[go: up one dir, main page]

KR101157176B1 - 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및방법 - Google Patents

세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101157176B1
KR101157176B1 KR1020050126262A KR20050126262A KR101157176B1 KR 101157176 B1 KR101157176 B1 KR 101157176B1 KR 1020050126262 A KR1020050126262 A KR 1020050126262A KR 20050126262 A KR20050126262 A KR 20050126262A KR 101157176 B1 KR101157176 B1 KR 101157176B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
vessel
cells
pump
microfluidic device
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020050126262A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070065629A (ko
Inventor
김수현
조윤경
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to KR1020050126262A priority Critical patent/KR101157176B1/ko
Priority to US11/555,763 priority patent/US20070141561A1/en
Publication of KR20070065629A publication Critical patent/KR20070065629A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101157176B1 publication Critical patent/KR101157176B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0424—Dielectrophoretic forces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00051—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 부피가 일정하게 유지되는 시료 순환 용기; 상기 용기에 연결된 펌프; 및 상기 용기에 위치한 트랩부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치, 및 상기 미세유동장치를 이용하여 세포 또는 바이러스를 농축 또는 정제하는 방법에 관한 것이다.
Figure R1020050126262
미세유동장치, 농축, 정제

Description

세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및 방법{Microfluidic device and method for concentration or purification of cells or viruses}
도 1 및 2는 본 발명에 따른 장치의 작동 원리를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3a 및 3b는 각각 실시예에 사용된 트랩부의 분해도 및 사시도를 나타내는 도면이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 일 구체예에 따른 미세유동장치의 트랩부에 구비되는 평평한 금속 판의 배열의 형태로 배열된 전극 구조의 평면도 및 측면도를 나타낸 도면이다.
도 5 및 6은 본 발명의 실시예에 사용된 트랩부에 구비되는 전극부의 차원을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 사용된 트랩부의 차원을 나타낸 도면이다.
도 8은 각각 20, 60, 100 및 250 ㎕/분의 유속으로 시료 순환 용기내를 순환하는 시료의 시간에 따른 농축 효율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 각각 20, 60, 100 및 250 ㎕/분의 유속으로 시료 순환 용기내를 순환하는 시료의 세포의 유속/회전수에 따른 세포의 농축 효율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 세포 또는 바이러스의 농축 및 정제용 미세유동장치, 및 상기 장치를 이용하여 세포 또는 바이러스를 농축하거나 정제하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 병원균 검출 또는 분자 진단법 등과 같은 생물학적 분석 과정에 있어서, 검출의 감도를 높이기 위해 시료의 전처리가 필요하다.
시료 전처리로는 농축, 정제 등의 과정을 사용하여 분석에 방해가 되는 물질을 제거하고 분석이 용이하도록 시료의 농도를 높이는 과정을 포함하는 것이 일반적이다.
이러한 생물 입자의 전처리 과정중 농축, 정제를 수행하기 위하여 유전 영동력, 자기력, 광학적 힘 등을 사용하여 입자를 포획할 수 있다. 그러나, 종래 알려진 입자 포획 방법은 입자의 포획 효율이 낮았을 뿐만 아니라, 농축된 시료를 분석한 결과로부터 초기 시료에 대한 정량 분석을 예측하기 위해서는 초기 시료 전체의 부피를 계측하는 수단 또는 단계가 별도로 요구되어 자동화 적용이 어려운 단점이 있었다. 현재까지, 이러한 시료 전처리 과정에서 농축, 정제 효율을 극대화시키기 위한 노력이 계속되고 있다.
본 발명의 목적은 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료를 효율적으로 농축 또는 정제할 수 있는 미세유동장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미세유동장치를 이용하여 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료를 농축하거나 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 부피가 일정하게 유지되는 시료 순환 용기; 상기 용기에 연결된 펌프; 및 상기 용기에 위치한 트랩부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료를 시료 순환 용기에 주입하는 단계; b) 상기 용기에 연결된 펌프를 가동시켜 상기 시료를 상기 용기내에서 순환시키는 단계; c) 상기 용기 내 특정 위치에서 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획함으로써 시료를 농축 또는 정제하는 단계; 및 d) 상기 용기로부터 농축 또는 정제된 시료를 회수하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스를 농축 또는 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 장치 및 방법에 따르면 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료의 농축 또는 정제 효율을 향상시킬 수 있다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 세포 또는 바이러스의 농축 또는 용해용 미세유동장치에 관한 것이다.
도 1 및 2는 본 발명에 따른 미세유동장치의 작동 원리를 개략적으로 도시한 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 미세유동장치는 부피가 일정하게 유지되는 시료 순환 용기, 상기 용기에 연결된 펌프, 및 상기 용기내 위치한 트랩부를 포함 한다.
상기 시료 순환 용기는 부피가 일정하게 유지되는 것으로서, 용기내 유입된 시료의 전체 부피를 정확하게 예측할 수 있는 것이면 어느 것이나 가능하다. 초기에 용기에 유입된 시료 전체 부피를 아는 경우, 트랩부에 의해 포획된 시료 내 입자의 농축 효율로부터 초기 시료내의 분석 물질의 양을 계측할 수 있다. 만약 시료 순환 용기의 부피가 변화하는 것이라면, 초기 시료 부피를 측정하기 위한 정량 펌프 또는 정량을 위한 별도의 수단을 장착할 필요가 있을 것이다.
상기 시료 순환 용기는 초기에는 루프 구조가 아닌 직선 또는 곡선 형태를 형성하고 있다가, 시료가 용기 내에 채워지면 루프 구조를 형성할 수 있어야 한다. 이러한 시료 순환 용기의 예로는 튜브 등이 있으나, 이에 한정되는 것이 아니다. 시료 순환 용기로 튜브를 사용하면 시료 주입 및 처리된 시료의 배출이 용이하여 자동화 장치에 적용되기에 유리하며, 튜브의 내경 및 길이로부터 초기 시료의 부피를 결정할 수 있는 장점이 있다. 시료 순환 용기로 튜브를 사용하는 경우, 루프를 형성할 수 있도록 유연한 튜브를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유동장치중의 펌프로 사용할 수 있는 것의 예로는 페리스탈틱(peristaltic) 펌프 또는 멤브레인(membrane) 펌프 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펌프는, 상기 시료 순환 용기내에 유입된 시료가 용기를 순환할 수 있도록, 상기 용기내에 연결된다. 상기 펌프는 용기의 특정 영역에 직접 장착될 수도 있다.
본 발명에 따른 미세유동장치에 사용되는 펌프는 상기 순환 용기 내부의 시 료와 직접 접촉하지 않는 것을 사용해야 펌프가 오염되지 않으므로, 본 발명의 미세유동 장치에 있어서, 펌프는 페리스탈틱 펌프를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유동장치에 적용되는 트랩부는 시료 순환 용기상에 위치한다. 이러한 트랩부는 전기장을 발생할 수 있는 유전적으로 분리된 교차 전극부를 포함할 수도 있고, 또는 자기력을 발생시킬 수 있는 자석을 포함할 수도 있고, 또는 광학적 힘을 발생시킬 수 있는 광학 집게(optical tweezer)를 포함할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 시료 중의 세포 또는 바이러스를 포획할 수 있는 수단이라면 어느 것이라도 가능하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 트랩부는 유전영동에 의해 작동되는데, 이 경우에는 트랩부는 전기장을 발생시킬 수 있는 유전적으로 분리된 교차 전극부(dielectrically separated crossing electrode portion)를 포함한다. 상기 트랩부는 상부 기판 및 하부 기판을 포함할 수 있고, 상기 교차 전극부는 용기의 하부 기판에 구비될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 교차 전극부는 유체 흐름 방향에 대하여 수직 방향으로 2줄 이상의 금속 판으로 이루어진 금속 판의 열로 이루어지고, 상기 열은 2 이상의 금속 판으로 이루어진 금속 판의 배열의 형태로 배열되어 있고, 상기 금속 판의 홀수 열은 하나의 금속 패드에 금속 선을 통하여 연결되어 있고, 상기 금속 판의 짝수 열은 다름 금속 패드에 금속 선을 통하여 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 홀수 열의 금속 판은 이웃하는 상기 짝수 열의 금속 판과 서로 어긋나게 배열될 수 있다.
상기 금속 판, 금속 패드 및 금속 선은 임의의 금속으로 구성된 것일 수 있으나, 예를 들면 금 또는 백금으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 바람직하게는, 금과 같은 세포와 같은 생물체에 적합한 금속(biocompatiable metal)이다. 이러한 금속 판, 금속 패드 및 금속 선은 미세패터닝 방법으로 만들어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 홀수 열의 금속 판과 상기 짝수 열의 금속 판 사이의 간격은 10 내지 100 ㎛이다.
도 4a에서, 유체의 흐름 방향에 대하여 수직으로 배열되어 있는 금속 판 (20, 20')의 열이 배열되어 있고, 상기 각 열은 4개의 금속 판 (20, 20')으로 구성되어 있다. 또한, 홀수 열의 금속 판들 (20')은 금속 선 (12')을 통하여 하나의 금속 패드 (10')에 연결되어 있고, 짝수 열의 금속 판들 (20)은 금속 선 (12)을 통하여 또다른 하나의 금속 패드 (10)에 연결되어 있다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 트랩부는 상부 기판 (18)과 하부 기판 (16)으로 구성되어 있고, 상기 금속 판 (20)은 용기의 하부 기판에 배열되어 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 트랩부는 자기력에 의해 작동되는데, 이 경우 트랩부는 자석을 포함한다. 이 경우, 수 마이크로미터 내지 나노미터 크기의 자성입자가 사용되는데, 이러한 자성입자는 표면이 항체 또는 핵산으로 코팅되어 있어 시료 내의 생체입자(예를 들어, 세포 또는 바이러스)와 선택적으로 결합하고 이를 강력한 자석으로 모을 수 있다. 세포 또는 바이러스의 포획에 사용되는 자성입자는 배치(batch) 형태로 시료의 농축, 정제에 활용되고 있다. 구체적으로, 트 랩부가 작동되지 않은 상태에서 시료와 자성입자를 혼합한 용액을 시료 순환 용기에 채우고 자기력을 가하면서 용액을 순환시켜 시료 용액 내의 세포 또는 바이러스를 포획할 수 있다. 이 때 트랩부에 가해지는 자기력을 조절하는 수단으로는, (i) 영구자석과 트랩부와의 거리를 조절하는 방법과 (ii) 전자석을 사용하여 전류의 세기로 조절하는 방법 등이 있다.
또한, 시료 순환 용기 내에 자성입자를 미리 넣어놓고 자기력을 가한 상태에서 시료 용액을 시료 순환 용기 내에 채우고 그런 다음 자기력을 제거한 상태에서 시료 용액을 순환시켜 자성입자와 시료용액이 혼합되도록 한 뒤 다시 자기력을 가한 상태에서 시료용액을 순환시켜 시료 용액 내의 생체입자를 포획하는 방법도 가능한데 이를 위해서는 시료순환용기 일부에 용액의 혼합을 돕는 믹서(mixer) 구조가 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 트랩부는 광학적 힘(optical force)에 의해 작동되는데, 이 경우 트랩부는 광학 집게를 포함한다. 광학 집게를 사용하는 방법에서 광학적 힘은 입사하는 광자로부터 입자로의 모멘텀 전이 및 시료중의 상기 입자 내부에서 발생하는 경사힘(gradient force)에 의해 생성되며, 이러한 두 효과의 평형에 의해 입자가 포획될 수 있다. 일반적인 광학 집게 방법은 포획되는 영역이 너무 적어서 다수의 입자를 포획하기 어려운 단점이 존재하지만, 광학 집게를 스캔하는 방법 또는 홀로그램을 이용하여 다수의 광학집게를 공간상에 생성하는 방법 등과 같이 다수의 생체입자를 포획할 수 기술이 개발되고 있다.
본 발명은 다른 측면은, 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료를 정제 또는 농축하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 a) 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료를 시료 순환 용기에 주입하는 단계; b) 상기 용기에 연결된 펌프를 가동시켜 상기 시료를 상기 용기내에서 순환시키는 단계; c) 상기 용기 내 특정 위치에서 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획함으로써 시료를 농축 또는 정제하는 단계; 및 d) 상기 용기로부터 농축 또는 정제된 시료를 회수하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 먼저 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료를 시료 순환 용기에 주입한다.
그런 다음 시료가 용기내를 완전히 채우면 상기 용기의 양 말단을 연결하여 루프 구조를 형성한 후, 상기 용기에 연결된 펌프를 가동시켜 시료가 상기 용기내에서 순환되도록 한다.
시료를 상기 용기 내에서 순환시키면서, 용기의 특정 위치에서 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획함으로써 시료를 농축 또는 정제하는데, 이때 세포 또는 바이러스를 포획하기 위한 수단으로는 유전적으로 분리된 전극부에 의해 불균일한 전기장을 발생에 의해, 또는 자석에 의한 자기력에 의해, 또는 광학 집게에 의한 광학적 힘에 의한 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료를 정제 또는 농축하는 단계는 시료 순환 용기 내 위치하는 교차 전극부에 전압을 인가하여 상기 챔버 내에 공간적으로 불균질한 전기장을 발생함으로써, 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획함으로써 수행된다. 이때 상기 인가되는 전압은 직류일 수도 있고, 교류일 수도 있으며, 직류 전압인 경우 1 내지 100V의 크기가 바람직하며, 교류전압인 경우 1 내지 100V의 크 기 및 100Hz 내지 100MHz의 주파수를 가지는 것이 바람직하다. 상기와 같이, 시료 순환 용기 내에 공간적으로 불균질한 전기장을 발생시키면 시료중에 세포 또는 바이러스는 유전영동에 의해 상기 전극부에 포획되어 결과적으로 농축된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 시료를 정제 또는 농축하는 단계는 상기 시료 순환 용기 내 특정 위치에 존재하는 자석에 의해 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획함으로써 수행된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 시료를 정제 또는 농축하는 단계는 상기 시료 순환 용기 내 특정 위치에 존재하는 광학 집게 수단으로부터 조사되는 레이저 빔에 의해 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획함으로써 수행된다.
시료 순환 용기내에서 시료를 충분히 순환시키면 시료가 용기에 위치한 트랩부를 여러번 통과되여 원하는 농축 효율을 달성하게 되고, 그런 다음 상기 용기로부터 농축 또는 정제된 시료를 회수함으로써, 시료내에 포함되어 있는 세포 또는 바이러스를 농축 또는 정제할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료는 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 시료는 동물세포, 식물세포, 박테리아, 바이러스, 파아지 등을 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 시료 순환 용기가 튜브인 것이 바람직하다. 시료 순환 용기가 튜브인 경우 유연한 것으로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 상기 펌프는 페리스탈틱 펌프 또는 멤브레인 펌프 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 페리스탈틱 펌프이다.
본 발명에 따른 방법을 수행하면, 우수한 세포 농축 또는 정제 효율을 달성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 본 발명에 따른 장치의 제조
튜브: 타이곤 튜브(타이곤(등록상표) STR-3603/R-3607(SC0002), Ismatec SA사; 내경 0.25mm, 길이 33mm, 튜브 내 용액 부피: 16㎕);
펌프: 페리스탈릭 펌프(ISM596A, Ismatec SA사, 스위스);
트랩부는 하기와 같이 제작되었다.
도 3a 및 3b는 실시예에 사용된 트랩부의 분해도 및 사시도를 나타내는 도면이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 상부 기판 (18)과 평면 금판의 어레이가 형성되어 있는 하부 기판 (16)을 3M 흡착 테이프 (22)(3M 사, 미국)를 매개하여 접착시킴으로써, 본 발명의 트랩부를 제작하였다. 상기 상부 기판 및 하부 기판을 유리로 제작된 것이다.
도 3b는 제작된 트랩부를 나타내는 것으로, 전원이 금속 패드를 통하여 연결되어 있고, 또한 트랩부 하부에 CCD 카메라(Quantix 57, Roper scientific)가 장착된 도립 형광 현미경(inverted fluorescence microscope, Nikon TE300)을 장착하였다.
도 4a 및 4b는 도 3a 및 3b에 나타낸 트랩부의 전극 구조를 나타내는 도면이다. 도 4a는 평면도로서, 각각 4개의 금 판 전극으로 구성된 4개의 금 판의 열이 각각 금 선을 통하여 금 패드에 연결되어 있다. 여기서, 홀수 열의 금 판은 하나의 금 패드에 연결되어 있고, 짝수 열의 금 기둥은 다른 금 패드에 연결되어 있다. 도 5b는 측면도로서, 금 판이 하부 기판에 형성되어 있는 것을 나타낸다.
도 5 및 6은 본 발명의 실시예에 사용된 전극부의 차원을 나타낸 도면이다. 도 5를 참조하면, 금 판을 금속 패드에 연결하는 금속 선의 폭은 5㎛이고, 동일한 금 판의 열 내의 금 판과 금 판 사이의 거리는 P (pitch)로, 금속 선으로부터 금 판의 폭은 W (width)로, 금 판의 열과 열 사이의 금 기둥의 거리는 D로 나타내었다. 화살표는 유체의 흐름 방향을 나타낸다. 본 실시예에서 제조된 전극부의 차원은, (W, P, D):(15, 15, 15)이었다(도 6 참조).
도 7은 본 발명의 실시예에 사용된 트랩부의 차원을 나타낸 도면이다. 도 7을 참조하면, 실시예에서 사용된 트랩부는 가로 10mm 및 세로 3mm이었다. 트랩부 챔버의 부피는 약 4㎕이었다.
상기 튜브를 페리스탈틱 펌프에 장착하고, 튜브의 한쪽 말단을 상기에서 제작된 트랩부의 입구 포트에 연결하였다. 그런 다음 페리스탈틱 펌프를 작동시키고 트랩부의 출구 포트에 세포 용액을 제공하여 튜브 및 트랩부가 세포 용액으로 거품없이 완전히 채워지면 튜브의 다른 말단을 트랩브의 출구 포트에 연결하여 폐쇄된 루프 구조를 만들었다.
실시예 2: 대장균을 포함하는 시료의 농축
본 실시예에서는 그람 음성 박테이라인 대장균(E. Coli)(ATCC #11775)을 37℃에서 BHI (brain heart infusion) 브로쓰(BD, 미국)에서 밤새도록 배양하였다. 그런 다음, 4℃, 5,000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 0.1mM 소듐 포스페이트 완충용액으로 3회 세척하였다. 전도도(conductivity)는 증류수로 희석하여 0.2mS/m으로 조정하였다.
그런 다음, 가시화를 위해 상기 대장균을 세포염색액(Live/Dead BacLight Bacterial viability kit, Molecular probes사, 미국)으로 표지하였는바, 제품의 매뉴얼에 따라, 3㎕의 SYPO 9와 프로피듐 아오다이드 염료 혼합물을 상기 세포 용액 (OD600 = 1) 1ml에 첨가하였다. 상기와 같은 방법으로 표지된 소듐 포스페이트 완충용액 중의 대장균 107 세포/ml를 제조하였다.
먼저, 튜브를 페리스탈틱 펌프에 장착하고, 튜브의 한쪽 말단을 상기 실시예 1에서 제조된 트랩부의 입구 포트에 연결하였다. 그런 다음 상기 소듐 포스페이트 완충용액 중의 대장균 107 세포/ml을 트랩부의 출구 포트에 제공하고, 트랩의 출구 포트까지 세포 용액 용액으로 거품없이 완전히 채워지면 튜브의 출구 포트를 튜브의 다른 말단에 연결하여 폐쇄된 루프 구조를 만들었다.
그런 다음, 페리스탈틱 펌프를 이용하여 시료가 튜브내를 20㎕/분의 유속으로 순환하도록 하였으며, 전원을 켜서 트랩부에 전기장(20V p-p, 100kHz) 1분 동안 공급하면서 CCD 카메라가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여 트랩부에 포획된 대장균의 형광 강도 이미지를 측정하였다. 측정된 이미지는 메타모르프(Universal Imagign Corp.)로 분석하였다.
한편, 세포 용액이 튜브내를 순환하는 유속을 각각 60 ㎕/분, 100 ㎕/분 및 250 ㎕/분으로 하여 상기와 동일한 방법을 수행하여 형광 강도 이미지를 분석하였는 바, 그 결과는 하기 표 1, 도 8 및 9와 같다.
회전수
(유속)		 1회전/분
(20㎕/분)		 3회전/분
(60㎕/분)		 5회전/분
(100㎕/분)		 12.5회전/분
(250㎕/분)
1회전 1.35E+06 (AU) 8.77E+05 (AU) 8.47E+05 (AU) 8.10E+05 (AU)
2회전 1.40E+06 (AU) 1.37E+06 (AU) 1.29E+06 (AU)
3회전 1.68E+06 (AU) 1.74E+06 (AU) 1.63E+06 (AU)
4회전 2.03E+06 (AU) 1.92E+06 (AU)
5회전 2.18E+06 (AU) 2.12E+06 (AU)
6회전 2.29E+06 (AU)
7회전 2.42E+06 (AU)
8회전 2.53E+06 (AU)
9회전 2.60E+06 (AU)
10회전 2.67E+06 (AU)
11회전 2.71E+06 (AU)
12회전 2.75E+06 (AU)
상기 표 1을 살펴보면, 유속이 빠를수록 1 회전당 포획 강도는 줄어들지만, 그 유속이 빠를수록 동일한 시간 이내에 포획 강도는 증가하였다. 구체적으로 살펴보면, 20 ㎕/분(1회전/분)의 유속인 경우와 250㎕/분(12.5회전/분)의 유속인 경우를 비교해 보면, 각각 1회전(1분 소요) 및 12회전(1분당 12.5회전하므로, 12회전은 57.6초 소요)한 후 형광 강도는 각각 1.35E+06 (AU) 및 2.75E+06 (AU)으로 250㎕/분의 유속인 경우가 더 짧은 시간에 20 ㎕/분의 유속인 경우에 비하여 약 2배 정도 높은 포획 정도를 나타내었다.
상기 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 장치는 시료가 계속 순환할 수 있으므로 시료를 빠른 속도로 용기내를 순환하면서 트랩부를 여러번 통과할 수 있어 농축 효율이 향상되었으며, 나아가 사용된 시료 순환 용기는 그 부피가 항상 일정하여 초기 시료의 부피를 별도로 측정하지 않아도 알 수 있으므로, 상기 측정된 농축 효율로부터 초기 시료내의 분석물질의 양을 용이하게 계측할 수 있다.
본 발명을 따르는 미세유동장치는 시료의 부피를 일정하게 유지하는 시료 순환 용기의 사용으로 인하여 시료가 트랩부를 여러번 통과할 수 있어 포획 효율이 향상되며, 나아가 상기 용기는 부피가 일정하게 유지되므로 별도의 측정수단 없이도 초기 시료의 부피를 알 수 있어 초기 시료내의 분석 물질의 양을 용이하게 계측할 수 있다.

Claims (20)

  1. 부피가 일정하게 유지되는 유연한 튜브인 시료 순환 용기;
    상기 용기에 연결된 펌프; 및
    상기 용기에 위치하며, 유전 영동력, 자기력 또는 광학적 힘에 의하여 시료 중의 세포 또는 바이러스를 포획하는 트랩부를 포함하되,
    상기 펌프는 상기 시료가 상기 트랩부를 복수 회 통과하도록 상기 시료를 상기 용기 내에서 순환시키며,
    상기 시료가 상기 트랩부를 통과할 때마다 포획된 세포 또는 바이러스의 양이 증가하는 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트랩부는 전기장을 발생할 수 있는 유전적으로 분리된 교차 전극부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 트랩부는 상부 기판 및 하부 기판을 포함하고 있고, 상기 교차 전극부는 하부 기판에 구비된 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  4. 제2항에 있어서, 상기 교차 전극부는 유체 흐름 방향에 대하여 수직 방향으로 2줄 이상의 금속 판으로 이루어진 금속 판의 열로 이루어지고, 상기 열은 2 이상의 금속 판으로 이루어진 금속 판의 배열의 형태로 배열되어 있고, 상기 금속 판의 홀수 열은 하나의 금속 패드에 금속 선을 통하여 연결되어 있고, 상기 금속 판의 짝수 열은 다른 금속 패드에 금속 선을 통하여 연결되어 있어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 홀수 열의 금속 판은 이웃하는 상기 짝수 열의 금속 판과 서로 어긋나게 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 홀수 열의 금속 판과 상기 짝수 열의 금속 판 사이의 간격은 10 내지 100 ㎛인 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 트랩부는 자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 트랩부는 광학 집게를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 펌프는 페리스탈틱 펌프 또는 멤브레인 펌프인 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 펌프는 페리스탈틱 펌프인 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
  13. a) 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료를 유연한 튜브인 시료 순환 용기에 주입하는 단계;
    b) 상기 용기에 연결된 펌프를 가동시켜 상기 시료가 상기 용기 내 특정 위치를 복수 회 통과하도록 상기 시료를 상기 용기내에서 순환시키는 단계;
    c) 상기 용기 내 특정 위치에서 유전 영동력, 자기력 또는 광학적 힘을 사용하여 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획함으로써 시료를 농축 또는 정제하는 단계; 및
    d) 상기 용기로부터 농축 또는 정제된 시료를 회수하는 단계를 포함하되,
    상기 시료가 상기 특정 위치를 통과할 때마다 포획된 세포 또는 바이러스의 양이 증가하는 세포 또는 바이러스를 농축 또는 정제하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단계 c)는 상기 용기 내 특정 위치에 존재하는 교차 전극부에 전압을 인가하여 상기 용기 내에 공간적으로 불균질한 전기장을 발생하여 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 단계 c)는 상기 시료 순환 용기 내 특정 위치에 존재하는 자석에 의해 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 단계 c)는 상기 시료 순환 용기 내 특정 위치에 존재 하는 광학 집게 장치로부터 조사되는 레이저 빔에 의해 시료중의 세포 또는 바이러스를 포획하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제13항에 있어서, 상기 펌프는 페리스탈틱 펌프 또는 멤브레인 펌프인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 펌프는 페리스탈틱 펌프인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020050126262A 2005-12-20 2005-12-20 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및방법 Active KR101157176B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050126262A KR101157176B1 (ko) 2005-12-20 2005-12-20 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및방법
US11/555,763 US20070141561A1 (en) 2005-12-20 2006-11-02 Microfluidic device and method for concentration or purification of sample containing cells or viruses

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050126262A KR101157176B1 (ko) 2005-12-20 2005-12-20 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070065629A KR20070065629A (ko) 2007-06-25
KR101157176B1 true KR101157176B1 (ko) 2012-06-20

Family

ID=38174052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050126262A Active KR101157176B1 (ko) 2005-12-20 2005-12-20 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20070141561A1 (ko)
KR (1) KR101157176B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101741104B1 (ko) 2015-09-01 2017-05-30 한국과학기술연구원 대용량 수인성 병원체 현장 포집 및 농축시스템

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8308926B2 (en) 2007-08-20 2012-11-13 Purdue Research Foundation Microfluidic pumping based on dielectrophoresis
US20100297747A1 (en) * 2007-10-25 2010-11-25 Manalis Scott R System and method for monitoring cell growth
WO2011130119A2 (en) 2010-04-14 2011-10-20 Millipore Corporation Methods of producing high titer, high purity virus stocks and methods of use thereof
CN117721078A (zh) * 2018-05-13 2024-03-19 Gpb科学有限公司 通过确定性侧向位移与产物再循环的组合的纯化和浓缩
KR102476310B1 (ko) * 2020-10-13 2022-12-08 가천대학교 산학협력단 미세유체 전기용해법을 이용한 세포 외 바이러스 추출 방법 및 미세유체 전기용해 장치
CN117417814B (zh) * 2023-12-18 2024-04-12 中国海洋大学 全自动病毒提取系统以及提取方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020150886A1 (en) * 2000-12-14 2002-10-17 The Regents Of The University Of California Method for detecting pathogens attached to specific antibodies
US20040011650A1 (en) * 2002-07-22 2004-01-22 Frederic Zenhausern Method and apparatus for manipulating polarizable analytes via dielectrophoresis
US6850363B1 (en) * 1999-11-10 2005-02-01 Carl Zeiss Jena Gmbh System for introducing optical tweezers and/or a treatment beam into a laser scanning microscope
US20050064585A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-24 William Wolf Viral concentration process

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5100627A (en) * 1989-11-30 1992-03-31 The Regents Of The University Of California Chamber for the optical manipulation of microscopic particles
US6083763A (en) * 1996-12-31 2000-07-04 Genometrix Inc. Multiplexed molecular analysis apparatus and method
EP1384022A4 (en) * 2001-04-06 2004-08-04 California Inst Of Techn NUCLEIC ACID AMPLIFICATION USING MICROFLUID DEVICES
US7470533B2 (en) * 2002-12-20 2008-12-30 Acea Biosciences Impedance based devices and methods for use in assays
US20050214737A1 (en) * 2004-03-26 2005-09-29 Dejneka Matthew J Transparent filtered capillaries

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6850363B1 (en) * 1999-11-10 2005-02-01 Carl Zeiss Jena Gmbh System for introducing optical tweezers and/or a treatment beam into a laser scanning microscope
US20020150886A1 (en) * 2000-12-14 2002-10-17 The Regents Of The University Of California Method for detecting pathogens attached to specific antibodies
US20040011650A1 (en) * 2002-07-22 2004-01-22 Frederic Zenhausern Method and apparatus for manipulating polarizable analytes via dielectrophoresis
US20050064585A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-24 William Wolf Viral concentration process

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101741104B1 (ko) 2015-09-01 2017-05-30 한국과학기술연구원 대용량 수인성 병원체 현장 포집 및 농축시스템

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070065629A (ko) 2007-06-25
US20070141561A1 (en) 2007-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022201238B2 (en) Flow cells utilizing surface-attached structures, and related systems and methods
JP6465878B2 (ja) 生体アクティビティをアッセイするための微少流体デバイス
JP3467995B2 (ja) キャピラリー電気泳動装置
Krishnan et al. Alternating current electrokinetic separation and detection of DNA nanoparticles in high‐conductance solutions
US8778157B2 (en) Detecting analytes
JP3825501B2 (ja) 微小物質保持担体、その懸濁系、微小物質操作装置及び微小物質位置制御方法
US7163611B2 (en) Concentration and focusing of bio-agents and micron-sized particles using traveling wave grids
JPH08508205A (ja) ダイエレクトロホリティクによる分離装置
US20070141561A1 (en) Microfluidic device and method for concentration or purification of sample containing cells or viruses
JP2012005381A (ja) 捕集機構、検出装置、捕集方法および検出方法
JP2023528342A (ja) 誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別チップ、装置、及び方法
CN105026923A (zh) 电泳方法以及电泳装置
US11891594B2 (en) Methods and apparatus for separating live from dead organisms in a sample
JP4840398B2 (ja) 抗原の分離装置並びにこれを利用した抗原の計測方法及び装置
JP7705922B2 (ja) ウィルス性粒子測定方法及びウィルス性粒子測定装置
JP2013221780A (ja) 検体処理装置
JP2009156604A (ja) 微粒子測定前処理キット
CN103308587A (zh) 空芯光纤电泳凝胶成像系统
WO2021097205A1 (en) Methods and apparatus for detection of bacteria in a sample using dielectrophoresis
JP3935947B6 (ja) 化学的、物理的または物理化学的反応を行うための電極アレイを有する装置
TW201217781A (en) Microfluidic system for detecting a biological entity in a sample
CN119372053A (zh) 非接触式生物微粒处理设备
JP3935947B2 (ja) 化学的、物理的または物理化学的反応を行うための電極アレイを有する装置
JP2021019513A (ja) 標的粒子の解析方法
JP2008096157A (ja) 微粒子検出装置

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20051220

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20100115

Comment text: Request for Examination of Application

Patent event code: PA02011R01I

Patent event date: 20051220

Comment text: Patent Application

PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20110823

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20120327

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20120611

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20120612

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150522

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20150522

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160518

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20160518

Start annual number: 5

End annual number: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170522

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20170522

Start annual number: 6

End annual number: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee