KR101112732B1

KR101112732B1 - 류코노스톡 락티스 유래의 신규 수크로오스 포스포릴라아제

Info

Publication number: KR101112732B1
Application number: KR1020090063666A
Authority: KR
Inventors: 김중수; 조현정; 김용모; 손동호; 장영효; 송재준; 최종현; 최낙식; 정민영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2009-07-13
Publication date: 2012-03-13
Anticipated expiration: 2029-07-13
Also published as: KR20110006162A

Abstract

본 발명은 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 유래의 신규 수크로오스 포스포릴라아제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 김치로부터 분리한 유산균 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 유래의 수크로오스 포스포릴라아제 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 유래의 신규 수크로오스 포스포릴라아제는 당을 전이시켜 배당체를 생산함으로써 성분의 안전성과 효능을 증강시킬 수 있어 화장품이나 식품 분야에 응용할 수 있다.

수크로오스, 김치, 유산균, 효소, 유전자, 재조합, 벡터

Description

류코노스톡 락티스 유래의 신규 수크로오스 포스포릴라아제 {Novel Sucrose Phosphorylase Derived from Leuconostoc lactis}

수크로오스 포스포릴라아제(Sucrose Phosphorylase EC 2.4.1.7)는 글리코실 가수분해효소 패밀리(glycosyl hydrolases family 13, α-amylase family)에 속하는 효소로 수크로오스와 무기 포스페이트(inorganic phosphate)를 D-프럭토오스와 α-D-글루코오스-1-포스페이트(α-D-glucose-1-phosphate, G1P)로 전환시키는 반응과 그 역반응에 관여하는 효소로 가인산분해(phosphorolysis)와 더불어 글리코실 전이반응(transglycosylation)을 촉매한다 (John J. Mieyal et al ., The enzymes ., 7:515-532, 1972).

수크로오스 포스포릴라아제는 슈도모나스(Pseudomonas saccharophila ), P. puterfaciens, 류코노스톡( Leuconostoc mesenteroides ), 스트렙토코커스( Streptococcus mutans ), 비피도박테리움( Bifidobacterium adolescentis DSM20083) 등의 다양한 박테리아에 존재하는 것으로 확인되었다. 이 중 Bifidobacterium adolescentis 속으로부터 분리한 수크로오스 포스포릴라아제의 3차 구조 분석을 통해 수크로오스 포스포릴라아제의 촉매반응 메카니즘이 밝혀졌다. Bifidobacterium adolescentis 속 수크로오스 포스포릴라아제의 주요 촉매부위 잔기(catalytic-site residues)는 catalytic nucleophile Asp¹⁹⁶, catalytic acid/base Glu²³⁷, Asp²⁹⁵으로 밝혀졌다. 이와 같은 내용을 근거로 페어와이즈 염기서열 정렬(pairwise suquence alignment)을 실행한 결과, L. mesenteroides의 수크로오스 포스포릴라아제와 비피도박테리움(Bifidobacterium adolescentis)의 수크로오스 포스포릴라아제의 촉매 잔기가 일치하는 것으로 확인되었다 (Christiane Goedl et al ., Cabohydrate Research, 343:2032-2040, 2008).

일반적으로 당전이 반응은 특이적인 공여체로부터 구조적으로 다양한 다수의 수용체로 진행된다. 수크로오스 포스포릴라아제에 의한 당전이 반응에서는 수크로오스, α-D-글루코오스-1-포스페이트(α-D-glucose-1-phosphate, G1P), 글루코오스-1-플루오리스(glucose-1-fluorise) 만이 공여체로서 작용 가능하나 수용체로는 당류와 당알코올류가 가능한 것으로 알려져 있으며, 이 외에도 카테킨(catechin)과 같은 페놀화합물과 벤젠 알코올과 같은 알콜화합물에도 수크로오스의 글루코오스기 를 전이시킬 수 있는 것으로 보고되었다 (Biosci . Biotechnol . Biochem ., 56:2011-2014, 1992).

수크로오스 포스포릴라아제는 카테킨(catechin), α-알부틴(α-arbutin), 아스코르브산(ascobic acid)에 당을 전이시켜 배당체로 만들 수 있으며, 이러한 배당체를 화장품이나 식품 분야에 응용함으로써 제품의 기능이나 안정성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대되어, 다양한 물리적 조건에서 활성을 갖는 수쿠로오스 포스포릴라아제의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 새로운 수크로오스 포스포릴라아제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 김치로부터 분리한 유산균 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001)로부터 수크로오스 포스포릴라아제의 유전자를 클로닝하고 이의 염기서열 및 이로부터 번역되는 효소의 아미노산 서열을 결정한 후, 신규한 효소임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 김치로부터 분리한 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 유래의 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 수크로오스 포스포릴라아제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 벡터로 형질전환되거나, 상기 수크로오스 포스포릴라아제 유전자가 염색체상에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 또는 상기 재조합 미생물을 배양하여, 수크로오스 포스포릴라아제를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 수크로오스 포스포릴라아제를 회수하는 단계를 포함하는 수크로오스 포스포릴라아제의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 수크로오스 포스포릴라아제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 재조합 벡터로 형질전환되거나, 상기 수크로오스 포스포릴 라아제 유전자가 염색체상에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 또는 상기 재조합 미생물을 배양하여, 수크로오스 포스포릴라아제를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 수크로오스 포스포릴라아제를 회수하는 단계를 포함하는 수크로오스 포스포릴라아제의 제조방법을 제공한다.

일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 수크로오스 포스포릴라아제에 관한 것이다.

본 발명에서 "수크로오스 포스포릴라아제(Sucrose Phosphorylase)"는 수크로오스의 대사와 다른 대사의 중간생성물에 관련하는 중요한 효소로, 수크로오스 포스필라제는 수크로오스의 프럭토오스와 α-D-글루코오스-1-포스페이트(α-D-glucose-1-phosphate, G1P)로 전환 시키는 반응에 촉매역할을 한다.

본 발명의 수크로오스 포스포릴라아제는 45℃에서 최적활성을 나타내며 최적 pH는 7이었고, 40℃ 이하에서 잔존활성이 높은 것으로 확인되었다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 수크로오스 포스포릴라아제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서 수크로오스 포스포릴라아제의 유전자는 1455개의 염기로 구성되어 있으며, 상기 유전자로부터 암호화되는 효소는 약 58kDa의 분자량을 가지며 484개의 아미노산 서열로 구성되는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 효소의 아미노산 서열을 NCBI BLAST 검색결과, Leuconostoc citreum KM20, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus johnsonii NCC 533의 수크로오스 포스포릴라아제와 각각 89%, 78%, 63%의 상동성을 갖는 신규한 수크로오스 포스포릴라아제인 것으로 확인되었다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 수크로오스 포스포릴라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동할 수 있게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수도 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능을 할 수 있거나, 또는 일부 경우 게놈 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡 터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid) 및 벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 본 발명은 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

수크로오스 포스포릴라아제 유전자를 염색체상에 삽입하는 비바이러스 전달 방법은 전지천공법, 리포펙션, 미세주사, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론 및 화학물질 촉진 DNA 유입을 포함한다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, Transfectam^TM 및 Lipofectin^TM이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science ., 270:404-410, 1995; Blaese et al ., Cancer Gene Ther ., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem ., 5:382389, 1994; Remy et al ., Bioconjugate Chem ., 5:647-654, 1994; Gao et al ., Gene Therapy ., 2:710-722, 1995; Ahmad et al ., Cancer Res ., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).

레트로바이러스의 친화성은 외부 외피 단백질과 일체화함으로써 변할 수 있어 표적 세포의 종류를 확대시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입 또는 감염시켜서 고바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 표적 조직에 따라 레트로바이러스 유전자 잔달 시스템이 결정된다. 레트로바이러스 벡터는 6-10kb 외부 서열을 포장할 수 있는 시스 액팅 긴 말단 반복을 포함한다. 벡터의 복제와 포장을 위해 충분한 최소의 시스 액팅 LTR은 영구적인 트랜스젠 발현을 위해 치료 유전자가 표적 세포로 통합되도록 사용할 수 있다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 그들의 조합 바이러스를 포함한다 (Buchscher et al ., J. Virol ., 66:2731-2739, 1992; Johann et al ., J. Virol ., 66:1635-1640 1992; Sommerfelt et al ., Virol ., 176:58-59, 1990; Wilson et al ., J. Virol ., 63:2374-2378, 1989; Miller et al ., J. Virol ., 65:2220-2224, 1991; PCT/US94/05700).

수크로오스 포스포릴라아제 단백질을 일시적으로 발현하는 경우에는 아데노바이러스 기반 시스템을 더욱 많이 이용하며, 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포들에서 고효율로 형질도입을 일으키지만 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 상기 벡터를 이용하면 높은 역가와 높은 수준의 발현을 얻을 수 있고, 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 또한 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터는 표적 핵산을 가진 세포로 형질도입하는데 이용되는데, 예를 들면 생체 외 상에서 핵산과 펩티드의 생산 및 생체 내 및 생체 외 상에서 유전자 치료에 이용되며 (West et al ., Virology., 160:38-47, 1987; 미국특허 제4,797,368호; WO93/24641; Kotin, Human Gene Therapy ., 5:793-801, 1994; Muzyczka, J. Clin . Invest ., 94:1351, 1994), 재조합 AAV 벡터의 구성은 이미 알려져 있다 (미국특허 제 5,173,414호; Tratschin et al ., Mol . Cell . Biol ., 5:3251-3260, 1985; Tratschin, et al ., Mol . Cell . Biol ., 4:20722081, 1984; Hermonat & Muzyczka, PNAS., 81:6466-6470, 1984; Samulski et al ., J Virol ., 63:038223828, 1989). 임상 실험에서는 적어도 6개의 바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달 방법이 이용되고 있는데 형질도입제를 생성하는 도움 세포 라인에 유전자를 삽입함으로써 결함이 있는 벡터를 보완하는 접근법이다. pLASN과 MFG-S는 임상 실험에서 사용되고 있는 레트로바이러스의 예이고 (Dunbar et al ., Blood ., 85:3048-305, 1995; Kohn et al ., Nat . Med ., 1:1017- 102, 1995; Malech et al ., PNAS ., 94:(22)12133-12138, 1997), PA317/pLASN는 유전자 치료에 사용된 최초의 치료 벡터로 (Blaese et al ., Science ., 270:475-480, 1995) MFG-S 포장 벡터의 형질도입 효율은 50% 또는 그 이상을 보였다 (Ellem et al., Immunol Immunother ., 44(1):10-20, 1997; Dranoff et al ., Hum . Gene Ther ., 1:111-2, 1997).

재조합 아데노 연관 바이러스 벡터(rAAV)는 결함 있고 비병원성인 제2형 파르보바이러스 아데노 연관 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스젠 발현 카세트 측면에 위치하는 AAV 145 bp 역위 말단 반복을 보유한 플라스미드로부터 유래한다. 형질도입된 세포의 게놈으로 통합에 기인하는 효율적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스젠 전달은 상기 벡터 시스템의 큰 장점이다 (Wagner et al ., Lancet ., 351:9117-17023, 1998; Kearns et al ., Gene Ther., 9:748-55, 1996). 복제 결핍 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 고역가로 생산될 수 있으며 많은 세포들을 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 트랜스젠이 Ad E1a 유전자, Ad E1b 유전자, 및 Ad E3 유전자를 치환하도록 설계되고 실제로 복제 결함 벡터가 트랜스에 제거된 유전자 기능을 제공하는 인간 293 세포에 전달된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견되는 비분열, 분화 세포를 포함하는 많은 형태의 생체 내 조직에 형질도입할 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 가진다. 임상 실험에서 Ad 벡터의 사용예는 근육주사를 통한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 치료를 포함한다 (Sterman et al ., Hum . Gene Ther., 7:1083-9, 1998).

본 발명에 있어서, 상기 숙주미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등을 예시할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 재조합 벡터로 형질전환되거나, 상기의 수크로오스 포스포릴라아제 유전자가 염색체상에 삽입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 재조합 미생물을 배양하여 수크로오스 포스포릴라아제를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 수크로오스 포스포릴라아제를 회수하는 단계를 포함하는 수크로오스 포스포릴라아제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는, 수크로오스 포스포릴라아제 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 LB 액체배지에서 배양하여, 엔도글루카나제를 생성시키고, 상기 배양액에서 균체를 회수하고, 상등액을 회수하여 효소를 정제하는데 이용하였다. 상기 상등액을 Ni-NTA 아가로스 담체를 통과시켜 크로마토그래피를 수행하여 엔도글루카나제를 회수하였다.

본 발명에 따른 재조합 균주의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있으며, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 상기 재조합 균주의 배양액으로부터의 셀룰라아제의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어, 염석, 분자량 커팅법, 크로마토그라피, 친화성 크로마토그라피, 증류, 전기투석, 투과증발, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 균주의 선별 및 분리

김치에서 수크로오스 포스포릴라아제의 활성이 높은 균주를 분리하기 위하 여, 김치의 희석용액을 MRS 배지 (Proteose peptone No.3 10g/L, Beef Extract 10g/L, Yeast Extract 5g/L, Sucrose 20g/L, Polysorbate 80 1g/L, Ammonium citrate 2g/L, Sodium Acetate 5g/L, Magnesium Sulfate 0.1g/L, Manganese Sulfate 0.05g/L, Dipotassium phosphate 2g/L)에 접종하고 30℃에 배양하여, 김치 유산균을 수집하였다.

김치 유산균을 배양한 후, 배양액 100㎕에 75% 에탄올 1㎖을 넣고 침전시켜 건조 후, 증류수 100㎕에 녹였다. 상기 준비된 100㎕의 시료와 5% 페놀 100㎕를 1.5㎖ 튜브에 넣고 30초 동안 배양하였다. 튜브를 얼음에 넣고, 125㎕의 황산을 넣은 후 30초 동안 혼합하였다. 그리고 80℃ water bath에서 30분 동안 반응시키고, 튜브를 상온에서 식힌 후, 스펙트로포토메터(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도 490nm에서 측정하여, 수크로오스의 가수분해 및 글리코실화 활성이 뛰어나고 수크로오스 포스포릴라아제 활성이 우수한 EG001 균주를 선별하고, 상기 균주를 16S rRNA 분석을 통하여 류코노스톡 락티스로 분류하였다.

실시예 2: 류코노스톡 락티스 EG001 ( Leuconostoc lactis EG001 ) 균주 유래 수크로오스 포스포릴라아제 유전자 분리

류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 균주를 균주 선별시 사용한 액체 배지에 진탕배양하고, 회수된 균체로부터 염색체 DNA를 분리하였다. 수크로오스 포스포릴라아제를 인코드하는 유전자의 일부 서열을 디제네레이트 PCR(degenerate PCR)을 이용하여 증폭하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (oligonucleotide primer)는 다양한 균주의 수크로오스 포스포릴라아제의 아미노산 서열을 비교하여 높게 보존된 부위를 선택하였다.

수크로오스 포스포릴라아제 유전자를 분리하기 위하여 PCR을 이용하였다. 하기의 염기서열 3 및 염기서열 4의 프라이머를 제작하여 PCR을 실행하였다.

서열번호 3: 5'-TTYGAYTTYATGATHAAYCAYAT-3'

(여기서, Y는 T/U 또는 C, H는 A 또는 C 또는 T/U)

서열번호 4: 5'-NAGRTTNGCNCCNACYTTRTA-3'

(여기서, N은 A 또는 G 또는 C 또는 T/U, R은 G 또는 A, Y는 T/U 또는 C)

PCR 수행을 위한 반응액은 20㎕에 100ng 염색체 DNA, 5μM 각각의 프라이머, 200nM dNTP, 2U Taq polymerase(Solgent), 1배 Taq DNA 중합효소 완충액(MgCl₂)이 되도록 조성하여 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성(denaturaion)을 수행한 후, 95℃에서 45초 변성, 50℃에서 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 연장(extension)을 30회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 확보된 증폭 단편은 pGEM-Teasy 플라스미드에 클로닝하여 염기서열의 결정을 의뢰하였고, 수크로오스 포스포릴라아제 유전자의 일부 서열임을 확인하였다.

수크로오스 포스포릴라아제 유전자의 전체 서열을 결정하기 위해서 인버스 PCR(inverse PCR) 방법을 이용하였다. 상기 PCR로부터 확인된 수크로오스 포스포릴라아제 일부 서열로부터 프라이머(서열번호 5, 6)를 제작하였다.

서열번호 5: 5'-ATGACTTTGCGTTGCCATTGATTAC-3'

서열번호 6: 5'-GTTGGTCACCGAATGTGTTCCA-3'

PCR 증폭을 위해 염색체 DNA는 다양한 제한효소를 처리한 후, 제한효소 처리한 염색체 DNA 500ng을 셀프 라이게이션(self-ligation)하여 사용하였다. PCR 수행을 위한 반응액은 20㎕에 25ng 염색체 DNA, 2μM 각각의 프라이머, 200nM dNTP, 2U rTaq polymerase(Takara), 1배 Taq DNA 중합효소 완충액(MgCl₂)이 되도록 조성하여 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성을 수행한 후, 94℃에서 30초 변성, 60℃에서 어닐링, 72℃에서 2분 30초 연장을 30회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 확보된 증폭 단편은 pGEM-Teasy 플라스미드에 클로닝하여 염기서열의 결정을 의뢰한 결과 수크로오스 포스포릴라아제 유전자의 전체서열(서열번호 2)을 확인하였다.

실시예 3: 수크로오스 포스포릴라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터

수크로오스 포스포릴라아제 유전자는 상기 확인된 유전자 염기서열로부터 정방향 프라이머를 제작하여 각각 XhoI과 BamHI 에 삽입하였다.

염기서열 7: 5'-GACTCGAGATGAAAAAGCTCACCAATGAAGTG-3'

염기서열 8: 5'-TAGGATCCTTAAGCCTGTGTGTTGAAAATTTC-3'

상기 유전자를 증폭하기 위한 PCR 반응액은 50㎕에 100ng 염색체 DNA, 0.2μM 각각의 프라이머, 200nM dNTP, 2U Taq polymerase(Solgent), 1배 Taq DNA 중합효소 (MgCl₂ 포함) 완충액이 되도록 조성하여 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성을 수행한 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 2분 연장을 30회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 상기 방법으로 획득한 PCR 생산물은 pGEM T-easy vector에 클로닝후 NcoI-NotI으로 처리하여 발현벡터인 pET302/NT-his의 XhoI-BamHI 부위에 subcloning하여 재조합 벡터를 구축하였다.

실시예 4: 재조합 수크로오스 포스포릴라아제의 발현 및 정제

수크로오스 포스포릴라아제의 과잉 생산을 위해서 재조합된 플라스미드를 대장균 [BL21(DE3)]에 도입하여 형질전환체를 구축하였고, 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린이 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 16시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후 새로운 LB 액체배지에 진탕 배양한 형질 전환체를 1% 농도로 넣은 후 진탕 배양하였다. 또한 600㎚에서 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 0.01mM 가 되도록 IPTG를 첨가하여 20℃에서 16시간 동안 180 rpm으로 진탕 배양하여 효소의 과잉 생산을 유도하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 0.85% NaCl로 세척하였다. 회수된 균체에 1mM PMSF와 10mM imidazole이 첨가된 100mM Tris-HCl (pH 8.0)을 가하여 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 효소를 정제하였다. 상기 상등액을 Ni-NTA 아가로스 담체를 통과시켜 크로마토그래피를 수행하였다. 효소의 용출시 250mM imidazole, 300mM NaCl, 20mM tris-HCl (pH 8.0)을 포함하는 용출액으로 효소활성 분획을 위하여 정제 여부를 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 1). 정제된 효소는 Amicom Ultra-15 (Millipore, 50K NMWL device)으로 농축한 후, 20% 글리세롤과 protease inhibitor cocktail (Roche)을 포함한 100mM Tris-HCl (pH 8.0) 용액에 넣어 4℃에서 12시간 동안 투석을 수행하였다.

정제된 수크로오스 포스포릴라아제의 표준 효소반응은 100mM 수크로오스, 50mM 포타슘 포스페이트(photassium phosphate) (pH 7.0), 적당히 희석된 정제된 효소를 최종 부피 100㎕가 되도록 반응하였다. 그 후 100℃에서 5분 동안 열을 가하여 반응을 종료하였다. 종료한 효소 반응액에 DNS solution 100㎕를 넣은 후 100℃에서 5분 동안 열을 가하였다. 그리고, 얼음에서 5분 동안 쿨링하였고, 증류수를 1㎖ 넣은 다음 575㎚에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 유닛(U)은 수크로오스가 분해되어 분당 생성되는 프럭토오스의 μ㏖ 수를 나타낸다 (표 1).

류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001)균주 유래의 수크로오스 포스포릴라아제 정제단계의 활성 및 회수율

	Total vol. ㎕(㎖)	Total protein (㎎)	Total activity (U)	Specific activity (U/㎎)	Yield (%)	Purification (Fold)
Culture suprernatant	7.5	30	9.6 x 10²	32	100	1
Ni-NTA affinity chromatography	0.42	3.5	4.4 X 10²	126	45	3.9

실시예 5: 정제된 수크로오스 포스포릴라아제의 생화학적 특성

류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001)균주로부터 정제된 수크로오스 포스포릴라아제의 최적 반응 조건을 알아보기 위해 DNS 방법에 의해 반응온도, pH의 영향을 조사하였다 (Gail Lorenz Miller, Analytical Chemistry , 31(3):426-428). 정제된 수크로오스 포스포릴라아제의 효소 반응은 100mM 수크로오스, 50mM 포타시움 포스페이트 (pH 7.0), 적당히 희석된 정제된 효소를 최종 부피가 100㎕가 되도록 반응하였다. 그 후 100℃에서 5분 동안 열을 가하여 반응을 종료하였다. 종료한 반응액에 DNS solution 100㎕를 넣은 후 100℃에서 5분 동안 열을 가하였다. 그리고, 얼음에 5분 동안 쿨링하였고, D.W를 1㎖ 넣고, 575㎚에서 흡광도를 측정하였다.

최적 반응온도를 알아보기 위해 정제된 효소를 사용하여 25~80℃ 범위에서 5℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였으며, 45℃에서 최적 반응온도인 것을 알 수 있었다 (도 2a). 또한, 정제된 효소의 최적 pH를 결정하기 위해 표준 효소반응에서 각기 다른 완충용액을 사용하였다. 최적 pH 결정에 사용된 완충용액은 50mM citric acid/Na₂HPO₄ buffer (pH 5.0-6.5), 50mM sodium phosphate buffer (pH 6.5-8.0), 그리고 Tris-Cl buffer (pH8.0-9.0)를 사용하였다. 각 pH buffer에서 상대적인 활성을 조사한 결과 pH 7에서 최대 활성을 나타내었다 (도 2b). 또한 열에 대한 안정성을 조사하기 위해서 25~50℃ 범위에서 잔존 활성을 측정하였다. 각 지정된 온도에서 1시간 방치 후에 잔존 활성을 확인한 결과 40℃ 이하에서 잔존 활성이 높게 남아있는 것을 확인하였다 (도 2c).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 재조합 대장균으로부터 정제한 수크로오스 포스포릴라아제를 SDS-PAGE 결과를 나타낸 그림이다.

도 2는 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 균주로부터 분리한 수크로오스 포스포릴라아제의 생화학적 특성을 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Sucrose Phosphorylase Derived from Leuconostoc lactis <130> P09-B124 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Leuconostoc lactis <400> 1 Met Lys Lys Leu Thr Asn Glu Val Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Leu Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asp Gln Val Leu Ser Asn Glu Leu 20 25 30 Asp Gly Val Val Gly Gly Val His Val Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr 35 40 45 Gly Asp Arg Gly Phe Ala Pro Glu Glu Tyr Glu Thr Val Asp Pro Lys 50 55 60 Phe Gly Asp Trp Ser Asp Ile Asp Lys Leu Ala Glu Lys Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Met Phe Asp Phe Met Leu Asn His Ile Ser Pro Gln Ser Lys Tyr Phe 85 90 95 Gln Asp Phe Leu Glu Lys Lys Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Met Phe 100 105 110 Leu Lys Tyr Ser Glu Phe Trp Pro Glu Asn Arg Pro Thr Ala Glu Asp 115 120 125 Ile Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Lys Ala Pro Phe Ala Pro Val 130 135 140 Thr Phe Ala Asp Gly Thr Thr Asp Gln Val Trp Asn Thr Phe Gly Asp 145 150 155 160 Gln Gln Met Asp Leu Asp Val Thr Lys Pro Val Thr Lys Gln Phe Ile 165 170 175 Lys Asp Ser Leu Ile Asn Leu Ala Arg His Gly Ala Ser Val Ile Arg 180 185 190 Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Ile Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe 195 200 205 Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Val Leu Asn Glu Val Arg Glu Ile 210 215 220 Leu Ala Ala Glu Gly Ser Glu Val Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr 225 230 235 240 Lys Ile Val Arg Lys Ile Thr Asp His Asp Met Tyr Ser Tyr Asp Phe 245 250 255 Ala Leu Pro Leu Ile Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Thr Asn 260 265 270 Arg Leu Ala Asp Trp Leu Arg Gln Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr 275 280 285 Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Lys Asp Leu Leu 290 295 300 Thr Gln Glu Glu Thr Asp Phe Thr Thr Glu Glu Met Tyr Lys Val Gly 305 310 315 320 Ala Asn Val Lys Lys Ile Phe Ser Ser Ala Ala Tyr Asn Asn Leu Asp 325 330 335 Ile Tyr Gln Ile Asn Thr Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn Asp Asp 340 345 350 Ala Ala Tyr Leu Leu Ala Arg Ala Thr Gln Ile Phe Ala Pro Gly Ile 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp Leu Glu 370 375 380 Leu Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr 385 390 395 400 Asp Leu Glu Glu Ile Ala Glu Thr Val Lys Arg Pro Val Val Ser Asn 405 410 415 Leu Phe Asp Leu Leu Arg Phe Arg Asn Thr Ser Ser Ala Phe Asp Leu 420 425 430 Asp Gly Glu Ile Lys Val Glu Asn Asn Gly Asp Asn Asp Leu Thr Ile 435 440 445 Thr Arg Thr Ser Ala Asp Gly Gln Thr Thr Ala Val Leu Thr Ala Asp 450 455 460 Phe Ala Thr Lys Gln Phe Lys Val Thr Glu Asn Asp Lys Glu Ile Phe 465 470 475 480 Asn Thr Gln Ala <210> 2 <211> 1455 <212> DNA <213> Leuconostoc lactis <400> 2 atgaaaaagc tcaccaatga agtgatgctc attacatatg ctgactcact tggtaagaat 60 ttgaaggaat tggatcaagt gttgtcaaat gaattggatg gtgttgttgg tggtgtccac 120 gttttgccat tcttcccatc aacaggcgac cgtggctttg cccctgaaga atatgaaaca 180 gttgatccaa agtttgggga ctggtctgac attgacaagt tagctgagaa gtattacttg 240 atgtttgact tcatgttgaa ccacatttca ccacaatcaa agtatttcca agacttctta 300 gaaaagaagg aagactcaga atactatgac atgttcttga agtattctga attctggcct 360 gaaaaccgtc caacagctga agacattgat ttgatttata agcgtaagga taaggcacca 420 tttgcgcccg taacatttgc ggacggcaca acagaccaag tttggaacac attcggtgac 480 caacaaatgg atttggatgt cacaaagcca gtgacaaagc aattcatcaa ggattcattg 540 attaaccttg cccgtcatgg tgcgtcagtg attcgtttgg atgcctttgc ttacgctatc 600 aagaagttgg atacaaacga cttcttcgtt gaaccagaaa tctgggacgt tttgaacgaa 660 gtacgtgaaa tcttggcagc agaaggttct gaagttttgc cagaaatcca tgaacactac 720 aagattgtgc gcaagattac ggatcacgac atgtattcat atgactttgc gttgccattg 780 attacgttgt actcacttta ttcaggtaag acaaaccgtt tggctgactg gttgcgtcaa 840 agcccaatga agcaatttac aacattggat acacacgatg gtattggtgt tgttgatgcc 900 aaggacttgt tgacacaaga agaaacagac tttacaacgg aagaaatgta caaggttggg 960 gctaacgtga agaagatctt ctcatcagca gcctacaata acttggatat ttaccaaatt 1020 aatacaactt attactcagc tttgggtaat gatgatgccg cttacttgct agcacgtgca 1080 acacaaatct ttgcaccagg tatcccacaa gtttattacg ttggtttgtt ggcaggtgaa 1140 aacgaccttg aattgttgga aagcacaaag gaaggccgta acatcaaccg tcactattac 1200 gaccttgaag aaattgctga aacagttaag cgtccagttg tgtcaaactt gtttgacttg 1260 cttcgcttcc gtaacacaag ctcagccttt gatcttgatg gtgagattaa ggttgaaaac 1320 aacggtgaca atgatttgac aattacacgt acatcagctg atggtcaaac aactgccgtt 1380 ttgacagctg actttgcgac aaagcaattc aaagtcactg aaaatgataa agaaattttc 1440 aacacacagg cttaa 1455 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttygayttya tgathaayca yat 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 nagrttngcn ccnacyttrt a 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgactttgc gttgccattg attac 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gttggtcacc gaatgtgttc ca 22 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gactcgagat gaaaaagctc accaatgaag tg 32 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 taggatcctt aagcctgtgt gttgaaaatt tc 32

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 류코노스톡 락티스 EG001 (Leuconostoc lactis EG001) 유래 수크로오스 포스포릴라아제.
제1항의 수크로오스 포스포릴라아제를 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
삭제
제2항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제2항의 수크로오스 포스포릴라아제 유전자가 염색체상에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
제6항 또는 제7항의 재조합 미생물을 배양하여 수크로오스 포스포릴라아제를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 수크로오스 포스포릴라아제를 회수하는 단계를 포함하는 수크로오스 포스포릴라아제의 제조방법.