[go: up one dir, main page]

KR101132626B1 - 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법 - Google Patents

난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101132626B1
KR101132626B1 KR1020090096803A KR20090096803A KR101132626B1 KR 101132626 B1 KR101132626 B1 KR 101132626B1 KR 1020090096803 A KR1020090096803 A KR 1020090096803A KR 20090096803 A KR20090096803 A KR 20090096803A KR 101132626 B1 KR101132626 B1 KR 101132626B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nanoparticles
poorly soluble
hdl
solvent
phosphatidylcholine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
KR1020090096803A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110039798A (ko
Inventor
김진설
용 강
최성민
김기용
최용운
Original Assignee
주식회사 녹십자
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 녹십자 filed Critical 주식회사 녹십자
Priority to KR1020090096803A priority Critical patent/KR101132626B1/ko
Publication of KR20110039798A publication Critical patent/KR20110039798A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101132626B1 publication Critical patent/KR101132626B1/ko
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1658—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 인지질, 난용성 약물 및 HDL 아포지단백을 용제(detergent)에 용해시켜 고밀도지단백(HDL) 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 의해 제조된 나노입자는 균일한 입자 크기 및 개선된 약물 로딩율을 가지므로 고용량 제제의 제조가 가능하며, 환자의 순응도를 높이는 장점이 있다.
난용성 약물, 소수성 약물, 고밀도지단백(HDL), 나노입자, 아포지단백

Description

난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법 {Method for preparing HDL nanoparticles for the delivery of hydrophobic drugs}
본 발명은 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백(HDL) 나노입자의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인지질, 난용성 약물 및 HDL 아포지단백을 용제(detergent)에 용해시켜 고밀도지단백 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
약물치료법에 있어서, 약물이 타겟으로 하는 세포 내부까지 전달되거나, 타겟으로 하는 생체 내 수용체에 용이하게 결합하기 위해서는 어느 정도 소수성 분자구조를 가져야 한다. 하지만, 상기 소수성 특성이 강한 약물들은 높은 생리활성에도 불구하고 물에서 낮은 용해도를 나타나는 경우가 많다. 특히, 항암제나 면역억제제와 같은 수많은 난용성 약물들은 거대한 다환(polycyclic) 구조로 인하여 물에서의 용해도가 매우 낮은 특성을 나타낸다. 이러한 소수성이나 난용성은 약물의 치료적 응용에 있어서 심각한 문제를 야기해 왔다. 즉, 소수성 또는 난용성 약물 은 낮은 생체 내 흡수율 및 이에 따른 생리활성의 저해를 야기하며, 특히 정맥주사제로 사용할 경우 낮은 용해도로 인한 약물의 불용성 부분에 의해 심각한 통증 유발과 더불어 자칫 혈전이 생겨 혈관이 막히게 할 수도 있다. 이에 상기 소수성 또는 난용성 약물의 용해도를 높이기 위한 다양한 시도가 있어왔다.
항암제 중 파클리탁셀(Paclitaxel)은 특히 용해도가 낮아서 비이온성 계면활성제인 크레모포어 EL？(polyoxyethylated castor oil)을 이용하여 용해도를 증가시켜 주사제로 사용하고 있다. 하지만, 상기 크레모포어 EL？로 인한 상당한 부작용이 보고된 바 있어, 가용화제로 크레모포어 EL？을 첨가한 파클리탁셀 제제는 투여 전 용매에 의한 과민반응을 예방하기 위해 스테로이드 투약과 같은 전처치의 과정을 거쳐 3시간 동안 천천히 투여해야 하는 불편함이 있었다. 이에 파클리탁셀의 제형을 바꾸어 부작용을 최소화하기 위한 시도가 많이 있어왔다. 그 대표적인 예가 아브락산TM이다. 아브락산은 기존 파클리탁셀 성분 항암제(탁솔TM)의 문제점으로 여겨지던 유독성 가용화제를 사용하지 않고, 주성분인 파클리탁셀에 알부민을 결합시켜 제조된 나노입자 형태로서, 종양에만 선택적으로 작용하여 부작용이 적으며, 고용량의 투여가 가능해 강력한 항암 작용을 나타낸다. 또한, 전처리 과정이 필요 없을 뿐만 아니라, 30분 만에 투여가 가능해 편리하다.
한편, 난용성 약물을 분산시키거나 용해시키기 위한 시도로서, 하나의 분자 내에 친수성 및 소수성 부분을 갖는 리포좀을 이용한 예가 있다. 그 대표적인 제품이 제넥솔PMTM으로서, 가용화제로 무독성 고분자인 메톡시 폴리에틸렌글리콜-폴리(D,L-락타이드)를 사용하여 독성 및 과민반응을 감소시키고 고용량 투여를 가능케 하여 우수한 치료효과를 기대할 수 있도록 하였다. 그럼에도 불구하고, 리포좀이나 미소구체(microsphere)와 같은 인위적인 고분자 입자들은 생체 내 면역계의 일부인 세망내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의해 투여 초기에 약물이 대량 제거되는 문제점이 있다.
최근에는 양쪽성 분자로서 지질단백질 중에서도 고밀도지단백(HDL)을 이용한 rHDL(reconstituted HDL) 나노입자가 연구되고 있으며, 상기 HDL은 생체 내에 있는 지질 및 콜레스테롤의 운반자로서 난용성 물질과 잘 결합하고, 생체에 적합하며, 완전하게 생분해가 이루어진다는 장점을 갖는다. 또한, rHDL(reconstituted HDL)은 리포좀이나 미소구체와 같은 인위적인 고분자 입자와는 달리 세망내피계(RES)에 의해 초기에 약물이 제거되는 문제점이 없다. 이러한 장점 때문에 HDL은 난용성 약물의 운반자로서 최적의 조건을 갖추고 있다고 할 수 있다. 미국특허공개 US 20090110739호는 지질성분, 콜레스테롤 성분 및 지질결합단백질 성분을 포함하는 나노입자를 개시하고 있으나, 나노입자의 크기가 일정치 않으며, 난용성 약물의 로딩율이 낮은 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 인지질, 아포지질단백질 및 난용성 약물을 이용하여 고 밀도지단백 나노입자를 제조하는 방법을 개발하였으며, 상기 방법에 따라 제조된 나노입자가 균일한 크기를 가지고, 난용성 약물의 로딩율을 증가시켜 고용량 투여가 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백(HDL) 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된, 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 a) 인지질 및 난용성 약물을 클로로포름/메탄올 용매(2:1, v/v)에 용해시킨 후, 질소가스 하에 건조시켜 박막을 형성시키는 단계; b) 상기 박막을 용제(detergent)가 함유된 완충액에 유화시키는 단계; c) 상기 유화액에 HDL 아포지단백(apolipoprotein)을 첨가하여 2~4℃에서 5~7시간 동안 반응시키는 단계; 및 d) 상기 반응액을 투석하여 용제를 제거하는 단계를 포함하는, 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백(HDL) 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자를 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 고밀도지단백 나노입자는 난용성 약물을 rHDL과 결합시켜 나노입자로 가용화시킴으로써 제제화가 용이하고, 약물의 로딩율이 높으므로, 주사제의 경우 환자의 순응도를 높여주고 또한 고용량 투여가 가능하다.
본 발명은 a) 인지질 및 난용성 약물을 클로로포름/메탄올 용매(2:1, v/v)에 용해시킨 후, 질소가스 하에 건조시켜 박막을 형성시키는 단계; b) 상기 박막을 용제(detergent)가 함유된 완충액에 유화시키는 단계; c) 상기 유화액에 HDL 아포지단백(apolipoprotein)을 첨가하여 2~4℃에서 5~7시간 동안 반응시키는 단계; 및 d) 상기 반응액을 투석하여 용제를 제거하는 단계를 포함하는, 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백(HDL) 나노입자의 제조방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법을 단계별로 보다 자세히 설명하면,
상기 단계 a)는 인지질 및 난용성 약물을 클로로포름/메탄올 용매(2:1, v/v)에 용해시킨 후, 질소가스 하에 건조시켜 박막을 형성시키는 단계이다. 상기 단계 a)에서 사용되는 인지질은, 외부는 친수성을 띄고 내부는 소수성을 띄어, 내부에 소수성, 양친매성 또는 양이온성 친수성 약물을 보유할 수 있으므로 상기 유효물질 들을 생체 내에서 안전하게 타겟 조직으로 전달하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 인지질로서, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 팔미토일-올레오익 포스파티딜콜린(POPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DOPC), 대두 포스파티딜콜린(soybean PC) 또는 난황 포스파티딜콜린(egg yolk PC)을 사용하는 것이 바람직하며, 특히 본 발명은 상기 인지질로 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 에스테르를 사용하지 않는다는 데에 특징이 있다. 도 1에서와 같이, 고밀도지단백(HDL)은 몸 속에서 지질 및 콜레스테롤을 운반하는 기본적인 역할을 수행하게 되는데, 콜레스테롤이나 콜레스테릴 에스테르를 함유하고 있는 HDL을 성숙 HDL(HDL2 or HDL3)이라고 하며 여기에 약물을 로딩시키면 HDL이 체내의 콜레스테롤을 제거하지 못하고 직접 간으로 흡수될 가능성이 있다. 따라서 콜레스테롤이나 콜레스테릴 에스테르를 함유하지 않는 preβ-HDL에 약물을 로딩시키면 약물과 더불어 전신의 지질 및 콜레스테롤도 동시에 운반하는 역할을 수행할 수 있게 된다. 더욱이 콜레스테롤을 함유하지 않음으로써 나노입자의 전체 크기를 감소시킬 수 있으며, 약물의 로딩량도 증가시키고, 나노입자의 균일성을 확보할 수 있는 장점이 있다.
한편, 상기 단계 a)에서 사용되는 난용성 약물은 치료, 진단, 또는 대사성 효과의 목적으로 개체에 투여되는 화합물로서, 이의 염 및 유도체를 포함한다. 본 발명에 사용되는 난용성 약물은 수용성 환경에 잘 용해되지 않는 물질로서, 예를 들면, 아메탄트론(ametantrone), 암포테리신 B(amphotericin B), 안나마이신(annamycin), 사이클로스포린(cyclosporin), 다우노루비신(daunorubicin), 디아제팜(diazepam), 독소루비신(doxorubicin), 엘립티니움(elliptinium), 에토포사이 드(etoposide), 케토코나졸(ketoconazole), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코나졸(miconazole), 미토잔트론(mitoxantrone), 니스타틴(nystatin), 페니토인(phenytoin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타크로리무스(tacrolimus) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 파클리탁셀(paclitaxel), 타크로리무스(tacrolimus) 또는 빈크리스틴(vincristine)일 수 있다. 상기 난용성 약물은 정전기, 소수성, 공유 결합, 수소 결합, 반데르발스 힘, 또는 이의 조합에 의해 인지질과 결합할 수 있다.
상기 인지질 및 난용성 약물을 용해시키기 위한 용매로서, 클로로포름/메탄올 용매(2:1, v/v)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 클로로포름/메탄올 용매는 인지질 및 난용성 약물과의 반응성이 없으며 휘발성이 강하여 공정 중에서 용매제거가 용이하고 난용성 약물 및 인지질을 쉽게 용해할 수 있는 장점이 있다.
한편, 상기 용매는 통상적인 용매 제거 기술을 이용하여 제거될 수 있다. 예를 들면, 오산화인(phosphorus pentoxide)과 같은 건조제의 존재 또는 부존재하에 감압 하에서 용매 증발을 수행하거나 또는 질소, 아르곤 등의 가스 하에서 증발시킬 수 있다. 바람직하게는, 질소가스 하에서 용매를 제거하여 건조시킴으로써 박막을 형성시킬 수 있다.
본 발명의 제조방법의 단계 b)는 단계 a)에서 제조된 박막을 용제(detergent)가 함유된 완충액에 유화시키는 단계이다.
상기 용제는 rHDL의 제조과정 중 지질의 분산을 용이하게 하여 아포지단백이 효과적으로 지질과 결합될 수 있도록 도와주는 역할을 하는 것으로서, rHDL의 제조에 사용하는 지질 성분이 양전하를 띠고 있기 때문에 음이온성 용제를 사용하여야 하며, 바람직하게는 콜산나트륨(sodium cholate)을 사용할 수 있다.
한편, 상기 용제는 박막을 분산시키기 위한 완충액에 포함될 수 있다. 종래 디메틸술폭사이드(DMSO)를 상기 완충액으로 사용해왔으나, DMSO는 정맥으로 투여될 경우 농도에 따라 많은 부작용을 발생시키는 문제점이 있었다. 이에 상기 완충액은 DMSO가 아닌 pH 7.5 내지 8.0의 완충액인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20 mM 트리스-염산 및 250 mM 염화나트륨으로 이루어진 완충액(pH 8.0)일 수 있다.
본 발명의 제조방법의 단계 c)는 단계 b)의 유화액에 HDL 아포지단백(apolipoprotein)을 첨가하여 2~4℃에서 5~7시간 동안 반응시키는 단계이다. 상기 HDL 아포지단백은 지질 결합 단백질 중 하나로서, 나노입자의 지질 단일층을 안정화시키는 역할을 한다. 상기 HDL 아포지단백의 예로서 아포지단백 A-I(apo A-I), 아포지단백 A-II(apo A-II), 아포지단백 A4(apo A4), 아포지단백 Cs(apo Cs) 또는 아포지단백 E(apo E)가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 아포지단백 A-I(apo A-I) 또는 아포지단백 A-II(apo A-II)가 사용될 수 있고, 가장 바람직하게는 아포지단백 A-I(apo A-I)이 사용될 수 있다. 상기 아포지단백 A-I은 바람직하게는 대한민국 등록특허 제0719389호(녹십자)에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다.
상기 단계 c)에서, 인지질/난용성 약물 혼합유화액(mixed emulsion)에 HDL 아포지단백을 첨가하여 2~4℃에서 5~7시간 동안 반응시키게 되는데, 상기 반응 온도에서 인지질과 아포지단백이 최적으로 결합할 수 있으며, 결합을 위해서는 최소 5시간 이상의 반응시간이 요구된다.
본 발명의 제조방법의 단계 d)는 단계 c)의 반응액을 투석하여 용제를 제거하는 단계이다. 상기 투석은 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 10,000 내지 50,000 Da MWCO PES 막을 갖는 한외여과를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 단계 d)를 거쳐 최종적인 나노입자가 형성되며, 상기 단계 종료 후, 제조된 나노입자를 추가로 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 적용하여, 보다 균일한 조성물을 제조할 수도 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 인지질, 난용성 약물, 용제 및 아포지단백은 2~4 : 0.05~0.2 : 2~4 : 1 중량의 비율로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제조방법에 따라, 항암제(예: 파클리탁셀) 뿐만 아니라 면역억제제(예: 타크로리무스)를 나노입자에 봉입하여 전달할 수 있으며, 상기 제조방법에 의해 제조된 나노입자들은 7 내지 20nm, 바람직하게는 8 내지 10 nm의 균일한 크기를 가지고, 난용성 약물은 균일한 나노 입자에 분포한다(도 2 및 3 참조). 또한, 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르의 사용없이, 포스파티틸콜린만으로 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자(실시예 1 및 2)는 인지질로 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르를 함유하여 US 2009/011739호에 개시된 방법에 따라 제조된 나노입자(비교예 1)에 비하여 8배 가량 증가한 약물 로딩율을 나타낸다(도 7 참조). 따라서, 본 발명의 제조방법은 나노입자의 크기를 균일하게 하고, 나노입자 내의 약물의 로딩율을 증가시키는 데에 효과적이다.
이에 따라, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된, 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백(HDL) 나노입자를 제공한다. 상기 나노입자는 7 내지 20 nm의 크기를 가지며, 원반형(discoidal) 타입인 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 실시예 등을 들어 상세히 설명하고자 하지만, 이로써 본 발명이 상기 실시예 등에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 파클리탁셀을 봉입한 고밀도지단백 나노입자의 제조
포스파티틸콜린(PC, Avanti Polar Lipids사) 77 mg 및 난용성 약물인 파클리탁셀 2 mg(SIGMA T7402)을 클로로포름/메탄올 용매(2:1(v/v)) 1 mL에 용해시킨 후, 질소 가스 하에서 용매를 증발시켜 박막(thin film)을 형성시켰다. 상기 박막에 용제로서 콜산나트륨(sodium cholate)을 지질 대비 0.7 내지 1.0 배 첨가하고, 20 mM 트리스-염산 및 250 mM 염화나트륨이 함유된 완충액(pH 8.0)을 2 mL 첨가하여 4℃에서 맑아질 때까지 교반하였다. 맑아진 상기 포스파티틸콜린/파클리탁셀/콜산 나트륨 용액에 대한민국 특허등록 제0719389호에 개시된 방법에 따라 제조된 30 mg의 아포 A-I 용액(1~10 mg/mL)을 첨가하고, 4℃에서 5시간 이상 교반시킨 후, 10,000~50,000 Da의 한외여과막(MWCO PES membrane)을 이용, 투석 완충액 (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)으로 투석하여 고밀도지단백(HDL) 나노 입자를 제조하였다.
실시예 2: 타크로리무스를 봉입한 HDL 나노입자의 제조
실시예 1의 난용성 약물로 파클리탁셀 대신에 면역억제 약물인 타크로리무스(tacrolimus, 녹십자)를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 수행하여 HDL 나노입자를 제조하였다.
비교예 1: 파클리탁셀을 봉입한 HDL 나노입자의 제조
본 발명에 따른 나노입자의 특성을 비교하기 위하여, 미국특허공개 2009/011739호에 의해 개시된 방법에 따라 나노입자를 제조하였다. 구체적으로, 지질 혼합물(난황 포스파티틸콜린, 콜레스테롤 및 콜레스테릴 올레에이트=3.8:1:88.5)에 2 mg의 파클리탁셀을 혼합한 후 질소 하에서 건조하여 박막을 형성시키고, 이를 디메틸술폭사이드(DMSO)에 녹인 후 1.4 mL의 10 mM 트리스, 0.1 M 염화칼륨 및 1 mM EDTA (pH 8.0) 완충액을 첨가하였다. 그리고 나서, PBS에 100 mg/mL의 농도로 녹인 콜산나트륨을 140 μL 첨가하고, 0.4 mL의 PBS에 녹인 아포 A-I(12.7 mg/mL)을 첨가하고, PBS로 최종 부피를 2 mL로 조정하였다. 상기 지질/단백질/콜산 혼합물을 4℃에서 12시간 동안 배양한 후, 투석하여 HDL 나노입자를 제조하였다.
실험예 1: HDL 나노입자의 크기 및 균일성 확인
상기 실시예 1 및 2에서 제조된 나노입자의 크기 및 균일성을 크기배제 크로마토그래프를 이용하여 확인하였다. 개략적으로, superdex 200 10/300 GL (GE healthcare) 컬럼을 사용하여, 이동상(50 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3, pH 7.0)의 유속을 0.4 mL/min으로 1시간을 유지하였고, 시료 100 μL를 주입하여 매 2분마다 분획을 받아 파클리탁셀 및 타크로리무스의 양을 확인하였다.
파클리탁셀의 경우, 분획시료 100 μL에 파클리탁셀 이동상 400 μL를 첨가하여 4℃에서 5시간 정치한 후 원심분리하여 상청액을 10 μL씩을 주입하였다. 파클리탁셀의 분석은 Kromasil KR100-5C18 컬럼(250×4.6 mm)을 사용하여 역상 크로마토그래피법으로 분석하였다. 이동상(아세토니트릴:메탄올:10 mM 암모늄 아세테이트 pH 5.0=48.5:16.5:35)의 유속을 0.8 mL/min으로 20분간 유지하고 UV 227 nm에서 측정하였다(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis., 31,(2003),283~289).
타크로리무스의 경우, TSK gel ODS 120A 컬럼을 이용하여 역상 크로마토그래피법으로 분석하였다. 이동상(물:이소프로판올:테트라하이드로퓨란=5:2:2)의 유속을 1 mL/min로 20분간 유지하고 컬럼 온도를 50℃로 유지하였다. 헵틸 파라히드록시벤조에이트(Heptyl parahydroxybenzoate) 0.75 g을 무수 에탄올 1 L에 녹여 내부표준액으로 사용하였으며, 분획시료는 내부표준액과 분획시료를 1:1 로 혼합한 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 10 μL를 주입하여 측정하였다(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis., 14, (1996), 339-346).
실험결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 실시예 1 및 2의 나노입자는 8 내지 10 nm의 균일한 크기를 가졌으며, 파클리탁셀 및 타크로리무스 역시 균일한 나노 입자에 분포함을 알 수 있었다.
한편, 실시예 1 및 2에서, 난용성 약물을 사용하지 않고 아포 A-I 및 팔미토일-올레오익 포스파티딜콜린(POPC)의 양을 달리하여 크기배제 크로마토그래피에 적용한 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 아포 A-I:POPC의 비율이 1:2.6 이상인 경우 MLV(multilamellar vesicle)로 판단되는 크기가 큰 입자(체류시간 20분 이하의 피크에 해당됨)가 생성되는 것으로 나타났다.
또한, 실시예 1 및 2에서, 난용성 약물을 사용하지 않고 아포 A-I 및 대두 포스파티딜콜린(soybean PC)의 양을 달리하여 크기배제 크로마토그래피에 적용한 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 아포 A-I:대두 PC의 비율이 1:4 이상인 경우 MLV로 판단되는 크기의 입자가 생성되는 것으로 나타났다. 도 4 및 도 5에서 MLV가 생성 되는 비율이 조금 다른데, 이는 대두 포스파티딜콜린이 POPC보다는 덜 균일한 지질성분이기 때문으로 판단된다. 상기 결과들로부터 입자크기에 아포 지단백 및 포스파티딜콜린의 비율이 중요함을 알 수 있다.
실험예 2: 나노입자의 형태 확인
상기 실시예 1 및 2에서 제조된 나노입자와 비교예 1에서 제조된 나노입자의 형태를 비교하기 위하여, 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 형태를 관찰하였다. 구체적으로, 제조된 나노 입자 1 mg/mL을 완충액(0.125 M ammonium acetate, 2.6 mM ammonium carbonate, 0.26 mM EDTA pH 7.4)으로 투석하여 2% 인텅스텐산(phosphotungstic acid, pH 7.0)으로 음성 염색(negative staining)을 1분간 하고 증류수로 세척한 후, 투과전자현미경(Carl Zeiss, LIBRA 120)을 이용하여 10만 내지 15만 배율로 관찰하였다.
관찰 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 a)는 인지질로 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르를 함유하여 US 2009/011739호에 개시된 방법에 따라 제조된 나노입자(비교예 1)의 TEM 이미지를, 도 6의 b)는 인지질로 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르가 없이 포스파티틸콜린만으로 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자(실시예 1)의 TEM 이미지를 나타낸다. 상기 도 6에서 보는 바와 같이, 비교예 1의 나노입자는 구형(spherical) 타입의 비교적 큰 입자(직경 40~50 nm)인데 반해, 본 발명의 나노입자들은 원반(discoidal) 타입의 작은 입자(직경 8~12 nm)임을 알 수 있다. 구형 타입의 나노 입자는 콜레스테릴 에스테르 및 콜레스테롤을 첨가한 결과로 형성된 모양이며, 원반 타입의 입자는 실제로 생체 내에 존재하는 pre-βHDL의 모양으로서 체내에 들어갔을 때 콜레스테롤을 흡수하게 되면 비로소 구형타입의 입자로 바뀌게 된다.
실험예 3: 나노입자의 약물 로딩 효율 확인
실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 나노입자의 약물 로딩율을 비교예 1과 비교하였다. 약물의 로딩율은 제조된 나노입자용액 100 μL를 이동상 400 μL와 혼합한 후 원심 분리하여 상등액을 파클리탁셀 분석법(역상 크로마토그래피법; 실험예 1 참조)으로 정량 분석 하였다.
실험결과를 도 7에 나타내었다. 인지질로 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르를 함유하여 US 2009/011739호에 개시된 방법에 따라 제조된 나노입자(비교예 1)의 로딩율은 7%인데 반하여, 인지질로 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르가 없이 포스파티틸콜린만으로 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자(실시예 1 및 2)의 로딩율은 54%로 8배 가량 높았다. 이는 본 발명의 제조방법이 약물의 로딩율을 증가시키는데 매우 효과적임을 보여준다. 따라서, 본 발명의 나노입자를 이용하는 경우, 고용량 제제의 투여가 가능하며, 환자의 순응도를 증가시키는데 유용할 것으로 판단된다.
실험예 4: 나노입자의 암세포 억제 효율 확인
실시예 1에서 제조된 파클리탁셀 함유 나노입자의 암세포에 대한 효율을 비교예 1의 나노입자와 비교하였다. 구체적으로, 유방암 세포인 SK-BR-3 세포(ATCC HTB-30)를 1.5×104 세포/웰로 96 웰플레이트에 넣고 24 시간 동안 웰에 부착시켰다. 그리고 나서, 제조된 나노입자를 파클리탁셀 농도별(0.05, 0.1, 0.15 및 0.2 μg)로 각 웰에 20 μL씩 처리하였다. 24시간 배양한 후에 시료를 제거하고, 각 웰에 2 mg/mL의 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, 시그마, M2128) 용액을 100 μL 씩 첨가하였다. 이후, 4시간 동안 배양한 후 MTT 용액을 조심스럽게 제거하고, 각 웰에 100 μL의 DMSO를 첨가하여 15~20분간 플레이트 쉐이커(plate shaker)로 교반시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자(실시예 1)가 비교예 1의 나노입자에 비해 1.5 내지 2 배 정도 더 높은 암세포 억제 효율을 보임을 알 수 있다.
도 1은 고밀도지단백(HDL)의 대사과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 파크리탁셀을 함유한 나노입자(실시예 1)의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 타크로리무스를 함유한 나노입자(실시예 2)의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 아포지단백 및 POPC의 함량을 달리하여 제조한 나노입자의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 아포지단백 및 대두 PC의 함량을 달리하여 제조한 나노입자의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 a) 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르를 포함하여 US2009/0110739에 개시된 방법에 따라 제조된 나노입자(비교예 1) 및 b) 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르를 포함하지 않고 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자(실시예 1)의 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 비교예 1과 실시예 1 및 2의 나노입자의 약물 로딩율을 비교한 그래프이다.
도 8은 MTT 분석에 따른 파클리탁셀, 파클리탁셀 함유 나노입자(실시예 1) 및 파클리탁셀 함유 나노입자(비교예 1)의 세포독성 결과를 나타낸 것이다.

Claims (9)

  1. a) 인지질 및 난용성 약물을 클로로포름/메탄올 용매(2:1, v/v)에 용해시킨 후, 질소가스 하에 건조시켜 박막을 형성시키는 단계;
    b) 상기 박막을 용제(detergent)가 함유된 완충액에 유화시키는 단계;
    c) 상기 유화액에 HDL 아포지단백(apolipoprotein)을 첨가하여 2~4℃에서 5~7시간 동안 반응시키는 단계; 및
    d) 상기 반응액을 투석하여 용제를 제거하는 단계
    를 포함하며, 상기 인지질, 난용성 약물, 용제 및 아포지단백이 2~4 : 0.05~0.2 : 2~4 : 1 의 중량비율로 사용되는 것을 특징으로 하는, 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백(HDL) 나노입자의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인지질이, 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 에스테르를 포함하지 않는, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 팔미토일-올레오익 포스파티딜콜린(POPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DOPC), 대두 포스파티딜콜린(soybean PC) 또는 난황 포스파티딜콜린(egg yolk PC)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 난용성 약물이 파클리탁셀(paclitaxel), 타크로리무스(tacrolimus) 또는 빈크리스틴(vincristine)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 용제가 콜산나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 완충액이 트리스-염산 및 염화나트륨으로 이루어진 pH 7.5 내지 8.0의 완충액인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 HDL 아포지단백이 아포지단백 A-I(apo A-I) 또는 아포지단백 A-II(apo A-II)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항의 방법에 따라 제조된, 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 나노입자가 7 내지 20 nm의 크기를 가지며, 원반형(discoidal) 타입인 것을 특징으로 하는 나노입자.
KR1020090096803A 2009-10-12 2009-10-12 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법 Expired - Fee Related KR101132626B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090096803A KR101132626B1 (ko) 2009-10-12 2009-10-12 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090096803A KR101132626B1 (ko) 2009-10-12 2009-10-12 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110039798A KR20110039798A (ko) 2011-04-20
KR101132626B1 true KR101132626B1 (ko) 2012-04-02

Family

ID=44046274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090096803A Expired - Fee Related KR101132626B1 (ko) 2009-10-12 2009-10-12 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101132626B1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8323686B2 (en) 2008-04-25 2012-12-04 Northwestern University Nanostructures suitable for sequestering cholesterol and other molecules
KR101304017B1 (ko) * 2011-12-27 2013-09-04 영남대학교 산학협력단 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물
WO2013108983A1 (ko) * 2012-01-20 2013-07-25 성균관대학교 산학협력단 ｐＨ-반응 고밀도 리포단백질-유사 입자 결합체
KR101455909B1 (ko) * 2012-01-20 2014-11-03 성균관대학교산학협력단 ｐＨ-반응 고밀도 리포단백질-유사 입자 결합체
CN103655477B (zh) * 2012-09-03 2017-06-23 唐为钢 一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂及其制备方法和用途
WO2015023797A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Northwestern University Lipophilic nanoparticles for drug delivery
US10434064B2 (en) 2014-06-04 2019-10-08 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
BR112017007012A2 (pt) 2014-10-06 2018-03-06 Exicure Inc compostos anti-tnf
US10078092B2 (en) 2015-03-18 2018-09-18 Northwestern University Assays for measuring binding kinetics and binding capacity of acceptors for lipophilic or amphiphilic molecules
WO2023243865A1 (ko) * 2022-06-13 2023-12-21 (주) 멥스젠 약물전달용 재구축 고밀도 지단백 나노입자

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR970002870B1 (ko) * 1987-03-05 1997-03-12 더 리포조옴 캄파니, 인코포레이티드 저독성 약물-지질계
US6514523B1 (en) 2000-02-14 2003-02-04 Ottawa Heart Institute Research Corporation Carrier particles for drug delivery and process for preparation
US20040229794A1 (en) * 2003-02-14 2004-11-18 Ryan Robert O. Lipophilic drug delivery vehicle and methods of use thereof
US20090110739A1 (en) 2007-05-15 2009-04-30 University Of North Texas Health Science Center At Forth Worth Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR970002870B1 (ko) * 1987-03-05 1997-03-12 더 리포조옴 캄파니, 인코포레이티드 저독성 약물-지질계
US6514523B1 (en) 2000-02-14 2003-02-04 Ottawa Heart Institute Research Corporation Carrier particles for drug delivery and process for preparation
US20040229794A1 (en) * 2003-02-14 2004-11-18 Ryan Robert O. Lipophilic drug delivery vehicle and methods of use thereof
US20090110739A1 (en) 2007-05-15 2009-04-30 University Of North Texas Health Science Center At Forth Worth Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110039798A (ko) 2011-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101132626B1 (ko) 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법
Jia et al. A novel dexamethasone-loaded liposome alleviates rheumatoid arthritis in rats
Jadhav et al. Novel vesicular system: an overview
EP1011634B1 (en) Preparation of pharmaceutical compositions
CN1897975B (zh) 口服给药的水溶性药物纳米颗粒组合物及其制备方法
US20060177495A1 (en) Polymer-lipid delivery vehicles
US20030235619A1 (en) Polymer-lipid delivery vehicles
CN103120645B (zh) 伊立替康或盐酸伊立替康脂质体及其制备方法
US20060222716A1 (en) Colloidal solid lipid vehicle for pharmaceutical use
JP2012207042A (ja) 低い水溶性を有する生物学的に活性な化合物を可溶化するための方法および組成物
US20240082154A1 (en) Disease-site-specific liposomal formulation
CN101474155A (zh) 注射用肺靶向载药前体脂质体及其使用方法
Ma et al. A highly stable norcantharidin loaded lipid microspheres: preparation, biodistribution and targeting evaluation
Qu et al. N-octyl-O-sulfate chitosan-modified liposomes for delivery of docetaxel: preparation, characterization, and pharmacokinetics
CN102579337B (zh) 含有多西他赛的长循环脂质纳米混悬剂及其制备方法
US8859001B2 (en) Fenoldopam formulations and pro-drug derivatives
Afreen et al. Pharmacosomes and emulsomes: an emerging novel vesicular drug delivery system
KR101768681B1 (ko) 탁산계 약물 전달용 리포좀 및 이의 제조방법
JPH07505408A (ja) 治療及び診断用組成物及びその製造方法，ならびにその用途
WO2014167435A2 (en) Liposomal pharmaceutical formulations for enhanced drug delivery
AU2003224796A1 (en) Cochleates made with purified soy phosphatidylserine
WO2003105765A2 (en) Phospholipid micelles in liposomes as solubilizers for water-insoluble compounds
WO2005021012A1 (ja) ゲムシタビン封入薬剤担体
AU2011229019A1 (en) Water-soluble pharmaceutical composition comprising at least one therapeutically active substance having hydrophobic properties and at least one compound selected from among sialoglycosphingolipids, glycosphingolipids or a mixture of sialoglycosphingolipids and glycosphingolipids
CN103040764B (zh) 一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20091012

PA0201 Request for examination
PG1501 Laying open of application
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20110817

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20120313

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20120327

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20120328

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141217

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20141217

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151229

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20151229

Start annual number: 5

End annual number: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170111

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20170111

Start annual number: 6

End annual number: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180108

Year of fee payment: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180108

Start annual number: 7

End annual number: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190114

Year of fee payment: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190114

Start annual number: 8

End annual number: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200113

Year of fee payment: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200113

Start annual number: 9

End annual number: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210111

Start annual number: 10

End annual number: 10

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220113

Start annual number: 11

End annual number: 11

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20221219

Start annual number: 12

End annual number: 12

PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20250107