KR101128262B1 - 양전하로 하전된 표면을 이용한 적혈구 세포의 제조방법 - Google Patents
양전하로 하전된 표면을 이용한 적혈구 세포의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 지지 기질 세포의 공배양 없이 적아세포(erythroblasts)를 부유 배양하여 적혈구 세포를 제조하는 방법에 있어서, 양전하로 하전된(positively charged) 내부 표면을 갖는 배양기 중에서 상기 적아세포를 부유 배양하여 세포핵 유출(enucleation)을 유도하는 것을 특징으로 하는 적혈구 세포의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의해, 양전하로 하전된 표면 상에서 적아세포를 배양할 경우, 지지 기질 세포의 공배양 없이도 하전된 표면이 지지 기질 세포의 기능을 수행하여, 높은 효율로 세포핵 유출을 유도함으로써, 적혈구 세포를 높은 효율로 제조할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 단순히 배양기 표면을 양전하로 하전시켜 적아세포를 부유배양함으로써, 단순하고 경제적으로 적혈구 세포를 제조할 수 있다.
적혈구 세포, 세포핵 유출, 정전기적 상호작용, 아민기
Description
본 발명은 적혈구 세포의 시험관 내(in vitro) 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지지 기질 세포의 공배양 없이 정전기적 특성을 이용하여 적아세포(erythroblasts)를 부유 배양하여 세포핵 유출(enucleation)을 유도하는 것을 특징으로 하는 적혈구 세포의 시험관 내(in vitro) 제조방법에 관한 것이다.
세포 배양 플레이트의 계면 화학적 상태는 점착성 세포(adherent cells)의 신호 또는 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 예를 들어 세포 성장, 생존율의 유지, 및 분화 능력과 같은 다양한 성질에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Stevens, M. & George, J.H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science 310, 1135-1138 (2005); Guo, L. et al. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells on photoreactive polymer-modified surfaces. Biomaterials 29, 23-32 (2008); Singhvi, R. et al. Engineering cell shape and function. Science 264, 696-698 (1994)). 따라서, 종래에는 조직 배양 플레이트를 히드록실, 카르복실, 및 아미드 기와 같은 화학적 기 에 노출시킴으로써 친수성 상태로 변형시켜, 이러한 조건들의 최적화를 시도하고 있다. 그러나, 이러한 정전기적 상태는 부유하는 세포에 대하여는 거의 영향이 없거나 혹은 영향을 전혀 미치지 않는 것으로 인식되어 왔다.
한편, 완전히 분화된 적혈구 세포(red blood cells, RBCs)를 얻기 위한 적혈구 전구체들의 분화에 있어서, 가장 중요한 단계 중 하나는 적아세포(erythroblasts)의 세포핵 유출(enucleation) 단계이다. 세포핵 유출은 세포질이 핵을 밖으로 밀어내는 것을 필요로 하기 때문에, 완전히 분화된 RBC를 생산하는데 있어서 최종 단계를 완료하기 위하여는 적아세포의 세포핵 유출을 위한 부착 부위를 제공하도록 기능하는 지지 기질 세포(supporting stromal cells)가 요구된다. 본 발명자들은 지지 기질 세포와의 공배양 없이 RBCs를 시험관 내로 제조하는 방법을 보고한 바 있으나(Baek EJ, Kim HS, Kim JH, Kim NJ & Kim, H.O. Stroma-free mass production of clinical grade red blood cells by using poloxamer 188 as an RBC survival enhancer. Transfusion (2009)), 지지 기질 세포 없이 적아세포를 부유 배양(suspension culture)할 경우, 성공율이 매우 낮다(Ronzoni, L. et al. Erythroid differentiation and maturation from peripheral CD34+ cells in liquid culture: cellular and molecular characterization. Blood cells, molecules & diseases 40, 148-155 (2008) 및 Choong, M.L., Yang, H.H. & McNiece, I. MicroRNA expression profiling during human cord blood-derived CD34 cell erythropoiesis. Experimental hematology 35, 551-564 (2007)). 따라서, 대량생산을 위해서는 공급량이 절대적으로 부족하고 비싼 문제점을 해결할 수 있는 제조방법으로서, 우혈청 같은 이종물질의 첨가나 넓은 면적의 배양공간이 필요한 문제점을 야기할 수 있는 지지 기질 세포와의 공배양 없이, 시험관 내(in vitro)에서 적혈구를 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다.
본 발명자들은 지지 기질 세포의 공배양 없이 적혈구 세포를 시험관 내(in vitro)로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세포 배양기 내부에 정전기적 특성을 부여하여 배양을 수행하였을 때, 특히 양전하로 하전시켜 정전기적 특성을 부여하여 적혈구 세포의 전구체 즉 적아세포(erythroblasts)를 배양하였을 때, 지지 기질 세포의 공배양 없이도 하전된 배양 표면이 지지 기질 세포의 기능을 수행하여, 높은 효율로 세포핵 유출(enucleation)을 유도한다는 것을 발견하였다. 이는 정전기적 특성이 점착성 세포 뿐만 아니라 적혈구 세포의 전구체와 같은 부유 세포의 배양에 있어서도 영향을 미칠 수 있다는 것으로 매우 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명은 정전기적 특성을 이용하여 지지 기질 세포의 공배양 없이 적혈구 세포의 전구체를 부유 배양하여 적혈구 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 지지 기질 세포의 공배양 없이 적아세포(erythroblasts)를 부유 배양하여 적혈구 세포를 제조하는 방법에 있어서, 양전하로 하전된(positively charged) 내부 표면을 갖는 배양기 중에서 상기 적아세포를 부유 배양하여 세포핵 유출(enucleation)을 유도하는 것을 특징으로 하는 적혈구 세포의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기는 바닥 표면이 양전하로 하전된 배양 플레이트일 수 있다.
상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기는 아민 기를 도입시킨 유리판(glass plate)을 배양기의 내부 표면 상에 고정시켜 얻어진 것일 수 있으며, 일 구현예에서 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기는 아민 기를 도입시킨 유리판을 배양 플레이트의 바닥 표면 상에 고정시켜 얻어진 배양 플레이트일 수 있다.
상기 아민기의 도입은 (3-아미노프로필)트리메톡시실란, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필메틸디에톡시실란, 및 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택된 아민기-함유 실란 커플링제(amine group-containing silane coupling agents)로 유리판을 처리함으로써 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 아민기-함유 실란 커플링제 처리는 C1-C4 알코올 중의 상기 아민기-함유 실란 커플링제의 용액을 상기 유리판에 가하고 12～48 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 의해, 양전하로 하전된 표면 상에서 적아세포를 배양할 경우, 지지 기질 세포의 공배양 없이도 하전된 배양 표면이 지지 기질 세포의 기능을 수행하여, 높은 효율로 세포핵 유출(enucleation)을 유도함으로써, 적혈구 세포를 높은 효율로 제조할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 단순히 배양기 표면을 양전하로 하전시켜 적아세포를 부유배양함으로써, 단순하고 경제적으로 적혈구 세포를 제조할 수 있다.
본 명세서에서, "적아세포(erythroblasts)"라 함은 적혈구 세포로 분화되기 전의 세포 즉, 적혈구 세포의 전구체를 말한다. 상기 적아세포는 호염기적 적아세포(basophilic erythroblast), 정염성 적아세포(orthochromic erythroblasts), 및 다염성 적아세포(polychromatophilic erythroblast)를 모두 포함한다. 상기 적아세포는 조혈 줄기 세포, 예를 들어 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포로부터 공지의 방법(예를 들어, Baek EJ, Kim HS, Kim JH, Kim NJ & Kim, H.O. Stroma-free mass production of clinical grade red blood cells by using poloxamer 188 as an RBC survival enhancer. Transfusion (2009))에 따라 분화시켜 얻을 수 있다.
본 발명은 지지 기질 세포의 공배양 없이 적아세포(erythroblasts)를 부유 배양하여 적혈구 세포를 제조하는 방법에 있어서, 양전하로 하전된(positively charged) 내부 표면을 갖는 배양기 중에서 상기 적아세포를 부유 배양하여 세포핵 유출(enucleation)을 유도하는 것을 특징으로 하는 적혈구 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기는 바닥 표면이 양전하로 하전된 배양 플레이트일 수 있다.
상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기는 통상적으로 사용되는 배양기[예를 들어, 인큐베이터(incubator), 배양 플레이트 등] 표면에 직접 양전하를 도입하여 제작할 수 있다. 그러나, 이 경우 배양기를 새롭게 제작하여야 하여야 하는 경우도 발생할 수 있으므로, 통상의 배양기 즉, 인큐베이터(incubator), 배양 플레이트 등을 그대로 사용하면서, 내부 표면에 양전하를 도입하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기는 양전하로서 아민기(amine group)를 도입시킨 유리판(glass plate)을 배양기의 내부 표면 상에 고정시켜 얻어질 수 있다. 일 구현예에서 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기는 아민 기를 도입시킨 유리판을 배양 플레이트의 바닥 표면 상에 고정시켜 얻어진 배양 플레이트일 수 있다. 상기 유리판은 예를 들어, 통상적으로 현미경에 사용되는 커버 글라스일 수 있고, 또한, 유리 섬유(glass fiber)가 중첩되어 얻어진 구조의 플레이트(plate)일 수도 있다. 상기 유리판의 크기는 크게 제한되는 것은 아니나, 디스크 형태일 경우 5～1000 mm, 더욱 바람직하게는 50～100 mm의 범위의 직경을 가질 수 있다. 상기 유리판의 형상은 크게 제한되는 것은 아니며, 디스크 형태, 사각형 등의 다각형 형태일 수 있다.
양전하로서 아민기(amine group)를 도입시킨 유리판 또는 유리 디스크는 아민기를 함유하는 실란 커플링제(amine group-containing silane coupling agents)로 유리판 또는 유리 디스크을 처리함으로써 제작될 수 있으며, 상기 아민기-함유 실란 커플링제는 3-아미노프로필)트리메톡시실란, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필메틸디에톡시실란, 및 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 아민기를 함유하는 실란 커플링제 처리 는 페닐트리에톡시실란, 페닐트리메톡시실란, 테트라에톡시실란 등의 알콕시 혹은 아릴옥시 실란류; 메탄올, 에탄올 등의 C1-C4 알코올; 테트라히드로퓨란; 아세토니트릴 등의 용매 중에서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 아민기-함유 실란 커플링제 처리는 C1-C4 알코올, 바람직하게는 메탄올 중의 상기 아민기-함유 실란 커플링제의 용액을 상기 유리판 또는 유리 디스크에 가하고 12～48 시간 동안, 바람직하게는 15～24 시간 동안, 더욱 바람직하게는 약 24 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다.
상기 부유 배양(suspension culture)은 통상의 방법에 따라 적절한 배지 중에서 적아세포를 배양함으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들이 보고한 바 있는 방법 즉, Baek EJ, Kim HS, Kim JH, Kim NJ & Kim, H.O. Stroma-free mass production of clinical grade red blood cells by using poloxamer 188 as an RBC survival enhancer. Transfusion (2009 Epub ahead of print)에 개시된 배지 및 배양 시간에 따라 부유배양을 수행할 수 있다. 상기 배지는 또한 IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), Stemline, X-vivo 등의 배지를 사용할 수 있으며, 배양 시간은 수시간～수주 동안 필요에 따라 조절할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예.
본 발명자들은 정전기적 힘이 다양한 비특이적인 물리적 성질에 의하여 지지 기질 세포와 유사한 환경을 제공함으로써, 세포와 배양기 표면 사이의 전기적 상호작용을 통하여 세포핵 유출에 영향을 미칠 수 있을 것으로 가정하였다. 이를 위해, 종래의 배양 플레이트 및 정전기적 특성이 구분되도록 다양하게 변형시킨 배양 플레이트를 제작하여 영향을 평가하였다. 즉, 소수성 플레이트(hydrophobic plates, DTOPV), 종래의 조직 배양 플레이트(traditional tissue culture plates, TCPS), 음전하으로 하전된 플레이트(negatively charged plates, DTOPV-UV), 및 음전하 및 양전하로 하전된 플레이트(NP 플레이트)를 제작하여, 세포핵 유출에 미치는 영향을 평가하였다. 또한, 세포핵 유출에 대한 아민기의 영향을 확인하기 위하여, 다음 4종의 플레이트를 추가로 평가하였다: TCPS, NP 플레이트, 10% 아민용액으로 표면 코팅된 플레이트(10% 아민 플레이트), 및 NP 플레이트와 유사한 밀도의 아민기로 표면 코팅된 플레이트(3.3% 아민 플레이트). 제대혈 조혈 줄기 세포는 21일 동안 배양하여 정염성 적아세포로 분화시켰다. 이후, 동일한 양의 적아세포를 상기 배양 플레이트 상에 분주하였다. 배양 1일 또는 2일 후에, 세포핵 유출율을 측정하였다.
1. 시험방법
(1) 세포 배양 플레이트
TCPS는 카르복실 및 히드록실 기를 표면에 가짐으로써, 단순한 폴리스티렌 표면에 비하여 친수성을 증가된 배양 플레이트이다(도 1a). 소수성 표면 즉, 유리 기질 상에 140 nm의 평균 두께를 갖는 광-반응성 디페닐아미노-s-트리아진 가교된 p-페닐렌 비닐렌 중합체(photo-reactive diphenylamino-s-triazine bridged p-phenylene vinylene polymer, DTOPV) 필름을 DTOPV의 클로로포름 용액(1 wt %)을 사용하여 1300 rpm 에서 15 초 동안 스핀 캐스트(spin cast) 방법으로 준비한 다음, 실온에서 건조하여 용매를 제거하였다(도 1b). 이후, DTOPV 얇은 필름을 고강도 UV 램프(Rolence Enterprise, Inc.,Taiwan, power: 13.05 mW/cm2, model POWERARC UV 100)에 60 분 동안 노출시켰으며, DTOPV 구조의 비닐렌기를 파괴하여 카르복실기가 제공되도록 하였다(DTOPV-UV)(도 1c). FT-IR 측정결과, UV 여기(excitation) 후 COOH 기가 형성된 것으로 나타났다. 상기 UV 노출된 DTOPV의 광-유발된 카르복실레이트 진동의 면적 강도는, 상기한 바와 같이 UV 비-노출된 것에 비하여, ～10 % 정도 높았다. 이리하여, 상기 표면 성질은 소수성에서 친수성으로 변화되었으며, 또한 광-산화를 통하여 광-유발된 COOH 기로 인하여 음성의 특성으로 변화되었다(도 1b,c). 또한, 상업적으로 구입한 아민-풍부 조직 배양 플레이트((NP plates; Primaria？ BD falcon, San Jose, CA)를 비교하였으며, 이는 폴리스티렌에 산소/질소 플라스마를 처리함으로써 -COOH 및 -NH2와 같은 산소- 및 질소-함유 관능기를 도입시켜 제조된 것이다(도 1d). 상기 플레이트는 6%의 화학적으로 결합된 질소(N) 및 15%의 결합된 산소(O) 를 갖는다.
세포핵 유출에 대한 아민기의 영향을 확인하기 위하여, TCPS, NP 플레이트, 아민기로 완전히 포화되도록 표면 코팅된 플레이트(10% 아민 플레이트), 및 NP 플 레이트와 유사한 밀도의 아민기로 표면 코팅된 플레이트(3.3% 아민 플레이트)에 대하여 추가로 시험하였다. 아민기를 도입하기 위하여, 커버 슬라이드를 메탄올 중의 (3-아미노프로필)트리메톡시실란(APTES; 알드리치)의 3.3% (v/v %) 및 10% (v/v %) 용액을 사용하여 밤새 실온에서 인큐베이션하여 처리하였다. 이후, 상기 슬라이드를 PBS로 세척하고, 챔버 슬라이드 플레이트(Lab-Tek II chamber slide system, Nalge Nunc International, Naperville, IL)로 옮겼다. 상기 커버 슬리이드에 의해 덮여진 표면 면적은 챔버 슬라이드 면적에 비하여 67.5% 이었다.
(2) 표면 특성의 비교
배양 플레이트의 표면 특성을 비교하기 위하여, 전하량, 접촉각, 및 필름의 거침도(roughness)를 You, J. et al. A Fluorescent Polymer for Patterning of Mesenchymal Stem Cells. Macromolecules 42, 3326-3332 (2009)에 따라 UV 노출 전 및 후에 측정하였다.
(3) 적혈 세포(erythroid cell)의 배양
이전에 보고된 방법(Baek EJ, Kim HS, Kim JH, Kim NJ & Kim, H.O. Stroma-free mass production of clinical grade red blood cells by using poloxamer 188 as an RBC survival enhancer. Transfusion (2009)))에 따라, 제대혈 CD34+ 세포를 IMDM 배지 중에서 시약 및 사이토카인과 함께 21 일 동안 배양하여 정염성 적아세포(orthochromic erythroblasts)로 분화시켰다. 단, 제대혈 유래 혈장 대신 소태아 혈청을 사용하여 분화를 유도하였다. 이후, 동일한 양의 적혈 세포를, 단일층으로 존재하도록, 상기에서 준비한 배양 접시에 1 x 105/cm2 의 밀도로 가하였다(도 2). 통상 세포핵 유출에 필요한 시간은 약 8.4 분으로 알려져 있으므로(Hebiguchi, M. et al. Dynamics of human erythroblast enucleation. International journal of hematology 88, 498-507 (2008)), 성숙 상태에 따라 상기 배양을 약 1 또는 2 일 동안 유지하였다. 이후, 세포핵 유출율(총 세포 중 세포핵이 유출된 세망세포(reticulocytes)의 퍼센트)를 Wright-Giemsa 염색 후 광학 현미경하에서 계수하였다. 생존율은 트리판 블루 염색에 의해 분석하였다. 적혈 세포가 높은 순도로 잘 성숙하였는지 확인하기 위하여, 유세포 분석을 사용하여, CD71, 글라이코포린 A(glycophorin A), 태아성 헤모글로빈(fetal hemoglobin), 및 성체 헤모글로빈(adult hemoglobin)을 분석하였으며, 이들은 기존에 보고된 바와 같이에 따라 성숙 적혈 세포 특이적 마커이다(Baek EJ, Kim HS, Kim JH, Kim NJ & Kim, H.O. Stroma-free mass production of clinical grade red blood cells by using poloxamer 188 as an RBC survival enhancer. Transfusion (2009))).
(4) 통계 분석
4 그룹 중 세포핵 유출율 및 생존율은 일원배치 분산분석(one way ANOVA) 및 Prism 3.0 (Graphpad, La Jolla, CA)을 사용한 Dunnett's 다중 비교 시험(Dunnett's multiple comparison test)에 의해 비교하였다. 결과는 P<0.05에서 통계적으로 유의성 있는 것으로 간주하였다. 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다.
2. 시험결과
(1) 배양된 세포 상태
배양 21일째에, 배양된 세포는 거의 순수하게 적혈구계(erythroid lineage)로 분화하였고, 주로 정염성 적아세포로 이루어졌다(도 3a). 배양된 세포는 바닥 표면과 완전히 접촉하도록 단일층으로 유지시켰다(도 2). 거의 모든 세포가 적혈 세포의 특이적 마커인 CD71, 글라이코포린 A 및 헤모글로빈을 발현하였다(도 4). 세포가 제대혈로부터 유래되었기 때문에, 상기 헤모글로빈은 태아 및 성체 형태의 헤모글로빈으로 나타났다. 4 종의 플레이트 상에서의 배양 후에, 세포핵 유출 과정의 세포, 유출된 핵, 및 세포핵 유출된 RBCs를 계수하였다(도 2b).
(2) 세포핵 유출율의 비교
가장 높은 평균 세포핵 유출은 NP 플레이트에서 56.8%로 발생하였다(표 1). DTOPV 이외의 3개의 플레이트에서의 평균 세포핵 유출이 약간 유사하였으나, NP 플레이트는 DTOPV에 비하여 지속적으로 더욱 높은 세포핵 유출을 나타냈으며, 1.5 배 더 높은 세포핵 유출율로 매우 유의성 있게 낮은 P 값(P<0.001)으로 나타났다. 이러한 우수한 결과는 통상 세포핵 유출 및 세포 생존율에 있어서 매우 넓은 변화를 나타내는 초기 세포 배양에 있어서 특히 중요하다. DTOPV-UV 및 TCPS는 또한 DTOPV 보다 각각 53.2% 및 52.2%로 유의성 있게 높은 세포핵 유출율(P<0.05)을 나타냈다(표 1).
| 배양 플레이트 |
세포핵 유출율(%)* |
노출된 화학기 |
접촉각(°) | Δ°DTOPV에 비해 증가된 세포핵 유출(%) | DTOPV와 비교한 세포핵 유출의 P 값 |
| DTOPV | 39.0 ± 5.2 | 3급 아민 | 97.1 | 100 | 1 |
| DTOPV-UV | 53.2 ± 6.3 | -COOH, 3급 아민 |
83.1 | 136 | < 0.05 |
| TCPS | 52.2 ± 7.5 | -COOH, -OH | 56 | 134 | < 0.05 |
| NP 플레이트 | 56.8 ± 6.5 | -COOH, -OH, -NH2 | ~40 | 146 | < 0.001 |
n= 12, * 평균 ± 표준오차
-COOH 관능기를 갖는 음전하로 하전된 표면에 있어서, TCPS 및 DTOPV-UV는 유사한 세포핵 유출율을 나타냈으나, 접촉각이 상이하였다. 이는 플레이트의 친수성만이 세포핵 유출율 증가의 원인은 아님을 시사한다(표 1). 세포핵 유출율 증가의 다른 주요 이유는 히드록실- 및 카르복실-기의 상이한 조성 및 중합체의 화학적 구조일 수 있다. DTOPV-UV 표면의 표면 접촉각은 TCPS에 비하여 더 높으며 NP 플레이트 보다는 훨씬 크기 때문에, DTOPV-UV 표면은 유사한 세포핵 유출율을 나타내는 세개의 플레이트 중 제일 낮은 친수성을 갖는다. 따라서, 세포핵 유출율 증가의 주요 원인은 친수성 뿐만 아니라 세포와 표면 사이의 정전기적 상호작용을 증가시키는 화학적 구조에 기인한 것일 수 있다. DTOPV-UV는 트리아진 및 디페닐아미노기 중에 3급 아민 구조를 가지며, 이는 세포핵 유출율을 촉진할 수 있다. 생존율은 4개의 플레이트 중 유의성 있는 차이가 없었으며(P=0.84), 이는 플레이트 표면 독성이 없음을 나타낸다.
NP 플레이트에서 지속적으로 더 높은 세포핵 유출에 미치는 -NH2 기의 영향을 확인하기 위하여, 상이한 밀도의 아민기로 코팅한 플레이트를 시험하였다 (표 2). 10% -NH2 플레이트는 시험된 3개의 다른 플레이트에 비하여, 매우 유의성 있게 높은 세포핵 유출율을 나타내었으며(P<0.001), 1.4 배 많은 RBCs를 제공하였다. 3.3% -NH2 플레이트 및 유사한 밀도의 아민기를 갖는 NP 플레이트는 유사한 세포핵 유출율을 나타냈으며, 이는 다른 음성의 화학기 보다 아민기의 중요한 역할을 확인해 준다. 세포핵 유출의 증가를 이론적으로 계산한다면, 소수성 플레이트에 비하여, TCPS는 소수성 표면에 비해 134% 많은 RBCs를 제공하고, 10% -NH2 기는 140 % 많은 RBCs를 제공하므로, 결국 -NH2 기는 188% 많은 RBCs를 제공할 수 있다 (134% x 140% = 188%). 4 군 중 생존율은 또한 상이하지 않았으며, 이는 제조된 표면이 독성이 없음을 확인해 준다.
| 배양 플레이트 | 세포핵 유출(%)* | ΔTCPS에 비해 증가된 세포핵 유출(%)* | 10% -NH2에 대한 세포핵 유출의 P 값 |
| TCPS | 46.4 ± 8.2 | 100.0 | < 0.001 |
| NP 플레이트 | 48.5 ± 7.2 | 104.5 | < 0.001 |
| 3.3% -NH2 플레이트 | 47.0 ± 8.8 | 101.4 | < 0.001 |
| 10% -NH2 플레이트 | 64.9 ± 6.0 | 139.8 | 1 |
n= 6, * 평균 ± 표준오차
결론적으로, 소수성 플레이트(DTOPV)에 비하여 더욱 친수성의 음성으로 대전된 TCPS 배양 표면 및 음성으로 대전된 플레이트(DTOPV-UV) 상에서 현저하게 높은 세포핵 유출율을 나타냈다. NP 플레이트는 더욱 현저하게 증가된 세포핵 유출을 나타냈으며, 소수성 군에 비하여 평균 1.5배 높은 세포핵 유출을 나타냈다. 증진된 세포핵 유출에 미치는 NP 플레이트 중의 아민-기의 영향을 최대화하기 위한 시험에서, 10% 아민 플레이트는 TCPS, NP 플레이트, 및 3.3 아민 플레이트에 비하여 유의성 있게 높은 세포핵 유출율을 나타냈으며(P<0.001), 40% 이상의 세포핵 유출된 RBCs를 생성하였다.
(2) DTOPV 코팅된 표면의 특성
본 발명자들은 DTOPV 코팅된 필름의 특성 및 UV 노출에 의한 표면 성질의 변화을 상세히 보고한 바 있다(You, J. et al. A Fluorescent Polymer for Patterning of Mesenchymal Stem Cells. Macromolecules 42, 3326-3332 (2009)). UV 노출은 DTOPV를 더욱 친수성이도록 하였으며, 정전기적 전하가 음성으로 되게 하였다. DTOPV 필름의 물 접촉 각(water contact angles)은 UV 노출에 따라 97.1°에서 83.1°로 감소하였다. DTOPV 및 DTOPV-UV 표면의 평균 거침도(roughness, Rm)는 0.43 nm 차이로 매우 유사하였다. 따라서, DTOPV 및 DTOPV-UV 표면 간의 세포핵 유출율의 차이는 표면 거침도에 기인할 수는 없다.
3. 고찰
고분자 생체물질(polymeric biomaterials)이 점착성 세포 배양에 널리 사용되어 왔다. 그러나, 부유 세포에 대한 적절한 미세환경을 유지하기 위하여, 특히 성숙 적혈 세포 및 이들의 세포핵 유출 조건을 위한 고분자 세포 배양 플레이트의 적용가능성에 대한 연구는 행해진 바 없다.
부유 세포는 피펫팅(pipetting)에 의해 배지 중에 쉽게 현탁되며, 중력에 의해 세포 배양 플레이트의 바닥으로 가라앉아 단일층을 형성하지만, 상기 표면에 견고하게 부착하지는 않는다. 단순하고 손쉬운 방법을 사용하여, 본 발명자들은 배양 플레이트의 정전기적 특성을 변화시켜, 어떠한 표면 상호작용이 RBCs를 가장 안정한 방법으로 다량의 세포를 생성하는지 평가하였다. 단순하고 경제적인 코팅 방법만을 사용하여, 본 발명자들은 부유 세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 폴리스티렌 표면에 비하여 1.88 배 많은 RBCs를 얻을 수 있었다.
상기 결과에 따라, 부유된 적혈 세포의 플레이트 표면과의 상호작용은 소수성 DTOPV 플레이트에 비하여 TCPS 및 DTOPV-UV 표면의 더 많은 친수성 표면 상에서 세포핵 유출을 증진시킨다. 놀랍게도, 상기 세포핵 유출율은 TCPS 및 DTOPV-UV의 음성기를 발현시키는 것 보다 NP 플레이트에서 더욱 높았다. 또한, 추가의 연구에 의해, 본 발명자들은 더욱 높은 밀도의 아민기에서 세포핵 유출율을 증가시킬 수 있었다. 이는 아민-플레이트의 음성기가 세포핵 유출을 위하여 -NH2 기 보다 덜 효과적이라는 것을 시사한다.
따라서, 본 연구로부터 첫번째로 중요한 결론은 부유 세포에 대한 플레이트 표면의 정전기적 효과를 환한 것이며, 이는 이전에 알려진 바 없다. 또다른 중요한 결론은 세포 유출 거동은 핵을 밖으로 유출시키기 위하여 부착가능한 지지면(supporting ground)을 필요로 하는 것을 확인한 것이다. 이는 세포-세포 접촉을 통하여 세포 부착 부위(anchorage)를 제공하기 위하여 기능하는 중간엽 줄기 세포와 같은 기질 세포 상에서 배양될 때, 더욱 우수한 세포핵 유출 결과를 부분적으로 설명한다. 이는 골수에서의 현상을 뒷받침하며, 골수에서는 적아세포가 부착하기 위하여 CD163 표면 당단백질 또는 Emp 단백질과 같은 수용체를 통하여 대식세포와 접촉시 적아세포로부터 세포핵이 유출된다. 대식세포 자체는 세포핵 유출에 대한 필수적인 인자는 아니지만, 세포핵 유출을 위하여 중요한 부착 표면을 제공하는 것으로 추정된다. 또한, 상기 결과는 설치류 적백혈 세포(erythroleukemia cells)의 세포핵 유출이 배양 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅시켰을 때 더욱 잘 분화된다는 보고(Patel, V.P. & Lodish, H.F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. J. Cell Biol. 105, 3105-3118 (1987))와 일치한다.
RBC 막은 글라이코포린과 같은 풍부한 내부 및 세포-표면 막 단백질을 함유한다. 상기 막은 높게 글라이코실화되어 있기 때문에, 표면에 음성 전하를 생성한다. 하나의 RBC는 그 세포 표면에 음전하를 가지고 있으며, 이는 서로 반발하여 RBCs 사이에 거리를 유지하도록 한다. 유사한 정전기적 힘은 배양 플레이트에 대한 세포의 부착 혹은 반발의 원인이 될 수 있으며, COOH 및 NH2 기와 같은 극성 관능기의 존재는 유리하게 또는 불리하게 작용할 수 있다. 친수성이고 또한 양이온기를 노출하는 플레이트는 음전하만을 갖는 것에 비하여 매우 유의성 있는 세포핵 유출율 증가를 나타냈으며((P<0.001), 이는 RBC 막의 음전하가 정전기적 상호작용을 통하여 플레이트 표면으로부터 반발한다는 것을 시사한다.
유출된 핵은 혈장 막 및 연관된 세포골격 요소(cytoskeletal elements)의 얇은 줄기(stalk)를 통하여 망상적혈구(reticulocyte)로 연결된다. 물리적 힘이 가해지지 않은 한, 망상적혈구로부터 상기 유출된 핵의 자발적인 분리는 거의 발생하지 않는다[Hebiguchi, M. et al. Dynamics of human erythroblast enucleation. International journal of hematology 88, 498-507 (2008)]. 상기 핵 및 주위의 세포질 내부의 DNA의 음전하는 정염성 적아세포의 세포핵 유출 부위에 음전하를 야기하게 된다. 세포핵 유출 부위의 음전하와 연결된 망상적혈구 사이의 반발력 및 양전하 표면 플레이트와 망상적혈구 사이의 고정된 힘은 연결 줄기(connecting stalk)의 최종 절단에 도움을 주게 된다. 배양 용액 중 세포들의 약한 브라운 운동(Brownian movement)은 부착된 세포에 자극을 가하게 되어 매달려 있는 핵(hung nucleus)을 떨어뜨리게 된다.
배지 중에 함유된 혈청은 피프로넥틴(fibronectin, Fn)을 통하여 정염성 적아세포의 부착을 증진시킬 수 있으며, 피브로넥틴은 최종 적혈구 생성에 중요한 것으로 알려져 있다(Lodish, H.F. & Patel, V.P. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The journal of cell biology 105, 3105-3118 (1987)). 매트릭스 단백질인 피브로넥틴은 세포 부착을 야기하며, 세포-결합 부위를 통하여 펼쳐진다. 이는 소수성 표면에 더욱 잘 부착하며, 또한 소수성 표면을 형성한다(Khademhosseini, A. et al. Cell and protein compatibility of parylene-C surfaces. Langmuir 23, 11718-11725 (2007); Toworfe, G.K. et al. Effect of functional end groups of silane self-assembled monolayer surfaces on apatite formation, fibronectin adsorption and osteoblast cell function. Journal of tissue engineering and regenerative medicine 3, 26-36 (2009)). 더 많은 피브로넥틴을 갖는 소수성 플레이이트가 세포핵 유출을 감소시켰기 때문에, 상기 효과는 프브로넥틴 부착으로부터 유래한 것이 아니라 정전기적 상호작용으로부터 유래한 것으로 사료된다. 또한, 배지 중의 혈청은 세포 부착에 영향을 미치지 않는다는 보고도 있으며(Lawrie, F., McInnes, C., Forrester, J.V. & Curtis, A.S. Adhesion of cells to polystyrene surfaces. The journal of cell biology 97, 1500-1506 (1983); Godek, M.L., Malkov, G.S., Fisher, E.R. & Grainger, D.W. Macrophage Serum-Based Adhesion to Plasma-Processed Surface Chemistry is Distinct from That Exhibited by Fibroblasts. Plasma processes and polymers 3, 485-497 (2006)), 또한, TCPS 상에 흡착된 피브로넥틴 양은 세포 부착에 충분하지 않다는 보고도 있다(Steele, J.G., Dalton, B.A., Johnson, G. & Underwood, P.A. Polystyrene chemistry affects vitronectin activity: an explanation for cell attachment to tissue culture polystyrene but not to unmodified polystyrene. Journal of biomedical materials research 27, 927-940 (1993)). 또한, 적혈 세포 분화의 나중 단계에서, 피브로넥틴에 대한 부착의 감소가 발생하며, 세망세포(reticulocytes)는 비부착 상태로 존재하게 된다(Patel, V.P. & Lodish, H.F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. J. Cell Biol. 105, 3105-3118 (1987)). 그러므로, 피브로넥틴은 세포핵 유출을 위해 필수적으로 중요한 것이 아니며, 단지 다른 부착성 세포에서 제시된 바와 같이 정전기적 상호작용에 의해 부착을 제공한다(Lawrie, F., McInnes, C., Forrester, J.V. & Curtis, A.S. Adhesion of cells to polystyrene surfaces. The journal of cell biology 97, 1500-1506 (1983))
본 발명에 따른 상기 결과는 정전기력이 미세환경에 존재하며, 핵 유출 거동에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 전형적으로, COOH 기는 염기성 혹은 약염기성 용액 중에서 COO- 로서 존재하고, 따라서 음전하 기로서 취급된다. 상기 시험에서, 배지는 중성(pH 7.4)이며, 따라서 상기 COOH기는 부분적으로 COO- 로서 유지되나, 전기적 비편재화에 의해 양성자 및 카르보닐 탄소에서 여전히 양성의 특성을 갖는다. 그러므로, 이들은 도 5a에 도시적으로 나타낸 바와 같이 적아세포의 세포핵 유출에 대한 정전기력을 제공한다. NP 플레이트의 경우, NH2 기는 인접한 COOH로부터의 양성자화에 따라 양성의 특성을 가지며, 따라서 적아세포의 세포핵 유출을 위하여 강한 정전기력을 제공한다(도 5b). 생체-물질을 사용한 보이지 않는 정전기적 상호작용을 특성화함으로써, 값비싼 공배양 과정을 제거하면서, 더욱 효율적인 RBC 대량생산 시스템에 적용되어 더욱 많은 RBC 생성물을 제공할 수 있다. 아민기를 갖는 세포 배양 플레이트는 정전기력에 의해 적아세포의 세포핵 유출을 증가시킨다. 아민기의 양전하는 음전하의 표면 당단백질을 갖는 부유 적혈 세포와 상호작용할 수 있다.
도 1은 시험에 사용된 배양 플레이트의 표면 분자 특성을 나타낸다. 도 1에서 (a)는 -COOH 및 -OH를 갖는 종래의 조직 배양 플리이트, (b)는 UV 노출 전의 소수성 DTOPV (3급 아민만을 가짐), (c)는 DTOPV에 대한 UV 노출에 의해 생성된 -COOH를 갖는 DTOPV-UV, (d)는 -COOH, -OH & -NH2 를 갖는 NP 플레이트, 및 (e)는 아민-코팅된 플레이트이다.
도 2는 제대혈 CD34+ 세포로부터 유래한 배양된 적혈 세포로서, TCPS 플라스크 중에서 12일(a) 및 21일(b)에 배양된 적혈세포의 형태를 나타낸다. 세포핵 유출 과정에 있는 정염성 적아세포(화살표)를 수확하여 준비된 세포 배양 플레이트에 동일한 밀도로 분주하였다. 상이한 플레이트 상에서의 1일 혹은 2일 후에, 세포를 수확하여(c), 세포핵 유출 계수를 위하여 염색하였다.
도 3은 배양된 적혈 세포의 형태를 나타낸다. 도 3에서 (a)는 제대혈 조혈 줄기세포로부터 시간 경과에 따른 적혈 세포의 성숙 과정을 나타낸다. 21일에, 정염성 적아세포를 상이한 배양 플레이트에 분주하였으며, 2일 동안 계속 배양하였다. 이후, 세포핵 유출된 세포를 Wright-Giemsa 염색에 의해 계수하였다(x400). 화살표는 세포핵 유출된 세망세포를 나타낸다. 세포핵 유출 후, 상기 세포를 여과하여 RBCs를 순수하게 수확하였다.
도 4는 배양된 적아세포의 유세포 분석 결과를 나타낸다. (a) 제대혈 유래 적혈 세포의 특이적 마커가 배양된 세포에서 매우 높게 발현되었으며, 이는 시험전 에 배양된 적아세포의 순도를 확인해 준다. (b) 조혈 줄기세포가 제혈로부터 유래되었기 때문에, 성숙한 적혈세포는 글라이코포린 A(glycophorin A) 및 태아와 성체 헤모글로빈 모두를 순수하게 발현하였으며, 이는 비-적혈계(non-erythoid lineages)를 배제한 적혈세포의 높은 순도를 나타낸다. (c) 21일째에 배양된 세포 또한 CD71 및 글라이코포린 A를 발현하였으며, 이는 적혈세포임을 나타낸다.
도 5는 (a) COOH 플레이트 (TCPS 및 DTOPV-UV) 및 (b) 아민-플레이트 상에서 인간 적아세포의 세포핵 유출에 대한 모식도이다.
Claims (6)
- 지지 기질 세포의 공배양 없이 적아세포(erythroblasts)를 부유 배양하여 적아세포를 적혈구 세포로 분화시키는 방법에 있어서, 양전하로 하전된(positively charged) 내부 표면을 갖는 배양기 중에서 상기 적아세포를 부유 배양하여 세포핵 유출(enucleation)을 유도하는 것을 특징으로 하는 적아세포를 적혈구 세포로 분화시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기가, 바닥 표면이 양전하로 하전된 배양 플레이트인 것을 특징으로 하는 적아세포를 적혈구 세포로 분화시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기가 아민 기를 도입시킨 유리판(glass plate)을 배양기의 내부 표면 상에 고정시켜 얻어진 것임을 특징으로 하는 적아세포를 적혈구 세포로 분화시키는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 양전하로 하전된 내부 표면을 갖는 배양기가 아민 기를 도입시킨 유리판을 배양 플레이트의 바닥 표면 상에 고정시켜 얻어진 배양 플레이트인 것을 특징으로 하는 적아세포를 적혈구 세포로 분화시키는 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 아민기의 도입이 (3-아미노프로필)트리메톡시실란, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필메틸디에톡시실란, 및 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택된 아민기-함유 실란 커플링제로 유리판을 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 적아세포를 적혈구 세포로 분화시키는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 아민기-함유 실란 커플링제 처리가 C1-C4 알코올 중의 상기 아민기-함유 실란 커플링제의 용액을 상기 유리판에 가하고 12～48 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 적아세포를 적혈구 세포로 분화시키는 방법.
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