펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하여 폴리펩타이드 내의 어디에서나 일어날 수 있다. 실제로, 공유적 변형에 의한 폴리펩타이드 내의 아미노 또는 카복실기 또는 둘 다의 차단 (blockage)은 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드 및 합성 폴리펩타이드에서 공통적인 것이며, 이러한 변형은 본 발명의 폴리펩타이드에도 마찬가지로 존재할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분해과정 전에 이. 콜라이 (E. coli)에서 만들어진 폴리펩타이드의 아미노 말단 잔기는 거의 변함없이 N-포르밀메티오닌일 수 있다.
폴리펩타이드에서 나타나는 변형은 종종 이것이 만들어지는 방식과 함수관계에 있다. 숙주에서 클로닝된 유전자를 발현시킴으로써 만들어진 폴리펩타이드의 경우에, 예를 들어, 변형의 성질 및 정도는 대부분 숙주세포 해독후 변형능 및 폴리펩타이드 아미노산 서열에 존재하는 변형 시그날에 의해서 결정될 것이다. 예를 들어, 잘 알려진 바와 같이, 글리코실화는 종종 이. 콜라이와 같은 박테리아 숙주에서는 일어나지 않는다. 따라서, 글리코실화를 원하는 경우에, 폴리펩타이드는 글리코실화 숙주, 일반적으로 진핵세포에서 발현되어야 한다. 곤충세포는 종종 포유동물 세포와 동일한 해독후 글리코실화를 수행하며, 이러한 이유로 특히 글리코실화의 천연적 패턴을 갖는 포유동물 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해서 곤충세포 발현 시스템이 개발되었다. 유사한 고려사항은 다른 변형에도 적용된다.
동일한 타입의 변형은 소정의 폴리펩타이드 내의 몇개의 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있는 것으로 인식될 수 있을 것이다. 또한, 소정의 폴리펩타이드는 다수의 변형 타입을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 다음의 용어들을 사용하여 두개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 서열 관계를 기술한다: "기준 서열", "비교창 (comparison window)", "서열 동일성 (identity)", "서열 동일성의 백분율", "실질적 동일성", "유사성 (similarity)" 및 "상동성 (homologous)". "기준 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 정의된 서열이며; 기준 서열은 예를 들어, 서열 리스트에 제시된 전체-길이 cDNA 또는 유전자 서열의 절편 (segment)으로서의 더 큰 서열의 서브셋트 (subset)일 수 있거나, 완전 cDNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 길이가 적어도 18개의 뉴클레오타이드 또는 6개의 아미노산이며, 종종 길이가 적어도 24개의 뉴클레오타이드 또는 8개의 아미노산이고, 때때로는 길이가 적어도 48개의 뉴클레오타이드 또는 16개의 아미노산이다. 두개의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 각각 (1) 두개의 분자 사이에서 유사한 서열 (즉, 완전 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 일부분)을 포함할 수 있으며, (2) 두개의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이에서 서로 다른 서열을 더 포함할 수 있기 때문에, 두개 (또는 그 이상)의 분자 사이에서의 서열 비교는 일반적으로 "비교창"에 걸쳐서 두개의 분자의 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소적 부위를 확인하고 비교함으로써 수행된다. 본 명세서에서 사용된 것으로 "비교창"은 적어도 18개의 인접한 뉴클레오타이드 위치 또는 6개의 아미노산으로 된 개념적 절편을 의미하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열은 적어도 18개의 인접한 뉴클레오타이드 또는 6개의 아미노산 서열의 기준 서열과 비교될 수 있고, 비교창에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 두개의 서열의 최적 정렬 (alignment)을 위해서 기준 서열 (이것은 부가 또는 결실을 포함하지 않는다)에 비해 20% 또는 그 미만의 부가, 결실, 치환 등 (예를 들어, 갭 (gap))을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 스미스와 워터만 (Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482 (1981))의 국소적 상동성 알고리듬 (local homology algorithm)에 의해서, 니들맨과 분쉬 (Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443 (1970))의 상동성 정렬 알고리듬 (homology alignment algorithm)에 의해서, 피어슨과 리프만 (Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . (U.S.A.) 85:2444 (1988))의 유사성에 대한 탐색방법에 의해서, 이들 알고리듬의 컴퓨터화된 임플리멘테이션 (computerized implementation)(GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), VectorNTI from Informatix, Geneworks, or MacVector software packages)에 의해서, 또는 검사에 의해서 수행될 수 있으며, 다양한 방법에 의해서 발생된 최적의 정렬 (즉, 비교창에 걸친 상동성의 최고 백분율을 제공하는)이 선택된다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "서열 동일성"은 두개의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 비교창에 걸쳐서 동일한 것 (즉, 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 잔기-대-잔기 기준)을 의미한다. 용어 "서열 동일성의 백분율"은 두개의 최적으로 정렬된 서열을 비교의 창에 걸쳐서 비교하고, 양 서열에서 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 나타나는 위치의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 얻고, 일치된 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총수 (즉, 창 크기)로 나누고, 결과값에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산된다. 본 명세서에서 사용된 것으로 용어, 용어 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 특징을 나타내는 것으로, 여기서는 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산이 적어도 18개의 뉴클레오타이드 (6개의 아미노산) 위치의 비교창에 걸쳐서, 종종 적어도 24-48개의 뉴클레오타이드 (8-16개의 아미노산) 위치에 걸쳐서 기준 서열과 비교한 것으로 적어도 85% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95% 서열 동일성, 더욱 통상적으로는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 서열 동일성의 백분율은 기준 서열을 비교창에 걸쳐서 기준 서열의 총 20% 또는 그 미만에 달하는 결실 또는 부가를 포함할 수 있는 서열과 비교함으로써 계산된다. 기준 서열은 더 큰 서열의 서브셋트일 수 있다. 폴리펩타이드를 기술하기 위해서 사용되는 경우의 용어 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 보존된 아미노산 치환체를 제 2 폴리펩타이드의 서열에 대해 비교함으로써 결정된다. 폴리뉴클레오타이드를 기술하기 위해서 사용되는 경우의 용어 "상동성"은 두개의 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬하여 비교한 경우에 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 가지고 뉴클레오타이드의 적어도 70%에서, 통상적으로는 뉴클레오타이드의 약 75% 내지 99%에서, 더욱 바람직하게는 뉴클레오타이드의 적어도 약 98 내지 99%에서 동일한 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 폴리뉴클레오타이드를 기술하기 위해서 사용된 경우의 "상동성"은 두개의 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬하여 비교한 경우에 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 가지고 뉴클레오타이드의 적어도 70%에서, 통상적으로는 뉴클레오타이드의 약 75% 내지 99%에서, 더욱 바람직하게는 뉴클레오타이드의 적어도 약 98 내지 99%에서 동일한 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "폴리머라제 연쇄반응" 또는 "PCR"은 DNA의 특정한 부분이 미국특허 제 4,683,195 호에 기술된 바와 같이 증폭되는 과정을 의미한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 디자인할 수 있도록 중요한 폴리펩타이드 단편의 말단으로부터의 서열 정보 또는 그 이상을 이용할 수 있도록 하는 것이 필요하며; 이들 프라이머는 서로를 향할 수 있고, 서열이 증폭될 주형의 반대 스트랜드와 동일하거나 유사할 수 있다. 두개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오타이드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 것이다. PCR을 사용하여 전체 게놈 DNA로부터 특정의 DNA 서열, 전체 세포성 RNA로부터 전사된 cDNA, 플라스미드 서열 등을 증폭시킬 수 있다 (일반적인 참조: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol., 51:263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).
본 명세서에서 사용된 것으로서, "엄격도 (stringency)"는 일반적으로 대략 Tm (융점)-5℃ (프로브의 Tm 이하 5℃) 내지 Tm 이하 약 20℃ 내지 25℃까지의 범위에서 일어난다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이해될 수 있는 바와 같이, 엄격 (stringent) 혼성화를 사용하여 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인 또는 검출할 수 있거나, 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인 또는 검출할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "엄격 조건"은 혼성화가 서열 사이에 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97% 동일성이 있는 경우에만 일어날 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "혼성화"는 폴리뉴클레오타이드 스트랜드를 염기 짝지음 (pairing)을 통해서 상보적 스트랜드와 결합시키는 모든 방법"을 포함하여야 한다 (Coombs, J. Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994).
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "치료학적 유효용량" 또는 "유효량"은 질환의 증상 또는 상태를 개선시키는 아데노바이러스의 양을 의미한다. 용량은 개체의 수명 연장을 유도할 수 있도록 종양 또는 전이성 성장이 느려지거나 중지되거나, 또는 종양 또는 전이가 크기가 줄어들게 되는 경우에 암 또는 그의 전이를 치료하는데 치료학적 유효용량으로 간주된다.
본 발명의 아데노바이러스
본 발명은 키메릭 아데노바이러스의 E2B 영역의 뉴클레오타이드 서열이, 각각 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E 및 F로부터 선택되고, 서로 상이한 적어도 두개의 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 키메릭 아데노바이러스, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 제공한다. 본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 종양세포용해성이며, 종양세포에 대하여 증진된 치료지수를 나타낸다.
키메릭 아데노바이러스의 분리
본 발명의 키메릭 아데노바이러스, 또는 그의 변이체 또는 유도체는 "생체선택 (bioselection)"으로 불리는 기술의 변형법을 사용하여 생산될 수 있으며, 여기서 증진된 종양원성 또는 세포 타입 선택성과 같은 원하는 특성을 갖는 아데노바이러스는 조절된 조건 하에서 유전자 선택의 사용을 통해서 생성된다 (Yan et al. (2003) J. Virol . 77:2640-2650).
본 발명에서는, 상이한 혈청형의 아데노바이러스의 혼합물을 모으고, 혈청형들 사이에서 재조합을 촉진시키기에 충분히 높지만 조발성 세포사를 발생시킬 정도로 높지는 않은 세포대 입자비로 종양세포의 서브컨플루언트 배양물 (subconfluent culture) 상에 바람직하게는 적어도 2회 통과시킨다. 바람직한 세포당 입자비는 세포당 약 500 입자이며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 용이하게 측정된다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 세포의 "서브컨플루언트 배양물"은 세포가 활발하게 성장하는 단일층 또는 현탁 배양물을 의미한다. 단일층으로 성장한 세포에 대한 예는 세포 성장을 위해서 이용할 수 있는 영역의 약 50% 내지 80%가 세포로 덮인 경우의 배양물일 수 있다. 바람직한 것은 성장 영역의 약 75%가 세포로 덮인 경우의 배양물이다.
바람직한 구체예에서, 아데노바이러스 혼합물은 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E 및 F 중의 대표적인 아데노바이러스 혈청형을 포함하는 것이다. 그룹 A 아데노바이러스는 설치류에서의 종양 형성과 연관되기 때문에, 혼합물 내에 포함되지 않는다. 생체선택 방법에서 유용한 바람직한 종양세포 라인에는 유방, 결장, 췌장, 폐 및 전립선으로부터 유도된 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 아데노바이러스 혼합물의 "생체선택적" 통과 (bioselective passaging)에 유용한 고체종양세포 라인의 몇가지 예로는 MDA231, HT29, PAN-1 및 PC-3 세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 조혈성 세포 라인에는 라지 (Raji) 및 다우디 (Daudi) B-림프양 세포, K562 적아구양 세포, U937 골수양 세포 및 HSB2 T-림프양 세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
이들 초기 계대 (passage) 중에 생성된 아데노바이러스를 사용하여 하나 이하의 아데노바이러스에 의한 세포의 감염을 허용하기에 충분히 낮은 세포 대 입자비로 비활동성 종양세포를 감염시킨다. 이들 조건 하에서 20회까지 계대시킨 후에, 가시적인 세포변성효과 (visible cytopathic effect; CPE, 참조: Fields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 135-136)가 나타나기 전에 최종 계대로부터의 상등액을 수확하여 매우 강력한 바이러스의 선택을 증가시킨다. 수확한 상등액은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 기술에 의해서 농축시킬 수 있다. 단일층 배양물에서 비활동성 세포, 즉 활발한 세포 성장이 중단한 것을 수득하는 바람직한 방법은 배양물이 융합한 이후에 3일 동안 성장하도록 하는 것이며, 여기서 융합은 세포 성장에 이용할 수 있는 전체 영역이 점유된 (세포로 덮인) 것을 의미한다. 유사하게, 현탁 배양물은 활발한 세포 성장의 부재를 특징으로 하는 밀도로 성장할 수 있다.
생체선택된 아데노바이러스 풀을 함유하는 농축된 상등액의 혈청형 프로필은 음이온교환칼럼 상에서 수확한 바이러스 풀의 체류시간을 측정함으로써 검사될 수 있으며, 여기서 상이한 아데노바이러스 혈청형은 특징적 체류시간을 갖는 것으로 알려져 있다 (Blanche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055-1062); 참조: 실시예 3, 도 1A 및 B. 본 발명의 아데노바이러스는 희석 및 플라크 정제, 또는 본 기술분야에서 잘 알려진 그 밖의 다른 기술에 의해서 농축된 상등액으로부터 단리될 수 있으며, 더 특정화하기 위하여 성장시킨다. 본 기술분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 단리된 키메릭 아데노바이러스의 서열을 결정한다 (참조: 실시예 5).
본 발명의 키메릭 아데노바이러스의 예는 생체선택방법에서 HT29 결장세포를 사용하여 단리된 키메릭 아데노바이러스 ColoAd1이다. ColoAd1은 서열 1의 핵산 서열을 갖는다. ColoAd1의 뉴클레오타이드 서열의 대부분은 Ad11 혈청형의 뉴클레오타이드 서열 (서열 2)과 동일하다 (Stone et al. (2003) Virology 309: 152-165; Mei et al. (2003) J. Gen . Virology 84:2061-2071). ColoAd1 뉴클레오타이드 서열에는 Ad11과 비교하여 두개의 결실이 있으며, 하나는 게놈의 E3 전사단위 부분 내의 길이가 2444 염기쌍인 것 (서열 2의 염기쌍 27979 내지 30423)이고, 두번째의 더 작은 결실은 E4orf4 유전자 내의 길이가 25 염기쌍인 것 (서열 2의 염기쌍 33164 내지 33189)이다. 아데노바이러스 단백질 DNA 폴리머라제 및 말단 단백질을 코딩하는 ColoAd1의 E2B 전사단위 부분 (서열 3)은 서열 1의 염기쌍 5067과 10354 사이에 위치하며, Ad11 및 Ad3 혈청형 사이의 상동성 재조합의 영역이다. ColoAd1의 이 부분 내에는 Ad11의 서열 (서열 1)과 비교하여 198개의 염기쌍 변화가 있다. 이 변화는 Ad3의 E2B 영역의 일부분 내의 서열 (서열 8)과 상동성인 ColoAd1의 E2B 영역 내의 뉴클레오타이드의 신장부 (stretches)를 제공하며, ColoAd1과 Ad3 사이에서 상동성인 가장 긴 신장부는 길이가 414 bp이다. ColoAd1의 E2B 영역 (서열 3)은 변형되지 않은 Ad11 아데노바이러스에 비해서 ColoAd1 아데노바이러스에 증진된 효력을 부여한다 (참조: 실시예 6; 도 7). 그 밖의 다른 구체예에서, 본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 두개보다 많은 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 키메릭 아데노바이러스, 또는 그의 변이체 또는 유도체는 그의 용해성 잠재력을 아데노바이러스 풀이 일차로 계대된 동일한 조직으로부터 유도된 종양세포의 패널에서 시험함으로써 특정 종양 타입에서의 그의 선택성에 대해서 평가될 수 있다. 예를 들어, HT-29 결장종양 세포 라인 상에 계대된 아데노바이러스 풀로부터 일차적으로 유도된 키메릭 아데노바이러스 ColoAd1 (서열 1)은 HT-29 세포, 및 DLD-1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48 및 Colo320DM을 포함하는 그 밖의 다른 결장-유도된 종양세포 라인의 패널 둘 다에서 재시험하였다 (참조: 도 3B). 이용할 수 있는 어떤 결장종양 세포 라인이라도 이러한 평가를 위해서 동등하게 유용할 수 있다. 그 밖의 다른 종양세포 타입 상에서 선택된 아데노바이러스 풀로부터 단리된 아데노바이러스 클론은 전립선 세포 라인 (예를 들어, DU145 및 PC-3 세포 라인); 췌장 세포 라인 (예를 들어, Panc-1 세포 라인); 유방종양 세포 라인 (예를 들어, MDA231 세포 라인) 및 난소 세포 라인 (예를 들어, OVCAR-3 세포 라인)을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 적합한 종양세포 패널에서 유사하게 시험할 수 있다. 그 밖의 다른 이용가능한 종양세포 라인은 본 발명의 아데노바이러스를 분리하고 확인하는데 동등하게 유용하다.
본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 이것이 유도된 아데노바이러스 혈청형과 비교하여 증진된 치료지수를 갖는다 (참조: 키메릭 아데노바이러스 ColoAd1의 세포용해활성을 Ad11p와 비교한 도 6).
본 발명은 또한, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있는 재조합 기술을 사용하여 제작된 키메릭 아데노바이러스를 포함한다. 이러한 키메릭 아데노바이러스는 재조합 기술에 의해서 제 2 아데노바이러스 혈청형의 게놈 내로 통합된, 하나의 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함한다. 통합된 서열은 어버이 아데노바이러스 혈청형에 특성, 예를 들어, 종양 특이성 또는 증진된 효력을 부여한다. 예를 들어, ColoAd1의 E2B 영역 (서열 3)은 Ad35 또는 Ad9의 게놈 내에 통합될 수 있다.
아데노바이러스 유도체
본 발명은 또한, 그 밖의 다른 치료학적으로 유용한 키메릭 아데노바이러스를 제공하도록 변형된 본 발명의 키메릭 아데노바이러스를 포함한다. 변형에는 이하에 기술하는 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
한가지 변형은 E1B-55K 단백질을 코딩하는 아데노바이러스 유전자에서의 돌연변이의 결과로 p53에 결합하는 능력을 실질적으로 결여하는 본 발명의 키메릭 아데노바이러스의 유도체의 생성이다. 이러한 바이러스는 일반적으로 결실된 E1B-55K 부분의 일부분 또는 전부를 갖는다 (참조: 미국특허 제 5,677,178 호). 미국특허 제 6,080,578 호는 그중에서도 특히 p53을 결합시키는 원인이 되는 E1B-55K 단백질의 영역에서 결실을 갖는 Ad5 돌연변이체를 기술하였다. 본 발명의 키메릭 아데노바이러스에 대한 또 다른 바람직한 변형은 미국특허 제 5,801,029 및 5,972,706 호에 기술된 것과 같은 E1A 영역에서의 돌연변이이다. 이들 변형의 타입은 종양세포에 대한 더 큰 선택성을 갖는 본 발명의 키메릭 아데노바이러스의 유도체를 제공한다.
본 발명에 포함되는 변형의 또 다른 예는 미국특허 제 5,998,205 호에 기술된 바와 같은 조직 특이적 프로모터의 조절 하에서의 바이러스 복제의 배치에 기인하여 증가된 정도의 조직 특이성을 나타내는 키메릭 아데노바이러스이다. 본 발명의 키메릭 아데노바이러스의 복제는 또한, 미국특허출원 제 09/14,409 호에 기술된 바와 같이, E2F 반응성 요소의 조절 하에 배치될 수도 있다. 이러한 변형은 E2F의 존재를 기초로 한 바이러스 복제 조절 기전을 제공하여 증진된 종양조직 특이성을 제공하며, 조직 특이적 종양에 의해서 실현된 조절과는 상이하다. 이들 구체예 둘 다에서, 조직 특이적 프로모터 및 E2F 반응성 요소는 아데노바이러스의 복제에 필수적인 아데노바이러스 유전자에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 포함되는 또 다른 변형은 신규한 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 중추 (backbone)로서 본 발명의 키메릭 아데노바이러스, 예를 들어, ColoAd1을 사용하는 것이다. 문헌 ((Lai et al. (2002) DNA Cell Bio. 21:895-913)에 기술된 바와 같이, 복제 결핍성인 아데노바이러스 벡터를 사용하여 치료제를 송달하고 발현시킬 수 있다. 여기서는 본 발명의 키메릭 아데노바이러스로부터 유도된 제 1 세대 (E1 및 E3-부분이 결실됨) 및 제 2 세대 (E4 영역이 추가로 결실됨) 아데노바이러스 벡터는 둘 다가 제공된다. 이러한 벡터는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 기술을 사용하여 용이하게 생산된다 (참조: Imperiale and Kochanek (2004) Curr . Top . Microbiol. Immunol . 273:335-357; Vogels et al. (2003) J. Virol . 77:8263-8271).
본 발명에 포함되는 추가의 변형은 바이러스 감염의 효율을 추적하기 위한 마커 (marker) 또는 리포터 (reporter)로서 유용한 이종 유전자의 삽입이다. 이러한 타입의 변형의 한가지 구체예는 티미딘 키나제 (TK) 유전자의 삽입이다. 감염된 세포 내에서의 TK의 발현을 사용하여, TK 반응의 방사성표지된 기질을 사용한 바이러스 감염 이후에 세포 내에 잔류하는 바이러스의 레벨을 추적할 수 있다 (Sangro et al., (2002) Mol . Imaging Biol . 4:27-33).
변형된 키메릭 아데노바이러스의 제작을 위한 방법은 일반적으로 본 기술분야에서 공지되어 있다 (참조: Mittal, S.K. (1993) Virus Res . 28:67-90; 및 Hermiston, T. et al. (1999) Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, ed, Humana Press). 재조합 핵산 방법, 폴리뉴클레오타이드 합성, 및 미생물 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공 (electroporation), 리포펙션 (lipofection))을 위해서 표준기술이 사용된다. 일반적으로, 효소적 반응 및 정제단계는 제조자의 설명서에 따라서 수행된다. 기술 및 과정은 일반적으로 본 기술분야에서의 통상적인 방법 및 본 명세서 전체에 걸쳐서 제시된 다양한 일반적 문헌 (참조: 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 따라서 수행된다. 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 분석화학, 유기합성화학 및 약제학적 제제화의 실험실적 과정은 본 기술분야에서 잘 알려지고 통상적으로 사용되는 것이다.
치료학적 잠재력의 측정
본 발명의 키메릭 아데노바이러스, 또는 그의 변이체 또는 유도체는 치료학적 표적으로서 중요한 조직으로부터 유도된 종양세포에서 그들의 용해성 잠재력을 시험함으로써 그들의 치료학적 유용성에 대하여 평가할 수 있다. 이러한 아데노바이러스를 시험하는데 유용한 종양세포 라인에는 DLD-1, HCT116, HT29, LS1034 및 SW48 세포 라인을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 결장 세포 라인; DU145 및 PC-3 세포 라인을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 전립선 세포 라인; Panc-1 세포 라인을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 췌장 세포 라인; MDA231 세포 라인을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 유방종양 세포 라인; 및 OVCAR-3 세포 라인을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 난소 세포 라인이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 조혈성 세포 라인에는 라지 (Raji) 및 다우디 (Daudi) B-림프양 세포, K562 적아구양 세포, U937 골수양 세포 및 HSB2 T-림프양 세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이용가능한 그 밖의 다른 어떤 종양세포 라인이라도 종양형성의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 아데노바이러스를 평가 및 확인하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스의 세포용해활성은 대표적인 종양세포 라인에서 측정될 수 있으며, 데이타는 효력의 측정치로 전환될 수 있고, 여기서 아데노바이러스는 서브그룹 C, 바람직하게는 Ad5에 속하며, 표준물 (즉, 1의 효력을 제공함)로서 사용된다. 세포용해활성을 측정하는 바람직한 방법은 MTS 시험이다 (참조: 실시예 4, 도 2).
특정 종양세포 라인에서 본 발명의 아데노바이러스의 치료지수는 종양세포 라인에서 소정의 아데노바이러스의 효력을 비-암성 세포 라인에서 동일한 아데노바이러스의 효력과 비교함으로써 계산될 수 있다. 바람직한 비-암성 세포 라인은 기원이 상피인 SAEC 세포, 및 기원이 내피인 HUVEC 세포이다 (참조: 도 4). 이들 두가지 세포 타입은 기관 및 맥관구조가 각각 유도되는 정상세포를 나타내며, 아데노바이러스의 송달 모드에 따라 아데노바이러스 치료 중에 독성이 있을 것 같은 부위 중의 대표적인 것이다. 그러나, 본 발명의 실시는 이들 세포의 사용으로 제한되지는 않으며, 그 밖의 다른 비-암성 세포 라인 (예를 들어, B 세포, T 세포, 대식세포, 단핵세포, 섬유아세포)이 또한 사용될 수도 있다.
본 발명의 키메릭 아데노바이러스는, 종양세포의 이식물을 수용한 누드 마우스에서 종양형성 또는 종양세포 부하량을, 동등한 종양세포 부하량을 수용한 비처리된 마우스에 비해서 감소시키는 그들의 능력에 의해서 종양세포 성장 (즉, 암)을 표적화하는 그들의 능력에 대해 더 평가될 수 있다 (참조: 실시예 7).
본 발명의 아데노바이러스의 평가는 또한, 통상적으로 종양 이종이식 시험을 사용하여 생성될 수 없는 종양에 존재하는 시험조건을 제공하는 일차 인간 종양 외이식편 (Lam et al. (2003) Cancer Gene Therapy; Grill et al. (2003) Mol . Therapy 6:609-614)을 사용하여 수행될 수도 있다.
치료학적 유용성
본 발명은 종양세포 성장의 억제를 위한 본 발명의 키메릭 아데노바이러스의 사용, 및 종양형성 및 그 밖의 다른 질환상태의 치료에 유용한 치료학적 단백질을 송달하기 위한 이들 키메릭 아데노바이러스로부터 유도된 아데노바이러스 벡터의 사용을 제공한다.
약제학적 조성물 및 투여
본 발명은 또한, 환자에게 치료학적 투여하기 위하여 제제화된 본 발명의 키메릭 아데노바이러스 (그의 변이체 및 유도체를 포함)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 치료학적 사용을 위해서, 약물학적 유효용량의 아데노바이러스를 함유하는 멸균 조성물은 예를 들어, 종양 상태의 치료를 위해서 인간 환자 또는 수의과적 비-인간 환자에게 투여된다. 일반적으로, 조성물은 수성 현탁액 중에 약 1011개 또는 그 이상의 아데노바이러스 입자를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 부형제가 이러한 멸균 조성물에서 종종 사용된다. 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 식염수, 0.3%-글리신 등의 다양한 수용액이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균상태이며, 일반적으로 목적하는 아데노바이러스 벡터 이외의 입자상 물질을 함유하지 않는다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하게 하기 위한 필요에 따라서, pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등과 같은 약제학적으로 허용되는 보조성분, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수 있다. 아데노바이러스에 의한 세포의 감염을 증진시키는 부형제가 포함될 수도 있다 (참조: 미국특허 제 6,392,069 호).
본 발명의 아데노바이러스는 또한, 리포좀 또는 면역리포좀 (immunoliposome) 송달에 의하여 종양세포에 송달될 수도 있으며; 이러한 송달은 종양세포 집단상에 존재하는 세포표면 특성 (즉, 면역리포좀에서 면역글로불린을 결합시키는 세포표면 단백질의 존재)을 기초로 하여 종양세포에 대해서 선택적으로 표적화될 수 있다. 일반적으로, 비리온 (virion)을 함유하는 수성 현탁액은 리포좀 또는 면역리포좀 내에 캅셀화된다. 예를 들어, 아데노바이러스 비리온의 현탁액은 통상적인 방법에 의해서 미셀 (micelles) 내에 캅셀화되어 면역리포좀을 형성할 수 있다 (미국특허 제 5,043,164 호, 미국특허 제 4,957,735 호, 미국특허 제 4,925,661 호; Connor and Huang, (1985) J. Cell Biol. 101: 581; Lasic D.D. (1992) Nature 355: 279; Novel Drug Delivery (eds. Prescott and Nimmo, Wiley, New York, 1989(; Reddy et al. (1992) J. Immunol. 148:1585). 개체의 암세포 상에 존재하는 암세포 항원 (예를 들어, CALLA, CEA)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 면역리포좀을 사용하여 비리온을 이들 세포에 대해서 표적화시킬 수도 있다 (Fisher (2001) Gene Therapy 8:341-348).
본 발명의 아데노바이러스의 효능을 더 증가시키기 위하여, 이들은 특정 종양세포 타입에 대해서 증진된 지향성 (tropism)을 나타내도록 변형될 수 있다. 예를 들어, PCT/US98/04964에 나타낸 바와 같이, 아데노바이러스의 외부 피막 상의 단백질은 정상세포보다 더 큰 정도로 종양세포 상에 존재하는 수용체에 결합하는 화학제, 바람직하게는 폴리펩타이드를 나타내도록 변형될 수 있다 (또한 참조: 미국특허 제 5,770,442 및 5,712,136 호). 폴리펩타이드는 항체일 수 있으며, 바람직하게는 단일쇄 항체이다.
아데노바이러스 치료법
본 발명의 아데노바이러스 또는 그의 약제학적 조성물은 종양성 질환 또는 암의 치료학적 치료를 위해서 투여될 수 있다. 치료학적 적용시에, 조성물은 특정의 종양성 질환에 이미 걸린 환자에게 상태 및 그의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키는데 충분한 양으로 투여된다. 이것을 수행하기에 적합한 양은 "치료학적 유효용량" 또는 "유효용량"으로 정의된다. 이러한 사용에 효과적인 양은 상태의 중증도, 환자의 일반적 상태, 및 투여의 경로에 따라서 좌우된다.
제한적인 것은 아니지만, 예를 들어, 고체 또는 혈액적 종양성 질환 (예를 들어, 췌장암, 결장암, 난소암, 폐암 또는 유방암, 백혈병 또는 다발성 골수종)을 갖는 인간 환자 또는 비-인간 포유동물은 본 발명의 적절한 아데노바이러스, 즉 해당 조직 타입에 대해서 개선된 치료지수를 갖는 것으로 나타난 것의 치료학적 유효용량을 투여함으로써 치료될 수 있다. 예를 들어, 결장암의 치료에 바람직한 키메릭 아데노바이러스는 아데노바이러스 ColoAd1 (서열 1)일 것이다. 감염성 아데노바이러스 입자의 현탁액은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 및 국소를 포함한 다양한 경로에 의해서 종양조직에 송달될 수 있다. ㎖당, 약 103 내지 1012 또는 그 이상의 비리온 입자를 함유하는 아데노바이러스 현탁액이 주입 (예를 들어, 난소암의 치료를 위해 복강 내로, 간암 또는 다른 비-간성 원발성 종양으로부터의 간 전이를 치료하기 위해서 문맥 내로), 또는 종양 매스에 대한 직접 주사 (예를 들어, 유방종양), 관장 (예를 들어, 결장암) 또는 카테터 (예를 들어, 방광암)를 포함한 그 밖의 다른 적합한 경로에 의해서 투여될 수 있다. 투여의 또 다른 경로, 즉 미스트 (mist)로서의 흡입 (예를 들어, 기관지원성 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐선암 또는 후두암을 치료하기 위한 폐송달을 위해서) 또는 종양 부위 (예를 들어, 기관지원성 암, 비인두암, 후두암, 경부암)에 대한 직접적인 적용이 다른 기원의 암에 적합할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스를 사용한 아데노바이러스 치료법은 특정의 암을 치료하기 위하여 통상적인 화학요법 또는 x-선 치료법과 같은 다른 항종양성 프로토콜과 조합될 수 있다. 치료는 동시에 또는 순차적으로 할 수 있다. 바람직한 화학요법제는 시스플라틴이며, 바람직한 용량은 치료할 암의 성질 및 시스플라틴을 투여하는데 일상적으로 고려되는 그 밖의 다른 인자들을 기초로 하여 진료의사에 의해서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 시스플라틴은 3-6시간에 걸쳐서 50-120 ㎎/㎡의 용량으로 정맥내 투여된다. 더욱 바람직하게는, 이것은 4시간에 걸쳐서 80 ㎎/㎡의 용량으로 정맥내 투여된다. 두번째 바람직한 화학요법제는 5-플루오로우라실이며, 이것은 때때로 시스플라틴과 배합하여 투여된다. 5-플루오로우라실의 바람직한 용량은 연속 5일 동안, 1일에 800-1200 ㎎/㎡이다.
아데노바이러스 벡터로서 본 발명의 아데노바이러스를 사용한 아데노바이러스 치료법은 또한, 바이러스-기본 치료법에서 유용한 것으로 알려진 다른 유전자와 배합될 수도 있다 (참조: 미국특허 제 5,648,478 호). 이러한 경우에, 키메릭 아데노바이러스는 이종 유전자가 감염된 세포 내에서 발현되도록 바이러스 게놈 내에 통합된, 치료학적 단백질을 코딩하는 이종 유전자를 더 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 치료학적 단백질은 소정의 세포 내에서 발현되는 경우에 어떤 치료학적 이점을 제공하는 것으로 예상되는 단백질을 의미한다.
한가지 구체예에서, 이종 유전자는 사이토신 데아미나제 (CD)와 같은 프로-드럭 활성화제 유전자이다 (참조: 미국특허 제 5,631,236; 5,358,866; 및 5,677,178 호). 또 다른 구체예에서, 이종 유전자는 공지된 세포사의 유도인자, 예를 들어, 아폽틴 또는 아데노바이러스 사망 단백질 (adenoviral death protein; ADP), 또는 융합 단백질, 예를 들어, 융해성 (fusogenic) 막 당단백질이다 (Danen-Van Oorschot et al. (1997) Proc . Nat . Acad . Sci . 94:5843-5847; Tollefson et al. (1996) J. Virol . 70:2296-2306; Fu et al. (2003) Mol. Therapy 7: 48-754, 2003; Ahmed et al. (2003) Gene Therapy 10:1663-1671; Galanis et al. (2001) Human Gene Therapy 12(7): 811-821).
이종 유전자 또는 그의 단편의 추가의 예로는 사이토킨 또는 케모킨과 같은 면역조절성 단백질을 코딩하는 것이 포함된다. 예로는 인터로이킨 2 (미국특허 제 4,738,927 또는 5,641,665 호); 인터로이킨 7 (미국특허 제 4,965,195 또는 5,328,988 호); 및 인터로이킨 12 (미국특허 제 5,457,038 호); 종양괴사인자 알파 (미국특허 제 4,67,063 또는 5,773,582 호); 인터페론 감마 (미국특허 제 4,727,138 또는 4,762,791 호); 또는 GM CSF (미국특허 제 5,393,870 또는 5,391,485 호, Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev . 8:119-128)가 포함된다. 추가의 면역조절성 단백질은 MIP-3을 포함하는 대식세포 염증성 단백질을 더 포함한다. 단핵세포 화학주성 단백질 (MCP-3 알파)가 또한 사용될 수 있으며; 이종 유전자의 바람직한 구체예는 바람직하게는 암에 대해서는 독성이지만, 정상세포에 대해서는 독성이 아닌 단백질을 코딩하는 유전자에 융합된, 세포막을 횡단하는 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들어, VP22 또는 TAT로 구성된 키메릭 유전자이다.
본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 또한, 치료학적으로 유용한 RNA 분자, 즉 siRNA를 코딩하는 유전자를 송달하기 위한 벡터로 사용될 수도 있다 (Dorsett and Tuschi (2004) Nature Rev Drug Disc 3:318-329).
일부의 경우에, 유전자는 본 발명의 키메릭 아데노바이러스 내에 통합되어 종양을 근절시키는 종양세포용해성 바이러스의 능력을 더 증진시킬 수는 있지만, 종양 그 자체에 대한 직접적인 충격을 갖는 것은 아니며 - 이들은 MHC 클래스 I 제시를 손상시키고 (Hewitt et al. (2003) Immunology 110: 163-169), 보체를 억제하며, IFNs 및 IFN-유도된 기전, 케모킨 및 사이토킨, NK 세포 기본 치사 (Orange et al., (2002) Nature Immunol . 3: 1006-1012; Mireille et al. (2002) Immunogenetics 54: 527-542; Alcami (2003) Nature Rev . Immunol . 3:36-50; 면역반응의 하향 조절 (예를 들어, IL-10, TGF-베타, Khong and Restifo (2002) Nature Immunol. 3:999-1005; 2002)를 억제하는 단백질, 및 세포외 매트릭스를 붕괴시키고 종양 내에서 바이러스의 확산을 증진시킬 수 있는 메탈로프로테이나제 (Bosman and Stamenkovic (2003) J. Pathol . 2000: 423-428; Visse and Nagase (2003) Circulation Res . 92: 827-839)를 코딩하는 유전자를 포함한다.
키트 ( Kits )
본 발명은 전술한 본 발명의 조성물의 성분들 중의 하나 또는 그 이상으로 충진된 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 (packs) 및 키트에 관한 것이다. 이러한 용기(들)에 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하고, 인체에 투여하기 위한 제품의 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인에 영향을 미치는 정부기관에 의해서 규정된 형태의 주의사항이 첨부될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 특정한 구체예, 및 그의 다양한 구체예를 예시하는 이하의 실시예에 의해서 더 기술된다. 본 발명의 특정한 관점을 예시하는 이들 실시예는 제한을 설명하는 것이 아니며, 기술된 발명의 범위를 제한하는 것도 아니다.
다른 식으로 나타내지 않는 한은, 본 발명의 실시는 본 기술분야의 숙련된 기술 이내에 있는 세포배양, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 조작, 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다 (참조예: Cell Biology: a Laboratory Handbook: J. Cells (Ed). Academic Press, N.Y. (1996); Graham, F.L. and Prevec, L. Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines. In: Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed) Butterworth. Pp 363-390; Grahan and Prevec Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. pp 109-128, 1991; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), 및 Ausubel et al. (1995), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons).
방법
재조합 핵산 방법, 폴리뉴클레오타이드 합성, 및 미생물 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해서 표준기술이 사용된다. 일반적으로, 효소적 반응 및 정제단계는 제조자의 설명서에 따라서 수행된다. 기술 및 과정은 일반적으로 본 기술분야에서의 통상적인 방법 및 본 명세서 전체에 걸쳐서 제시된 다양한 일반적 문헌 (참조: 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 따라서 수행된다. 본 명세서에서 사용된 명명법, 및 분석화학, 유기합성화학 및 약제학적 제제화 및 송달, 및 환자의 치료의 실험실적 과정, 및 아데노바이러스 돌연변이체를 제작하는 방법은 본 기술분야에서 일반적으로 공지되어 있다 (참조: Mittal, S.K., Virus Res., 1993, vol. 28, pages 67-90; 및 Hermiston, T. et al., Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, ed, Humana Press, 1999). 또한, 아데노바이러스 5 게놈은 진뱅크 (Genbank) 10 수탁번호 #M73260으로 등록되어 있으며, 바이러스는 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A.)로부터 수탁번호 VR-5로 이용할 수 있다.
바이러스 및 세포 라인
Ad 혈청형 Ad3 (GB 스트레인), Ad4 (RI-67 스트레인), Ad5 (아데노이드 (Adenoid) 75 스트레인), Ad9 (힉스 (Hicks) 스트레인), Ad11p (슬로비트스키 (Slobitski) 스트레인), Ad16 (Ch. 79 스트레인), 및 이하의 것을 제외한 모든 세로 라인은 모두 ATCC로부터 구입하였다: MDA231-mt1 (MDA231 세포의 빠르게 성장하는 피하 이식된 이종이식편으로부터 닥터 데브 자코브스키 (Dr. Deb Zajchowski)에 의해서 분리된 유도체) 및 Panc1-sct (Panc1 세포의 빠르게 성장하는 피하 이식된 이종이식편으로부터 닥터 산드라 바이록 (Dr. Sandra Biroc)에 의해서 유도됨), HUVEC (Vec Technologies, Rensselaer, NY) 및 SAEC (Clonetics, Walkersville, MD). Ad40은 세인트 루이스 대학 (St. Louis University)에서 닥터 윌리암 에스.엠. 볼드 (Dr. William S.M. Wold)로부터 제공된 것이었다.
실시예 1 - 바이러스 정제 및 정량화
바이러스 저장물을 293 세포 상에 번식시키고, CsCl 구배 상에서 정제하였다 (Hawkins et al., 2001). 바이러스 입자를 정량하기 위해서 사용된 방법은 리소스 (Resource) Q 대신에 음이온-교환제 TMAE 프락토젤 (Fractogel)이 사용된 것을 제외하고는 문헌 (Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453-465)의 방법을 기초로 한다. 간략하면, 1.25 ㎖ 칼럼을 프락토젤 EMD TMAE-650 (S)(Catalog # 116887-7 EM Science, Gibbstown, NJ 08017)으로 충전시켰다. HPLC 분리는 다음의 조건을 사용하여 애질런트 (Agilent) HP 1100 HPLC 상에서 수행되었다: 완충액 A = 50 mM HEPES, pH 7.5; 완충액 B = 완충액 A 중의 1.0 M NaCl; 분당, 1 ㎖의 유속. 완충액 A 중에서 30분 이성의 기간 동안 칼럼 평형화시킨 후에, 샘플의 약 109-1011개의 바이러스 입자를 10-100 ㎕ 용적으로 칼럼 상에서 부하시키고, 이어서 4 칼럼 용적의 완충액 A로 부하시켰다. 16 칼럼 용적에 걸쳐서 확대되고, 100% 완충액 B에서 종결되는 선형 구배가 적용되었다.
칼럼 유출액을 A260 및 A280 nm에서 모니터하고, 피크 면적을 계산하고, 260 대 280 nm 비를 결정하였다. 바이러스 피크는 1.33에 근접한 A260/A280 비를 갖는 피크로 확인되었다. 표준물의 ㎖당, 바이러스 입자의 수는 문헌의 방법 (Lehmberg et al. (1999) J. Chrom . B, 732: 411-423)을 사용하여 결정되었다. 사용된 바이러스 농도 범위에서, 각각의 샘플의 A260 nm 피크 면적은 샘플 내의 바이러스 입자의 수에 정비례한다. 각각의 시험 샘플 내에서 ㎖당, 바이러스 입자의 수는 표준물에서의 ㎖당, 바이러스 입자의 공지된 수를 표준물의 A260 nm 바이러스 피크 면적에 대한 샘플의 A260 nm 바이러스 피크 면적의 비와 곱하여 줌으로써 계산되었다.
칼럼은 각각의 샘플 구배 후에 2 칼럼 용적의 0.5 N NaOH로 세척하고, 이어서 2 칼럼 용적의 100% 완충액 A, 3 칼럼 용적의 100% 완충액 B, 및 그 다음에 4 칼럼 용적의 100% 완충액 A로 세척함으로써 재생되었다.
실시예 2 - 생체선택
서브그룹 Ads B-F를 나타내는 바이러스 혈청형을 모아서, 2 라운드 (round) 동안 높은 입자-대-세포 비로 표적 종양세포의 서브컨플루언트 배양물 상에 통과시켜 혈청형들 사이에서 재조합이 일어나도록 유도하였다. 그 다음에, 높은 바이러스 입자-당-세포 감염의 서브컨플루언트 배양물의 두번째 라운드로부터의 상등액 (1.0, 0.1, 0.01, 0.001 ㎖)을 사용하여 표적 종양세포 라인 PC-3, HT-29, Panc-1 및 MDA-231의 일련의 오버-컨플루언트 T-75 조직배양 플라스크를 감염시켰다. 오버-컨플루언시 (over-confluency)를 달성하기 위해서, 각각의 세포 라인을 해당 세포 라인이 접종 후 24 내지 40시간 사이에 컨플루언시에 도달하도록 하는 분배비 (split ratio)로 접종하고, 세포를 접종한 후, 감염시키기 전에 총 72시간 동안 성장하도록 하였다. 이것은 인간 고체종양에서의 성장조건을 모방하도록 세포의 컨플루언시를 최대화하도록 하였다.
세포배양 상등액을 감염시킨 후 3 또는 4일에 CPE의 어떠한 징후도 나타내지 않은 10-배 희석단계의 첫번째 플라스크로부터 수확하였다 (HT-29 및 PC-3의 경우에, 이것은 10-20회 계대를 위해서 두번째 플라스크의 수확물, 즉 감염시킨 후 3일에 CPE를 검출할 수 있는 희석도 100-배 이하의 수확물로 변형시켰다). 각각의 수확물은 바이러스의 연속 계대 (successive passage)를 위한 출발물질로 사용하였다. 이 과정은 바이러스 풀이 20회의 생체선택적 계대를 달성할 때까지 반복하였 다.
각각의 생체선택된 풀로부터의 개개의 바이러스를 표준방법 (Tollefson, A., Hermiston, T.W., and Wold, W.S.M.; "Preparation and Titration of CsCl-banded Adenovirus Stock" in Adenovirus Methods and Protocols, Human Press, 1999, pp. 1-10, W.S.M. Wold, Ed)을 사용하여 A549 세포 상에서 플라크 정제를 2 라운드로 수행함으로써 단리하였다. 간략하면, 각각의 표적 종양 라인 상에서의 20번째 계대로부터 수확한 상등액의 희석액을 사용하여 표준 플라크 시험에서 A549 세포를 감염시켰다. 잘 개별화된 플라크를 수확하고, 동일한 플라크 시험방법을 사용하여 이들 수확물로부터의 개개 플라크의 두번째 라운드를 발생시켰다. 플라크 정체의 두번째 라운드로부터 잘 단리된 플라크는 순수한 것으로 간주되었으며, 감염된 배양물은 이들 정제된 플라크를 사용하여 제조되었고, 이들 배양 상등액의 종양세포붕괴 효력은 기술된 바와 같이 MTS 시험에 의해서 측정되었다.
실시예 3 - 혈청형 특정화
바이러스 풀 또는 분리된 ColoAd1 아데노바이러스를 포함하는 어버이 아데노바이러스 혈청형은 실시예 1에 기술된 바와 같이 리소스 Q 대신에 음이온-교환제 TMAE 프락토젤 매질 (EM Industries, Gibbstown, NJ)이 사용된 것을 제외하고는 문헌 (Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453:465)에 기술된 방법과 유사한 음이온-교환 크로마토그라피를 사용하여 확인되었다 (참조: 도 1).
아데노바이러스 타입 5는 구배 중에 약 60% 완충액 B에서 용출하였다. 다른 혈청형들 (3, 4, 9, 11p, 16, 35 및 40)은 각각 문헌 (Blamche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055-1062)에 공개된 Q 세파로즈 XL 상에서의 체류시간과 일치하는 특징적 체류시간에서 용출하였다.
실시예 4 - 세포용해 시험
바이러스 용해능은 MTT 시험 (Shen et al., 2001)의 변형법을 사용하여 측정되었다. 간략하게, MTT 시험 대신에 MTS 시험 (Promega, CellTiter 96™ 수성 비-방사성 세포증식시험 (Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay))이 사용되었으며, 이는 세포에 의한 MTS의 수성 가용성 포르마잔으로의 전환은 시간을 감소시키고, MTT 시험과 연관된 휘발성 유기용매의 사용을 배제하기 때문이다.
시험을 수행하기 위하여, 세포를 24시간 이내에 컨플루언트 단일층을 생성하는 각각의 종양세포 라인에 대해 규정된 밀도로 접종하였다. 이들 조밀하게 접종된 세포를 시험 바이러스(들)에 노출시키기 전에 추가로 2일 동안 성장하도록 하였다. 종양 및 원발성 정상세포 둘 다의 감염은 100의 세포당 입자비로 시작하여 0.005의 세포당 입자비에서 끝나는 바이러스의 단계적 3배 희석액을 사용하여 4중으로 수행되었다. 감염된 세포를 37℃에서 배양하고, MTS 시험은 개개의 원발성 세포 또는 종양세포 라인에 대해서 지시된 시점에 수행되었다. 모의-감염된 세포는 음성 대조군으로 사용하였으며, 제시된 시험에 대한 100% 생존점 (survival point)을 설정하였다.
실시예 5 - DNA 서열결정
Ad11p (서열 2) 및 ColoAd1 (서열 1) 게놈 DNA의 DNA 서열결정 (sequencing)은 다음과 같이 수행되었다. 간략하게, ColoAd1 및 Ad11p로부터 정제된 아데노바이러스 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Sau3A1으로 부분적으로 분해시키고, 플라스미드 벡터 pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) 내에 숏건 (shotgun) 클로닝시켰다. 양성 클론을 번식시키고, 프라이머 M13R 및 KS (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 서열결정하였다. 각각의 서열반응은 시퀀서 (Sequencer™; Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan)를 사용하여 유발시키고, 배열을 바꾸고, 조립하였다. 커버리지 (coverage)에서의 갭은 관행적인 올리고뉴클레오타이드 프라미어에 의해서 증폭되었으며, 서열결정되었다. 바이러스 게놈의 말단은 아데노바이러스 DNA로부터 분리하여 직접 서열결정되었다. 모두에서, 각각의 게놈은 3×+ 커버리지 및 2× 커버리지에서의 431 염기에서 서열결정되었다.
ColoAd1 E2B 영역을 결정하기 위하여, 하나는 E2B pTP 유전자 (bp9115, 5'GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3' (서열 4) 및 bp 9350, 5'GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGT3' (서열 5))에 대한 것이고, 또 하나는 DNA 폴리머라제 유전자 (bp 7520 5'CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3' (서열 6) 및 bp 7982, 5'GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3' (서열 7))에 대한 것인 두개의 프라이머 셋트를 생성시켰으며, 이들을 PCR에 사용하여 어드밴테이지 (Advantage) 2 PCR 키트 (Clonetics, Walkersville, MD; Cat #K1919-Y)로부터의 시약을 사용하여 다양한 혈청형 (Ad3, 4, 5, 9, 11p, 16 및 40)으로부터 DNA 단편을 단리시키고, 이것을 PCT- 200 열순환기 (thermocycler) (MJ Research, Watertown, MA) 상에서 주행시켰다. 이어서, 이들 단편은 ABI 3100 유전자 분석기 상에서 염료 종결자 (dye terminator) 서열결정을 사용하여 Ad3의 DNA 서열과 함께 서열결정되었다.
Ad3의 E2B 영역은 단리된 Ad3 DNA 및 오버래핑 (overlapping) 프라이머를 사용하여 서열결정되었다.
서열 정보는 벡터 NTI 프로그램 (informatix)을 사용하여 분석되었다.
실시예 6 - 재조합 바이러스의 제작
Ad11p (서열 2) 및 ColoAd1 (서열 1)의 게놈 DNA는 CsCl 구배-밴드 바이러스 입자로부터 정제되었다. 게놈 DNA를 바이러스 게놈 내에서 각각 단지 한번만 Pac1로 분해시켰다. Pac1 절단은 ColoAd1 뉴클레오타이드 서열 (서열 1) 상의 염기 18141에서, 및 Ad11 뉴클레오타이드 서열 (서열 2) 상의 염기 18140에서 일어난다. 분해된 DNA를 등량으로 혼합시키고, 16℃에서 밤새 T4 DNA 리가제의 존재하에 결합시킨다. 이러한 결합 (ligation) 혼합물을 CaPO4 형질감염 키트 (transfection kit) (Invitrogen, Carlsbad, CA; Cat #K2780-01)를 사용하여 A549 세포에 형질감염시켰다. 분리된 플라크를 취하여 제한효소분해 및 PCR 분석에 의해서 선별하여 4개의 바이러스 집단 (Ad11p, ColoAd1, 좌측 말단 Ad11/우측 말단 ColoAd1 (ColoAd1.1) 및 좌측말단 ColoAd1/우측 말단 Ad11p (ColoAd1.2))을 구분하였다.
각각의 집단의 바이러스 용해능은 실시예 3에 기술된 바와 같이 HT29 및 HUVEC 세포 라인을 포함한 다수의 세포 라인에서 결정되었다. 결과는 최저로 강력한 것으로부터 가장 강력한 것으로 Ad11p, ColoAd1.2, ColoAd1.1, ColoAd1의 효력 순서를 나타내었다 (참조: HT29 세포에서의 결과에 대한 도 7).
또한, 야생형 Ad11p E3 및 E4 영역이 각각 복원된 전장 ColoAd1 게놈을 함유하는 키메릭 아데노바이러스 pCJ144 및 pCJ146을 제작하였다. 이들 변형은 상동성 재조합에 의해서 BJ5183 이. 콜리이 내에 도입시켰다 (Chartier et al. (1996) J. Virol . 70:4805-4810). 이들 키메릭 아데노바이러스는 둘 다 ColoAd1 또는 ColoAd1.2에 비해서 HT29 및 HUVEC 세포에서 감소된 용해능을 나타내었다.
실시예 7 - 아데노바이러스의 생체내 효능
전형적인 인간 종양 이종이식 누드 마우스 실험에서, 동물에게 마우스의 후측복부 (hind flank)에 피하로 5×106 세포를 주사하였다. 종양의 크기가 100-200 ㎕에 달하면, 이들에게 비히클 (PBS) 또는 2×1010 입자의 바이러스를 연속 5일 동안 주사하였다 (총 1×1011 입자). 종양 크기의 감소는 PBS 대조군과 추가의 대조 바이러스 (Ad5, ONYX-015)에 대비하여 기록된다.
실시예 8 - 원발성 인간 조직 외이식편에 대한 ColoAd1 선택성
수술중에 분리된 결장직장 종양 및 인접한 정상조직으로부터 조직 검체를 배양 매질에 넣고, 동등한 수의 ColoAd1 또는 Ad5로 감염시켰다. 배양 상등액을 감 염후 24시간에 수거하여, 생성된 바이러스 입자의 수를 측정하였다. ColoAd1이 종양세포 상에서 Ad5에 비해서 투입 입자당 더 많은 바이러스 입자를 생성하였으며, 한편 이것은 정상세포 상에서는 Ad5에 비해서 투입 입자당 더 적은 입자를 생성하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Harden, Paul Hermiston, Terry Kuhn, Irene <120> Chimeric Adenoviruses for Use in Cancer Treatment <130> 53183AUSM1 <150> US 60/574,851 <151> 2004-05-26 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 32325 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 1 ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60 aaaagtgtgg atcgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gctaaaaggg gcggtgcgac 120 cgtgggaaaa tgacgttttg tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtg 180 acgcataaaa aggctttttt ctcacggaac tacttagttt tcccacggta tttaacagga 240 aatgaggtag ttttgaccgg atgcaagtga aaattgttga ttttcgcgcg aaaactgaat 300 gaggaagtgt ttttctgaat aatgtggtat ttatggcagg gtggagtatt tgttcagggc 360 caggtagact ttgacccatt acgtggaggt ttcgattacc gtgtttttta cctgaatttc 420 cgcgtaccgt gtcaaagtct tctgttttta cgtaggtgtc agctgatcgc tagggtattt 480 atacctcagg gtttgtgtca agaggccact cttgagtgcc agcgagaaga gttttctcct 540 ctgcgccggc agtttaataa taaaaaaatg agagatttgc gatttctgcc tcaggaaata 600 atctctgctg agactggaaa tgaaatattg 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cttcgtacag gaactctgac 5700 cactctgata caaaggcgcg cgtccaggcc agcacaaagg aggctatgtg ggaggggtag 5760 cgatcgttgt caaccagggg gtccaccttt tccaaagtat gcaaacacat gtcaccctct 5820 tcaacatcca ggaatgtgat tggcttgtag gtgtatttca cgtgacctgg ggtccccgct 5880 gggggggtat aaaagggggc ggttctttgc tcttcctcac tgtcttccgg atcgctgtcc 5940 aggaacgtca gctgttgggg taggtattcc ctctcgaagg cgggcatgac ctctgcactc 6000 aggttgtcag tttctaagaa cgaggaggat ttgatattga cagtgccggt tgagatgcct 6060 ttcatgaggt tttcgtccat ctggtcagaa aacacaattt ttttattgtc aagtttggtg 6120 gcaaatgatc catacagggc gttggataaa agtttggcaa tggatcgcat ggtttggttc 6180 ttttccttgt ccgcgcgctc tttggcggcg atgttgagtt ggacatactc gcgtgccagg 6240 cacttccatt cggggaagat agttgttaat tcatctggca cgattctcac ttgccaccct 6300 cgattatgca aggtaattaa atccacactg gtggccacct cgcctcgaag gggttcattg 6360 gtccaacaga gcctacctcc tttcctagaa cagaaagggg gaagtgggtc tagcataagt 6420 tcatcgggag ggtctgcatc catggtaaag attcccggaa gtaaatcctt atcaaaatag 6480 ctgatgggag tggggtcatc taaggccatt tgccattctc 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tcctttgacg agaaatttca 1980 gtggaaaatt gaggcctggc gcttgtacct cgcgctttac tatgttgtct gcatcggcat 2040 gaccatcttc tgtctcgatg gtggtcatgc tgacgagccc tcgcgggagg caagtccaga 2100 cctcggcgcg gcaggggcgg agctcgagga cgagagcgcg caggccggag ctgtccaggg 2160 tcctgagacg ctgcggagtc aggttagtag gcagtgtcag gagattaact tgcatgatct 2220 tttggagggc gtgagggagg ttcagatagt acttgatctc aacgggtccg ttggtggaga 2280 tgtcgatggc ttgcagggtt ccgtgtccct tgggcgctac caccgtgccc ttgtttttca 2340 ttttggacgg cggtggctct gttgcttctt gcatgtttag aagcggtgtc gagggcgcgc 2400 accgggcggc aggggcggct cgggacccgg cggcatggct ggcagtggta cgtcggcgcc 2460 gcgcgcgggt aggttctggt actgcgccct gagaagactc gcatgcgcga cgacgcggcg 2520 gttgacatcc tggatctgac gcctctgggt gaaagctacc ggccccgtga gcttgaacct 2580 gaaagagagt tcaacagaat caatctcggt atcgttgacg gcggcttgcc taaggatttc 2640 ttgcacgtcg ccagagttgt cctggtaggc gatctcggcc atgaactgct cgatctcttc 2700 ctcttgaaga tctccgcggc ccgctctctc gacggtggcc gcgaggtcgt tggagatgcg 2760 cccaatgagt tgagagaatg cattcatgcc cgcctcgttc 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Claims (27)

  1. E2B 영역을 포함하는 게놈을 가지며, 종양세포용해성이고, 종양세포에 대한 증진된 치료지수를 나타내며,
    여기서 상기 E2B 영역은 제 1 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열 및 제 2 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열을 포함하고;
    상기 제 1 및 2 아데노바이러스 혈청형은 각각 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E 및 F로부터 선택되며 서로 상이한 것인,
    재조합 키메릭 아데노바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, 섬유, 헥손 및 펜톤 단백질을 코딩하는 영역을 더 포함하며, 여기서 아데노바이러스의 섬유, 헥손 및 펜톤 단백질을 코딩하는 핵산은 동일한 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래하는 것인 아데노바이러스.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 종양세포가 결장, 유방, 췌장, 폐, 전립선, 난소 또는 조혈성 종양세포인 아데노바이러스.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 종양세포가 결장 종양세포인 아데노바이러스.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 E2B 영역의 뉴클레오타이드 서열이 서열 3을 포함하는 것인 아데노바이러스.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 뉴클레오타이드 서열이 서열 1을 포함하는 것인 아데노바이러스.
  7. E2B 영역을 포함하는 게놈을 가지며, 종양세포용해성이고, 종양세포에 대하여 증진된 치료지수를 나타내며, E1, E2, E3 및 E4로 구성된 군으로부터 선택된 아데노바이러스 복제에 수반된 단백질을 코딩하는 하나 이상의 아데노바이러스 영역의 결실을 통해서 복제 결핍성이 되었고,
    여기서 상기 E2B 영역은 제 1 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열 및 제 2 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열을 포함하고;
    상기 제 1 및 2 아데노바이러스 혈청형은 각각 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E 및 F로부터 선택되며 서로 상이한 것인,
    재조합 키메릭 아데노바이러스.
  8. 제 7 항에 있어서, E1 및 E3 영역이 결실된 복제 결핍성 아데노바이러스.
  9. 제 8 항에 있어서, E4 영역의 결실을 더 포함하는 복제 결핍성 아데노바이러스.
  10. 제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 아데노바이러스에 의해서 감염된 세포 내에서 발현되는 이종 유전자를 더 포함하는 아데노바이러스.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 이종 유전자가 티미딘 키나제인 아데노바이러스.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 이종 유전자가 사이토킨 및 케모킨, 항체, 프로드럭 전환효소 및 면역조절성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 치료학적 단백질을 코딩하는 것인 아데노바이러스.
  13. 제 1 항의 아데노바이러스로 암세포를 감염시키는 것을 포함하는, 시험관 내에서 암세포의 성장을 억제하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 암세포가 결장암 세포인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 뉴클레오타이드 서열이 서열 1을 포함하는 것인 방법.
  16. 제 12 항의 아데노바이러스로 세포를 감염시키는 것을 포함하는, 시험관 내에서 세포에 치료학적 단백질을 송달하는 방법.
  17. (a) 아데노바이러스 서브그룹 B-F를 나타내는 아데노바이러스 혈청형을 모아서 아데노바이러스 혼합물을 생성시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 모은 아데노바이러스 혼합물을, 혈청형들 사이에서의 재조합을 촉진시키기에 충분히 높지만 조발성 세포사를 발생시킬 정도로 높지는 않은 세포당 입자비로 종양세포의 활발하게 성장하는 배양물 상에 통과시키는 단계;
    (c) 단계 (b)로부터의 상등액을 수확하는 단계;
    (d) 종양세포의 비활동성 배양물을 단계 (c)에서 수확한 상등액으로 감염시키는 단계;
    (e) 세포변성 효과 (Cytopathic Effect (CPE))의 어떠한 징후라도 나타나기 전에 단계 (d)로부터 세포배양물 상등액을 수확하는 단계;
    (f) 종양세포의 비활동성 배양물을 단계 (e)에서 수확한 상등액으로 감염시키는 단계; 및
    (g) 단계 (f)에서 수확한 상등액으로부터 플라크 정제에 의해서 제 1 항의 바이러스를 단리하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 아데노바이러스를 단리하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 단계 (b)를 단계 (c)에서 상등액을 수확하기 전에 2회 수행하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 단계 (e) 및 (f)를 단계 (g) 이전에 20회까지 반복하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 플라크 정제의 두번째 라운드를 단계 (g) 이후에 수행하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, 종양세포가 결장, 유방, 췌장, 폐, 전립선, 난소 또는 조혈성 종양세포인 방법.
  22. 제 17 항에 있어서, 세포당 입자비가 세포당 500 입자인 방법.
  23. (a) 아데노바이러스 서브그룹 B-F를 나타내는 아데노바이러스 혈청형을 모아서 아데노바이러스 혼합물을 생성시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 모은 아데노바이러스 혼합물을, 혈청형들 사이에서의 재조합을 촉진시키기에 충분히 높지만 조발성 세포사를 발생시킬 정도로 높지는 않은 세포당 입자비로 종양세포의 활발하게 성장하는 배양물 상에 통과시키는 단계;
    (c) 단계 (b)로부터의 상등액을 수확하는 단계;
    (d) 종양세포의 비활동성 배양물을 단계 (c)에서 수확한 상등액으로 감염시키는 단계;
    (e) 세포변성 효과의 어떠한 징후라도 나타나기 전에 단계 (d)로부터 세포배양물 상등액을 수확하는 단계;
    (f) 종양세포의 비활동성 배양물을 단계 (e)에서 수확한 상등액으로 감염시키는 단계; 및
    (g) 단계 (f)에서 수확한 상등액으로부터 플라크 정제에 의해서 키메릭 아데노바이러스를 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 생산된 것으로,
    E2B 영역을 포함하는 게놈을 가지며, 종양세포용해성이고, 종양세포에 대한 증진된 치료지수를 나타내며,
    여기서 상기 E2B 영역은 제 1 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열 및 제 2 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된 핵산 서열을 포함하고;
    상기 제 1 및 2 아데노바이러스 혈청형은 각각 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E 및 F로부터 선택되며 서로 상이한 것인,
    재조합 키메릭 아데노바이러스.
  24. 제 23 항에 있어서, 단계 (b)를 단계 (c)에서 상등액을 수확하기 전에 2회 수행하는 것인 재조합 키메릭 아데노바이러스.
  25. 제 23 항에 있어서, 단계 (e) 및 (f)를 단계 (g) 이전에 20회까지 반복하는 것인 재조합 키메릭 아데노바이러스.
  26. 제 23 항에 있어서, 플라크 정제의 두번째 라운드를 단계 (g) 이후에 수행하는 것인 재조합 키메릭 아데노바이러스.
  27. 제 23 항에 있어서, 세포당 입자비가 세포당 500 입자인 재조합 키메릭 아데노바이러스.
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