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KR101142834B1 - 글라브리딘을 안정화 시키는 방법 - Google Patents

글라브리딘을 안정화 시키는 방법 Download PDF

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KR101142834B1
KR101142834B1 KR1020100053752A KR20100053752A KR101142834B1 KR 101142834 B1 KR101142834 B1 KR 101142834B1 KR 1020100053752 A KR1020100053752 A KR 1020100053752A KR 20100053752 A KR20100053752 A KR 20100053752A KR 101142834 B1 KR101142834 B1 KR 101142834B1
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chitosan
glabridine
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중앙대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 환경적 요인으로부터 쉽게 불안정해지는 글라브리딘을 키토산과 이온결합을 시킴으로써, 글라브리딘의 산화적 분해를 방지하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로 글라브리딘의 작용기인 수산기를 키토산의 아민기와 이온결합시킴으로써 나노입자를 합성하여 글라브리딘의 산화적 분해를 방지하는 것이다.
본 발명에 의하면 글라브리딘 분자 내에 존재하는 레조시놀 (resorcinol)이 산화되어 라디칼 (radical)이 되고 글라브리딘이 산화적 분해가 되는 것을 방지하여 화장품의 미백자료로 쉽게 변질, 변색되는 것을 방지할 수 있다.

Description

글라브리딘을 안정화 시키는 방법 {Stabilizing Method for glabridin}
본 발명은 글라브리딘 (glabridin)을 안정화 시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 글라브리딘 (glabridin)을 키토산과 이온결합시킴으로써 나노입자를 합성하여 글라브리딘의 산화적 분해를 방지하는 기술에 관한 것이다.
감초 (Glycyrrhiza uralensis Fisch, Glycyrrhiza glabra L.)는 콩과 ( Leguminosae )에 속하는 다년생 초본 식물로서, 그 뿌리와 줄기는 약용 및 식용으로 사용된다. 특히 감초는 약용 식물로서 한방 및 민간에서 해독제, 진해거담제, 완화제, 소화성 궤양 치료제 및 위궤양 치료제로 사용되며, 그 외에도 근육이나 조직의 급격한 긴장에 의하여 생기는 통증을 풀어주는 작용, 체중의 증가, 백혈구의 증가, 이뇨 작용, 항염 작용의 약효가 있다. 따라서 이러한 약효를 이용하기 위하여 감초는 한약제로서 그대로 이용하거나 감초 추출물을 제조하여 식품, 담배, 화장품에 이용하고자 하는 시도가 계속되고 있다.
감초 추출물은 글리시리진 (Glycyrrhizin), 글리시레틱 산 (Glycyrrhetic acid), 리코리시딘 (Licoricidin), 히스파글라브리딘 A (Hispaglabridin A), 히스파글라브리딘 B (Hispaglabridin B), 글라브리딘 (Glabridin), 4-O-메틸글라브리딘
(4-O-methylglabridin), 이소프레닐챨콘 유도체 (Isoprenylchalcone derivative), 이소리퀴리티제닌 (Isoliquiritigenin), 포르모노네틴 (Formononetin) 등을 포함하고 있다. 감초 추출물 중 글리시리진은 항염 작용, 해독작용, 항궤양 작용, 수전해질 호르몬 작용이 있어 종래 글리시진만을 추출 정제하기 위한 방법들이 공지되어 있다. 감초로부터 글리시리진을 추출하는 방법은 감초근을 물 또는 알칼리성 수용액으로 추출할 때 규산 소오다, 황산 알루미늄을 순차적으로 첨가하여 pH를 4.5 ~ 6.5로 조절하여 정치시킴으로써 불순물을 침전시키고 여과 분리하는 방법, 감초 추출물을 메탄올 추출 공정, 음이온 교환 수지 탈색 공정, 에탄올 재결정 공정을 조합 또는 순차적으로 실시하는 방법 등이 공지되어 있다. 이와 같이 감초로부터 글리시리진을 추출하는 방법은 다양한 방법이 공지되어 있으며, 이로부터 추출된 글리시리진은 순도가 높다.
상기 감초 추출물 중 주 성분인 글라브리딘은 체내에서 인체에 해로운 저 밀도 인지질 (Low Density Lipoprotein)의 산화를 억제시키는 효과가 있다고 알려져 있다(Belinky, P., A., Aviram, M., Fuhrman, B., Rosenblat, M., and Vaya, J., 'The antioxidative effects of the isoflavan glabridin on endogenous constituents of LDL during its oxidation', Atherosclerosis , Vol. 137, 49, (1998)). 저 밀도 인지질은 콜레스테롤을 몸 전체로 전달시키는 역할을 하는 것으로 체내에서 저 밀도 인지질이 과량으로 존재할 경우 산화가 일어나며, 이로 인해 동맥 경화, 당뇨병, 성인병의 원인이 될 수 있다. 또한, 글라브리딘은 피부에 중요한 영향을 끼치는 소수성 물질의 하나로서, 피부 미백에 탁월한 효과를 지니고 있어, 이를 원료로 하여 미백 효과가 있는 기능성 화장품을 제조하는 예가 증가되고 있다(대한민국 공개 특허 1993-21190호).
그러나 유용성 감초 추출물 내에 글라블리딘 (Glablidin) 성분은 빛, 열 그리고 산소 등의 환경요인으로부터 산화적 분해가 일어나 화장품의 미백재료로 쉽게 변질, 변색이 일어나는 문제가 있다.
이에 본 발명자는 글라브딘이 환경적 요인으로부터 산화적 분해를 막아 화장품의 미백재료로 쉽게 변질, 변색되는 것을 방지하고자 생분해성이 있는 키토산과 이온결합시킴으로써 나노입자를 만드는 방법을 고안하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 환경적 요인으로부터 쉽게 불안정해지는 글라브리딘을 키토산과 이온결합을 시킴으로써, 글라브리딘의 산화적 분해를 방지하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로 글라브리딘의 작용기인 수산기를 키토산의 아민기와 이온결합시킴으로써 나노입자를 합성하여 글라브리딘의 산화적 분해를 방지하는 것을 목적으로 하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 키토산을 산 (acid)에 용해시키는 단계;
(b) 글라브리딘을 용매에 용해시키는 단계;
(c) 상기 (a) 및 (b) 용액을 혼합하는 단계;
를 포함하는 글라브리딘을 안정화시키는 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 산은 아세트산, 젖산, 포름산, 염산 또는 질산인 것이 바람직하다.
상기 (b) 단계의 용매는 알콜, 에틸 아세테이트 또는 아세톤인 것이 바람직하다.
상기 (c) 단계의 혼합은 (a) 용액 대 (b) 용액의 비율이 5:5 내지 8:2인 것이 바람직하다.
상기 (a) 단계의 키토산은 N-아실화 된 키토산인 것을 포함할 수 있다.
N-아실화 된 키토산은 N-프로피오닐 키토산 (N-propionyl Chitosan), N-부티릴 키토산 (N-butyryl Chitosan) 또는 N-헥사노일 키토산 (N-hexanoyl Chitosan)인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 합성된 키토산-글라브리딘 복합체 또는 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체를 제공한다.
상기 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체는 N-프로피오닉 키토산 (N-propionic chitosan)-글라브리딘 복합체, N-부타노익 키토산 (N-butanoic chitosan)-글라브리딘 복합체 또는 N-헥사노익 키토산 (N-hexanoic chitosan)-글라브리딘 복합체인 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 글라브리딘 분자 내에 존재하는 레조시놀 (resorcinol)이 산화되어 라디칼 (radical)이 되고 글라브리딘이 산화적 분해가 되는 것을 방지하여 화장품의 미백재료로 쉽게 변질, 변색되는 것을 방지할 수 있다.
도 1은 글라브리딘의 화학구조식이다. 구형으로 나타낸 부분은 레조시놀의 화학구조식을 나타낸다.
도 2는 키토산의 화학구조식이다.
도 3은 키토산과 N-아실화 된 키토산의 화학구조식이다.
도 4는 글라브리딘과 키토산이 이온결합 한 화학구조식이다.
도 5는 글라브리딘과 아실화된 키토산이 이온결합 한 화학구조식이다.
도 6는 키토산 샘플의 FT-IR 스펙트럼이다. (a) 키토산 (b) N-프로피오닐 키토산 (N-propionyl chitosan) (c) N-부티릴 키토산 (N-butyryl chitosan) (d) N-헥사노일 키토산 (N-hexanoyl chitosan)이다. 키토산에 아실기가 붙었는지 FT-IR을 통해서 확인한 것이다.
도 7은 2wt% CD3COOD/D2O 용매안의 키토산 샘플의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 8은 키토산 (chitosan), 글라브리딘 (glabridin), 키토산-글라브리딘 복합체 (chitosan-glabridin complex) 및 N-아실화된 키토산 (N-acylated chitosan)의 FT-IR 스펙트럼이다. 위부터 (a) 키토산; (b) N-아실화된 키토산; (c) 글라브리딘; (d) 키토산-글라브리딘 복합체; (e) N-프로피오닐 키토산-글라브리딘 복합체 (N-propionyl Chitosan-Glabridin complex);(f) N-부티릴 키토산-글라브리딘 복합체 (N-butyryl Chitosan-Glabridin complex);(g) N-헥사노일 키토산-글라브리딘 복합체 (N-hexanoyl Chitosan-Glabridin complex)이다.
도 9는 키토산-글라브리딘 복합체 나노입자의 TEM 이미지이다.(A) 및 (C) 는 키토산 용액 대 글라브리딘 용액의 비가 5:5이고,(B) 및 (D)는 키토산 용액 대 글라브리딘 용액의 비가 8:2이다. A 와 B는 10K배, C 와 D는 150K배 확대한 것이다.
도 10은 키토산-글라브리딘 복합체 나노입자의 입자의 크기 분포 (particle size distribution)이다.
도 11은 키토산-글라브리딘 복합체 나노입자의 입자의 크기 분포 (particle size distribution)이다.
도 12는 각각의 샘플과 적절한 대조군으로부터의 메탄올 추출의 UV스펙트럼이다.
도 13은 Encapsulation 효율을 나타낸 것이다. 이는 키토산 및 N-아실화된 키토산과의 복합체를 이룰 때 몇%가 붙는지 알기 위해 측정하였다.
도 14는 Loading Capacity을 나타낸 것이다. 이는 키토산-글라브리딘 복합체에서 키토산 g당 글라브리딘이 몇 g이 붙었는지 알기 위함이다.
도 15는 자외선 방사능 샘플은 HPLC에 의해 정량적으로 나타낸 것이다. 이는 UV조사에 따른 글라브리딘의 안정성에 관해 알기 위함이다.
도 16는 G: 글라브리딘, C: 키토산-글라브리딘 복합체, P: N-프로피오닐 키토산-글라브리딘 복합체, B: N-부티릴 키토산-글라브리딘 복합체, H: N-헥사노일 키토산-글라브리딘 복합체의 열적 안정성을 나타낸 것이다. 온도 조건(냉장, 25도, 40도)에 따른 열적 안정성이다.
도 17은 빛의 노출(●), 냉각(○), 25℃(▼) 및 40℃(△): L *(흰색100, 검정색0),a *(+red,-green), 및 b *(+yellow,-blue)에 따른 색의 변화를 나타낸다. (G: 글라브리딘 용액, N: 키토산이 부재 시, C-H: 복합체 용액)
도 18은 1. 글라브리딘의 부재 시, 2. 키토산의 부재시, 3. 키토산-글라브리딘 복합체 용액, 4. N-프로피오닐 키토산-글라브리딘 복합체 용액, 5. N-부티릴 키토산-글라브리딘 복합체 용액, 6. N-헥사노일 키토산-글라브리딘 복합체 용액의 1개월 후의 경시변화를 나타낸 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 활성성분인 글라브리딘을 키토산과 이온결합시킴으로써 나노입자를 합성하여 글라브리딘의 산화적 분해를 방지하는 기술을 제공한다. 이하 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일실시예에서 글라브리딘과 이온결합을 하는 키토산은 새우, 게 등 갑각류의 외피와 곤충류의 표피, 균류의 세포벽에 분포되어 있으며, 지구상에서 셀룰로오스 다음으로 가장 풍부한 천연 고분자 물질로 N-아세틸글루코사민 (n-acetyl glucosamine)잔기가 직쇄상으로 2,000-3,000 잔기 이상이 β-1,4 결합한 화합물이다. 또한, 키토산은 음전하를 띄는 기존의 대부분의 식물섬유 (식이섬유)와 달리 용해상태에서 양전하를 띄는 지구상 유일한 천연 동물성 식이섬유란 특이한 구조를 가지고 있다. 이와 같은 특이구조의 천연성분 때문에 생체에 대한 적합성이 뛰어나고 고분자 응집제, 화장품 첨가제, 콜레스테롤 저하작용, 식품첨가제, 의료용 봉합사, 항암제, 상처치유제 등 다양한 용도로 실용화되고 있는 활성이 강한 천연재료다.
본 발명의 일실시예에서는 키토산 (도 2참조)의 2번 탄소에 붙어있는 아민기가 반응을 하게 되며, 키토산은 음이온 분자로 작용을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 아실화 된 키토산을 글라브리딘과 이온결합을 시킬 수 있다. 아실화 된 키토산은 키토산을 카르복실산 (carboxyl acid) 유도체나 산무수물과 반응을 시켜서 아실반응을 일으킬 수 있다. 카르복실산의 체인 길이가 증가함에 따라 소수성이 증가 하게 되고, 글라브리딘의 안정화에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 활성성분인 글라브리딘 (도 1참조)은 체내에서 인체에 해로운 저 밀도 인지질 (Low Density Lipoprotein)의 산화를 억제시키는 효과가 있다고 알려져 있다 (Belinky, P., A., Aviram, M., Fuhrman, B., Rosenblat, M., and Vaya, J., 'The antioxidative effects of the isoflavan glabridin on endogenous constituents of LDL during its oxidation', Atherosclerosis , Vol. 137, 49, (1998)). 또한, 글라브리딘은 피부에 중요한 영향을 끼치는 소수성 물질의 하나로서, 피부 미백에 탁월한 효과를 지니고 있어, 이를 원료로 하여 미백 효과가 있는 기능성 화장품을 제조할 수 있다.
그러나 글라브리딘은 환경적인 요소에 의해 쉽게 산화되어 분해가 되면 갈변현상과 냄새가 변하게 된다. 이는 글라브리딘이 폴리페놀의 일종으로 분자 내에 있는 레조시놀 (resorcinol)이 환경적 요인에 의해 산화되게 되면 퀴논을 형성하여 라디칼을 만들어 글라브리딘을 분해시키기 때문이다.
따라서, 본 발명의 일실시예에서는 글라브리딘의 분자 내의 활성을 가지고 있는 레조시놀의 두 개의 수산기 (도 1참조)를 키토산의 아민기와 이온결합을 통해서 글라브리딘의 레조시놀이 산화되는 것을 방지하여 글라브리딘을 안정화시키는 것으로 글라브리딘은 양이온 분자로 작용을 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는
(a) 키토산을 산 (acid)에 용해시키는 단계;
(b) 글라브리딘을 용매에 용해시키는 단계;
(c) 상기 (a) 및 (b) 용액을 혼합하는 단계;
를 포함하는 글라브리딘을 안정화시키는 방법을 제공한다.
키토산은 아미노기와 하이드록실 그룹사이의 수소결합의 형성으로 인한 굳은 결정 구조 때문에 용해되는 용매가 제한적이다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 키토산이 용해되는 용매로 산 (acid)이 바람직하며, 비제한적인 예로서 아세트산 (acetic acid), 젖산 및 포름산 등과 같은 유기산 그리고 약한 염산 및 질산 등과 같은 무기산이 있고, 아세트산이 보다 바람직하다.
글라브리딘은 비극성 물질이기 때문에 글라브리딘이 용해되는 용매의 비제한적 예로는 알콜, 에틸 아세테이트, 아세톤이 바람직하다.
상기 키토산이 용해된 용액과 글라브리딘이 용해된 용액을 혼합시키면 글라브리딘 내의 두 개의 수산기 (도 1참조)와 키토산의 아민기가 이온결합을 통해서 나노입자를 형성할 수 있다. 따라서 글라브리딘의 레조시놀이 산화되는 것을 방지하여 글라브리딘을 안정화시킬 수 있게 되는 것이다.
상기 혼합은 키토산이 용해된 용액 대 글라브리딘이 용해된 용액의 비율이 5:5 내지 8:2인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 8:2의 비율로 혼합 시에 나노입자의 사이즈가 작고 고르게 분포할 수 있게 된다 (도 9 참조).
또한 본 발명의 일실시예에서는 N-아실화 된 키토산을 글라브리딘과 이온결합시켜 글라브리딘을 안정화시킬 수 있다. N-아실화 된 키토산은 이에 제한되지 않으나, N-프로피오닐 키토산 (N-propionyl Chitosan), N-부티릴 키토산 (N-butyryl Chitosan), N-헥사노일 키토산 (N-hexanoyl Chitosan)인 것이 바람직하다. 알킬기의 탄소수가 증가함에 따라 키토산의 소수성이 증가를 하고 글라브리딘과 이온결합 시에 UV조사에 따른 글라브리딘의 안정성이 증가하는 것을 알 수 있다 (도 15 참조).
또한 본 발명의 일실시예에서는 상기 글라브리딘을 안정화 시키는 방법으로 합성된 키토산-글라브리딘 복합체 또는 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체를 제공한다. 상기 복합체는 나노입자인 것을 포함할 수 있다.
상기 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체는 이에 제한되지 않으나, N-프로피오닐 키토산 (N-propionyl Chitosan)-글라브리딘 복합체, N-부티릴 키토산 (N-butyryl Chitosan)-글라브리딘 복합체, N-헥사노일 키토산 (N-hexanoyl Chitosan)-글라브리딘 복합체를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 >
측정장비
나노입자 크기 및 분포는 입자크기측정기 (Particle Analyzer, Model LM10, NTA1.3 analytical software, NanoSight Ltd, UK)를 사용하여 측정을 하였다. (Model LM10, NTA1.3 analytical software, NanoSight Ltd, UK). Scanning profiles는 자외선/가시광선 분광광도계 (UV/Visible Spectrophotometer, S-3150, SCINCO, S.Korea)를 사용하여 얻었고, IR-스펙트럼은 FT-적외선 분광기 (FT-IR Spectrometer, FTIR-8400S, Shimadzu, Japan)를 사용하여 400-4000 cm1 범위에서 기록되었다. 합성된 나노-복합체는 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, JEM1010, JEOL, Japan)을 사용해서 관찰했다. HPLC (305 system, Gilson, France)은 글라브리딘의 양을 분석하기 위해 사용되었고, HPLC 컬럼은(C18,5㎛, 150×4.6㎜) Grace Davison Discovery Sciences (USA)에서 구매했다.
재료 ( Materials )
저분자 키토산 (Fluka, Switzerland)은 탈아세틸화반응의 정도는 78%이고, N-아실화 된 키토산을 합성하기 위해 프로피온산 무수물 (propionic anhydride), 부탄산 무수물 (butanoic anhydride), 헥산산 무수물 (hexanoic anhydride) (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 글라브리딘 (Bioland, S.Korea)은 바이오 랜드에서 공급 받았으며, 시약으로는 아세트산 (Sigma-Aldrich, USA), 메탄올 (J.T. Baker, USA), 아세톤, 에테르가 쓰였다. 키토산 (Mw 16 X 104, 리젠)은 flake 형태의 키토산을 ball mill로 5일 동안 곱게 갈아 파우더 형태로 만들었다. 파우더 형태의 키토산을 체 (sieve)로 크기별로 나누어 이 중 53~90㎛ 크기의 키토산 파우더를 사용하였다. N-아실화 된 키토산 합성에는 아세트산 (추가 정제, Aldrich), 메탄올, 프로피온산 무수물 (97%, Aldrich), 부탄산 무수물 (98%, Aldrich), 헥산산 무수물 (99%, Aldrich), 팔미트산 무수물 (90%, Aldrich)가 쓰였고 아세톤, 디에틸에테르는 wash용액으로 쓰였다.
N- 아실화 된 키토산 합성 ( Preparation of N- acylated chitosan )
키토산 1g을 20% 아세트산 20ml에 녹이고 완전히 녹인 키토산/ 아세트산 용액을 100ml 메탄올에 희석시켰다. 그리고 하나의 글루코사민 잔기 (glucosamine residue)당 각각의 프로피온산 무수물 (propionic anhydride), 부탄산 무수물 (butyric anhydride), 헥산산 무수물 (hexanoic anhydride)이 0.4 몰 동량 (molar equivalent)이 되도록 첨가한 후 메탄올 (methanol) 100ml에 넣었다. 0.4 molar equivalent의 프로피온산 무수물 (propionic anhydride), 부탄산 무수물 (butyric anhydride), 헥산산 무수물 (hexanoic anhydride) / 1 글루코사민 잔기 용액을 키토산/ 아세트산 용액에 넣었다. 이 용액을 실온으로 밤새 반응시키고 반응이 진행 되는 동안 이 용액들은 겔 (gel)화 되었다. 여기에 200ml 아세톤 (aceton)을 넣어준 후 세게 흔들어 겔이 깨지도록 혼합하였다. 아세톤에 혼합된 겔을 3,000rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 용액만을 제거하여 세척하였다. 이러한 방법으로 아세톤과 에틸 에테르로 각각 3번씩 세척하였고, 세척한 겔을 진공 건조하여 파우더 형태의 N-아실화 된 키토산을 만들었다 (도 3참조).
키토산 및 N- 아실화된 키토산- 글라브리딘 나노입자 제조
키토산 및 합성한 N-아실화된 키토산 시료를 1% 아세트산에 0.1%의 농도로 하루 동안 완전히 녹였다. 글라브리딘 파우더 시료는 메탄올 (methanol)에 1%의 농도로 완전히 녹이고, 키토산 및 N-아실화된 키토산 용액을 글라브리딘 용액에 첨가하여 섞어 주었다. 섞어준 두 개의 용액을 vortex를 이용하여 혼합하여 분석하였다.
N- 아실화된 키토산 분석
키토산 및 합성된 N-프로피오닐 키토산 (N-propionyl Chitosan), N-부티릴 키토산 (N-butyryl Chitosan), N-헥사노일 키토산 (N-hexanoyl Chitosan) 파우더를 FT-IR 및 1H-NMR을 이용하여 합성 및 치환율 (표 2)을 알아보았다. 각각의 키토산 NMR 샘플 5mg을 2 wt% CD3COOD/D2O 0.5ml를 용매로 사용하여 300MHz NMR spectrometer로 측정하였다. (도 6및 도 7 참조) 상기 H-NMR을 통하여 chitosan에 아실기 합성 여부와 몇 %의 아실기가 붙었는지 확인 할 수 있었다.
하기 표 1은 N-아실화 된 키토산의 화학적 이동 (Chemical shift of N-acylatedchitosan)을 나타내고, 표 2는 치환율을 나타낸다.
Figure 112010036629944-pat00001
NMR data에서 얻은 integral값을 위 식에 적용하여 Dsubs (%)를 알 수 있었다.
Figure 112010036629944-pat00002
나노입자 복합체 ( Nanoparticle complex ) 분석
키토산 및 각각의 N-아실화 된 키토산과 글라브리딘 복합체 용액이 합성되었는지 알아보기 위하여 FT-IR을 사용하였다. FT-IR로 샘플을 측정하기 위해 각각의 나노입자 복합체 용액을 동결건조 하여 스폰지 형태의 샘플을 KBr 파우더와 섞어서원형 (disc)을 만들어 측정하였다 (도 8참조). 각각의 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체의 FT-IR 데이터를 보면, fingerprint 영역인 1500cm-1이하에서 글라브리딘과 동일한 피크가 있는 것으로 보아 복합체에 글라브리딘이 있음을 알 수 있으며, 또한 3000cm-1 대에 broad 하게 나오는 키토산의 OH 피크로 키토산도 있음을 확인할 수 있었다 (도 8참조). IR 피크를 확대하여 보면 1590cm-1에서 세미 더블렛 피크가 나타나는데 이는 키토산의 아민 그룹과 글라브리딘의 하이드록실그룹의 정전기 상호작용 (electrostatic interaction)에 의해 생긴 피크이다. 이런 결과에 의해 복합체에 키토산과 글라브리딘이 있음을 확인하였고 또한 정전기 상호작용에 의해 결합하였음을 확인 할 수 있었다 (도 8참조).
나노입자 구조 ( Nanoparticle morphology )
키토산과 글라브리딘으로 만들어진 나노입자의 모양을 확인하기 위해 TEM을 사용하였다. 키토산 용액과 글라브리딘 용액을 5:5와 8:2의 비율로 만든 나노입자 샘플을 그리드 (grid)에 올려놓아 10K와 150K의 배율로 측정하였다 (도 9참조). 키토산 용액과 글라브리딘 용액이 5:5의 비율보다는 8:2 비율의 나노입자 크기가 작고 고르게 분포한 것을 볼 수 있다.
나노입자 크기 ( Nanoparticle size ) 측정
키토산 및 각각의 N-아실화 된 키토산과 글라브리딘으로 만든 나노입자의 크기를 입자크기측정기 (particle analyzer)를 이용하여 측정하였다. 각각의 나노입자 복합체 용액은 입자 (particle) 수가 많아 크기를 측정하기 위해 1,000배 희석하여 측정하였다 (도 10 및 11 참조).
나노입자에서 글라브리딘 확인
나노입자에 글라브리딘이 있는지 확인하기 위하여 UV spectroscopy 측정 하였다. UV spectroscopy를 측정하기 위하여 각각의 나노입자 복합체 용액을 동결건조 하여 키토산은 녹지 않고 글라브딘만 녹는 용매인 메탄올로 추출하여 280nm에서 UV spectroscopy로 측정하였다 (도 12 참조).
물질에 따른 UV-Visible의 흡수의 크기는 파장에 따라 다르며 파장에 따른 흡수스펙트럼은 물질마다 고유의 값을 가진다. 각각의 물질마다 고유의 값을 갖는 λ max를 UV-Visible spectrophotometer를 이용하여 확인하였다. 글라브리딘은 232nm와 280nm에서 고유의 λ max를 가지는데 도 12를 보면 실험에 의해 만들어진 키토산-글라브리딘 복합체에서 글라브리딘이 있음을 알 수 있었다.
Encapsulation efficiency & Loading capacity
키토산-글라브리딘 복합체와 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체에서 글라브리딘이 키토산 및 N-아실화된 키토산에 얼마나 붙는지 효율을 알기 위하여 encapsulation efficiency와 loading capacity를 PVDF 멤브레인 필터 (membrane filter)를 이용하여 이를 측정하였다(표 3 및 표 4참조). PVDF 멤브레인 필터 (membrane filter)를 통해 빠져나온 용액을 Gout라 하고, PVDF 멤브레인 필터에 걸러져 생성된 cake를 메탄올로 글라브리딘만을 추출하여 빠져나온 용액을 Gin이라 하였다(도 13및 도 14 참조). 표 3은 Encapsulation efficiency (EE)에 관한 것이고, 표 4는 Loading Capasity (LC)에 관한 것이다.
Figure 112010036629944-pat00003
EE : Encapsulation Efficiency
G0 : 총 글라브리딘의 양 (total amount of Glabridin)
Gout : 유리된 글라브리딘의 양 (amount of free Glabirdin)
Gin : 키토산-글라브리딘 복합체내에서 추출된 글라브리딘의 양 (amount of extract glabridin in chitosan-glabridin complex)
Figure 112010036629944-pat00004
LC : Loading Capacity
G0 : 총 글라브리딘의 양 (total amount of Glabridin)
Gout : 유리된 글라브리딘의 양 (amount of free Glabirdin)
Gin : 키토산-글라브리딘 복합체내에서 추출된 글라브리딘의 양 (amount of extract glabridin in chitosan-glabridin complex)
C0 : 총 키토산의 양 (total amount of chitosan)
UV 노출에 따른 글라브리딘의 안정성 측정
UV 노출에 따른 글라브리딘의 안정성을 측정하기 위하여 키토산-글라브리딘 복합체와 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체를 280nm의 UV 파장으로 0분, 10분, 60분 동안 조사하였으며 대조 실험군으로는 1% 글라브리딘/메탄올 용액이 쓰였다. 조사 된 각각의 샘플에서 글라브리딘의 변화를 보기 위하여 HPLC를 이용하였으며 280nm UV로 탐지하였다 (도 15 참조).
온도에 따른 글라브리딘의 안정성 측정
온도에 따른 글라브리딘의 안정성을 측정하기 위하여 키토산-글라브리딘 복합체와 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체를 0일, 3일, 7일 동안 냉장, 25℃, 40℃의 세 가지 조건에서 측정하였다. UV 노출에 따른 글라브리딘의 안정성 실험과 마찬가지로 글라브리딘의 변화를 보기 위하여 HPLC를 이용하였다 (도 16 참조).
색차계
상기 각각의 샘플을 일광, 냉장, 25도, 40도 조건에서 색깔변화를 color difference meter을 이용하여 관찰 하였다 (도 17참조).
상태 변화
상기 각각의 샘플의 1개월 후의 상태를 관찰 하였다 (도 18참조). 도 18의 A의 1개월 후의 사진이 B이다. 2번 샘플의 경우 키토산이 없는 용액으로 1개월 후에는 침전되어 가라앉았다. 하지만 3-6번 샘플의 경우에는 입자 (particles)들이 1개월 후에도 가라앉지 않고 고르게 분산되어 있는 것을 관찰 할 수 있었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. (a) 키토산을 산 (acid)에 용해시키는 단계;
    (b) 글라브리딘을 용매에 용해시키는 단계;
    (c) 상기 (a) 및 (b) 용액을 혼합하는 단계;
    를 포함하는 글라브리딘을 안정화시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 산은 아세트산, 젖산, 포름산, 염산 또는 질산인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 용매는 알콜, 에틸 아세테이트 또는 아세톤인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 혼합은 (a) 용액 대 (b) 용액의 비율이 5:5 내지 8:2인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 키토산은 N-아실화 된 키토산인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 N-아실화 된 키토산은 N-프로피오닐 키토산 (N-propionyl Chitosan), N-부티릴 키토산 (N-butyryl Chitosan) 또는 N-헥사노일 키토산 (N-hexanoyl Chitosan)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 합성된 키토산-글라브리딘 복합체.
  8. 제 5항 또는 제 6항의 방법에 의해 합성된 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 N-아실화 된 키토산-글라브리딘 복합체는 N-프로피오닐 키토산(N-propionyl Chitosan)-글라브리딘 복합체, N-부티릴 키토산(N-butyryl Chitosan)-글라브리딘 복합체 또는 N-헥사노일 키토산(N-hexanoyl Chitosan)-글라브리딘 복합체인 것을 특징으로 하는 복합체 .
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