KR101127756B1

KR101127756B1 - Ｇｉｔ１ 유전자 결손 마우스 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101127756B1
Application number: KR1020110089182A
Authority: KR
Inventors: 김은준; 강창원; 마원; 원혜정; 함은경; 김은진
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2012-03-23
Also published as: US20130061338A1; JP2013054023A; JP5436511B2; US8552253B2

Abstract

본 발명은 뇌의 신경시냅스 단백질인 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1)유전자가 결손된 인간을 제외한, 특히 포유류를 주의력결핍 과잉행동장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD) 모델로 사용하는 방법에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 GIT1 결손 생쥐에 대한 분자 생물학적, 세포 생물학적, 전기 생물학적, 동물 행동학적 분석에 관한 것으로, 후보물질인 약물 투여를 통한 주의력결핍 과잉행동장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD)인 과잉 행동과 전두엽에서의 세타파의 회복을 관찰하여, 주의력결핍 과잉행동장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD) 회복을 유도할 수 있는 새로운 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

Description

ＧＩＴ１ 유전자 결손 마우스 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법{Screening of drug for Attention Deficit Hyperactive Disorder by using GIT1 knock-out mice as a novel ADHD mouse model}

본 발명은 뇌의 신경시냅스 단백질인 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1)의 유전자가 결손된 인간을 제외한, 특히 포유류를 주의력결핍 과잉행동장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD) 모델로 사용하는 방법에 대한 것이다.

또한, 본 발명은 GIT1 결손 생쥐에 대한 분자 생물학적, 세포 생물학적, 전기 생물학적, 동물 행동학적 분석에 관한 것으로, 후보물질인 약물 투여를 통한 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD)인 과잉행동과 전두엽에서의 세타파의 회복을 관찰하여, 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 회복을 유도할 수 있는 새로운 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

주의력결핍 과잉행동장애(이하 'ADHD' 라고 함)는 주의력 결핍, 과잉행동, 충동성을 보이는 널리 알려진 정신 질환의 일종이다. 전 세계 취학 아동의 5% 정도가 ADHD 관련 증상을 보일 정도로 유병률이 매우 높은 질환이다. 또한 Leibson 등(2001, JAMA, 285, 60-66.)의 연구에 따르면, ADHD 증상을 보이는 아동을 둔 가정의 경우, 그렇지 않은 가정에 비해서 2배 정도 높은 의료비를 보인다. 그리고 ADHD 아동의 부모는 스트레스와 자책감, 심지어 우울증 증세를 보이는 등, 사회 전반적으로 ADHD의 치료에 대한 필요성이 부각되고 있다. 이러한 높은 유병률과 이에 따른 사회적 영향에 의하여 ADHD의 발병 기전을 밝히기 위해 세계적으로 많은 연구가 진행되어 왔다.

ADHD의 기전을 설명하기 위하여 많은 가설이 제시되었고, 이중 도파민 가설이 가장 많은 주목을 받아왔다. 그러나 유전체 역학 연구(genome-wide linkage or association studies)들에서 도파민과 무관한 많은 유전자들이 ADHD 와 연관이 있음이 밝혀졌다. 이와 함께, ADHD의 이질성과 강한 유전성은 다양한 ADHD 관련 유전자의 존재를 강하게 시사하고 있다.

히스타민 H3 수용체는 1987년에 알-알파-메틸히스타민(R-α-methylhistamine) 및 치오페라미드(thioperamide) 등과 같은 H3 작용 리간드가 발견됨에 따라서 히스타민 H3 수용체의 역할이 확인되기 시작하였고, 아울러 H3 수용체 길항제는 히스타민 뿐 만 아니라 다른 주요 뇌신경전달물질인 아세틸콜린, 도파민, 세로토닌 및 노르에피네프린의 분비조절작용이 있다는 사실도 일부 밝혀지기 시작하였다(Schlicker E., The histamine H3 receptor, Leurs and Timmerman ed., 12-26, Elsevier). 히스타민은 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린 등과 같은 신경전달물질의 분비를 직접적으로 조절할 수 있는 능력을 지니고 있기 때문에 H3 수용체 길항제는 위에서 언급한 기능 외에도 많은 다양한 약리작용을 지니고 있다. 즉, ADHD, 비만증, 간질, 정신분열증, 우울증, 통증, 약물남용/중독 등 매우 다양한 질환관련 작용들을 지니고 있기 때문에 단독으로 또는 타 약물과의 병용요법제로의 개발이 널리 시도되고 있다. 그러나 병용 투여되는 약물과의 상호작용 유발 가능성이 제기되면서 비이미다졸(nonimidazole)구조를 가진 H3 수용체 길항제 개발에 역점을 두기 시작하였다. 지금 현재 글락소-스미스클라인의 GSK-189254(임상 2상), GSK-239512(임상 1상), 존슨앤존슨의 JNJ-17216498(임상 2상), 바이오프로젯의 BF-2649(임상 1/2상) 등이 히스타민 H3 수용체 길항제로서 인지기능 장애 (알츠하이머질환), 수면장애 또는 정신병 치료제 신약을 목표로 활발하게 개발되고 있는 것으로 알려져 있다.

히스타민 H3 길항제로서 유용한 (1-4-피페리디딜) 벤즈이미다졸 유도체(특허문헌1, 한국특허등록 제10-0827470호)가 있으며, 많은 종류의 화합물이 알려져 있다.

이러한 ADHD의 연구를 위하여 많은 종류의 화합물의 개발뿐만 아니라, ADHD 의 다양한 모델 동물이 제안 되었다. Wultz 등(Behavioral and neural biology, 1990, 53(1), 88-102.)은 기존에 알려진 자발적인 과잉행동성 랫트(Spontaneous Hypertensive Rat, 이하 SHR 라고 함)이 ADHD 모델 동물로서 활용될 수 있음을 밝혔으며, 현재까지도 다양한 ADHD 관련 연구에 사용되고 있다. 특히 SHR에서 도파민의 분비와 대사에 문제가 있음이 밝혀졌으며 (Russell et al., Behav. Brain. Res., 1998, 163-171.), 이는 ADHD에서의 도파민의 중요성을 의미하는 연구 결과이다. 그러나 SHR의 ADHD관련 증상에 대한 병리학적 원인에 대한 뚜렷한 연구 결과는 없으며, 도파민과 ADHD의 연관성은 지속적으로 밝혀지고 있으나, 인과 관계가 뚜렷하게 밝혀졌다고 보기에는 무리가 있는 상황이다.

Gainetdinov 등(Science, 1999, 283(5400), 397-401.)은 도파민 수송체를 유전적으로 제거한 생쥐 (DAT-KO mice)를 이용한 실험을 통하여, 새로운 ADHD 모델 동물을 제안하였다. 이는 도파민 신호 전달과 관련된 단백질이 ADHD와 관련이 있다는 것을 직접적으로 증명한 논문으로, 기존의 도파민 가설을 뒷받침할 수 있는 발견이다. 그러나 DAT-KO mice의 경우, ADHD 증상을 회복하는 데에 있어서 도파민보다는 세로토닌이 더 중요함을 보이는 등, 도파민 가설과는 상반되는 연구 결과이기도 하다.

Hess 등 (J Neurosci., 1992, 12(7), 2865-74.)은 2번 염색체의 일부가 제거된 돌연변이 생쥐인 콜로보마(이하 Coloboma라고 함) 생쥐의 과잉행동에 주목하였으며, 이후 유전체 연관 연구 등을 통하여 제거된 2번 염색체 상에 존재하는 SNAP-25라는 단백질이 ADHD와 연관이 있음이 밝혀졌다. 그러나 이후의 ADHD의 기저 원인을 밝히기 위한 시도가 이루어지지 않아, coloboma 생쥐에서의 ADHD 기작에 대한 연구는 답보 상태이다.

위에서 언급한 ADHD 모델 동물 이외에도 다양한 모델이 제안되었으나, ADHD와 관련되어 있는 유전자가 밝혀져 있지 않거나, 대부분 동물 행동 실험 수준의 연구에 머물렀다. 따라서 ADHD 의 기저원인을 알기 위한 분자 생물학적, 세포 생물학적, 전기 생리학적 접근 방법의 필요성이 대두되었다. 이러한 방법을 통하여 얻어진 ADHD에 대한 연구 결과는 ADHD의 기저 원인에 대한 더 넓은 시야를 제공할 뿐만 아니라, 새로운 치료제의 발견 가능성을 제안할 수 있다.

기존에 사용되어 왔던 ADHD 치료제로는 신경자극제로 분류되는 암페타민과 메틸페니데이트가 있다. Swanson 등(Neuropsychol. Rev., 2007, 17, 39-59.)의 보고에 따르면, 지난 1990년 이후로 ADHD의 치료를 위한 신경자극제 처방이 지속적으로 증가하고 있다.

그러나 이러한 신경자극제의 사용은 환각과 불안 등의 심각한 부작용을 유발할 수 있다. Fleckenstein 등(Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2007, 47, 681-698.)의 연구는 신경자극제가 도파민 분비 신경 세포와 세로토닌 분비 신경 세포에 손상을 입힐 수 있다는 것을 시사하고 있으며, Kolb 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 10523-10528.)의 연구 결과는 지속적인 암페타민의 복용이 신경세포의 구조적 가소성(structural plasticity)에 영향을 주어, 새로운 경험에 의한 학습 및 기억 작용을 제한할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 신경자극제의 부작용과 신경세포독성, 그리고 기억과 학습 능력에 미치는 악영향은 새로운 ADHD 치료제의 필요성을 부각한다.

G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1 (이하 GIT1 라고 함)은 다기능 어댑터 단백질로서, ARF small GTPases를 위한 GTPase-활성화 도메인 (ARF GAP domain)을 포함한 몇몇 도메인으로 이루어져 있다. GIT1의 ARF GAP 도메인은 베타2-아드레날린 수용체와 다른 G-단백질 결합 수용체의 식균 작용을 통한 수송에 중요한 역할을 담당하고 있다. 또한 GIT1은 GRK, PIX, FAK, PLCγ, MEK1, Piccolo, liprin-α, paxillin등과 같은 다양한 신호 전달 단백질과 어댑터 단백질과 결합을 하며, 이는 GIT1이 신호 전달 어댑터로서 기능할 수 있음을 의미한다.

뇌에서의 GIT1은 시냅스에 존재하며, 신경 돌기의 성장, 수상돌기가시 구조형성, 시냅스 형성, 시냅스 AMPA(2-amino-3-(5-methyl-3-oxo-1,2- oxazol-4-yl)propanoic acid) 수용체의 국한(AMPA receptor localization) 등에 관여한다. GIT1은 헌팅턴 질병과 관련된 헌팅턴 단백질과 결합하며, 헌팅턴 환자의 뇌에서 GIT1 단백질이 분열된 현상을 관찰한 연구 결과가 있다. 또한 GIT1 결손 생쥐를 이용한 다른 연구 결과에서는 수상 돌기의 성장과 수상 돌기 가시의 밀도 감소, 그리고 학습 및 기억 능력의 손상이 보고된 바가 있으며(Prashanthi Menon et al., Brain Res. 2010; 1317: 218226), 이는 GIT1이 뇌에서 중요한 기능을 수행하고 있음을 시사한다.

그러나 GIT1에 대한 지금까지의 연구는 분자 생물학적, 세포 생물학적 연구에 국한되어 있다. 그리고 선행된 행동 실험의 경우, 실험 결과를 설명할 수 있는 뚜렷한 기작을 제시하지 못하였다.

본 발명자는 GIT1 결손 생쥐를 ADHD 모델 동물로 사용하여, 기존에 사용된 분자 생물학적, 세포 생물학적, 동물 행동학적 연구 방법 외에도 시스템 수준에서의 일렉트로엔세파로그램(Electroencephalogram, 이하 'EEG' 라고 함) 측정 등의 실험을 진행하여, ADHD의 기저 원인에 대한 유전적인 원인을 제공하고, ADHD 증상을 보이는 GIT1 결손 생쥐를 이용하여 새로운 ADHD 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.

한국특허등록 제10-0827470호: 히스타민 H3 길항제로서 유용한 (1-4-피페리디닐)벤즈이미다졸 유도체, 등록일자: 2008년04월28일, 출원인: 쉐링 코포레이션

Leibson et al., JAMA, 2001, 285, 60-66. Wultz et al., Behavioral and neural biology, 1990, 53(1), 88-102. Russell et al., Behav. Brain. Res. 1998, 163-171. Gainetdinov et al., Science, 1999, 283(5400), 397-401. Hess et al., J Neurosci. 1992, 12(7), 2865-74. Swanson et al., Neuropsychol. Rev. 2007, 17, 39-59. Kolb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 10523-10528.

본 발명의 목적은 뇌의 신경시냅스 단백질인 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1)의 유전자가 결손된 인간을 제외한, 특히 포유류를 주의력결핍 과잉행동장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD)의 동물 모델로 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 GIT1 유전자 결손 생쥐를 사용하여 ADHD 후보물질인 약물을 투여하여 회복을 유도할 수 있는 새로운 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 뇌 질환의 일종인 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD)를 가지고 있는 인간을 포함한 포유류에서, 이러한 중추 신경계 질환 및 정신 질환의 약물을 스크리닝 할 수 있고 치료 예방 할 수 있는 방법으로 GIT1 유전자가 결손된, 인간을 제외한 포유동물을 사용하는 방법을 제공한다.

상기 중추 신경계 질환 및 정신 질환은 수면 장애, 각성장애, 수면발작(narcolepsy), 인지기능 장애(cognitive disorder), ADHD, 비만증(obesity), 간질(epilepsy), 정신분열증(shizophrenia), 우울증, 통증 및 약물남용/중독으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명에서의 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD)의 예방 또는 치료제 후보물질로는 집중력 강화제인 메칠페니데이트 (Methylphenidate), 암페타민 (d-Amphetamine) 및 페몰린 (Pemoline)으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나, 항정약물로 중추신경을 자극하는 기전을 갖고 있는 만큼 여러 부작용을 발생시킬 수 있으며 특히, 불면, 반동 효과 (rebound phenomena), 식욕저하, 불쾌감, 어지러움, 자극 과민성이나 불안 및 안절부절 등의 증상이 나타날 수 있다.

그 외에 상기 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산 첨가 염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.

상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 경구 투여, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 중에서 대상 동물의 증상, 후보물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택될 수 있다. 또한 후보 물질의 투여량은 투여 방법, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택될 수 있다.

본 발명에서의 후보물질 투여동물은 포유류, 바람직하게는 생쥐, 랫트, 돼지 및 원숭이로부터 선택된 하나 이상의 것이 될 수 있으며, 본 발명자들이 발명한 GIT1 결손 생쥐가 가장 바람직하다.

상기 GIT1 유전자는 뇌의 시냅스에 존재하며 신경 돌기의 성장, 수상 돌기 가시 구조형성, 시냅스 형성, 시냅스 AMPA 수용체의 국한(AMPA receptor localization)등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 GIT1은 헌팅턴 단백질과 결합되며, 헌팅턴 환자의 뇌에서는 GIT1 단백질이 분열되는 현상이 관찰되고, GIT1 결손 생쥐를 이용한 다른 연구결과에서는 수상 돌기의 성장과 수상 돌기 가시의 밀도 감소, 그리고 학습 및 기억 능력이 손상되는 것으로, GIT1이 뇌에서 중요한 기능을 하고 있음을 알 수 있다.

본 발명에서의 치료 약물 또는 정신질환을 스크리닝하는 방법으로는 신경세포, 특정 유전자 적중된 세포 및 동물 모델을 이용하는 방법으로 이 중 선택되는 하나 이상을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

상기 신경세포의 예로는 도파민성 신경 세포로 MES23.5 세포, MN9D 세포, PC12 세포, SHSY5Y 세포와 CATH.a 세포등이 포함되며, 이러한 도파민성 신경세포는 이 세포에서의 변화되는 바이오 마커와 신경 보호 타겟을 찾기 위해 사용되어지고 있다. 특히 유전성 파킨슨병(familial Parkinson's disease)을 일으키는 유전자 돌연변이인 DJ-1, Parkin 또는 PINK1의 유전자들의 기능 상실시 나타나는 변화들을 통해 신경 보호를 위한 치료제 및 바이오 마커를 발굴하고자 하는 연구들이 시도되고 있지만, 상기 세포 모델들은 도파민 신경 세포만의 세포내 환경이 유지되지 못하고 있으며 세포의 기원이 전혀 다르거나 또는 융합된 세포의 유전적 특성을 함께 보유하는 단점이 있다.

또한 특정 유전자 적중된 세포 모델을 통한 스크리닝 방법도 유전자 상실이 아닌 siRNA와 같은 유전자 부분 상실을 일으킨 세포 모델로써 완벽한 유전자 기능 소실시 나타날 수 있는 변화에 대한 타겟 발굴에는 미흡한 점이 있다.

본 발명에서 상기 세포 모델과 더불어 정신질환 치료제 및 약물을 스크리닝하는데 사용되어지는 동물 모델로는 SHR, 도파민 수송체를 유전적으로 제거한 생쥐 (DAT-KO mice), 파킨슨 DJ-1 유전자 상실(knockout)동물, SNAP-25 단백질이 결여된 콜로보마 생쥐 및 GIT1 유전자 결손 생쥐로부터 하나 이상을 선택하여 사용되어짐을 알 수 있다.

상기 동물 모델에서는 특히, 분자, 생화학적 연구를 진행하기에 충분한 순수 도파민성 세포를 얻기가 어렵고, 실제 파킨슨병을 앓고 있는 환자에서도 샘플을 얻기 어려운 실정인 것으로 알려져 있다. 예를 들어 파킨슨 발병에 대한 병인유전자로서의 DJ-1에 관한 상세한 기작에 대해서는 밝혀지지 않았으며, DJ-1 유전자상의 변이에 의해 단백질이 정상적으로 생산되지 않는 경우 파킨슨병이 유발된다는 사실도 아직 불명확한 것으로 알려져 있다.

그러므로 특히, 본 발명에서는 GIT1 결손 생쥐에서 주의력 결핍, 과잉행동, 산만함 및 행동 장애 테스트로 치료제 또는 약물을 스크리닝하는 방법으로 사용됨이 바람직함을 알 수 있다.

본 발명에서의 GIT1 결손 생쥐를 사용한, 구체적인 스크리닝 방법으로는 개방 공간 시험(Open field test), 사육 우리 행동 시험 (Homecage activity test), 모리스 수중 미로 시험(Morris water maze test), 물체 인지 시험 (Novel object recognition test) 및 일렉트로엔세파로그램(Electroencephealogram, 이하 EGG 라고 함) 시험으로부터 선택된 하나 이상을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

상기 개방 공간 시험 및 사육 우리 행동 시험을 통해 GIT1 결손 생쥐에서 는 상기에서 제공되는 후보물질들을 투여할 경우 정상생쥐인 대조군과 비교하여 과잉행동이 유의하게 개선되는 효과를 보일 수 있으며,모리스 수중 미로 시험과 물체 인지 시험의 스크리닝 방법을 통하여 기억, 공간 지각 및 학습 능력이 위에서와 마찬가지로 개선된 효과를 보이는 특징이 있으므로 상기 후보 물질의 선별을 위한 좋은 동물 모델로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

특히, 본 발명에서의 GIT1 결손 생쥐는 시스템 수준에서의 EEG를 통한 스크리닝 방법으로 전두엽에서의 비정상적인 세파 영역 파형 및 전력 스펙트럼 밀도를 분석하여, 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD)를 가진 포유류의 대뇌 기능을 평가하는 기준과, 기저 원인에 대한 새로운 평가 방법으로 제공될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명은 GIT1 유전자 결손 생쥐를 사용하여 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 발병의 원인이 되는 신경화학적 요인, 유전적 요인 및 환경적 요인을 분석하고, 이러한 질환 및 각종 불안장애의 원인을 해독하여, 예방제 또는 치료제를 스크리닝하기 위한 효과적인 동물 모델로 제공할 수 있다.

도 1은 GIT1 유전자의 1번 인트론에 유전자 트랩(gene-trap)이 삽입된 상황의 도해(엑손의 번호는 각 회색 상자에 숫자로 표시되고, β-geo는 β-갈락토시다아제와 네오마이신의 결합체를 의미하며, 화살표는 유전형 검정을 위해서 사용된 프라이머 세트를 의미)이며,
도 2는 본 발명에 사용된 GIT1 결손 생쥐의 유전형을 검정한 PCR 결과(도 2a)와 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블랏 실험 결과(도 2b)이며,
도 3은 GIT1 결손 생쥐에서 관찰되는 개방 공간에서의 과잉행동(도 3a)과 ADHD 치료 약물인 암페타민과 메틸페니데이트 처리를 통한 과잉행동의 회복(도 3b, 3c)이며,
도 4는 정상 생쥐와 GIT1 결손 생쥐의 친숙한 공간에서의 이동 거리를 24시간 동안 측정한 것이며,
도 5는 GIT1 결손 생쥐의 공간 지각 및 학습 능력 관찰을 위한 모리스 수중 미로의 결과(a는 정상 생쥐 및 GIT1 결손 생쥐가 5일간의 훈련 기간 동안 숨겨져 있는 발판을 찾는데 걸리는 시간이 감소함을 나타내는 것이며, b는 프로브 테스트 동안 발판의 위치를 지나간 횟수이며, c는 수중 미로의 각 사분면에 머무른 시간)이며,
도 6은 물체 인식 및 학습 능력 관찰을 위한 물체 인지 시험의 결과(a는 샘플 기간에서의 전체 물체 탐색 시간이며, b는 시험 기간에서 관찰되는 새로운 물체에 대한 선호도이며, c는 GIT1 결손 생쥐의 물체 인지 능력이 암페타민 처리에 의해서 회복됨을 나타낸 그림)이며,
도 7은 GIT1 결손 생쥐의 전두엽에서 관찰되는 비정상적인 세타 파형(a)과 그에 따른 파워 스펙트럼 밀도(b)이며, 암페타민 처리에 의한 비정상적 세타 파형의 회복 그림(c)이며,
도 8은 염색체 17번의 24926101번째 염기위치(Genome Build 36.3)에 존재하는 rs550818 1개의 단일염기다형성 그림이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[실시예 1] GIT1 유전자의 결손 생쥐 확인

본 발명에서의 GIT1 결손 생쥐의 제작에 사용된 배아 줄기 세포(ES cell, FHCRC-GT-S10-12C1)는 Fred Hutchinson Cancer Center에서 구입하였다. ES cell(embryonic stem cell)을 500λ의 β-mercaptoethanol, 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신, 15% (v/v)의 FBS(소태아 혈청)를 포함한 배양액(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, Gibco)에 배양한 후, 상기 세포를 C57BL/6 생쥐의 포배낭(Blastcyst)에 주입(microinjection)하였다. 주입된 포배낭은 ICR 대리모 생쥐의 자궁에 착상시켜 키메라 생쥐를 제작하였다. 상기 키메라 생쥐는 아구티 색의 털의 발현과 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 유전형을 확인하였다. 상기 키메라 생쥐는 C57BL/6종과 129/SV/Jae종과 각각 교배하여 번식을 하였다. 각 종에서 얻은 이형접합체(Heterozygote) 생쥐간의 교배를 통해서 나온 생쥐를 이용하여 본 발명의 실험에 이용 하였다.

[실시예 1-1] 중합효소연쇄반응을 이용한 GIT1 유전자의 결손 확인

상기 실시예 1의 GIT1 유전자의 결손을 확인하기 위하여 크게 두 가지 실험방법을 사용하였다. 한 가지는 중합효소 연쇄 반응으로, GIT1 유전자의 특정 부분을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여, GIT1 유전자의 결손 유무를 확인할 수 있었다. 또한 GIT1 결손 생쥐와 이형 생쥐에만 포함되어있는 외래 유전자인 βgeo를 증폭할 수 있는 프라이머를 함께 사용하여, 각 생쥐의 유전형을 정확히 파악할 수 있었다. 중합효소 연쇄 반응에 사용된 프라이머 세트의 염기 서열은 하기 표 1과 같다.

유전형 확인을 위한 프라이머 세트

Name	Length(-mer)	Sequences (5' to 3')
GIT1+	22	GGA ACT CTG ATG GTG ACG TTG G
GIT1-	22	AAT GCA GAG CCA GAC ACC TCA C
βgeo+	24	TTA TCG ATG AGC GTG GTG GTT ATG
βgeo-	25	GCG CGT ACA TCG GGC AAA TAA TAT C

상기 표 1의 프라이머 세트의 위치는 도 1에 표시되어 있다. 상기 프라이머 세트를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 진행할 경우, 정상 생쥐의 경우에는 500 염기쌍 크기의 DNA 조각이 증폭되었으며, GIT1 결손 생쥐의 경우에는 680 염기쌍 크기의 DNA 조각이 증폭되었다. 이형 생쥐에서는 상기의 두 크기의 염기쌍 조각이 증폭되었다. 이러한 중합효소 연쇄 반응의 결과는 도 2a에서 보는 바와 같이 관찰되었다.

상기 중합효소 연쇄 반응을 위한 혼합물은 14.8μl의 2차 증류수, 1.6μl의 10mM dNTP, 2.0μl의 Taq 중합효소 버퍼, 0.4μl의 Taq 중합효소(Sungenetics), 0.1μl(100 pM)의 프라이머, 1μl(100 μg/ml)의 DNA 원형으로 구성하였다. 상기 혼합액은 중합효소연쇄반응을 이용하여 유전자형을 확인하였다. 상기 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 반응 시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초로 구성된 싸이클을 40회 반복하였다. 다음 72℃에서 5분 간 반응 시킨 후, 상기의 산물을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동을 통하여 확인하였다.

[ 실시예 1-2] 웨스턴 블랏을 이용한 GIT1 유전자의 결손 확인

상기 실시예 1의 GIT1 유전자 결손을 확인하기 위한 다른 방법으로, 상기 GIT1 단백질의 결손을 웨스턴 블랏(Western blotting) 실험을 이용하였다. 웨스턴 블랏에 사용할 시료의 제작을 위하여 8주령 이상의 정상 생쥐와 GIT1 결손 생쥐의 전체 뇌 조직을 사용하였다. 추출한 뇌 조직을 균질화 버퍼(Homogenization Buffer; 0.32M Sucrose, 4mM HEPES, 1mM MgCl₂, 0.5mM CaCl₂, 1mM PMSF, 5μg/ml PepstatinA, 2mM Benzamidin, 2μg/ml Leupeptin)와 혼합하여 균질기(Homogenizer)를 이용하여 파쇄한 후, 파쇄 된 뇌 조직은 브래드포드(Bradford) 실험을 통하여 조직 내 단백질 농도를 확인하였다. 상기의 단백질을 2X SDS 버퍼(pH6.8의 100mM TrisCl, 5% β-Mercaptoethanol, 4% Sodium Dodesyl Sulfate, 0.2% BromoPhenyl Blue, 20% 글리세롤)와 혼합하여, 100℃에서 10분간 변성(denaturalization)시켜 뇌 조직 시료를 준비하였다.

상기의 과정을 통해 준비된 뇌 조직 시료를 7.5% 아크릴아마이드 젤에 걸어, 16mA에서 단백질 분리가 될 때까지 전기영동 하였다. 전기영동 후에 아크릴아마이드 젤을 니트로 셀률로오즈 트랜스퍼 멤브레인(Nitrocellulose transfer membrane; Whatman)에 밀착시킨 후, 트랜스퍼 버퍼(14.4g Glycine, 3.03g Tris, 200ml 메탄올, 800ml 증류수)에 완전히 담근 후에, 85V에서 90분간 전기영동을 수행하였다. 상기 과정을 통해 단백질은 트랜스퍼 멤브레인으로 이동 되고, 이동된 단백질은 GIT1 항체를 이용하여 검출하였다.

상기 웨스턴 블랏을 수행하기 위하여, 트랜스퍼 멤브레인을 Ponceau S 염색약을 통하여 염색하고, 단백질의 대략적인 위치를 확인하였다. 증류수로 멤브레인을 여러 차례 세척하여 Ponceau S 염색약을 제거하고, 블로킹 솔루션 (5% 탈지분유를 TBST 용액에 녹인 것)에 30분 동안 정체하였다. 이후 GIT1에 대한 항체(Neuromab)를 희석(1:1000)한 TBST 용액에 1시간 동안 반응 시켰다. 상기 GIT1 단백질에 결합하지 않은 항체를 제거하기 위하여 10분간 3번 TBST 용액을 이용하여 세척하였다. 2차 항체를 희석(1:10000)한 TBST용액에 멤브레인을 30분간 정체하여, GIT1 항체에 2차 항체가 결합되도록 하였다. 이후 결합하지 않은 2차 항체를 제거하기 위하여 10분간 3번 TBST 용액을 이용하여 세척하였고, 상기 멤브레인에 ECL 용액(GE Healthcare)에 반응시킨 후, 암실에서 x-ray 필름(Fujifilm)에 노출하여 GIT1 단백질의 유무를 확인하였다. 상기와 같은 결과는 도 2b에 관찰된 바와 같이 GIT1^-/-인 동형생쥐에서만 GIT1 유전자가 결손 됨이 확인되었다.

[ 실시예 2] GIT1 결손 생쥐의 개방 공간 시험( Open field test )

[ 실시예 3] GIT1 결손 생쥐의 사육 우리 행동 시험 ( Homecage activity test )

본 발명의 GIT1 결손 생쥐를 이용하여 친숙한 공간에서의 과잉행동 증상을 관찰하기 위하여, 사육 우리 행동 시험 (Homecage activity test)를 진행하였다. 본 발명의 시험은 20-35-17cm 규격의 사육 우리에 상기의 배치된 생쥐를 행동 측정실에 24시간동안 배치하여, 생쥐가 행동 실험실에 순응화(habituation)하도록 하였다. 그 후 12시간의 밝은 주기와 12시간의 어두운 주기 동안의 생쥐의 행동을 비디오 촬영하였고, 동물 행동 분석 프로그램을 통해서 전체 이동 거리를 분석하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 생쥐의 야행성에 따라, 낮에는 생쥐의 행동이 줄어들어 이동 거리가 매우 짧아, 정상 생쥐와 GIT1 결손 생쥐 간의 이동거리에 차이가 없었으나, 행동이 활발해 지는 밤 시간의 경우에는 본 발명의 GIT1 결손 생쥐가 친숙한 공간에서 정상 생쥐에 비해 더 많은 거리를 이동하였으며 과잉행동을 보이는 특징이 있음을 확인하였다.

[ 실시예 4] GIT1 결손 생쥐의 모리스 수중 미로 시험( Morris water maze test )

본 발명의 GIT1 결손 생쥐를 이용하여 모리스 수중 미로 시험(Morris water maze test)을 통한 생쥐의 공간 학습 및 기억 능력을 측정하였다. 상기 모리스 수중 미로는 지름 120 cm의 흰색 수조에, 보이지 않는 10 cm 지름의 발판을 준비한 것으로, 상기 생쥐는 하루에 2번, 30분 간격으로 발판의 위치를 파악하고 기억하기 위한 훈련 기회를 가지며, 훈련은 5일 동안 연속적으로 이루어졌다. 상기 훈련을 통한 학습 효과는 도 5에 나타난 바와 같이, a에서는 정상 생쥐가 GIT1 결손 생쥐에 비해서 더 빠른 시간 내에 숨겨진 발판을 찾는 결과로 확인되어, GIT1 결손 생쥐의 공간 지각 학습 및 기억 능력이 문제가 있음을 확인 할 수 있었다. 또한 b 와 c 는 6일에 발판이 제거된 수조에서 1분 동안의 프로브 시험(probe test)을 진행하여, 수조의 각 사분면에서 생쥐가 소모하는 시간의 비율을 관찰한 결과, GIT1 결손 생쥐가 실제 발판이 있는 사분면에서 정상 생쥐에 비해 시간을 적게 소모했으며, 발판의 위치를 정확히 지나는 횟수를 동물 행동 분석 프로그램을 통하여 분석한 결과, GIT1 결손 생쥐가 정상 생쥐에 비해 발판의 위치를 정확히 지나가는 횟수가 감소함을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5] GIT1 결손 생쥐의 물체 인지 시험 ( Novel object recognition test )

본 발명의 GIT1 결손 생쥐를 이용하여 물체에 대한 인지 및 기억 능력을 분석하기 위한 물체 인지 시험 (Novel object recognition test)은 개방 공간 시험에서 사용된 개방 공간 상자에서 이루어졌다. 상기 물체 인지 시험은 샘플 기간(Sample phase)과 시험 기간(Test phase)으로 구성되었다. 샘플 기간 동안 생쥐는 개방 공간 상자에 위치한 동일한 두 개의 물체를 10분 동안 탐색하게 되었으며, 이를 비디오 촬영하여 상기 생쥐가 두 물체를 관찰한 시간을 기록하였다. 그 결과 도 6에서 확인한 바와 같이, a에서는 정상 생쥐와 GIT1 결손 생쥐가 물체를 탐색하는 시간이 통계적으로 차이가 없는 것으로 나타났다. 또한 예로 두 개의 동일한 물체 중 하나를 생쥐에 노출되지 않은 새로운 물체로 바꾸고, 24시간 후에 시험 기간을 진행하였다. 상기 시험 기간으로는 10분이 주어지며, 이 시간 동안 생쥐가 두 물체를 관찰한 시간을 측정하였다. 이 때 생쥐의 코 끝이 물체에 접촉하거나, 생쥐가 물체로부터 2 cm 이내에서 물체를 향하고 있는 것을 관찰로 규정하였다. 본 실험의 물체 인지 및 기억 능력의 회복을 관찰하기 위해서, 샘플 기간 20분 전, 본 발명의 생쥐에 4mg/kg/day 의 양으로 암페타민 혹은 식염수를 복강 주사 하여 개방 공간 상자에 배치하였다. 본 실험 결과, 도 6b에 관찰된 것은 GIT1 결손 생쥐가 정상 생쥐에 비해서 새로운 물체를 인지하는 능력이 떨어지며, 이러한 물체 인지 능력은 ADHD 치료 약물인 암페타민에 의해서 회복됨을 도 6c에서 확인할 수 있었다.

[ 실시예 6] GIT1 결손 생쥐의 세타 영역 파형 및 전력 스펙트럼 밀도( Power Spectrum Density )의 분석

본 발명의 GIT1 결손 생쥐를 이용하여 전두엽에서의 비정상적 세타 영역 파형 및 전력 스펙트럼 밀도(Power Spectrum Density)의 분석을 위한 시술은 케타민(ketamine)을 150mg/kg 으로 복강 주사하여 마취된 생쥐의 머리를 스테레오탁식(stereotaxic)에 고정하여 진행하였다. EEG 전극(electrode)은 오른쪽 전두엽과 왼쪽 전두엽에 삽입하며, 구체적인 좌표는 정수리점(Bregma)를 기준으로 전방 2.8mm, 측면 0.8mm로, 스테레오탁식(stereotaxic) 기기를 이용하여 정확한 좌표를 산정하여 위치를 잡는다. 접지 전극(grounding electrode)는 후두엽 위치에 삽입하였다. 상기 생쥐는 전극 삽입 후 일주일의 회복기를 보내며 뇌파 측정 시에 EEG chamber 안에 넣어 1시간 동안 측정하였다. EEG 신호는 Grass model 7H polygraph(Grass Technologies)을 이용하여 증폭한 뒤, DIGIDATA 1320A(Molecular Devices)를 통하여 2000Hz의 샘플링 주파수(sampling frequency)로 디지털화한 후, pClamp8.0 프로그램(Axon Instruments)를 이용하여 데이터를 얻고 분석을 진행하였다. 그 분석 결과는 도 7에 나타난 바와 같이, a에서는 GIT1 결손 생쥐의 비정상적인 세파 파형이 전두엽에서 나타난 것이며, b에서는 파워 스펙트럼 밀도를 나타낸 것이다. 특히 암페타민을 투여한 후에는, c에서 보이는 바와 같이 GIT1 결손 생쥐의 과잉행동과 손상된 기억력은 식염수를 투여한 군에서 보다 비정상적인 세파 파형이 회복됨을 알 수 있었다.

Claims

뇌의 신경시냅스 단백질인 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자가 결손 된 인간을 제외한 포유동물을 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 모델로 사용하는 방법.
1) GIT1 유전자가 결손 된 인간을 제외한 포유류의 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD)의 예방 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 후보물질 투여 후, 인간을 제외한 포유류의 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 테스트를 수행하는 단계; 및,
3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 주의력결핍 과잉행동w장애(ADHD)의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 단계;,
를 포함하는 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 예방제 또는 치료제의 스크리닝 방법
제 2항에 있어서,
상기 단계 1)의 인간을 제외한 포유류는 생쥐, 랫트, 돼지 또는 원숭이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 단계 2)의 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 테스트는 주의력 결핍, 과잉행동, 산만함 및 행동 장애로부터 선택된 하나 이상을 특징으로 하는 질환을 가진 GIT1 유전자가 녹- 아웃된 생쥐에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 단계 1)의 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 단계 3)의 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD)의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 단계는 개방 공간 시험(Open field test),사육 우리 행동 시험 (Homecage activity test), 모리스 수중 미로 시험(Morris water maze test), 물체 인지 시험 (Novel object recognition test) 또는 일렉트로엔세파로그램(Electroencephealogram) 시험을 선택하 는것을 특징으로 하는 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 예방제 또는 치료제의 스크리닝 방법.