KR101162422B1

KR101162422B1 - 핵산 증폭용 조성물

Info

Publication number: KR101162422B1
Application number: KR1020090116664A
Authority: KR
Inventors: 박수민; 장원철
Original assignee: 박수민
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2012-07-10
Anticipated expiration: 2029-11-30
Also published as: KR20110060158A

Abstract

유전자 변형에 대한 신속한 진단이 가능하고 진단비용이 저렴하며, 증폭의 길이도 길어지고 에러률도 줄어들어 안정성이 증가된 핵산 증폭용 조성물이 개시되어 있다. 이를 위하여, 본 발명은 유전자 증폭반응 완충액, 8 내지 12mM의 dNTP, 80 내지 120mM의 염화마그네슘, 중합효소, 및 증류수를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 핵산의 증폭시간을 단축할 수 있고, 증폭반응을 통해 증폭산물의 확인하는데 소요되는 비용이 현저하게 줄어드는 효과를 가진다.

Description

핵산 증폭용 조성물{COMPOSITION FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID}

본 발명은 핵산 증폭용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 변형에 대한 신속한 진단이 가능하고 진단비용이 저렴하며 안정화된 핵산 증폭용 조성물에 관한 것이다.

중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction : PCR)은 전체 유전자 중 염기서열을 알고 있는 특정한 하나의 유전자 절편을 DNA 중합효소에 의해 증폭하여 유전자를 검사하고 분리하는 분자생물학의 기본 기법이며, 당 분야에 공지되어 있다. PCR 증폭의 각 사이클에서, 이중쇄 표적 서열은 변성되고, 프라이머는 변성된 표적의 각 쇄에 어닐링된 후, DNA 중합효소의 작용에 의해 연장된다. 증폭의 특이성은 프라이머 혼성화의 특이성에 의해 결정된다. 프라이머는 표적 핵산 서열의 각 쇄의 3' 말단에 존재하는 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적이도록 선택된다. 전형적인 PCR에서 사용되는 승온하에서, 프라이머는 오직 의도하는 표적 서열에만 혼성화된다.

그러나 증폭 반응 혼합물은 통상적으로 프라이머 혼성화의 특이성을 보장하기 위해 요구되는 온도보다 충분히 낮은 온도인 상온에서 조합된다. 그러한 스트린전트(stringent) 조건하에서, 프라이머는 부분적으로만 상보적인 핵산 서열(또는 심지어 다른 프라이머)에 비특이적으로 결합하여 원하지 않는 연장 생성물의 합성을 개시할 수 있는데, 이는 표적 서열을 따라 증폭될 수 있다. 비특이적 프라이머 연장 생성물의 증폭은 목적한 표적 서열의 증폭과 경쟁하여 목적 서열의 증폭 효율을 현저히 감소시킬 수 있다. 비특이적 증폭은 반응의 개시 전에 비표적 서열에 결합한 프라이머로부터 연장 생성물의 생성을 감소시킴으로써 줄일 수 있다.

핫 스타트(hot-start : HS) 프로토콜이라 일컬어지는 한 방법에서는, 필요한 혼성화 특이성을 제공하기에 충분하도록 온도가 상승할 때까지 하나 또는 그 이상의 중요한 시약을 반응 혼합물에 첨가하지 않는다. 이 방법에서 반응 혼합물은 반응 조건이 특이적 프라이머 혼성화를 보장하지 않는 동안에는 프라이머 연장을 지속할 수 없다. 핫 스타트 방법은 초기 고온 인큐베이션 단계 후에 반응 튜브를 열고 제외된 시약을 첨가함으로써 수동식으로 수행할 수 있다. 그러나, 수동식 핫 스타트 방법은 노동 집약적이고 반응 혼합물이 오염될 위험성을 증가시킨다. 반응 성분들을 분리하거나 유리시키기 위해 왁스와 같은 열에 불안정한 물질을 사용하는 핫 스타트 방법은 미국특허 제5,411,876호에 기재되어 있다. 이러한 방법들에서, 고온의 반응 전 인큐베이션은 열에 불안정한 물질을 녹여 시약이 섞이도록 한다.

반응 개시 전 비-표적 서열에 결합된 프라이머로부터 연장 생성물의 형성을 감소시키는 다른 방법은, 열-가역적인 방법으로 DNA 중합효소에 비공유적으로 결합 하는 화합물을 사용하는 것이다. 미국특허 제5,338,671호는 DNA 중합효소 활성을 저해하기 위해 열안정성 DNA 중합효소에 특이적인 항체를 사용하는 것이 기재되어 있다. 이 항체는 반응 혼합물을 혼합하기 전에 상온하의 완충액 내에서 DNA 중합효소와 함께 인큐베이션하여, 항체-DNA 중합효소 복합체를 형성한다. 항체에 의한 DNA 중합효소 활성의 저해는 고온에서 반응 전 인큐베이션에 의해 불활성화된다.

핵산의 비특이적 증폭 산물의 형성을 억제하는 방법으로, 또한 수소 결합을 파괴하는 화학 물질을 사용할 수 있는데, 이는 핵산의 AT, GC의 수소 결합 등에 작용하여 DNA 이중 가닥 결합을 약하게 하고, 이차 구조를 제거하여 비특이적인 반응을 최소화한다. 그러나, 수소 결합 파괴 물질 및 중합효소 항체를 같이 사용할 경우, 수소결합 파괴 물질은 DNA 구조를 약화시켜 비특이적 반응을 저해시키는 장점이 있지만, Taq DNA 중합효소와 항체의 활성화 부위의 결합까지도 약화시키는 단점이 있다.

이에, 상기 표적 핵산을 신속하고 정확하게 증폭시키며, 표적 핵산의 증폭과 동시에 증폭산물을 검출하기 위한 조성물에 대한 개발의 필요성이 요구되고 있다.

따라서 본 발명의 목적은 표적 핵산을 정확하게 증폭시킬 수 있고, 증폭반응을 통해 증폭산물의 확인하는데 소요되는 비용이 감소되는 핵산 증폭용 조성물을 제공하는데 있다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 증폭반응 완충액 15 내지 25 부피%, 8 내지 12mM의 dNTP 15 내지 25 부피%, 80 내지 120mM의 염화마그네슘 3 내지 5 부피%, 중합효소 2 내지 4 부피%, 및 증류수 41 내지 65 부피를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 조성물을 사용하면, 표적 핵산을 신속하고 정확하게 증폭시키며, 표적 핵산의 증폭과 동시에 증폭산물을 검출할 수 있어 증폭산물을 확인하는데 소요되는 시간이 줄어드는 효과를 가진다.

또한, 본 발명에 의한 조성물을 사용하면, 증폭산물의 확인하는데 소요되는 비용이 감소되며, 사용법이 간단하여 장소에 구애받지 않고 임상진단 실험실 및 기타 어느 장소에서도 검사가 가능하며, 표적 DNA의 존재 여부를 간단하고 신속하게 판단할 수 있다.

이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들에 의한 핵산 증폭용 조성물을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 의한 핵산 증폭용 조성물은 표적 핵산을 신속하고 정확하게 증폭시키며, 표적 핵산의 증폭과 동시에 증폭산물을 검출하기 위해 사용되는 것으로서, 유전자 증폭반응 완충액(10X reaction buffer), 8 내지 12mM의 디옥시리보뉴클레오티드(dNTP), 80 내지 120mM의 염화마그네슘(MgCl₂), 중합효소, 정제수를 포함하며, 안정제를 더 포함할 수 있다. 여기서, 핵산 증폭이란 표적 핵산의 임의의 배열에 대하여 특이적인 프라이머 또는 랜덤한 배열의 프라이머와, 중합효소(DNA 폴리머라아제 또는 RNA 폴리머라아제)를 이용하여 시료 중의 핵산을 증폭시키는 것을 의미한다.

이러한, 핵산 증폭용 조성물을 사용하면, 표적 핵산이 시료 중에 미량밖에 존재하지 않는 경우에도 추출 및 정제과정의 손실이 생기지 않는다. 따라서, 검출감도의 저하를 초래하지 않고, 미량의 표적 핵산을 검출하는 것이 가능하게 된다. 이에, 작업의 간단화를 도모할 수 있고, 작업시간을 단축할 수 있게 된다.

본 발명의 일 실시예에 의한 핵산 증폭용 조성물은 유전자 증폭반응 완충액을 포함한다.

상기 유전자 증폭반응 완충액은 핵산의 증폭반응을 위해 첨가 되는 것으로서, 이러한 목적을 달성할 수 있는 유전자 증폭반응 완충액이라면 어떠한 완충액을 사용하여도 무방하지만, Tris-HCl와 베타인(Betaine), 소 혈청 알부민(BSA), 및 Tween 20 을 포함한 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, Tween 20 대신 Triton X-100을 사용할 수도 있다.

일 실시 양태로서, 본 발명에 따른 유전자 증폭반응 완충액은 600 내지 650mM의 Tris-HCl, 150 내지 200mM의 황산암모늄, 0.5 내지 1M 베타인, 10 내지 20mM 소 혈청 알부민, 20mM BSA, Tween 20을 포함한다.

다른 실시 양태로서, 본 발명에 따른 유전자 증폭반응 완충액은 80 내지 120mM의 Tris-HCl, 350 내지 450mM의 염화칼륨, 0.5 내지 1M 베타인, 10 내지 20mM 소 혈청 알부민, Tween 20을 포함한다.

각 실시 양태에 사용되는 Tween 20은 유전자 증폭반응 완충액 100 부피%를 기준으로 0.1 내지 0.2%를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 유전자 증폭반응 완충액은 전체 100 부피%를 기준으로 15 내지 25 부피%가 포함된다. 이때, 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 유전자 증폭반응 완충액의 함량이 15 부피% 미만이면 핵산 증폭반응에 의한 핵산 증폭이 원활하게 수행되지 않는다. 또한, 유전자 증폭반응 완충액의 함량이 25 부피%를 초과하면 핵산 증폭반응에 의한 핵산 증폭 원활하게 수행되지 않거나 비특이적 반응이 일어날 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의한 핵산 증폭용 조성물은 dNTP를 포함한다.

상기 dNTP는 핵산의 증폭 반응 시 GATC 합성을 위해 첨가되는 것으로서, dNTP의 최종농도는 8 내지 12mM인 것이 바람직하며, 10mM인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 dNTP는 전체 100 부피%를 기 준으로 15 내지 25 부피%가 포함된다. 이때, 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 제한 dNTP의 함량이 15 부피% 미만이거나 dNTP의 함량이 25 부피%를 초과하면 핵산 증폭반응에 의한 핵산 증폭이 원활하게 수행되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의한 핵산 증폭용 조성물은 염화마그네슘을 포함한다.

상기 염화마그네슘은 핵산 증폭용 조성물의 활성을 촉진하기 위해 첨가되는 것으로서, 염화마그네슘의 최종농도는 80 내지 120mM인 것이 바람직하며, 100mM인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 염화마그네슘은 전체 100 부피%를 기준으로 3 내지 5 부피%가 포함된다. 이때, 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 염화마그네슘의 함량이 3 부피% 미만이면 중합효소가 활성화되지 않는다. 또한, 염화마그네슘의 함량이 5 부피%를 초과하면 비특이적 반응이 발생할 수 있게 된다.

본 발명의 일 실시예에 의한 핵산 증폭용 조성물은 중합효소를 포함한다.

상기 중합효소는 세포벽으로부터 추출된 핵산을 증폭시키기 위해 첨가되는 것으로서, 이러한 목적을 달성할 수 있는 중합효소라면 어떠한 중합효소를 사용하여도 무방하지만, 단일클론항체(Monoclonal antibody)가 사용된 중합효소를 사용하는 것이 바람직하며, 특정적으로는 Hot start Taq DNA Polymerase(2.5Unit/ml)를 사용하는 것이 좋다.

본 발명에 따른 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 중합효소는 전체 100 부피%를 기준으로 2 내지 4 부피%가 포함된다. 이때, 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 중합효소의 함량이 2 부피% 미만이면 핵산 증폭반응이 진행되지 않으며, 중합효소의 함량이 4 부피%를 초과하면 비특이적 반응이 발생할 수 있게 된다.

본 발명의 일 실시예에 의한 핵산 증폭용 조성물은 증류수를 포함한다.

상기 증류수는 핵산 증폭용 조성물의 최종 부피와 농도를 조절하기 위해 첨가되는 것으로서, 3차 증류수를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 증류수는 전체 100 부피%를 기준으로 41 내지 65 부피%가 포함된다. 이때, 핵산 증폭용 조성물에 포함되는 증류수의 함량이 41 부피% 미만이거나 증류수의 함량이 65 부피%를 초과하면 핵산 증폭반응이 원활하게 진해되지 않거나 비특이적 반응이 발생할 수 있게 된다.

전술한 핵산 증폭용 조성물은 세포로부터 추출된 핵산에 첨가되어 핵산 증폭반응을 수행하는 것으로서, 세포로부터 핵산을 추출하는 핵산 추출방법 및 상기 핵산 추출방법에 사용되는 핵산 추출용 조성물의 일 실시예를 설명하면 다음과 같다.

상기 핵산 추출용 조성물은 세포벽을 원활하게 분해시키기 위해 pH 12.5 내지 13.5의 알칼리 용액으로 형성되는 것이 바람직하며, 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 수산화칼륨(KOH) 및 계면활성제를 포함하여 구성된다.

이러한 핵산 추출용 조성물은 핵산을 추출함에 있어서 기존의 방법보다 단계를 줄이고, 핵산을 추출하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있으며, 세포 용해와 핵산 추출이 동시에 가능하다.

보다 구체적으로, 상기 PEG으로는 어떠한 PEG를 사용하여도 무방하지만, PEG 200을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 알칼리 용액으로 형성된 핵산 추출용 조성물은 세포를 파괴하여 핵산을 추출하는 일을 수행하지만, 핵산 증폭용 시약에 들어가면 저해제가 될 수 있다. 그러나 본 발명에 따른 핵산 추출용 조성물은 핵산 증폭용 시약에 저해 반응을 일으키지 않는 PEG가 첨가되어 있으므로, 핵산 증폭용 시약에 대해 저해제가 되지 않는다.

이때, PEG는 핵산 추출용 조성물 100 부피%를 기준으로 50 내지 60 부피%가 포함된다. 여기서, 핵산 추출용 조성물에 포함되는 PEG의 함량이 50 부피% 미만이거면 핵산 증폭이 적게 되고, PEG의 함량이 60 부피%를 초과하면 핵산의 증폭이 잘 되지 않을 수 있다.

상기 KOH는 전체 용액이 알카리성을 가지도록 하는 것으로서, 최종농도는 100 내지 200mM인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, KOH는 핵산 추출용 조성물 100 부피%를 기준으로 38 내지 49 부피%가 포함된다. 여기서, 핵산 추출용 조성물에 포함되는 KOH의 함량이 38 부피% 미만이면 pH가 낮아지고, KOH의 함량이 49 부피%를 초과하면 pH가 높아져 결국 핵산 증폭용 시약에서 저해제가 된다.

상기 계면활성제는 세포벽의 분해를 보조하기 위해 첨가되는 것으로서, Span 20, Span 40, Span 60, Span 65, Span 80, Span 85 등(나카라이테스크사 제품명)의 d-소르비톨의 지방산에스테르, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, Tween 81, Tween 85 등(나카라이테스크사 제품명)의 폴리옥시에테틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르, TritonX-100 등(나카라이테스크사 제품명)의 폴리옥시에틸렌글리콜p-t-옥틸페닐에테르, 2-메르캡토에탄올, 사코실 설페이트(sarcosyl sulfate) 및 SDS(sodium dodecyl sulfate) 등을 사용할 수 있다. 이들은, 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상을 병용해서 사용해도 무방하다. 특히, 이 중에서는TritonX-100, Tween 20을 사용하는 것이 바람직하고, TritonX-100을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

이러한 계면활성제는 핵산 추출용 조성물 100 부피%를 기준으로 0.5 내지 2 부피%가 포함된다. 이때, 핵산 추출용 조성물에 포함되는 계면활성제의 함량이 0.5 부피% 미만이면 세포벽이 원활하게 분해되지 않아 핵산 추출량이 적어지는 문제가 발생할 수 있다. 또한, 핵산 추출용 조성물의 함량이 2 부피%를 초과하면 핵산 증폭반응에 저해가 될 수 있다.

아울러, 상기 핵산 추출용 조성물을 이용한 핵산 추출 방법은 시료에 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 제 1 단계, 및 시료와 핵산 추출용 조성물의 혼합물을 반응시키는 제 2 단계를 포함한다.

상기 제 1 단계는 시료에 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 단계로서, 추출하고자 하는 대상이 되는 시료 1 내지 10㎕(㎎)에 핵산 추출용 조성물 100 내지 300㎕를 첨가한다. 여기서, 상기 시료로 혈액, 타액 등의 액체시료를 사용하는 경우 에 핵산 추출용 조성물은 약 100㎕가 사용되는 것이 바람직하며, 상기 시료로 단단한 조직이나 식물 등의 고체시료를 사용하는 경우에 핵산 추출용 조성물은 200 내지 300㎕가 사용되는 것이 바람직하다.

상기 핵산 추출방법에 의해 추출하는 표적 핵산은 DNA(디옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산) 중 어느 것이어도 무방하다. 세포에는 이들의 핵산(DNA 및 RNA)이 포함되어 있기 때문에, 그 중의 표적 핵산을 상기 핵산 추출방법으로 추출할 수 있게 된다. 이때, 세포의 종류는 한정되는 것이 아니며, 동물 세포, 식물 세포, 미생물 세포 등의 모든 세포를 대상으로 할 수 있다. 상기 핵산 추출방법에 이용하는 시료로서는 세포를 포함하는 생체유래 시료가 적합하지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 생체에 유래하지 않는 시료에도 상기 핵산 추출방법을 적용하는 것은 가능하다.

생체에 유래하지 않는 시료로는, 예를 들어, 세포를 포함하는 식품재료, 흙, 물, 섬유, 먼지 등을 들 수 있다. 생체유래 시료로는 동물 및 식물의 생체 구성성분을 적절하게 이용할 수 있다. 인간을 포함하는 동물유래의 시료로는, 예를 들어, 혈액, 조직액, 림프액, 뇌척수액, 고름, 점액, 콧물, 객담, 소변, 대변, 복수 등의 체액류, 피부, 폐, 간, 점액, 각종 장기, 뼈 등의 조직과 비강, 기관지, 피부, 각종 장기 등을 세정한 후의 세정액을 들 수 있다. 그리고 인간의 경우는 투석 배액도 시료로 할 수 있다.

또한, 상기 핵산의 추출방법의 표적으로 하는 핵산은 시료에 포함되는 세포 고유의 핵산에 한정되지 않고, 세포에 감염된 바이러스의 핵산이나, 세포가 탐식한 미생물 등의 핵산에도 적용할 수 있다. 따라서, 감염증 환자의 탐식세포(백혈구 등)를 포함하는 생체유래 시료도 헥신 추출방법의 시료로 적합하다.

한편, 상기 제 2 단계는 상기 시료와 핵산 추출용 조성물이 혼합된 시료용액을 상온 내지 100℃에서 일정시간 동안 반응시키는 단계로서, 상기 반응을 통해 시료의 세포벽을 분해시킴으로써 상기 시료의 핵산을 추출한다. 이때, 상기 일정시간은 10 내지 15분인 것이 바람직하다. 또한, 액체시료는 상온에서 반응시키는 것이 바람직하며, 고체시료는 끓는물(약 100℃)에서 중탕으로 반응시키는 것이 바람직하다.

상기 제 2 단계를 시료에 따라 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.

제 1 양태로서, 상기 시료로 혈액, 타액 등 액체시료가 사용되면, 1 내지 10㎕의 액체시료에 약 100㎕의 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 것이 바람직하며, 상온에서 10 내지 15분 동안 반응시키는 것이 바람직하다.

제 2 양태로서, 상기 시료로 조직, 식물 등 고체시료가 사용되면, 1 내지 10㎎의 고체시료에 약 100㎕의 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 것이 바람직하며, 상온에서 10 내지 15분 동안 반응시키는 것이 바람직하다. 다만, 고체시료로 단단한 조직이나 직물을 사용하는 경우에는 1 내지 10㎎의 고체시료에 200 내지 300㎕의 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 것이 바람직하며, 끓는 물(약 100℃)에서 중탕으로 10 내지 15분 동안 반응시키는 것이 바람직하다.

제 3 양태로서, 상기 시료로 객담을 사용하면, 10 내지 50㎕의 객담에 약 100 내지 200㎕의 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 것이 바람직하며, 끓는물(약 100℃)에서 중탕으로 10 내지 15분 동안 반응시키는 것이 바람직하다.

기존의 핵산 추출 방법들은 여러 가지 용액을 사용하여 세포를 용해하는 단계, 용해 후 단백질을 분리하는 단계 등으로 나뉘어져 있고, 단백질 분리 단계에서는 반응 효소를 처리하여 일정 시간 효소 활성을 보이도록 반응시키는 단계들이 포함되어 있어서 시간이 많이 소요되며, 여러 단계를 거쳐야 하므로 불순물의 오염 가능성이 증가하고 반복적인 실험을 수행할 시에 재현성 있는 결과를 얻는데 어려움이 있었다. 하지만 상기 핵산 추출용 조성물을 이용한 핵산 추출방법은 하나의 조성물을 가지고 세포 용해와 단백질 분리, 및 핵산 추출을 동시에 가능하게 함으로써 핵산을 추출하는 단계를 줄이는 동시에 핵산을 추출하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있다. 또한, 여러 단계로 나뉘었던 것을 2 단계에서 모두 가능케 함으로써 작업자가 범할 수 있는 실수와 오차를 줄여 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다.

그리고 상기 핵산 추출용 조성물은 아주 적은 양의 세포를 가지고도 DNA 추출이 가능하고 세포 수가 많아져도 추출 효율이 일정하다.

또한, 상기 핵산 추출용 조성물을 사용하여 추출한 DNA는 제한 효소에 의해 정확히 절단되고, 단백질, RNA 및 다른 효소 등에 의해 오염되어 있지 않으므로, 상기 DNA를 효소 반응이 포함된 다른 실험에 사용하여도 아무런 문제가 되지 않고, PCR 반응을 수행하여도 아무런 문제가 되지 않는다,

한편, 본 발명에 따른 핵산 증폭 조성물은 핵산을 증폭하는데 이용할 수 있으며, 상기 핵산 증폭 조성물을 이용한 핵산 증폭방법의 일 실시예를 설명하면 다음과 같다.

이러한 핵산 증폭방법으로는, 종래 공지의 증폭방법을 적절히 이용할 수 있다. 구체적으로는 PCR법, Nested-PCR법, RT-PCR법, ICAN법, UCAN법, LAMP법, 프라이머 익스텐션법, 전사(Transcription), 복제(Replication) 등을 이용할 수 있으며, PCR법 및 LAMP법을 이용하는 것이 바람직하다.

일 실시 양태로서, 핵산 증폭 방법은 시료에 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 제 1 단계와, 시료와 핵산 추출용 조성물이 혼합된 시료용액을 반응시켜 핵산을 추출하는 제 2 단계, 및 상기 시료용액에 핵산 증폭용 조성물을 첨가하여 핵산 증폭반응을 수행하는 제 3 단계를 포함한다.

상기 제 1 단계는 시료에 핵산 추출용 조성물을 첨가하는 단계로서, 추출하고자 하는 대상이 되는 시료 1 내지 10㎕(㎎)에 핵산 추출용 조성물 100 내지 300㎕를 첨가한다. 이때, 핵산 추출용 조성물은 폴리에틸렌글리콜(PEG)과, 100 내지 200mM의 수산화칼륨, 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 시료로 혈액, 타액 등의 액체시료를 사용하는 경우에 핵산 추출용 조성물은 약 100㎕가 사용되는 것이 바람직하며, 상기 시료로 단단한 조직이나 식물 등의 고체시료를 사용하는 경우에 핵산 추출용 조성물은 200 내지 300㎕가 사용되는 것이 바람직하다.

상기 제 2 단계는 상기 시료와 핵산 추출용 조성물이 혼합된 시료용액을 상온 내지 100℃에서 일정시간 동안 반응시켜, 상기 시료의 세포벽을 분해시킴으로써 상기 시료의 표적 핵산을 추출하는 단계이다. 이때, 상기 일정시간은 10 내지 15분인 것이 바람직하다. 또한, 액체시료는 상온에서 반응시키는 것이 바람직하며, 고체시료는 끓는물(약 100℃)에서 중탕으로 반응시키는 것이 바람직하다.

상기 제 3 단계는 상기 제 2 단계를 통과한 시료용액에 핵산 증폭용 조성물을 첨가하여 핵산 증폭반응을 수행하는 단계로서, 상기 핵산 증폭용 조성물은 2 내지 5㎕이 첨가되는 것이 바람직하다. 필요에 따라, 상기 시료용액에는 핵산 증폭용 조성물의 안정을 위해 안정제가 추가로 더 첨가될 수도 있다. 이러한 안정제로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 안정제를 사용하는 것이 바람직하지만, 트리할로즈, Methyl-a-D-Gluco-pyranoside를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 제 3 단계에서는 핵산 증폭반응을 수행하기 전에 특정 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머가 첨가될 수 있다.

한편, 상기 제 3 단계 이후에는 제 3 단계를 통과한 시료용액에 시약을 첨가하여 상기 시료용액에 표적 DNA가 존재하는지 검출하는 단계가 더 포함될 수 있다.

여기서, 상기 시약은 각종 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), 올리고뉴클레오티드라이게이션 분석반응(oligonucleotide ligation assay), 혼성화 분석반응(hybridization assay), 각종 프로브 분석반응(probe assay)에 통상적으로 사용되는 분석시약을 의미할 수 있다. 구체적으로 상기 시약은 핵산 증폭반응이 완료된 생물학적 시료용액에 표적 DNA가 존재하는지를 관찰할 수 있는 시약으로서, 통상 광학적으로 검출할 수 있는 광을 생성하는 시약으로서 형광시약이 사용되고 있다. 상기 형광시약을 사용할 경우 생물학적 시료 용액과 혼합과정 후 발생되는 형광을 통하여 상기 생물학적 시료용액에 표적 DNA가 존재하는지를 관찰할 수 있게 된다. 이러한 핵산 분석시약으로서는 예를 들면 이중나선 DNA에 끼워들어 가는 Sybr Green I(Molecular probe, USA)를 들 수 있다. 여기서, Sybr Green I는 핵산증폭 중에 증폭되는 이중나선 DNA에 끼워 들어가 특정 파장의 형광을 나타내는 시약이다.

또한, 상기 표적 DNA의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적으로, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로우스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 증폭 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하의 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

아가로우스 겔 제조

먼저, 삼각플라스크(250 ㎖)에 아가로우스[QA-Agarose™, Q-bio gene, USA] 2 g을 넣고, 0.5X TBE(tris boric acid EDTA) 완충용액[Tris-Base, Q-biogene, USA] 100 ㎖을 넣는다.

그 다음, 상기 삼각플라스크의 혼합물을 전자레인지에서 2분 동안 녹인 후 상기 혼합물을 겔 용기에 넣는다.

그 다음, 상기 혼합물을 30분 동안 굳혀 2% 아가로우스 겔을 제조하였다.

전기영동장치를 이용한 증폭산물의 확인

전기영동장치[Mupid-α, Advance, Japan]에 0.5X TBE 완충용액을 채운 후 증폭산물 4 ㎕와 6X Loading dye(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 30% glycerol)[Bio Basic, CANADA] 0.8 ㎕를 섞어서 4.8 ㎕씩 로딩(loading)하였다.

그 다음, 100V에서 25분 동안 전기영동 시켰다.

그 다음, 겔을 떼어내어 EtBr(ethidium bromide)[SIGMA^®, USA]로 10 분간 염색한 후, 10 분간 증류수로 DNA와 결합하지 못한 EtBr을 씻어냈다.

그 다음, UV transilluminator[CTOC KOREA, Korea] 위에 아가로우스 겔을 올려놓고 반응여부를 확인했으며, 마지막으로 염기서열분석법으로 확인하였다.

제 1 유전자 증폭반응 완충액 제조

600mM Tris-HCl, 200mM (NH₂)₄SO₄, 1M Betaine, 20mM BSA, 0.2% Tween 20을 포함하는 완충액을 제조하였다.

제 2 유전자 증폭반응 완충액 제조

100mM Tris-HCl, 400mM KCl, 20mM BSA, 0.2% Tween 20, 1M Betaine을 포함하는 완충액을 제조하였다.

[실시예 1] 핵산 추출용 조성물 제조

삼각플라스크(250 ㎖)에 PEG 200[SIGMA^®, 미국] 55 ㎖와 150 mM의 KOH[Duchefa Bichemical사, 네덜란드] 44 ㎖, 및 Tween 20[나카라이테스크사, 일본] 1 ㎖를 주입하고, 이를 혼합하여 핵산 추출용 조성물을 제조하였다.

[실시예 2] 핵산 증폭용 조성물 제조

제 1 유전자 증폭반응 완충액 10 ㎖, 10mM dNTP[SIGMA^®, 미국] 10ml, 100mM MgCl₂[SIGMA^®, 미국] 0.4ml, 중합효소[HS Prime Taq DNA Polymerase, 제넷바이오, 한국] 2ml, 3차 증류수 27.6ml를 첨가하여 핵산 증폭용 조성물을 제조한다.

[실시예 3] 핵산 증폭용 조성물 제조

제 2 유전자 증폭반응 완충액 10 ㎖, 10mM dNTP[SIGMA^®, 미국] 10ml, 100mM MgCl₂[SIGMA^®, 미국] 0.4ml, 중합효소[HS Prime Taq DNA Polymerase, 제넷바이오, 한국] 2ml, 3차 증류수 27.6ml를 첨가하여 핵산 증폭용 조성물을 제조한다.

[비교예 1] 핵산 증폭용 조성물 제조

[실시예 2]와 동일한 실험 조건하에서 핵산 증폭용 조성물을 제조하되, 상기 중합효소[HS Prime Taq DNA Polymerase, 제넷바이오, 한국] 2ml 대신 중합효소[Prime Taq DNA Polymerase, 제넷바이오, 한국] 2ml를 사용하여 핵산 증폭용 조성물을 제조한다.

[실험예 1]

혈액에 포함된 핵산 추출

먼저 삼각플라스크(250 ㎖)에 전혈 10 ㎕와 핵산 추출용 조성물 100 ㎕를 주입하였다.

그 다음, 전혈 및 핵산 추출용 조성물을 실온에서 5분 동안 반응 후 p53 gene의 exon 5,6,8을 증폭하는 프라이머와 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물 5 ㎕를 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

그 다음, 2% 아가로우스 겔 및 전기영동장치를 이용하여 증폭산물을 관찰하 였다.

[비교실험예 1]

혈액에 포함된 핵산 추출

[실험예 1]과 동일한 실험 조건하에서 핵산을 추출하되, 상기 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물 대신 [비교예 1]의 핵산 증폭용 조성물을 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

도 1은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 핵산 증폭 결과물에 대한 전기영동 사진이다.

도 1을 참조하면, 핵산 증폭용 조성물을 제조할 경우 Hot start taq DNA polymerase를 사용하는 것이 더욱 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

이때, M은 100bp 마커이고, 1과 2와 3은 3가지 프라이머에 혼합된 시료이며, A는 실험예 1를 나타내며, B는 비교실험예 1을 나타낸다.

[실험예 2]

조직에 포함된 핵산 추출

먼저 삼각플라스크(250 ㎖)에 쇠고기 조직 10 ㎎과 핵산 추출용 조성물 100 ㎕를 주입하였다.

그 다음, 쇠고기 조직 및 핵산 추출용 조성물을 100℃의 끓는물에서 중탕으 로 10분 동안 반응시킨 후 5 ㎕의 용액을 취하여 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물에 첨가하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

그 다음, 2% 아가로우스 겔 및 전기영동장치를 이용하여 증폭산물을 관찰하였다.

도 2는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 핵산 증폭산물에 대한 전기영동 사진이다.

도 2를 참조하면, 조직의 경우는 혈액보다 핵산 추출 과정에 소비되는 시간이 오래걸리는데 본 발명에 따른 핵산 추출용 조성물과 핵산 증폭용 조성물을 사용하면 조직으로부터 핵산을 추출하고 증폭하는데 소비되는 시간을 단축시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이때, M은 100bp 마커이고, P는 증폭된 핵산이며, 1과 2는 쇠고기 조직이고, 3과 4는 보관된 혈액이다.

[실험예 3]

콩에 포함된 GMO 추출

먼저 삼각플라스크(250 ㎖)에 곱게 갈린 콩 10 ㎎과 미숫가루 10 ㎎ 및 핵산 추출용 조성물 100 ㎕를 주입하였다.

그 다음, 콩과 미숫가루 및 핵산 추출용 조성물을 100℃의 끓는물에서 중탕으로 15분 동안 반응시킨 후, 5 ㎕의 용액을 취하여 콩의 내재 유전자인 lectin 유전자와 GMO 여부를 확인하인 Nos 유전자를 증폭하는 프라이머와 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물을 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

[비교실험예 2]

콩을 이용한 핵산 추출

실험예 3과 동일한 실험 조건하에서 핵산을 증폭하되, 상기 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물 대신 [비교예 1]의 핵산 증폭용 조성물을 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

도 3은 본 발명의 제 3 실시예에 따른 핵산 증폭산물에 대한 전기영동 사진이다.

도 3을 참조하면, 핵산 증폭용 조성물을 제조할 경우 중합효소로 Hot start taq DNA polymerase를 사용하는 것이 더욱 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

이때, M은 100bp 마커이고, P는 GMO 양성대조군이며, N은 음성대조군이고, 1 내지 4는 미숫가루이며, 5 내지 6은 콩이다. 또한, A는 실험예 3을 나타내며, B는 비교실험예 2를 나타낸다.

[실험예 4]

객담에 포함된 결핵균주 추출

먼저, 병원의 오가와 배지에서 키워진 결핵균을 NaOH 처리하여 죽인 후 Tris-HCl 버퍼를 사용하여 10배씩 희석하였다.

그 다음, 삼각플라스크(250 ㎖)에 10배씩 희석된 결핵균이 첨가된 정상인의 객담 10 ㎕와 핵산 추출용 조성물 100 ㎕를 주입하였다.

그 다음, 객담 및 핵산 추출용 조성물을 100℃의 끓는물에서 중탕으로 10분 동안 반응시킨 후 5 ㎕의 용액을 취하여 인(人)형 결핵을 검출하는 IS6110 유전자 부위를 증폭하는 프라이머와 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물을 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

[비교실험예 3]

객담에 포함된 결핵균주 추출

실험예 4와 동일한 실험 조건하에서 핵산을 증폭하되, 상기 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물 대신 [비교예 1]의 핵산 증폭용 조성물을 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

도 4는 본 발명의 제 4 실시예에 따른 핵산 증폭 결과물에 대한 전기영동 사진이다.

도 4를 참조하면, 단순한 과정을 통해서도 결핵 균주가 검출될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이때, M은 100bp 마커이고, N은 음성 대조군이며, 1 내지 5는 10배씩 희석한 결핵균을 첨가한 객담이다. 또한, A는 실험예 4를 나타내며, B는 비교실험예 3을 나타낸다.

[실험예 5]

구강상피세포 포집액에 포함된 Apoe 유전자 추출

먼저, 실험대상자의 입안을 세정한 구강상피세포 포집액을 1.5 ㎖의 원심분리 튜브(tube)로 옮기고, 2분 동안 상온에서 12,000rpm으로 원심분리 한 다음, 펠릿(pellet)이 딸려오지 않게 튜브의 상층액을 제거하였다.

그 다음, 원심분리 및 상층액 제거과정을 2회 반복하여 수행하였다.

그 다음, 수집된 펠릿에 핵산 추출용 조성물 100 ㎕를 주입하였다.

그 다음, 펠릿 및 핵산 추출용 조성물을 끓는물에서 중탕으로 5분 동안 반응시킨 후 5 ㎕의 반응용액을 취하여 [실시예 2]의 핵산 증폭용 조성물을 첨가 하여 핵산 증폭반응을 수행하였다.

그 다음, 제한효소(Hha1)를 처리하여 DHPLC 분석을 통해 유전자형을 분석하였다. 여기서, 상기 제한효소(HhaI)는 GCGC를 인식하여 첫 번째 G와 C 사이를 자르는 제한효소로, ApoE 유전자 중 GCGC 유전자의 형이 다른 타입을 분석하여 E2, E3, E4 유전자형을 구분한다.

도 5는 본 발명의 제 5 실시예에 따른 핵산 증폭 결과물에 대한 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진이다.

도 5를 참조하면, 실험대상자에 대한 ApoE 유전자의 유전자형을 확인할 수 있었다.

이와 같이, 본 발명에 따른 핵산 증폭용 조성물은 일반적인 핵산 증폭용 조성물을 사용할 경우와 비교하면, 표적 핵산을 정확하게 증폭시키는 효과를 지니고 있다. +

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 2는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 핵산 증폭 결과물에 대한 전기영동 사진이다.

도 3은 본 발명의 제 3 실시예에 따른 핵산 증폭 결과물에 대한 전기영동 사진이다.

Claims

유전자 증폭반응 완충액 15 내지 25 부피%;

8 내지 12mM의 dNTP 15 내지 25 부피%;

80 내지 120mM의 염화마그네슘 3 내지 5 부피%;

중합효소 2 내지 4 부피%; 및

증류수 41 내지 65 부피%를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자 증폭반응 완충액은

600 내지 650mM의 Tris-HCl 및 150 내지 200mM의 황산암모늄을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자 증폭반응 완충액은

80 내지 120mM의 Tris-HCl 및 350 내지 450mM의 염화칼륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.
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