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KR101077783B1 - 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이의 발현 벡터, 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질의 제조방법 - Google Patents

재조합 인간성장호르몬 단백질, 이의 발현 벡터, 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질의 제조방법 Download PDF

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KR101077783B1
KR101077783B1 KR1020110081238A KR20110081238A KR101077783B1 KR 101077783 B1 KR101077783 B1 KR 101077783B1 KR 1020110081238 A KR1020110081238 A KR 1020110081238A KR 20110081238 A KR20110081238 A KR 20110081238A KR 101077783 B1 KR101077783 B1 KR 101077783B1
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KR
South Korea
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growth hormone
human growth
signal peptide
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seq
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KR1020110081238A
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Inventor
이성학
노선희
김희대
Original Assignee
바이오알앤디 주식회사
명문제약주식회사
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Abstract

본 발명은 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간성장호르몬 본래의 신호펩티드의 치환, 또는 이와 더불어 시그널 펩티다아제-I 효소와 상기 재조합 인간성장호르몬 단백질을 함께 발현시키는 것을 통해 인간성장호르몬 생산 효율을 현저히 향상시킬 수 있는 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질 제조방법에 따라 인간성장호르몬 단백질을 간단한 공정을 통해 대량 생산할 수 있으며, 특히 신호펩티드와 결합되지 않은 천연형 인간성장호르몬의 생산량을 현저히 높일 수 있어, 왜소증을 비롯하여 골다공증, 우울증 등의 성인병에 실제 적용될 경우 장기 투여시 면역반응의 우려를 줄일 수 있어 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

재조합 인간성장호르몬 단백질, 이의 발현 벡터, 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질의 제조방법{RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE, EXPRESSION VECTOR THEREOF, AND PREPARING METHOD OF HUMAN GROWTH HORMONE USING THEREOF}
본 발명은 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간성장호르몬 본래의 신호펩티드의 치환, 또는 이와 더불어 시그널 펩티다아제-I 효소와 상기 재조합 인간성장호르몬 단백질을 함께 발현시키는 것을 통해 인간성장호르몬 생산 효율을 현저히 향상시킬 수 있는 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질 제조방법에 관한 것이다.
인체 유래의 유용 단백질을 대장균을 이용하여 발현시킬 경우, 발현된 단백질이 3차 구조를 제대로 이루지 못하여 침전물(inclusion body)로 형성되는 경우가 많다. 인체 유래의 단백질은 시스테인 아미노산끼리 이중 설파이드(disulfide) 결합을 이루는데, 대장균 세포질은 인체 세포에 비하여 환원성이 높은 상태이기 때문에 설파이드 결합이 제대로 형성되지 못하고 그로 인해 정상적인 3차 구조를 이루지 못한다. 따라서, 침전물을 유레아나 구아니딘에 녹인 후 정상적인 3차 구조를 유도하는 방법을 쓰기도 하지만, 이러한 방법은 공정이 복잡하고 수율이 낮은 문제가 있다.
이를 이용한 인간성장호르몬 생산을 위한 방법으로, 초기에는 천연형 인간성장호르몬의 아미노 말단에 대장균에서 발현 시 필요한 메티오닌 아미노산이 결합된 형태로 대장균 세포에서 생산되었다(Genetech사 Protropin). 이렇게 생산된 인간성장 호르몬은 대장균 세포내에서 침전물 형태로 만들어지며, 유레아나 구아니딘으로 녹인 후 3차 구조를 형성토록 하는 일련의 과정을 거쳐 활성을 가진 인간성장호르몬으로 만들어진다. 그런데 이에 따라 만들어진 인간성장호르몬은 인체 내의 천연형 호르몬과는 달리 아미노 말단에 메티오닌을 가지고 있어 장기 투여 시 면역반응을 일으킬 수 있다는 문제가 있었다.
대장균의 경우, 세포내막과 외막 사이에 존재하는 주변세포질(Periplasm)로 유용단백질을 분비하도록 유도하여 정상적인 3차 구조를 가진 단백질을 얻는 방법을 쓰기도 한다. 이러한 방법에 따라, 주변세포질로 유용단백질을 분비시킬 경우 세포에 삼투압을 가하는 방법에 의해 분비된 단백질을 세포로부터 회수하는 방법을 사용하는데, 순도가 높은 반면 회수율이 좋지 못하며, 배양 및 회수 과정에서 깨어지는 세포가 많은 경우 순도 또한 높지 못한 문제가 있다.
따라서 현재 메티오닌이 남아 있는 인간성장호르몬 제품은 생산되지 않고 있으며, 메티오닌을 제거하기 위한 방법 중 하나로 아미노펩티다아제를 처리하는 방법이 개발되어 있다. 그러나 이처럼 침전물을 녹여 인간성장호르몬을 만드는 방법은 처리단계가 복잡하고 추가로 효소 처리를 하여야 하기 때문에 생산 공정이 복잡하고 비용도 많이 든다. 메티오닌을 제거하기 위한 다른 방법으로서 노보노디스크(Novo Nordisk)사는 침전물이 아닌 형태의 인간성장호르몬을 발현하지만 아미노 말단에 메티오닌을 추가로 가지고 있는 형태를 발현시켜 정제 공정에서 효소를 이용하여 이를 제거하는 방법을 사용하고 있으나 역시 효소처리로 인한 상술한 바와 같은 문제가 있으며(Indian J Pediatr(Suppl) 1991; 58:23-32), 또 다른 방법으로서 효모를 이용하여 인간성장호르몬을 생산하기도 하는데 인체와는 다른 효모의 당화(glycosylation) 작용에 의하여 제거가 어려운 변형체가 생성되는 단점이 있다 (대한민국 특허 10-0274191).
왜소증 환자에 대한 처방으로 개발되었던 인간성장호르몬은 현대에는 골다공증, 우울증 등 성인병에도 처방되는 등 그 적응증이 늘어가고 있다. 따라서 단순한 공정과 높은 생산성을 통하여 원가를 낮출 수 있는 인간성장호르몬 생산법이 요구되고 있다.
이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 인간성장호르몬 본래의 신호펩티드를 치환하거나, 또는 이와 더불어 상기 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질을 시그널 펩티다아제-I 효소와 함께 발현시키는 것을 통해 인간성장호르몬 생산 효율을 현저히 향상시킬 수 있는 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 재조합 인간성장호르몬 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터를 제조하는 단계, 및 상기 제조된 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는 인간성장호르몬 생산방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 18의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터로 미생물을 형질전환시키는 단계, 2) 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된, 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계, 및 3) 상기 2) 단계에서 제조된 발현벡터를 상기 1) 단계에서 형질전환된 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는 인간성장호르몬 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 18의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 후, 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된, 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 다시 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체를 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
인간성장호르몬은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성되고, 아미노 말단이 페닐알라닌-프롤린-트레오닌(Phe-Pro-Thr)의 서열로 이루어져 있는 분자량 22kDa의 폴리펩티드 호르몬이다.
본 발명자들이 보다 용이한 공정을 통해 천연형 인간성장호르몬을 대량 생산하기 위해 연구한 결과, 인간성장호르몬 단백질에 포함되어 있는 본래의 신호펩티드를 변형 또는 변형되지 않은 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환하거나, 또는 이와 더불어 상기 본래의 신호펩티드가 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질을 시그널 펩티다아제-I 효소와 함께 발현시킬 경우, 인간성장호르몬 단백질의 생산량을 현저히 향상시킬 수 있고, 특히 천연형 인간성장호르몬 단백질의 생산량을 높임으로써 장기 투여에 따른 면역반응의 우려를 줄일 수 있음을 확인하였으며, 또한 상기 재조합 인간성장호르몬 단백질을 시그널 펩티다아제-I 효소와 함께 또는 단독으로 발현하도록 형질전환된 형질전환체를, 저온으로 배양하고, 이후 수확된 세포를 계면활성제를 포함하는 버퍼를 사용하여 파쇄할 경우, 세포 내액의 상층액을 통해 신호펩티드와 결합되지 않은 천연형 인간성장호르몬을 용이한 공정을 통해 대량으로 얻을 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 재조합 인간성장호르몬 단백질이 제공된다.
본 발명자들의 실험결과, 재조합 유전자를 사용하여 대장균에서 천연형 인간성장호르몬을 생산할 경우, 생산된 인간성장호르몬 단백질을 주변세포질로 분비되도록 유도하는 신호펩티드의 종류에 따라 천연형 인간성장호르몬 단백질의 생산 효율에 차이가 있음을 확인하였다.
바람직하게는 상기 인간성장호르몬 본래의 신호펩티드는 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환할 수 있다.
바람직하게는 상기 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 또한 바람직하게는 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환시 다른 신호펩티드 특히, 엔테로톡신 II 신호펩티드로 치환한 경우에 비해 인간성장호르몬의 발현량이 약 2.4 배 정도 향상되는 효과가 있다(실험예 1 참조).
그런데, 상기 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬을 발현시에 신호펩티드가 제거되지 않은 것으로 보이는 인간성장호르몬 전구체(Pre-Human Growth Hormone, Pre-hGH)가 미량으로 함께 발현됨을 확인할 수 있었다.
상기 인간성장호르몬 전구체는 천연형 인간성장호르몬과 분자량 및 전기적 성질이 유사하기 때문에 이후 정제 단계에서 분리가 매우 어려운 문제가 있다.
본 발명자들이 상기 인간성장호르몬 전구체의 성상을 파악하기 위하여 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드와 결합되어 있는 인간성장호르몬 전구체의 아미노 말단 서열을 분석한 결과, 오염된 전구체는 22개 아미노산으로 구성된 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드의 9번째 알라닌(alanine) 다음에서 잘라진 것으로 천연형 인간성장호르몬에 13개의 신호펩티드 유래 아미노산이 붙어 있는 형태임을 알 수 있었다.
이는 후술할 시그널 펩티다아제 I에 의해 신호펩티드가 잘라질 때, 신호펩티드 말단에 존재하는 알라닌 다음이 잘라지는 점에 비추어, 인간성장호르몬 전구체는 시그널 펩티다아제 I에 의해 신호펩티드가 다른 위치에서 잘라진 결과라고 추정할 수 있다.
따라서 이와 같이 다른 위치에서 신호펩티드가 잘라지는 문제점을 방지하기 위해, 바람직하게는 상기 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 8번째 또는 9번째에 위치한 알라닌이 류신 또는 발린으로 치환된 변형된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
보다 바람직하게는 9번째에 위치한 알라닌이 류신 또는 발린으로 치환된 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
이처럼 상기 서열번호 3의 아미노말단으로부터 9번째에 위치한 알라닌을 류신 또는 발린으로 치환함으로써, 신호펩티드가 다른 위치에서 잘라짐으로 인해 생성되는 인간성장호르몬 전구체의 생성량을 현저히 감소시킬 수 있는 효과가 있다(실험예 5 참조).
본 발명은 또한 상술한 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
바람직하게는 상기 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자는 인간성장호르몬 본래의 신호펩티드가 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 아미노산 서열로 구성된 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 아미노산 서열 중 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드 부분에 해당하는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 9번째에 위치한 알라닌이 류신 또는 발린으로 치환된 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 유전자를 포함하는 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터를 제조하기 위한 벡터는 전사 및 번역 종결제 (terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유하는 벡터로서 원핵생물, 진핵생물, 또는 양자 모두에 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균 발현 T7 프로모터를 가진 pBR 벡터를 사용할 수 있다.
바람직하게는 상기 pBR 벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 절단위치에 상기 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 발현벡터를 제조할 수 있으며, 이와 같이 제조된 발현벡터를 pBR-agp-hGH 벡터로 명명하였다(도 1c).
상기 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있으며, 형질전환의 대상이 되는 숙주는 다양한 원핵생물 또는 진핵생물일수 있고, 바람직하게는 대장균일 수 있다.
재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터로 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
이와 같이 제조된 형질전환체를 배양하여 세포를 수확하고, 파쇄하여 생성된 인간성장호르몬을 고수율로 수득할 수 있다.
따라서 본 발명의 다른 일 구현예에 따라, 상기 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터를 제조하는 단계, 및 상기 제조된 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는 인간성장호르몬 생산방법이 제공된다.
바람직하게는 상기 형질전환 단계 이후에 상기 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 LB 배지, SOB 배지 혹은 TB 배지가 될 수 있다.
바람직하게는 상기 배양 단계는 인간성장호르몬의 숙주(바람직하게는 대장균) 세포 내 효율적인 발현을 위하여 저온 배양법을 이용하여 이루어질 수 있다.
신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬을 예컨대 37℃와 같은 고온에서 배양하면서 인간성장호르몬의 발현을 유도하면 세포 성장이 급격하게 저하되며 인간성장호르몬의 발현량도 많지 않은 문제가 있다.
따라서 바람직하게는 배양개시 후 세포가 지수 생장곡선(exponential growth curve)을 보이는 시기에 배양 온도를 10-30℃, 보다 바람직하게는 15-24℃의 저온으로 낮추어 1 내지 6시간 추가 배양 후, 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬의 발현을 유도하는 방법을 사용하여 인간성장호르몬의 발현량을 높일 수 있다.
이와 같이 저온에서 추가 배양 및 단백질 발현 유도 후 동일한 온도 조건에서 15-24시간 추가 배양하면 균주의 성장이 이루어지면서 인간성장호르몬의 발현량도 지속적으로 증가시킬 수 있다.
바람직하게는 상기 배양 단계 이후에, 상기 배양 단계를 거쳐 수확된 세포를, 계면활성제를 포함하고 0-500mM 염농도와 pH 7.5-9.0 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 버퍼로 파쇄하여 세포 내액을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.
천연형 인간성장호르몬은 세포의 침전물에 비해 세포 내액에 훨씬 다량으로 존재하고 있으므로(실험예 2 내지 4 참조), 세포 파쇄시 전체 세포 내액을 취하여 천연형 인간성장호르몬을 고수율로 수득할 수 있다.
세포 파쇄는 초음파, 프렌치프레스(French press), 마이크로플루다이저(Microfluidizer) 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 세포 파쇄를 위한 파쇄 용액은 바람직하게는 계면활성제, 및 0-500mM 염농도와 pH 7.5-9.0 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 한다.
세포 파쇄 시, 계면활성제를 포함하는 파쇄 용액을 사용하면 인간성장호르몬 전구체(Pre-hGH)의 양이 줄어들면서 천연형 인간성장호르몬의 양이 늘어나는 효과가 있다(실험예 3 참조).
상기 계면활성제로는 Triton X-100, NP40, Tween20 등 비이온계열 계면활성제(Non-ionic detergent) 를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 0.1~2%(v/v)로 사용할 수 있다.
또한 세포 파쇄에 사용하는 버퍼의 염(salt) 농도 및/또는 pH 또한 천연형 인간성장호르몬 생성에 중요한 요소이다.
상기 염(salt)은 임의로 사용 가능한 것으로서, 예컨대 NaCl, KCl, NH4Cl, 또는 (NH4)2SO4 등을 0-500mM 농도로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 염 농도를 낮게 포함함으로써 천연형 인간성장호르몬의 생성량을 높일 수 있다(실험예 4 참조).
또한 본 발명자들이 pH 변화에 따른 천연형 인간성장호르몬 생성을 비교하기 위하여 실험한 결과, pH가 높을수록 천연형 인간성장호르몬의 생성량이 증가함을 확인할 수 있었다(실험예 2 참조). 따라서 파쇄 용액에 포함되는 버퍼는 바람직하게는 pH 7.5~9.0 조건을 갖는 인산칼륨(Potassium phosphate) 버퍼, 또는 Tris-HCl 버퍼가 될 수 있다.
이와 같이 전체 세포를 파쇄하여 천연형 인간성장호르몬을 얻는 방법은 삼투압을 이용하여 주변세포질 분액을 얻는 방법에 비해 훨씬 간단하며 천연형 인간성장호르몬 회수율 또한 현저히 높다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따라, 1) 서열번호 18의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터로 미생물을 형질전환시키는 단계, 2) 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된, 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계, 및 3) 상기 2) 단계에서 제조된 발현벡터를 상기 1) 단계에서 형질전환된 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는 인간성장호르몬 생산 방법이 제공된다.
글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬의 발현시 신호펩티드가 제거되지 않은 전구체(Pre-Human Growth Hormone, Pre-hGH)가 세포 파쇄 침전물에 많이 생성됨을 확인할 수 있었다. 따라서 이를 천연형 인간성장호르몬으로 만들기 위하여 신호펩티드 절단에 작용하는 시그널 펩티다아제 I 효소를 함께 발현시키는 시스템을 사용하였다.
상기 시그널 펩티다아제 I 효소는 재조합 인간성장호르몬과 동시 또는 이시에 함께 발현시킬 수 있으며, 이에 따라 천연형 인간성장호르몬의 생성량을 현저히 향상시킬 수 있다(실험예 1, 표 1).
상기 시그널 펩티다아제 I 와 재조합 인간성장호르몬을 함께 발현시키기 위해, 서열번호 18의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터(도 2 참조)로 미생물(바람직하게는 대장균)을 형질전환시킨 후에, 상기 형질전환된 미생물에, 재조합 인간성장호르몬 발현 벡터를 도입하여 다시 형질전환시킬 수 있다.
이와 같이 2단계에 걸쳐 형질전환된 형질전환체는 시그널 펩티다아제 I 와 재조합 인간성장호르몬을 함께 발현시킴으로써 천연형 인간성장호르몬의 생산량을 현저히 높일 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 일 구현예에 따라, 서열번호 18의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 후, 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된, 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 다시 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체가 제공된다.
상기 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터는 바람직하게는 도 9의 개열지도로 표현되는 것일 수 있으며, 상기 재조합 인간성장호르몬 발현 벡터는 바람직하게는 도 8의 개열지도로 표현되는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 두 번째 형질전환 단계 이후에, 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 배양단계는 바람직하게는 배양 개시후 상기 두 번째 형질 전환단계를 통해 형질전환된 미생물이 지수생장곡선을 보이는 시점에서 온도를 10-30℃로 낮추어 배양 후 재조합 인간성장호르몬의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 배양단계 이후에, 상기 배양 단계를 거쳐 수확된 세포를, 계면활성제, 및 0-500mM 염농도와 pH 7.5-9.0 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 버퍼를 포함하는 파쇄 용액으로 파쇄하여 세포 내액을 얻는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이와 관련된 보다 구체적인 사항은 상술한 바와 같다.
본 발명의 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질 제조방법에 따라 인간성장호르몬 단백질을 간단한 공정을 통해 대량 생산할 수 있으며, 특히 신호펩티드와 결합되지 않은 천연형 인간성장호르몬의 생산량을 현저히 높일 수 있어, 왜소증을 비롯하여 골다공증, 우울증 등의 성인병에 실제 적용될 경우 장기 투여시 면역반응의 우려를 줄일 수 있어 매우 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 인간성장호르몬 발현 벡터 제조용 pBR 벡터(도 1a), 인간성장호르몬 발현 벡터 pBR-Pre-hGH(도 1b) 및 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현 벡터 pBR-agp(STII)-hGH(도 1c)를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에 따라 시그널 펩티다아제-I 발현 벡터 pLysED-SP I을 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에 따라 인간성장호르몬 발현 정도를 확인한 결과로서, 도 3a는 폴리아크릴아미드젤(Polyacrylamide gel) 상에서 관찰한 결과이고, 도 3b는 도 3a의 결과를 인간성장호르몬에 대한 단일항체(monoclonal antibody)를 이용한 면역분석법(Western blot)을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 2에 따라 초음파 파쇄 처리 여부 및 파쇄 용액의 pH 변화에 따른 천연형 인간성장호르몬 생성 효율 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 3에 따라 계면활성제 사용 여부 및 사용 농도에 따른 천연형 인간성장호르몬 생성 효율 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 4에 따라 파쇄 용액 중 포함된 염의 농도에 따른 천연형 인간성장호르몬 생성 효율 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 5에 따라 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드 변형에 따른 인간성장호르몬 전구체(Pre-hGH) 생성량 감소 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 재조합 인간성장호르몬 발현 벡터(pBR-agp-hGH)의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 9는 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터(pLysED-SPI)의 개열지도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 글루코스 -1- 포스파타제 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현 벡터 및 형질전환 균주 제조
1.1. 인간성장호르몬 발현 벡터( pBR - Pre - hGH ) 제조
대장균에서 천연형 인간성장호르몬이 발현되도록 하기 위하여, 인간성장호르몬 유전자를 합성하여 대장균 발현 프로모터를 가진 벡터에 클로닝하였다.
구체적으로 인간성장호르몬 유전자는 아미노산 서열을 유지하면서 대장균 코돈(codon) 사용 빈도에 맞게 유전자 서열을 디자인 한 후 합성하였다(서열번호 2).
다음으로 인간성장호르몬 발현 벡터 제조용 pBR 벡터를 제조하기 위해, 우선 상호 상보적인 염기서열과 말단에 NdeI, EcoRI 절단면을 가지고 있는 히스티딘 태깅(histidine tagging)용 프라이머를 제작하여 이중 나선으로 어닐링(annealing) 시킨 후, pET21b 벡터(Novagen)를 제한효소 NdeI(NEB)과 EcoRI(NEB)으로 자른 위치에 리가아제(NEB)로 삽입하여 pET21b-His 벡터를 제조하였다. 제조된 pET21b-His 벡터는 다시 BamHI(NEB)과 EcoRI(NEB)으로 자르고, 자른 위치에 트롬빈(thrombin) 절단 위치를 가지고 있는 상호 상보적이며 말단에 BamH I과 상보적인 BglII 절단면과 EcoRI 절단면을 가지고 있는 프라이머 결합체를 리가아제로 삽입하여 pBR 벡터를 제조하였다(도 1a).
이와 같이 제조된 pBR 벡터는 발현을 위하여 삽입한 유전자의 아미노 말단에 6개의 히스티딘으로 구성된 태그와 이를 제거할 수 있는 트롬빈 절단 위치를 가지게 된다. 사용된 프라이머는 각각 아래와 같다.
<히스티딘 태깅용 프라이머>
tatgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatccggg (서열번호 35)
actctcctagcgtagtggtagtggtagtgcctaggcccttaa (서열번호 36)
<트롬빈 절단위치 삽입용 프라이머>
gatctctggtgccacgcggatccggg (서열번호 37)
agaccacggtgcgcctaggcccttaa (서열번호 38)
합성한 서열번호 2의 인간성장호르몬 유전자는 본래 인간성장호르몬이 가지고 있던 신호펩티드 아미노산을 코딩하고 있는 유전자이며, 이를 NdeI과 XhoI 제한효소 절단위치를 이용하여 대장균 발현 T7 프로모터를 가진 상기 제조된 pBR 벡터에 클로닝하여 인간성장호르몬 발현 벡터 pBR-Pre-hGH를 얻었다 (도 1b) (Gene2Oligo: oligonucleotide design for in vitro gene synthesis. Rouillard JM, Lee W, Truan G, Gao X, Zhou X, Gulari E. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue):W176-80.).
1.2. 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 유전자, 이의 발현 벡터( pBR - agp - hGH ), 및 형질전환 균주 제조
A. 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 유전자 제조
1) 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 유전자 제조
대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드(agp 유전자의 신호펩티드)로 인간성장호르몬 본래의 신호펩티드를 치환하기 위해, 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드(서열번호 6)를 두 개의 프라이머(primer) agp(SP)-1F(서열번호 9)(5'-aaggaaaaaacatatgaacaaaacgctaatcgccgcagctgtggcagggatag-3'; 밑줄 그은 부분은 NdeI 제한효소 자리), 및 agp(SP)-2R(서열번호 10)(5'-ggatggtcgggaatgcctgagcgtttgaagcgagtaaaactatccctgcc-3')를 사용하여 PCR 법으로 증폭하였다(95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행). 신호펩티드가 포함되지 않은 인간성장호르몬 유전자는, 천연형 인간성장호르몬의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열을 이용한 hGH-F (서열번호 11) 및 인간성장호르몬 카복시 말단의 hGH-R(서열번호 12)의 프라이머쌍을 이용하여 상기 실시예 1.1.에서 얻어진 pBR-Pre-hGH로부터 PCR을 통하여 증폭함으로써 본래의 신호펩티드가 제거된 인간성장호르몬 유전자 조각을 얻었다(95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행).
증폭된 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드 유전자의 3’-말단과 자신의 신호펩티드가 제거된 채로 증폭된 인간성장호르몬 유전자의 5’-말단은 13개의 상보적인 서열을 가지도록 디자인되었다(서열번호 6, 및 서열번호 13). 이 두 DNA 조각을 주형으로 하여, agp(SP)-1F(서열번호 9)와 hGH-R 프라이머(서열번호 12)(5'- atatctcgagctagaaaccgcaagaaccttcaac-3'; 밑줄 그은 부분은 Xho l의 절단부위)를 사용한 두 번째 PCR(95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행)을 통하여 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 유전자 조각을 증폭하였다(서열번호 14 및 15: agp-hGH).
2) 엔테로톡신 II 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 유전자 제조
인간성장호르몬 발현량을 비교하기 위하여 기존에 알려진 대장균 유래의 엔테로톡신 II(AAA23989.1) 신호펩티드(P22542[1-23])와 인간성장호르몬의 결합체를 만들어 생성량을 비교하였다 (Gene, 55 189-196(1987)). (도 3).
먼저 대장균 유래의 엔테로톡신 II 신호펩티드(stiI 유전자의 신호펩티드)로 인간성장호르몬 본래의 신호펩티드를 치환하기 위해, 엔테로톡신 II 신호펩티드 (서열번호 23)를 다섯 개의 프라이머(primer) STII(SP)-1F(서열번호 24)(5'- aaggaaaaaacatatgaaaaagaatatcgcatttc-3'; 밑줄 그은 부분은 NdeI 제한효소 자리), STII (SP)-2R (서열번호 25) (5'- aacatagatgcaagaagaaatgcgatattctttt -3'), STII (SP)-3F(서열번호 26)(5'- ttcttgcatctatgttcgttttttctattgct -3'), STII (SP)-4R(서열번호 27)(5'- tgcataggcatttgtagcaatagaaaaaacg -3'), STII (SP)-5F(서열번호 28)(5'- acaaatgcctatgcattcccgaccatcccgc -3')를 사용하여 PCR 법으로 증폭하였다(95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행).
신호펩티드가 포함되지 않은 인간성장호르몬 유전자는, 천연형 인간성장호르몬의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열을 이용한 hGH-F (서열번호 11) 및 인간성장호르몬 카복시 말단의 hGH-R(서열번호 12)의 프라이머쌍을 이용하여 상기 실시예 1.1.에서 얻어진 pBR-Pre-hGH로부터 PCR을 통하여 증폭함으로써 본래의 신호펩티드가 제거된 인간성장호르몬 유전자 조각을 얻었다(95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행).
증폭된 엔테로톡신 II 신호펩티드 유전자의 3’-말단과 자신의 신호펩티드가 제거된 채로 증폭된 인간성장호르몬 유전자의 5’-말단은 13개의 상보적인 서열을 가지도록 디자인되었다(서열번호 23, 및 서열번호 13) 이 두 DNA 조각을 주형으로 하여, STII(SP)-1F (서열번호 24)와 hGH-R 프라이머(서열번호 12)(5'- atatctcgagctagaaaccgcaagaaccttcaac-3'; 밑줄 그은 부분은 Xho l의 절단부위)를 사용한 두 번째 PCR (95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행)을 통하여 엔테로톡신 II 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 유전자 조각을 증폭하였다(서열번호 29 및 30: STII-hGH).
B. 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 유전자 발현 벡터( pBR - agp -hGH) 및 형질전환 균주 제조
상기 A.1) 및 A.2) 에서 증폭된 재조합 인간성장호르몬 유전자 조각(서열번호 14 및 서열번호 29)은 각각 제한효소인 NdeI(NEB)과 XhoI(NEB)으로 자른 후 같은 제한효소로 자른 pBR 벡터의 절단 부위에 리가아제(NEB)를 사용하여 삽입하여 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현 벡터 pBR-agp-hGH(서열번호 31)와, 엔테로톡신 II 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터 pBR-STII-hGH를 제조하였다(도 1c).
또한 상기 제조된 발현 벡터(pBR-STII-hGH 및 pBR-agp-hGH)로 BL21(DE3) 대장균 균주(Novagen)를 형질전환시켜 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질을 발현하는 균주를 제조하였다(Dagert, M.; Ehrlich, S. (1979). "Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells". Gene 6 (1): 23-28. 참조).
실시예 2. 시그널 펩티다아제 -I 및 재조합 인간성장호르몬 동시발현 균주 제조
2.1. 시그널 펩티다아제 -I 유전자 획득
324개의 아미노산으로 이루어진 대장균의 시그널 펩티다아제-I 을 코딩하는 유전자를 확보하기 위하여 유전자의 양쪽 말단에 해당하는 프라이머 SPI-1F(서열번호 16)(5’-aaggaaaaaacatatggcgaatatgtttgccctg-3’) 및 SPI-2R(서열번호 17)(5’-atatctcgagttaatggatgccgccaatgc-3’)를 제작 후 대장균 게놈 DNA(AAA24064.1)를 주형으로 PCR을 수행하였다(95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행). 추출한 PCR 산물을 발현벡터에 클로닝하기 위하여, 프라이머에 미리 삽입된 제한효소 위치(NdeI 및 XhoI)를 이용하여 절단하여 시그널 펩티다아제-I 유전자를 얻었다(서열번호 18).
2.2. 시그널 펩티다아제 -I 발현 벡터 및 형질전환 균주 제조
시그널 펩티다아제-I 발현용 벡터를 제조하기 위해, 우선 인간성장호르몬 발현 벡터와 동시 발현이 가능하도록 p15A 복제 시작점(p15A origin)과 클로람페니콜(Chloramphenicol) 내성 유전자를 가지는 벡터(pLysE)(Novagen)를 변형하여 pLysED 벡터를 제조하였다.
구체적으로, 말단에 SacI(NEB) 절단 위치를 공통으로 가지고 있는 두개의 프라이머 pLys-3M(서열번호 32) 및 pLys-4M(서열번호 33)를 제작하여 pLysE 벡터를 주형으로 PCR 법으로 증폭한 후(95℃로 50초, 60℃로 50초, 및 68℃로 5분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행) 제한효소 SacI 으로 절단하고 이를 다시 리가아제(NEB)를 이용하여 접함함으로써 pLysED 벡터를 제조하였다. 이후 pLysED 벡터의 테트라사이클린(tetracycline) 유전자의 프로모터(Tet)를 사용하여 시그널 펩티다아제-I 유전자를 상시 발현하도록 제작하였다. 즉, 상기 벡터 내 상시 발현 프로모터인 tet 프로모터 위치에 상기 실시예 2.1에서 얻어진 시그널 펩티다아제-I 유전자를 제한효소 NdeI과 XhoI을 이용하여 클로닝하여 시그널 펩티다아제-I 발현 벡터 pLysED-SP I를 제조하였다(도 2 및 서열번호 34). 이후 상기 제조된 벡터를 이용하여 BL21(DE3) 대장균 균주를 형질전환 하였다 (Dagert, M.; Ehrlich, S. (1979). "Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells". Gene 6 (1): 23-28. 참조).
2.3 시그널 펩티다아제 -I 및 재조합 인간성장호르몬 동시발현 균주 제조
시그널 펩티다아제-I을 발현하도록 형질전환된 상기 실시예 2.2.의 균주에 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현용 벡터인 실시예 1.2.B의 pBR-agp-hGH 벡터 및 pBR-STII-hGH 벡터를 각각 형질전환 하여 시그널 펩티다아제-I 및 재조합 인간성장호르몬 동시발현 균주를 제조하였다 (Dagert, M.; Ehrlich, S. (1979). "Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells". Gene 6 (1): 23-28. 참조).
실시예 3. 변형된 글루코스 -1- 포스파타제 신호펩티드 제조 및 상기 변형된 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현 벡터 제조
인간성장호르몬 전구체(Pre-hGH) 생성을 감소시키기 위해 변형된 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드를 제조하였다. 구체적으로 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드의 아미노산 서열 중 아미노말단으로부터 9번째 알라닌을 발린, 류신, 또는 글리신으로 치환하기 위하여 하기와 같이 부분 변형 프라이머를 제작한 후 PCR 방법을 이용하여 신호펩티드의 아미노산 서열을 변형시켰다.
<글루코스-1-포스파타제 신호펩티드 변형용 프라이머>
agp(2A-G)-F(서열번호 19):
aaggaaaaaacatatgaacaaaacgctaatcgccgca ggc gtggcagggatag
agp(1A-L)-F(서열번호 20):
aaggaaaaaacatatgaacaaaacgctaatcgcc ctg gctgtggcagggatag
agp(2A-L)-F(서열번호 21):
aaggaaaaaacatatgaacaaaacgctaatcgccgca ctg gtggcagggatag
agp(2A-V)-F(서열번호 22):
aaggaaaaaacatatgaacaaaacgctaatcgccgca gtg gtggcagggatag
실시예 1.2.의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬을 발현하는 벡터(pBR-agp-hGH)를 주형으로 하여, 상기 변형용 프라이머, 및 인간성장호르몬의 3’ 말단의 프라이머(hGH-R) (서열번호 12)를 이용하여 각각 PCR 반응을 수행하여, 본래의 신호펩티드 대신 변형된 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드를 갖는 재조합 인간성장호르몬 유전자를 증폭하였다 (95℃로 30초, 55℃로 30초, 및 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행). 증폭한 유전자 조각은 제한효소NdeI과 XhoI 절단위치를 이용하여 pBR 벡터에 클로닝하여 변형된 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 벡터를 제조하였다.
이후 시그널 펩티다아제-I을 발현하도록 형질전환된 상기 실시예 2.2.의 균주를 상기 제조된 변형된 신호펩티드 치환 인간성장호르몬 발현 벡터로 형질전환하여 시그널 펩티다아제-I 및 변형된 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 동시발현 균주를 제조하였다.
실험예 1. 신호펩티드의 종류 및 시그널 펩티다아제 -I과의 동시발현 여부에 따른 인간성장호르몬 발현 정도 확인
상기 실시예 1.2.에서 제조된, 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현 균주를 LB 배지(Difco) 에서 키운 후 IPTG(이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드, isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 0.5mM로 처리하여 인간성장호르몬 발현을 유도하였다. 배양 시 초기에는 37℃로 키운 후 균주가 지수생장곡선을 보이는 시점에 배양 온도을 18℃로 낮추고 3시간 정도 배양한 후 IPTG를 처리하고 처리 후 22시간 추가 배양한 다음 세포를 수확하였다.
또한 상기 실시예 2.3.에서 제조된 시그널 펩티다아제-I 및 신호펩티드 치환 인간성장호르몬 동시발현 균주를 상술한 것과 동일한 방법으로 LB 배지에서 인간성장호르몬 발현을 유도하고, 세포를 수확하였다.
이후 상기 수확된 각 세포들에서 인간성장호르몬 발현 여부를 확인하기 위해, 수확한 대장균 세포를 계면활성제가 들어간 세포 파쇄 용액(Tris-HCl(pH7.9, 25℃) 20mM, Triton X-100 0.1%, 50mM NaCl)에 현탁하고 초음파(sonication; BRANSON사 Digital Sonifier, Power 20%, 1초×5회)를 이용하여 세포를 파쇄하여 세포 내액을 취하였다.
파쇄한 세포 용액을 원심분리(15,510g, 20분)하여 상층액을 취하였으며, SDS-PAGE 상에서 쿠마시블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하거나(도 3a) 면역분석법(Western blot)을 이용하여(도 3b) IPTG에 의하여 유도된 인간성장호르몬을 확인하여 하기 표 1 및 도 3에 나타내었다. 도 3에 표시된 각 레인(lane)은 아래와 같다.
M: 단백질 사이즈 마커,
1: 엔테로톡신 II 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액,
2: 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액,
3: 인간성장호르몬 식약청 표준품 (2 ug)
4: 시그널펩티다아제-I를 동시 발현시킨 엔테로톡신 II 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액
5: 시그널펩티다아제-I를 동시 발현시킨 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액
6: 인간성장호르몬 식약청 표준품 (0.1 ug)
7: 엔테로톡신 II 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액 (10배 희석)
8: 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액 (10배 희석)
9: 시그널펩티다아제-I를 동시 발현시킨 엔테로톡신 II 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액 (10배 희석)
10: 시그널펩티다아제-I를 동시 발현시킨 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액 (10배 희석)
신호펩티드 종류 시그널 펩티다아제 I
발현 여부		 인간성장호르몬 발현량
(mg/L/1 O.D.600nm)
엔테로톡신 II - 5.2
글루코스-1-포스파타제 - 12.4
엔테로톡신 II + 20.9
글루코스-1-포스파타제 + 76.7
상기 표 1 및 도 3에 나타난 바와 같이, 치환된 신호펩티드의 종류에 따라 천연형 인간성장호르몬(hGH) 발현양에 있어서 차이가 나타났으며, 특히 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 경우의 인간성장호르몬 발현량이 엔테로톡신 II 신호펩티드로 치환된 경우에 비하여 약 2.4배 정도 높게 나타났음을 확인할 수 있었다(도 3a의 1,2 레인, 및 도 3b의 7,8 레인 비교).
또한, 상기 인간성장호르몬 발현량은 시그널 펩티다아제 I과의 공동 발현 여부에 따라서도 큰 차이를 보였다. 즉, 시그널 펩티다아제-I을 함께 발현시킨 경우, 치환된 신호펩티드가 엔테로톡신-II 신호펩티드인 경우는 물론이고, 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드인 경우에도 모두 천연형 인간성장호르몬의 발현량이 증가되었으며, 구체적으로 엔테로톡신 II 신호펩티드의 경우에는 시그널 펩티다아제 I 효소와 함께 발현시키지 않은 경우에 비하여 약 4배 이상, 글루코스-1-포스파타제의 경우에는 약 6배 이상의 인간성장호르몬이 세포 파쇄 후 원심분리 상층액에서 발견되어 천연형 인간성장호르몬의 발현량 증가가 뚜렷함을 확인할 수 있었다(도 3a의 4,5 lane, 및 도 3b의 9,10 lane 비교). 이는 상기 시그널 펩티다아제 I과 신호펩티드 치환 인간성장호르몬을 함께 발현시킴으로써 상기 시그널 펩티다아제 I이 인간성장호르몬과 결합하고 있는 신호펩티드를 절단함으로써 천연형 인간성장호르몬의 발현량이 증가하였기 때문이다.
실험예 2. 초음파 파쇄 처리 여부 및 파쇄 용액의 pH 변화에 따른 천연형 인간성장호르몬 생성 효율 측정
상기 실시예 2.3.에서 시그널 펩티다아제-I 및 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬을 동시발현하도록 형질전환된 균주를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 LB 배지에서 인간성장호르몬 발현을 유도하고, 세포를 수확하였다.
수확된 세포를 다양한 pH 조건의 인산칼륨 버퍼를 포함하는 파쇄용액(인산칼륨(pH 6.0/7.0/8.0), 25℃) 100mM, Triton X-100 0.1%(v/v), EDTA 1mM)에 현탁하고, 이후 초음파 세포 파쇄처리를 하지 않은 경우, 및 초음파 세포 파쇄 처리를 한 경우를 각각 비교하였다. 나아가 상기 초음파 파쇄 처리를 한 실험군에 대해서는 파쇄 용액의 pH 변화에 따른 영향을 측정하였다.
초음파 파쇄 및 유도된 인간성장호르몬의 확인은 상시 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하여 도 4에 나타내었다. 도 4에 표시된 각 레인은 아래와 같다.
홀수 번호의 레인: 초음파 세포 파쇄 미처리
짝수 번호의 레인: 초음파 세포 파쇄 처리
1,2 : pH 6.0
3,4 : pH 7.0
5,6 : pH 8.0
도 4에 나타난 바와 같이, 홀수 번호의 레인(초음파 파쇄 미처리군)에서는 천연형 인간성장호르몬(hGH)의 생성량이 미미한 반면, 신호펩티드가 제거되지 않은 전구체(Pre-Human Growth Hormone. Pre-hGH)가 다량으로 생성되었음을 알 수 있었으며, 짝수 번호의 레인(초음파 파쇄 처리군)에서는 전구체에 비해 천연형 인간성장호르몬이 훨씬 다량으로 생성되었음을 알 수 있어, 천연형 인간성장호르몬은 파쇄 처리를 통해 생성량을 보다 높일 수 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 파쇄처리에 의한 생성량 증대 효과는 본 실험에 사용된 초음파를 이용한 방법에 제한되지 않고, 이외에도 마이크로플루다이저, 프렌치 프레스 등의 다양한 파쇄 처리 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
또한 다양한 pH 조건에 따른 영향을 살펴보면, 세포 파쇄시의 파쇄용액의 pH 를 높일 수록 인간성장호르몬의 전구체의 생성량은 감소하고 천연형 인간성장 호르몬(hGH) 생성량은 현저히 증가함을 알 수 있어, 세포 파쇄를 통하여 세포 내액을 취함으로써 천연형 인간성장호르몬을 고수율로 수득할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 나아가 파쇄 용액의 pH가 높을수록 천연형 인간성장호르몬 생성량을 보다 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 파쇄 용액 중 계면활성제 사용 여부 및 사용 농도에 따른 천연형 인간성장호르몬 생성 효율 측정
상기 실시예 2.3.에서 시그널 펩티다아제-I 및 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬을 동시발현하도록 형질전환된 균주를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 LB 배지에서 인간성장호르몬 발현을 유도하고, 세포를 수확하였다.
이후 파쇄 용액으로서 다양한 농도의 계면활성제(Triton X-100)를 포함하는 파쇄용액(Tris-HCl (pH7.9, 25℃) 20mM, Triton X-100 (0, 0.1, 0.2, 0.5, 1%(v/v)), NaCl 50mM버퍼)을 사용한 것 외에는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 상기 수확된 세포를 파쇄하여 세포 내액을 취한 후, 원심분리하여 상층액에 존재하는 천연형 인간성장호르몬을 추출하였다. 추출된 천연형 인간성장호르몬은 SDS-PAGE 상에서의 쿠마시 염색(Coomassie staining) 혹은 면역분석법으로 확인하여 도 5에 나타내었다. 도 5에 표시된 각 레인은 아래와 같다.
홀수 번호의 레인: 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액
짝수 번호의 레인: 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 침전물
1,2 : Triton X-100 불포함
3,4 : 0.1% Triton X-100
5,6 : 0.2% Triton X-100
7,8 : 0.5% Triton X-100
9,10 : 1% Triton X-100
도 5에 나타난 바와 같이, 짝수 번호의 레인(세포 침전물)에서는 천연형 인간성장호르몬(hGH)의 생성이 거의 관찰되지 않은 반면, 신호펩티드가 제거되지 않은 전구체(Pre-Human Growth Hormone. Pre-hGH)가 다량으로 생성되었음을 알 수 있었으며, 홀수 번호의 레인(세포 내액)에서는 전구체에 비해 천연형 인간성장호르몬이 훨씬 다량으로 생성되었음을 알 수 있어, 천연형 인간성장호르몬은 세포 내액에 주로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 계면활성제를 첨가한 파쇄 용액을 사용한 경우(레인 3~10), 계면활성제를 첨가하지 않은 파쇄 용액을 사용한 경우(레인 1, 2)에 비해 인간성장호르몬의 전구체의 생성량은 감소하고 천연형 인간성장 호르몬(hGH) 생성량이 현저히 증가함을 확인할 수 있어, 천연형 인간성장호르몬 생성량 증가를 위해 계면활성제의 사용이 중요함을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 파쇄 용액 중 포함된 염의 농도에 따른 천연형 인간성장호르몬 생성 효율 측정
상기 실시예 2.3.에서 시그널 펩티다아제-I 및 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬을 동시발현하도록 형질전환된 균주를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 LB 배지에서 인간성장호르몬 발현을 유도하고, 세포를 수확하였다.
이후 파쇄 용액으로서 다양한 농도의 염(NaCl 0~500mM)을 포함하는 파쇄용액(Tris-HCl (pH7.9, 25℃) 50mM, Triton X-100 0.1%(v/v), EDTA 1mM)을 사용한 것 외에는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 상기 수확된 세포를 파쇄하여 세포 내액을 취한 후, 원심분리하여 상층액에 존재하는 천연형 인간성장호르몬을 추출하였다. 추출된 천연형 인간성장호르몬은 SDS-PAGE 상에서의 쿠마시 염색(Coomassie staining)으로 확인하여 도 6에 나타내었다. 도 6에 표시된 각 레인은 아래와 같다.
홀수 번호의 레인: 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 내액
짝수 번호의 레인: 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 인간성장호르몬 발현 세포 침전물
1,2 : NaCl 불포함
3,4 : 50mM NaCl
5,6 : 100mM NaCl
7,8 : 200mM NaCl
9,10 : 500mM NaCl
도 6에 나타난 바와 같이, 짝수 번호의 레인(세포 침전물)에서는 천연형 인간성장호르몬(hGH)의 생성이 거의 관찰되지 않은 반면, 신호펩티드가 제거되지 않은 전구체(Pre-Human Growth Hormone. Pre-hGH)가 다량으로 생성되었음을 알 수 있었으며, 홀수 번호의 레인(세포 내액)에서는 전구체에 비해 천연형 인간성장호르몬이 훨씬 다량으로 생성되었음을 알 수 있어, 천연형 인간성장호르몬은 세포 내액에 주로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 다양한 농도의 NaCl을 첨가한 파쇄 용액을 사용한 경우(레인 3~10), NaCl을 첨가하지 않은 파쇄 용액을 사용한 경우(레인 1, 2)에 비해 인간성장호르몬의 전구체의 생성량은 증가하고 천연형 인간성장 호르몬(hGH) 생성량은 감소함을 확인할 수 있어, 파쇄 용액에 포함되는 염 농도가 낮을수록 천연형 인간성장호르몬 생성량을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 글루코스 -1- 포스파타제 신호펩티드 변형에 따른 인간성장호르몬 전구체( Pre - hGH ) 생성 억제 확인
상기 실시예 3에서 제조된 시그널 펩티다아제-I 및 변형된 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬을 동시발현하는 균주를, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 LB 배지에서 인간성장호르몬 발현을 유도하고, 수확된 세포를 파쇄하여 유도된 인간성장호르몬을 면역분석법(Western blot)으로 확인하여 도 7에 나타내었다.
도 7에 표시된 각 lane은 아래와 같으며, 변형되지 않은 대조군으로는 상기 실시예 2.3.에서 제조된 시그널 펩티다아제-I 및 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 동시발현 균주를 사용하였다.
1 : 9번째 알라닌(alanie) -> 글리신(glycine) 변형
2 : 8번째 알라닌(alanie) -> 류신(leucine) 변형
3 : 9번째 알라닌(alanie) -> 류신(leucine) 변형
4 : 9번째 알라닌(alanie) -> 발린(valine) 변형
5 : 대조군
도 7에 나타난 바와 같이, 신호펩티드를 변형시키지 않은 대조군의 경우 인간성장호르몬 전구체(Pre-hGH)가 뚜렷하게 관측되었으나(레인 5), 변형된 신호펩티드로 치환된 재조합 인간성장호르몬을 발현하는 균주의 경우(레인 1~4) 인간성장호르몬 전구체의 크기 및/또는 생성량이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한 감소 정도는 특히, 9번째 알라닌을 류신 또는 발린으로 변형한 경우(레인 3, 4) 인간성장호르몬 전구체의 크기가 더욱 작아졌으며 그 양 또한 현저히 감소하여, 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드의 9번째 알라닌의 변형을 통해 원치 않는 인간성장호르몬 전구체의 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
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Claims (20)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 재조합 인간성장호르몬 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 9번째에 위치한 알라닌이 류신 또는 발린으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 인간성장호르몬 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항의 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자
  4. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터
  5. 제4항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 8의 개열지도로 표현되는 것인 발현 벡터.
  6. 제4항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 제4항의 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계
    를 포함하는 인간성장호르몬 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환 단계 이후에
    상기 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 더 포함하고,
    상기 배양은 배양 개시후 상기 형질전환체가 지수생장곡선을 보이는 시점에서 온도를 10-30℃로 낮추어 배양 후 재조합 인간성장호르몬의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 것인, 인간성장호르몬 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양단계 이후에,
    상기 배양 단계를 거쳐 수확된 세포를
    계면활성제, 및 0-500mM 염농도와 pH 7.5-9.0 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 버퍼를 포함하는 파쇄 용액으로 파쇄하여 세포 내액을 얻는 단계를 더 포함하는, 인간성장호르몬 생산 방법.
  11. 1) 서열번호 18의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터로 미생물을 형질전환시키는 단계;
    2) 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된, 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 2) 단계에서 제조된 발현벡터를 상기 1) 단계에서 형질전환된 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계
    를 포함하는 인간성장호르몬 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 2) 단계의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 9번째에 위치한 알라닌이 류신 또는 발린으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것인, 인간성장호르몬 생산 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 1) 단계의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터는 도 9의 개열지도로 표현되는 것인, 인간성장호르몬 생산 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 2) 단계의 발현벡터는 도 8의 개열지도로 표현되는 것인, 인간성장호르몬 생산 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 3) 형질전환 단계 이후에,
    4) 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계를 더 포함하고,
    상기 배양은 배양 개시후 상기 3)단계를 통해 형질전환된 미생물이 지수생장곡선을 보이는 시점에서 온도를 10-30℃로 낮추어 배양 후 재조합 인간성장호르몬의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 것인, 인간성장호르몬 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 4) 배양단계 이후에,
    상기 배양 단계를 거쳐 수확된 세포를
    계면활성제, 및 0-500mM 염농도와 pH 7.5-9.0 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 버퍼를 포함하는 파쇄 용액으로 파쇄하여 세포 내액을 얻는 단계를 더 포함하는, 인간성장호르몬 생산 방법.
  17. 서열번호 18의 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 후,
    서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 1 내지 26번째에 위치한 신호펩티드가, 대장균 유래의 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드로 치환된, 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 다시 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 시그널 펩티다아제 I 유전자를 포함하는 발현벡터는 도 9의 개열지도로 표현되는 것인, 형질전환체.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 글루코스-1-포스파타제 신호펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노말단으로부터 9번째에 위치한 알라닌이 류신 또는 발린으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것인, 형질전환체
  20. 제17항에 있어서,
    상기 재조합 인간성장호르몬 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터는 도 8의 개열지도로 표현되는 것인, 형질전환체.
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