KR101159288B1

KR101159288B1 - 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산 및 정제 방법

Info

Publication number: KR101159288B1
Application number: KR1020100017795A
Authority: KR
Inventors: 이영일; 이현승; 조영화
Original assignee: 주식회사 에스씨티
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2012-07-09
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: KR20110098261A

Abstract

본 발명은 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산 및 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 기존의 방법에 비해 AAV1 ~ AAV5 벡터 표준품을 최적의 조건에서 대량으로 생산하는 방법 및 정제 정도를 향상시킬 수 있는 임상시험용 의약품 품질관리에 적용되는 아데노 연관 바이러스 혈청형 1~5(AAV1~AAV5) 벡터 표준품의 대량 생산 및 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, AAV1~AAV5 벡터 표준품의 생산 효율성이 향상되고, 오염된 다른 물질들에 기인하는 부적격 반응을 최소화할 수 있는 정제과정이 향상되었으므로, 특히 임상시험용의약품 유전자 치료제의 품질관리를 하는데 사용 가능하고 유용하다.

Description

아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산 및 정제 방법{Method for Mass Production and Purification of Adeno?Associated Virus Sero Type Vector}

본 발명은 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산 및 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 기존의 방법에 비해 AAV1 ~ AAV5 벡터 표준품을 최적의 조건에서 대량으로 생산하는 방법 및 정제 정도를 향상시킬 수 있는 임상시험용 의약품 품질관리에 적용되는 아데노 연관 바이러스 혈청형 1~5(AAV1~AAV5) 벡터 표준품의 대량 생산 및 정제 방법에 관한 것이다.

유전자 치료법은 유전자 전달 및 발현에 의하여 질병을 치료하는 방법으로서, 약물 치료와는 달리 장애가 있는 특정 유전자를 목표로 유전적 결함을 교정하는 치료법이다. 유전자 치료의 궁극적인 목표는 살아있는 세포를 유전적으로 변형하여 유익한 치료효과를 얻는 것이다. 상기 치료법은 질환 부위로 유전인자의 정확한 전달, 생체 내에서의 완전한 분해, 독성 및 면역 항원성 부재(不在) 및 유전인자의 장기간 안정적인 발현이라는 장점을 지니고 있어서, 질병치료에 있어 더할 나위 없는 최선의 치료법으로 각광받고 있다.

유전자 치료의 주 연구 분야는 특정 질병에 치료 효과를 나타내는 유전자를 도입하거나, 항암제 등에 저항성을 나타내도록 정상세포의 저항 기능을 증강시키거나, 각종 유전성 질환자에 있어서 변형되거나 소실된 유전자를 대체하는 분야로 요약할 수 있다.

유전자 치료법은 크게 생체 내(in vivo)와 생체 외(ex vivo) 두 가지로 구분된다. in vivo 유전자 치료법은 치료 유전자를 직접 체내에 주입하는 것이고, ex vivo 유전자 치료법은 일차적으로 목적 세포(target cell)를 시험관 내에서 배양하고, 이들 세포에 유전자를 도입시킨 다음, 유전자 변형된 세포를 다시 체내로 주입하는 것이다. 현재 유전자 치료 연구 분야에서는 in vivo 유전자 치료법보다는 ex vivo 유전자 치료법을 많이 사용하고 있다.

유전자 전달 기술은 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비-바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다.

상기 전달 기술 중에서, 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료유전자로 대체된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제 능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자 치료를 위해 선호되는 방법이다. 바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다. 이 중에서도 특히 연구가 활발히 진행되고 있는 것은 레트로바이러스와 아데노바이러스이다.

숙주세포의 게놈에 통합기능이 있는 레트로바이러스(retrovirus)의 특징은 인체에 해가 없지만 통합시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7 kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 그러나, 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 체세포 조직을 항시 in vitro에서 증식하여야만 한다는 단점도 지니고 있다. 또한, 레트로바이러스는 원형암유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.

한편, 아데노바이러스(Adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점을 가지는데, 중간 정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환 시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈세포, 림프구, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나, 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염률이 낮다. 또한, 전달된 유전자는 1~2주 후에 가장 많이 발현되고, 일부 세포에서는 3~4주 정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역원성을 갖는다는 것이다.

아데노-연관 바이러스(Adeno-Associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. AAV는 단일 가닥의 원바이러스(Provirus)로서, 복제하기 위하여 보조바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈은 4,680 bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 트랜스-유전자(trans-gene)는 각각 145 bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence)부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라스미드 DNA와 함께 트랜스펙션(transfection)시키고 아데노바이러스는 보조바이러스로서 첨가한다. AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복 투여시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈은 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자 발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.

1994년 CFTR 유전인자를 포함한 AAV 벡터가 섬유아세포증(cystic fibrosis) 치료를 위하여 NIH에 승인된 이래, 다양한 질병의 임상치료에 이용되고 있다. 혈액응고인자인 인자 IX 유전자(factor IX gene)를 포함한 AAV 벡터는 B형 혈우병(hemophilia B) 치료에 이용되고 있고, AAV 벡터를 이용한 A형 혈우병 (hemophilia A) 치료제 개발이 진행되고 있다. 또한, 여러 가지 종류의 항암유전자를 함유한 AAV 벡터는 종양 백신으로 사용하는 경우가 인증되었다.

유전자치료에 사용되는 AAV 벡터 중 가장 널리 사용되고 있는 것이 rAAV2 혈청형 벡터이고, rAAV2 혈청형 벡터에 대해서는 바이러스의 유전자 복제 기전, 염색체 삽입 기전 등을 포함한 많은 연구가 축적되어 왔다. 그러나, AAV2를 암환자에 재차 투여했을 경우 첫번째 투여시에 발생한 면역 반응에 의해, 2차 투여시에는 바이러스가 중화되어 치료효율이 급격히 떨어지는 단점이 있다.

또한, AAV는 독자적인 자가복제 능력이 없기 때문에, 치료에 필요한 정도의 재조합 AAV를 효과적으로 만들어내기가 쉽지 않다. 상기 단점으로 인하여, 재조합 AAV가 유전자 치료 연구의 초기 생성 과정에서부터 널리 사용되지는 않았지만, 바이러스의 생활사에 대한 꾸준한 연구의 결과, 헬퍼바이러스-유리 생산 시스템(Xiano, X., Li, J. and Samulski, R.J., J. Virol., 72:2224, 1998; Grimm, D. et al., Hum. Gene Ther., 9:2745, 1998; Matsushita, T. et al., Gene Ther., 5:938, 1998; Donway, J.E. et al., Gene Ther., 6:986, 1999; Allen, Mol. Ther., 1:88, 1999; Cao, L. et al., J. Virol., 74:11456, 2000)와 같은 rAAV 생산을 위한 효과적인 방법들이 고안되었다. 상기 방법 중, rAAV를 생산하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 방법은 목적 유전자를 코딩하는 rAAV 발현벡터와 AAV rep-cap 유전자 발현벡터 및 감염성 입자 형성에 필요한 아데노 바이러스 기원 유전자의 발현벡터를 모두 포괄하는 헬퍼플라스미드(AAV rep-cap 유전자 및 아데노 연관 바이러스 감염성 입자 형성에 필요한 상기 아데노 바이러스 기원 유전자를 동시에 포함하는 플라스미드)를 HEK 293 세포와 같이, 아데노 바이러스의 E1 유전자로 형질전환된 포장용 세포주에 이중 또는 삼중 형질도입시키는 방법이다.

대부분의 경우에 있어서, 형질도입은 인간 배아 신장 293 세포(HEK 293)와 같이 아데노바이러스의 E1 유전자를 보충할 수 있는 포장용 세포주를 부착 배양한 상태에서 수행하는 것이 일반적이다 (Grimm, D., Methods, 28:146, 2002; Zolotukhin, S. et al., Methods, 28:158, 2002). 그러나, 종래의 연구 결과를 종합하면, 동물 실험에서 치료효과를 입증하는데 필요한 rAAV의 양은 10¹³ 입자 정도로서, 이 정도의 rAAV를 생산하기 위해서는 15㎠ 배양 접시를 기준으로 최소한 20에서 많게는 5,000개의 HEK 293 배양 접시에 대한 형질도입이 필요하다 (Kay, M.A. et al., Nat. Genet., 24:257, 2000; Chuah, M.K. et al., J. Gene Med., 3:3, 2001; Matsushita, T. et al., Gene Ther., 5:938, 1998; Gao, G.P. et al., Hum. Gene Ther., 9:2353, 1998; Zolotukhin, S. et al., Gene Ther., 6:973, 1999; Chadeuf, G. et al., J. Gene Med., 2:260, 2000; Drittanti, L. et al., Gene Ther., 7:924, 2000; Drittanti, L. et al., J. Gene Med., 3:59, 2001).

또한, 인간을 대상으로 하는 임상 실험을 하는데 있어서는 약 10¹³ 내지 10¹⁴개의 입자가 1회의 임상 적용에 사용될 것으로 추정되기 때문에 훨씬 더 많은 수의 배양 접시와 그에 대한 형질도입이 필요하다 (Grimm, D. et al., Hum. Gene Ther., 10:2445, 1999). 따라서, AAV 유래 유전자 전달체를 사용하는 각종 난치성 질환의 유전자 치료를 실현하는데 있어서 효과적인 rAAV의 대량 생산방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 재조합 아데노 연관 바이러스 입자를 정제하는 통상적인 방법으로는 CsCl, 이오딕사놀(iodixanol)과 같은 물질의 밀도차를 이용하는 초원심분리법(Zolotukhin, S. et al., Gene Ther., 6:973, 1999)이 있으나, 상기 방법은 대량 생산에 부적합하고, 감염성 바이러스 벡터의 순수 분리 효율이 낮아 정제의 두번째 단계에 이온교환수지를 사용하거나, AAV 바이러스의 유력한 수용체로 알려진 헤파린 황산염 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan) 수용체와 유사한 헤파린, 셀루핀 황산염(cellufine sulphate) 등의 친화력을 이용하는 친화성 수지(affinity resin)를 사용하는 정제법과 병행하여 사용하기도 한다 (Zolotukhin, S. et al., Gene Ther., 6:973, 1999; O'Riordan, C.R. et al., J. Gene Med., 2:444, 2000; Zolotukhin, S. et al., Methods, 28:158, 2002; Snyder, R.O. et al., Curr. Opin. Biotechnol., 13:418, 2002; 미국등록특허 제6,593,123호). 그러나, 헤파린 기반의 친화성 수지도 용량 증대에 한계가 있으며, 고순도를 필요로 하는 임상 등급의 재조합 아데노 연관 바이러스 정제 공정에 사용할 경우, 친화수지 유래 물질의 완벽한 제거를 확인해야 하는 등 산업용으로 사용하기 어려운 문제점을 가지고 있다.

현재 유전자치료제를 이용해 진행되고 있는 임상시험은 약 16백여건이고, 유전자전달체 별로 분류를 하면 가장 주된 전달체로 이용되는 벡터는 아데노바이러스(adenovirus) 벡터로 총 24%를 차지하고 있으며, 386건에 달한다. 유전자치료제를 이용한 임상시험용의약품에 대한 품질평가 가이드라인에 의하면 외래성 바이러스(adventitious virus) 오염 정도를 평가하여 안전성을 검증하는 것이 필요하다. 특히 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자치료제는 생산 시 AAV 오염에 대한 검증이 필요하고 이러한 분석시험 시 AAV 혈청형 2(AAV2) 유전자가 들어있는 DNA를 양성대조군으로 포함하여 분석을 하거나 AAV 혈청형 2 벡터를 직접 사용하는데 이를 수행하기 위해서는 오염물질이 없는 AAV2 표준품을 사용하는 방법으로 안전성 검증 분석실험이 진행된다. 보통 AAV 표준품은 ATCC에서 구입을 하여 사용하는데 그 가격이 매우 고가이다.

이에 본 발명자들은, AAV의 각 혈청형에 대한 대량생산 효율성을 증대하여, 정제과정을 통해 오염물질이 없는 순수한 표준품을 제작하여 아데노바이러스 벡터 등의 유전자치료제 임상시험용의약품을 품질평가 할 때 사용할 수 있는 대량생산 및 정제방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, rAAV2 벡터를 293T 세포에 도입하여 형질전환 후, 4~6일 동안 배양하여 rAAV2 벡터를 대량 생산하고, 밀도구배 및 센트리콘, 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 경우, 오염물질이 없는 순수한 표준품을 대량생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 대량생산 효율성을 증대하기 위한 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 정제과정을 통해 오염물질이 없는 순수한 표준품을 제작하기 위한 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 정제 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포주를 파쇄하여 AAV 혈청형 벡터를 수득하는 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 세포를 파쇄한 세포파쇄액을 CsCl을 이용한 밀도구배 원심분리하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 원심여과(centrifugal filtration)하여, AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 세포를 파쇄한 세포파쇄액을 이온교환수지를 이용한 크로마토그래피를 이용하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 CsCl 밀도구배 원심분리하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법을 제공한다.

본 발명은 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산 및 정제 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 아데노 연관 바이러스 혈청형 1～5 벡터의 생산 효율성 및 감염 효율성이 증가되고, 생산비용이 절감되며, 정제 정도를 향상시켜 오염되어 있던 단백질에 기인하는 면역반응을 최소화할 수 있으므로, 임상 시험용 유전자 치료제 생산에 유용하다.

도 1는 본 발명에 따른 AAV 혈청형 벡터의 생산조건으로 생산된 AAV 2 혈청형 벡터를 CsCl 밀도구배 원심분리 방법과 센트리콘을 여과방법으로 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 AAV 혈청형 벡터의 생산조건으로 생산된 AAV 2 혈청형 벡터를 CsCl 밀도구배 원심분리 방법 또는 이온교환수지 크로마토그래피 방법과 CsCl 밀도구배 원심분리방법을 함께 사용한 방법으로 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2의 결과를 AAV 2 혈청형에 대한 특이적 다클론 항체를 이용하여 웨스턴블러팅한 결과를 나타낸 것이다.

일 관점에서 본 발명은 (a)MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포주를 파쇄하여 AAV 혈청형 벡터를 수득하는 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 대량 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 AAV 혈청형 벡터는 MOI 50~0.5로 형질전환시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 AAV 혈청형 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 및 AAV5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

기존에 AAV 혈청형 벡터의 표준품의 대량생산에 사용되는 방법은 ATCC의 방법에 따르며, 상기 ATCC에서 사용되는 표준품의 대량생산 방법은 AAV 혈청형 벡터의 세포내 복제를 위하여 헬퍼바이러스를 co-infection 사용하고 있어, 정제단계에서, 헬퍼바이러스의 유입 가능성이 있으며, 각각의 AAV 혈청 타입에 따라, 서로 다른 헬버바이러스를 사용하여, 제조가 번거로운 단점이 있다.

상기 ATCC에서 사용하는 기존의 대량생산방법은, AAV1(ATCC 645)의 경우에는, Adenovirus type 7a(ATCC VR-848)를 헬퍼바이러스(Helper virus)로 사용하고(Atchison, R.W. et. al., Science, 149:754-755, 1965), AAV2(ATCC VR-680)의 경우는 Adenovirus type 2(ATCC VR-846)를 헬퍼바이러스로 사용하고(Hoggan, M.D. et. al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 55:1467, 1966), AAV3(ATCC VR-681)의 경우는 Adenovirus type 7a(ATCC VR-848)를 헬퍼플라스미드로 사용하고(Hoggan, M.D. et. al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 55:1467, 1966), AAV4(ATCC VR-646)의 경우는 Simian adenovirus 3(SV-15, ATCC VR-1449)를 헬퍼바이러스로 사용하고(Parks, W. P. et. al., Journal of Virology, 1:171, 1967), AAV5(ATCC 1523)의 경우는 Adenovirus type 2(ATCC VR-846)를 헬퍼바이러스로 사용한다(Bantel-Schaal & zur Hausen, Virology, 134:52, 1984; Georg-Fries, et. al., Virology, 134:64, 1984).

ATCC에서 사용하는 기존의 대량생산방법은 상기 각각의 AAV혈청형 벡터와 각각의 헬퍼바이러스를 HEK293을 생산세포주로 하여 co-infection 방법으로 생산하였다. HEK293을 3 x 10⁶ cells/100 mm 배양접시 농도로 계대하였고, 24시간이 지나면 헬퍼바이러스를 56℃에서 30분간 열 변성 시킨 후 MOI 10~100 조건으로, AAV 혈청형 벡터는 MOI 100~1,000 조건으로 생산세포주에 동시에 감염시켜 AAV 혈청형 벡터를 생산하고, 감염 24 시간 후 생산효율성을 분석하였다.

일 양태에서, 본 발명의 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 대량 생산방법은 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 세포내 복제를 위하여, 헬퍼바이러스가 아닌 헬퍼플라스미드를 사용하여, 정제단계에서의 헬퍼바이러스의 혼입을 원천적으로 차단하고 있으며, 모든 혈청형 벡터에서 동일한 헬퍼플라스미드를 사용할 수 있어, 각 혈청형벡터를 한꺼번에 정제할 경우 공정을 단순화할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명의 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 대량 생산방법은 AAV 및 헬퍼플라스미드를 감염시킨 세포를 5일간 배양한 후 AAV 함유 세포분획을 수득하였으며, 이는 기존의 ATCC 방법이 2일간 배양한 후 AAV를 수득하는 것에 비하여 훨씬 높은 생산효율성을 나타내었다.

즉, 본 발명에서 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 대량 생산방법은 AAV 및 헬퍼플라스미드를 감염시킨 세포는 4~6일간 배양하여 AAV 벡터를 증폭시킨 후, AAV를 수득하는 것이 바람직하며, 4일 미만으로 배양 시에는 수득되는 AAV 벡터의 양이 감소하고, 6일을 초과하여 배양할 경우 생산 효율성이 감소하고 새로운 배지를 넣어 주어야 하기 때문에 생산 비용이 증가하므로 표준품 생산 및 임상시험용의약품 생산에 적용하기에는 바람직하지 않다.

또 다른 양태에서, 본 발명에서 세포에 감염시키는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 양이 10 또는 1 MOI로 하였을 때 높은 AAV 벡터 생산성을 나타내었다.

그러므로, 본 발명에서 세포에 감염시키는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터는 50~0.5 MOI인 것이 바람직하며, 50 MOI를 초과하거나 0.5MOI 미만으로 감염시킬 경우, 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 생산성이 떨어지게 된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터와 헬퍼플라스미드를 HEK293세포와 293T세포에 각각 형질전환시킨 경우, 293T세포에서 더 높은 AAV 벡터 생산 효율성을 나타내었다.

다른 관점에서, 본 발명은 (a) MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 세포를 파쇄한 세포파쇄액을 CsCl을 이용한 밀도구배 원심분리하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 원심여과(centrifugal filtration)하여, AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법에 관한 것이다.

본 발명의 일양태에서, 293T 세포에 rAAV2 벡터 및 pHelper를 코-트랜스펙션(co-transfection)한 후, 상기 형질전환된 세포를 배양한지 5일이 경과하면 상기 세포들을 모아 초음파 파쇄(sonication)한 다음, RNase와 DNase를 처리하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리를 2번 반복하여 RI(Refractive Index)가 1.37~1.42g/㎖인 부분을 모아 AAV(rAAV) 파티클을 순수 분리하였고, 이렇게 분리된 rAAV2 벡터를 Centricon(Millipore, YM-100)을 이용하여 5,000g, 20분, 4℃로 원심여과(centrifugal filtration)하는 방법으로 정제하였다. 그 결과, 원심 여과법과 CsCl 밀도구배법과 Centricon을 함께 사용하여 정제한 경우가 기존 CsCl 밀도구배법에 의해 정제한 경우보다 휠씬 높은 정제 효율을 보였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 세포를 파쇄한 세포파쇄액을 이온교환수지를 이용한 크로마토그래피를 이용하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 CsCl 밀도구배 원심분리 하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법을 제공한다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀도구배 원심분리 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는, 293T 세포를 AAV2와 헬퍼플라스미드를 Ca-phosphate mediated transfection 방법으로 형질전환한 후, 배양한 다음 수확하여, 원심분리 후 상층액은 amicon(Millipore, Cat. No. 4211)을 이용하여 원심분리방법으로 농축하였다. 농축된 세포분획을 POROS HS50(Applied Biosystems,USA) 레진이 충전된 크로마토그래피에 로딩하여, 바이러스가 있는 분획을 모은 후 상기 모아진 샘플을 CsCl 밀도구배 원심분리하여 더욱 정제하였고 바이러스의 정제정도를 분석한 결과, CsCl 밀도구배원심분리만을 수행한 분획보다 크로마토그래피와 CsCl 밀도구배 원심분리를 함께 수행한 정제실험에서 가장 순수한 VP 단백질을 얻을 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 표준품 AAV 1~5 혈청형 벡터의 대량생산방법 확립

본 발명에서는 ATCC의 AAV1~5의 대량생산방법과 차별화된 방법을 이용하여 AAV1(ATCC 645), AAV2(ATCC VR-680), AAV3(ATCC VR-681), AAV4(ATCC VR-646) 및 AAV5(ATCC 1523) 등 AAV 5종류 혈청형을 대량 증폭하여 표준품을 생산하였다.

본 실시예에서 사용되는 세포배양은 37ㅀC, 5% CO₂ 배양기에서 10% FBS(GIBCO, USA)를 포함한 DMEM(GIBCO, USA) 완전배지를 이용하여 진행하였고, AAV 표준품을 생산하기 위해 세포를 계대할 때부터는 2% FBS를 포함한 DMEM 완전배지를 이용하여 배양하였다.

(1-1): ATCC 방법과 본 발명에 따른 AAV2 대량생산 방법의 생산효율성 비교

먼저, ATCC에서 사용하는 기존의 AAV2 대량생산방법은 Adenovirus type 2(ATCC VR-846)를 helper virus로 사용하고 HEK293을 생산세포주로 하여 co-infection 방법으로 생산하였다(Hoggan, M.D. et. al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 55:1467-1474, 1966). HEK293(ATCC CRL-1573)을 세포수 3 x 10⁶ cells/100 mm 배양접시로 도말하여 계대하였고, 24시간이 지나면 helper virus를 56℃에서 30분간 열 변성 시킨 후 MOI 10～100 조건으로, AAV2(ATCC VR-680)은 MOI 100～1,000 조건으로 생산세포주에 동시에 감염시켜 AAV2을 생산하였다. 감염 후 48시간 후, 즉 2일째부터 생산효율성을 분석하였으며, 생산 효율성 향상이 가능한지 확인하기 위하여, 열변성하지 않은 live helper virus를 동일한 조건으로 감염시킨 실험도 실시하였다.

본 실시예의 방법으로는, AAV1(ATCC 645), AAV2(ATCC VR-680), AAV3(ATCC VR-681), AAV4(ATCC VR-646) 및 AAV5(ATCC 1523)의 AAV 5종류 혈청형을 대량 증폭하여 표준품을 생산하기 위하여, helper virus를 사용하는 대신 아데노 헬퍼 플라스미드(pHelper, Stratagene Co., USA)를 대신 사용하였다. helper-free방법으로 혈청형별 다른 helper virus를 사용하는 번거로움을 단순히 하였고, 표준품 정제과정으로 포함할 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리방법을 수행할 때 helper virus 오염을 사전에 방지할 수 있다.

생산세포주로는 HEK293(ATCC CRL-1573) 혹은 293T(ATCC CRL-11268)을 이용하였다. HEK293 혹은 293T 세포를 3 x 10⁶ cells/100 mm culture plate 상태로 계대하였고, 24시간이 지나면 각 AAV를 MOI 0.1~1000 조건으로 먼저 8시간 처리하였고, 연이어 pHelper 플라스미드 DNA를 15μg/100mm 배양접시 농도로 첨가하여, Ca-phosphate mediated transfection 방법(C. Chen and H. Okayama, Mol. Cell. Biol., 7:2745, 1987)을 이용하여 감염시킨 배지 위에 더 첨가하였고, 18시간이 경과하면 감염 및 transfection 배지를 제거하고 새로운 완전배지를 넣은 후 48시간 후부터 120시간(Day 2~5)까지 AAV를 증폭시켰다.

AAV를 증폭시킨 세포는 freezing & thawing 방법으로 3번 반복하여 파쇄하였고, 4℃ 12,000 rpm에서 10분 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 정량에 이용하였다. AAV의 정량은 Real-time PCR 방법(MiniOpticon, BIO-RAD, USA)으로 하기의 프라이머를 이용하여, 95℃ 5min/ (94℃ 30sec, 55℃ 30sec, 72℃ 30sec) X 40 cycle의 조건으로 수행하였다.

AAV1~AAV4는 하기 공통 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 증폭된 산물의 크기는 140bp이었다.

서열번호 1: 5'-GGG TGG CCG AGA AGG AAT-3'(AAV-F)

서열번호 2: 5'-CCT CCG GGG CCT TAC TCA-3'(AAV-R)

AAV5는 하기 specific primer를 이용하여 실시하였으며, 증폭된 크기는 187bp 이었다.

서열번호 3:5'-AGC AGC TTG AGG CGG GAG ACA AC-3'(AAV5-F)

서열번호 4: 5'-TTT CCG GTA GGG GCC GTC TTA GC-3'(AAV5-R)

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, ATCC에서 사용하는 기존의 AAV벡터 생산방법보다 본 발명에 의한 헬퍼플라스미드를 사용하는 방법의 생산 효율이 훨씬 높은 것을 알 수 있다.

ATCC 방법과 본 발명의 방법에 따른 AVV2 혈청형 벡터의 생산효율성비교

생산 세포주	생산에 사용한 바이러스 및 DNA양			생산효율성 (v.g./cell)
생산 세포주	AAV2 (M.O.I)	Ad2 (M.O.I)	pHelper DNA(㎍)	생산효율성 (v.g./cell)
HEK293 cell (100 mm dish)	1000	Live Ad2 100	-	3.92 × 10²
	1000 (ATCC방법)	Heat inactivated(열변성) 100	-	8.32 × 10¹
	1000	Heat inactivated(열변성) 1	-	2.56 × 10²
	1000 (본 발명)	-	15	2.16 × 10 ³

(1-2) AAV 혈청형 벡터의 증폭시간 및 감염 MOI 농도별 생산효율성 비교

AAV2 바이러스를 이용하여, AAV 혈청형 벡터의 증폭시간 및 감염 MOI 농도별 생산효율성 비교하였다.

AAV2 바이러스의 MOI를 1000, 100, 10, 1 및 0.1로 하여, 세포 내 증폭시간을 2일, 3일, 4일 및 5일로 하여 AAV2 벡터의 생산 효율성을 확인하였다.

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, AAV2를 10 MOI로 감염시키고, 5일간 증폭시킨 군의 생산효율성이 6.29 x 10³으로 가장 높아, AAV 혈청형 벡터의 생산 효율성은 증폭시간에 의존적임을 확인할 수 있었다.

AAV2 혈청형 벡터의 증폭시간 및 감염 MOI 농도별 생산효율성 비교

생산 세포주	생산에 사용한 바이러스 및 DNA양		생산효율성 (v.g./cell)
생산 세포주	AAV2 (M.O.I)	pHelper DNA(㎍)	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5
HEK293 cell (100 mm dish)	1000	15	2.18 × 10²	8.47 × 10²	4.14 × 10³	2.81 × 10³
	100	15	1.27 × 10³	9.31 × 10²	3.40 × 10³	2.36 × 10³
	10	15	2.34 × 10 ²	1.77 × 10 ³	4.10 × 10 ³	6.29 × 10 ³
	1	15	3.90 × 10¹	2.36 × 10³	3.55 × 10³	1.55 × 10³
	0.1	15	8.21 × 10¹	7.00 × 10¹	3.14 × 10³	9.62 × 10²

(1-3) HEK 293 및 293T를 이용한 생산세포주별 AAV 혈청형 벡터의 생산효율성 분석

생산효율성이 높은 생산세포주를 확인하고자, HEK 293 및 293T세포(ATCC CRL-11268)를 사용하여, AAV2를 10, 100 및 1000 MOI로 감염시키고, 5일간 증폭시켰다.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, HEK 293세포 보다 293T세포에서 훨씬 높은 생산효율성을 나타내었다.

HEK 293 및 293T에서의 AAV 혈청형 벡터의 생산효율성 분석

생산에 사용한 바이러스 및 DNA양		생산효율성 (v.g./cell)
AAV2 (M.O.I)	pHelper DNA(㎍)	HEK293	293T cell
1000	15	2.81 X 10³	2.85 X 10⁴
100	15	2.36 X 10³	7.43 X 10⁴
10	15	6.29 X 10 ³	1.61 X 10 ⁵

(1-4) AAV1~5벡터의 생산효율성 확인

(1-3)에서 확립한 조건(293T 세포 사용, 감염증폭 시간 5일)으로 AAV1~5 벡터의 생산효율성을 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, AAV1~5벡터의 생산효율성 MOI 10 또는 1을 사용 하였을 때 높게 나타났다.

본 발명의 방법에 따른 AAV1~5벡터의 생산효율성 확인

생산 세포주	생산에 사용한 바이러스 및 DNA양		생산효율성 (v.g./cell)
생산 세포주	AAV2 (M.O.I)	pHelper DNA(㎍)	AAV1	AAV2	AAV3	AAV4	AAV5
293T cell (100 mm dish)	1000	15	3.65 × 10⁴	4.98 × 10³	1.28 × 10⁵	3.29 × 10⁴	1.89 × 10⁵
	100	15	1.30 × 10⁵	4.57 × 10⁴	2.18 × 10⁵	3.93 × 10³	1.91 × 10⁵
	10	15	1.21 × 10 ⁵	1.78 × 10 ⁵	2.89 × 10 ⁵	1.35 × 10 ³	1.41 × 10 ⁵
	1	15	2.15 × 10 ⁵	2.52 × 10 ⁵	9.25 × 10 ⁴	N.D.	2.59 × 10 ⁵

실시예 2: 생산된 AAV혈청형 벡터의 정제

(2-1) CsCl 밀도구배법을 이용한 정제

HEK293(human embryonic kidney 293, ATCC CRL-1573) 또는 293T(ATCC CRL-11268) 세포에 상기 rAAV2 벡터 및 pHelper를 코-트랜스펙션(co-transfection)시킨 후, 상기 형질전환된 세포를 배양한지 5일이 경과하면 상기 세포들을 모아 초음파 파쇄(sonication)한 다음, RNase와 DNase를 처리하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리를 2번 반복하여 RI(Refractive Index)가 1.37~1.42g/㎖인 부분을 모아 AAV(rAAV) 파티클을 분리하였다.

(2-2) CsCl 밀도구배법 및 센트리콘을 이용한 정제

상기 rAAV2 벡터를 CsCl 밀도구배법과 Centricon(Millipore, YM-100)을 이용하여 5,000g, 20분, 4℃로 원심여과(centrifugal fiteration)하는 방법을 함께 사용하여 정제함으로써 rAAV 벡터의 정제 정도를 향상시켰다.

즉, HEK293(human embryonic kidney 293, ATCC CRL-1573) 또는 293T(ATCC CRL-11268) 세포에 상기 rAAV2 벡터 및 pHelper를 코-트랜스펙션(co-transfection)한 후, 상기 형질전환된 세포를 배양한지 5일이 경과하면 상기 세포들을 모아 초음파 파쇄(sonication)한 다음, RNase와 DNase를 처리하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리를 2번 반복하여 RI(Refractive Index)가 1.37~1.42g/㎖인 부분을 모아 AAV(rAAV) 파티클을 순수 분리하였고, 이렇게 분리된 rAAV2 벡터를 Centricon(Millipore, YM-100)을 이용하여 5,000g, 20분, 4℃로 원심여과(centrifugal filtration)하는 방법으로 정제하였다.

이때, 기존의 CsCl 밀도구배 방법으로만 정제된 AAV2 벡터를 대조군으로 사용하였으며, 상기에서 정제된 AAV2 벡터를 12% SDS-PAGE한 후, 코마시 블루(Coomassie Blue) 염색법으로 정제 효율을 확인하였다.

그 결과, 원심 여과법과 CsCl 밀도구배법과 Centricon을 함께 사용하여 정제한 경우가 기존 CsCl 밀도구배법에 의해 정제한 경우보다 휠씬 높은 정제 효율을 보였고, 주된 캡시드 단백질(VP1, VP2, VP3) 밴드만을 확인할 수 있었다 (도 1).

(2-3) 크로마토그래피법 및 CSCl 밀도구배 원심분리법

HEK293 또는 293T 세포를 3X10⁶cell 농도로 하였으며, AAV2와 헬퍼플라스미드를 Ca-phosphate mediated transfection 방법으로 형질전환한 후, 18 시간 후 배지를 갈아주었고, 그 후로부터 48시간 후에 수확하여, 원심분리 후 상층액은 amicon(Millipore, Cat. No. 4211)을 이용하여 5,000g, 4℃에서 원심분리하여 농축하였고, 세포와 농축된 세포배양액을 합하여 최종부피를 2.42 ml로 맞추었다.

크로마토그래피는 POROS HS50(Applied Biosystems,USA) 레진을 사용하였으며, 구입한 레진을 골고루 풀어지도록 한 후, 적량을 취하여, 3시간 정도 정치시켜 레진을 가라앉힌 후, 상층액을 제거하고, 레진 부피의 2배 부피에 해당하는 0.5M NaCl 용액으로 재현탁시킨 후, 칼럼에 충진하였다. 충진된 컬럼을 0.1M NaCl packing buffer으로 세척한 후, 200mM NaCl/20mM Na-Phosphate buffer(pH7.3) 를 레진 부피만큼 총 5회를 흘려주었다.

상기 준비한 세포와 농축된 세포배양액을 3회 freezing/thawing을 실시한 후 소니케이션하여, 세포를 파쇄하고, RNase와 DNase를 각각 0.001g씩 처리하고 37℃ 에서 30분간 반응시켰다. RNA와 DNA가 제거된 세포파쇄액을 200mM NaCl/20mM Na-Phosphate buffer(pH7.3)를 이용하여 최종부피를 10ml로 만든 후, 0.22㎛ 여과지로 여과하여 샘플을 준비하였다.

상기 준비된 샘플을 각각 칼럼에 로딩하고, 각 칼럼에 200mM NaCl/20mM Na-Phosphate buffer(pH7.3)를 sample의 부피에 해당하는 8ml 씩 3회 세척한 후, 400mM NaCl/20mM Na-Phosphate buffer(pH7.3)를 24ml 넣어주면서 0.5ml 씩 분획(fraction)을 수득하였다.

상기 수득한 분획(fraction)을 PCR로 정량하고 바이러스가 있는 분획을 모은 후 10mM Tris?HCl(pH8.0)을 이용하여 8ml로 맞춰주었고 샘플의 CsCl 밀도를 1.41로 맞추기 위하여 이에 CsCl을 5.22g을 넣어 녹여 주었다.

Ultra centrifuge tube에 1.61 밀도의 CsCl을 2ml 넣어준 후 위의 샘플을 넣었고, 튜브의 부족한 부분은 1.41g/ml 밀도의 CsCl용액으로 채워주었다. 60,000rpm, 4℃, 24시간 조건으로 원심분리 수행 후 0.5ml 분획을 받아 바이러스 파티클을 확인한 후 CsCl을 제거하기 위하여 HEPES buffer로 투석하여 바이러스를 정제하였다. 정제된 바이러스는 real-time PCR을 이용하여 정량하였다.

정제된 바이러스는 amicon(Millipore, Cat. No. 4211)을 이용하여 5,000g, 4℃에서 원심분리하여 농축하였으며, 이를 바이러스의 정제정도 분석실험의 샘플로 사용하였다.

12% SDS-PAGE 조건에서 정제된 바이러스를 전기영동한 후, Silver stain kit(Bio-Rad, Cat. No. 161-0444)를 이용하여 정제정도를 분석하였으며, 웨스턴 블럿을 수행하여 확인하였다. 12% SDS-PAGE 조건에서 정제된 바이러스를 전기영동한 후, PVDF membrane(Bio-Rad, Cat. No. 162-0177) 에 단백질을 transfer하여, 5% skim milk로 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, 1차 항체(anti-AAV2 capsid, polyclonal, PROGEN Cat. No. 61084) 항체와 PBS-T(0.02%)의 비율을 1:200 비율로 희석하여 섞은 후 상온에서 4시간 반응시키고, 2차 항체(ECL kit, GE Healthcare Cat. No. RPN2108)항체와 PBS-T(0.02%)의 비율을 1:5000비율로 하여 섞은 후 상온에서 4시간 반응시킨 후, ECL kit(GE Healthcare Cat. No. RPN2108)를 이용하여 AAV2의 VP1, VP2, VP3 단백질을 가시화하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 크로마토그래피와 CsCl 밀도구배 원심분리를 함께 수행한 정제실험에서 가장 순수한 VP 단백질을 얻을 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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다음 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법:
(a) MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계;
(b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계;
(c) 상기 배양된 세포를 파쇄한 세포파쇄액을 CsCl을 이용한 밀도구배 원심분리하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 수득된 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 원심여과(centrifugal filtration)하여, AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계.
제3항에 있어서, AAV 혈청형 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 및 AAV5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법.
다음 단계를 포함하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법:
(a) MOI 50~0.5의 AAV 혈청형 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계;
(b) 상기 형질전환된 293T 세포를 4~6일 동안 배양하는 단계;
(c) 상기 배양된 세포를 파쇄한 세포파쇄액을 이온교환수지를 이용한 크로마토그래피를 이용하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 수득된 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 CsCl 밀도구배 원심분리하여 AAV 혈청형 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계.
제5항에 있어서, AAV 혈청형 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 및 AAV5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노 연관 바이러스 혈청형(AAV) 벡터의 정제방법.