KR101038510B1

KR101038510B1 - 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법

Info

Publication number: KR101038510B1
Application number: KR1020090003498A
Authority: KR
Inventors: 양재헌; 김대근; 김희자; 두은철
Original assignee: 김희자; 우석대학교 산학협력단
Priority date: 2009-01-15
Filing date: 2009-01-15
Publication date: 2011-06-01
Anticipated expiration: 2029-01-15
Also published as: KR20100084069A

Abstract

본 발명은 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용 농축시럽의 제조에 관한 것으로 좀 더 상세하게는 감초를 주약제로 하고 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조를 배합하여 추출 및 가수분해 시켜 생약 중에 함유되어 있는 다당체 성분을 비당체로 전환시켜 줌으로써 소화관 흡수능력을 높이고 소염 및 진통효과의 증강, 항산화작용의 증진, 체력보강, 면역 기능을 강화 시킬 뿐 아니라 보관 중 변질 및 미생물 오염을 방지시킬 수 있는 내복용 농축 시럽의 제조 방법이다.

감초, 가수분해 추출물, 흡수능력 개선, 생옥고

Description

감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법{prepartaion of concentrated syrups for oral use containing hydrolyzed products of Glycyrrhizae Radix extracts and its compounding herbal medicines}

본 발명은 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각종 환경공해와 어려운 경제여건 속에서 사회생활을 영위하면서 필연적으로 겪을 수밖에 없는 피로의 축적, 강박 관념, 정신적 긴장, 불안감, 감정의 손상, 소화기능장애, 수면장애 및 면역기능의 저하로 인하여 발생된 각종 순환기 질환, 소화기 질환, 퇴행성 질환의 염증 및 통증에 예방 및 개선 효과가 알려져 있는 한방 생약들 중 감초를 주약으로 하고 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조를 복합하여 가수분해추출물로 제조함으로써 위장관 흡수능력을 촉진시키고 체력을 보강하며 각종 염증을 개선하고 간장보호 및 해독작용, 콜레스테롤 저하작용, 순환기질환 예방 및 개선 효과를 나타낼 수 있는 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법에 관한 것이다.

대한민국 공개특허공보번호 제10-2005-0108415호

대한민국 공개특허공보번호 제10-2006-0134057호

일반적으로 생강감초탕, 경옥고는 체력의 보강, 각종 염증의 개선, 간장보호와 해독작용, 순환기질환 예방 및 개선 효과를 위하여 사용되고 있다.

특히, 생강감초탕은 감초를 위시하여 인삼, 생강 및 대조로 처방되어 한방에서 사용되어 왔으며, 이러한 생강감초탕은 심근세포에 공급되는 영양부족으로 심근의 수축력이 원활하지 못하고 기관지 및 폐의 면역기능 저하, 구강과 기관지의 진액이 부족하여 입술에 침이 잘 고이거나 인후와 구강의 건조, 기침과 천식 및 가슴이 답답할 때 심근세포, 구강, 기관지, 폐점막에 영양을 공급하며 점막을 원활하게 하여 면역기능을 강화하기 위한 것이다.

또한, 경옥고는 인삼을 위시하여 복령, 생지황 및 벌꿀로 처방되어 정력과 체력을 보강하고 면역기능을 강화하며 위장 및 순환기질환에 탁월한 효능을 나타냄으로써 민간요법으로 오랜 기간 보약으로 취급되어 왔다.

그러나, 감초를 위시하여 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조 등 구성생약들을 복합한 후 상기 생강감초탕 또는 경옥고를 제조하기 위하여 열탕으로 추출하거나 숙성시킬 경우에는, 수많은 활성성분과 보조성분들이 복잡하게 반응하여 침전 및 응집물을 생성시키고 유효성분이 불활성화 됨으로써 개별생약이 나타낼 수 있는 약리적인 효능을 현저하게 떨어뜨리게 되는 문제점이 발생하였다.

본 발명은 한방에서 체력을 보강하고 혈액순환을 촉진시키며 면역기능을 높여주고 모든 세포에 영양을 공급하며 뇌세포를 활성화하여 정신작용을 증진시키는 효능을 나타냄으로써 한방 및 민간요법으로 오랫동안 사용되어 온 경옥고와, 심근세포에 영양을 공급함으로써 심근의 수축력을 높이고 기관지 및 폐의 기능을 강화시켜주며 혈액순환을 촉진시키고 위액 분비를 항진하여 소화기능을 높여주는 생강감초탕의 구성생약을 배합하여, 복잡하고 비과학적인 제조방법을 개선하고 유효성분의 추출효율을 높여주며 원료생약의 보관 및 제조과정에서 변질 및 미생물 오염을 방지시킴으로써 혈액순환촉진, 소화기능개선, 위장보호, 기관지 손상예방, 체력보강 및 면역기능강화 등의 효능을 극대화 시킬 수 있는 제조방법을 개발하고자 한다.

본 발명에 따른 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법에 의하면, 피로의 축적, 정신적 긴장, 불안감, 감정의 손상, 소화기능 장애, 수면 장애 및 면역 기능저하로 인하여 발생된 각종 순환기 질환, 소화기 질환, 퇴행성 질환의 염증 및 통증에 예방 및 개선 효과가 알려져 있는 한방 생약들 중 감초를 주약으로 하고, 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조를 복합하여 가수분해추출물로 제조함으로써, 유효성분의 흡수 능력을 높이고 소화기능을 촉진시키며 체력보강, 면역기능 향상, 간장 보호 및 해독작용, 콜레스테롤 저하작용, 순환기질환 예방 및 개선 효과가 발생한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명이 응용하려한 생강감초탕은 감초를 위시하여 인삼, 생강 및 대조로 처방되어 한방에서 사용되어 왔다. 심근세포에 공급되는 영양부족으로 심근의 수축력이 원활하지 못하고 기관지 및 폐의 면역기능이 저하되어 있고, 구강과 기관지의 진액이 부족하여 입술에 침이 잘 고이거나 인후와 구강이 건조하고, 기침과 천식이 있으며, 가슴이 답답할 때 심근세포, 구강, 기관지, 폐점막에 영양을 공급하며 점막을 원활하게 하여 면역기능을 강화한다.

경옥고는 인삼을 위시하여 복령, 생지황 및 벌꿀로 처방되어 정력과 체력을 보강하고 면역기능을 강화하며 위장 및 순환기질환에 탁월한 효능을 나타냄으로써 민간요법으로 오랜 기간 보약으로 취급되어 왔다.

본 발명은 제조방법이 힘들고 까다로운 상기 생강감초탕과 경옥고의 구성 생약을 각각 가수분해추출 및 발효법으로 제조하여 생약 중에 함유되어있는 다당체성분을 비당체로 전환시켜줌으로써 유효성분의 흡수능력을 증진시키고 변질 및 미생물 오염을 최대한으로 방지시키고자 하였다.

특히 생약 중에 함유된 활성성분의 효능을 관찰해 보면,

첫째, 감초에 함유된 Glycyrrhizin(글리시리진)은 항알러지작용, NK세포(Natural Killer cell) 활성화작용, 인터페론 생성, 해열작용을 가지며, 위산분비를 억제하고 위점막을 보호함으로써 항 궤양작용을 나타낸다.

Glycyrrhetic acid(글리시레틴 산)은 스테로이드 호르몬과 같은 작용을 가짐 으로써 항염증작용, 해독작용, 해열작용, 소화기 평활근 경련 억제, 간 손상 억제 작용을 나타내며, Phospholipase A2(포스포리파아제 A2)의 활성을 억제하고 Prostaglandin(프로스타글란딘) 생성을 저해하여 진통작용을 나타낼 뿐 아니라 기관지평활근 경련을 억제하여 진해작용 및 진경작용을 나타낸다.

LH-1은 면역세포를 활성화하고 Macrophage(대식세포) 탐식능을 강화시키며 면역기억세포의 생성을 촉진하고, 심근세포에 영양을 공급하여 심장의 기외 수축을 완화하며 심장운동능을 정상화 시킨다.

Ligustrazine(리구스트라진)은 항염작용을 가지고 있고, β-Amyrin(β-아미린)은 항균작용 및 항바이러스작용을 가짐으로써 황색포도상구균, 결핵간균에 대한 항균작용 및 항종양 작용을 나타낸다.

둘째, 인삼에 함유된 Ginsenoside Rg1,Re,Rb2(인삼배당체 Rg1,Re,Rb2)는 부신피질기능을 강화하고 면역세포 생성을 촉진하여 면역기능을 증강시키고, Ginsenoside Rb1,Re 및 Adenosine(아데노신)은 혈중의 중성지방 생성을 저하시키며, Ginsenoside Rg2, Rg3은 혈소판응고를 저해하여 혈전생성을 방지한다.

Ginsenoside Rb1은 혈소판응고 억제작용이 있어서 인삼을 상복하면 뇌혈전이 예방되고 지방간의 지질분해작용을 가지고 있어 알코올 과음으로 인한 지방간의 예방과 치료에 사용하며, Cholesterol(콜레스테롤) 혈증을 저하하고 임파구의 활성을 촉진하여 면역기능을 증강시키며, 진정작용이 있어 신경을 안정시키고 불면증을 개선한다.

Ginsenoside Rb2는 암세포 증식을 억제하고, Ginsenoside Rb2,Re,Rg1은 골수 세포의 단백질합성과 지질합성 및 적혈구 생성을 촉진하여 체력을 강화한다. Saponin(사포닌)은 신경의 흥분전도를 가속화하고 조건반사능을 신속하게 하여 피로를 경감시키고 작업능률을 높이는 것으로 보고되어 있다.

한편 여러 종류의 아미노산과 함께 Vitamin B12(비타민 B12) 및 Folic acid(엽산)등이 함유되어 있어 세포에 영양을 공급하고 빈혈을 개선한다.

셋째, 복령에 함유되어 있는 β-Pachymose(β-파키모스), Pachymic acid(파키믹 산), Lecithin(레시틴), 단백질, 지방, 칼륨등은 뇌세포를 활성화하여 정신을 안정시키며, 모든 세포에 영양을 공급하여 허약체질을 개선하며, Pachyman(파키만) 및 Pachymose(피키모스)등의 다당체는 면역기능을 증강시키고 항종양작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. Choline(콜린)은 혈중지질분해를 촉진시키고 Acethylcholine(아세틸콜린)으로 생합성 되어 뇌세포를 활성화한다.

넷째, 생지황에 함유된 Catalpol(카탈폴)은 혈당강하작용을 가지고 있고, Adenosine(아데노신)이 항혈전작용, 항류마티스작용을 나타내며, 철분은 조혈작용과 함께 허혈을 개선하고 신장혈류를 증진하여 이뇨를 증가시키고 관절의 부종 및 동통을 경감시킨다.

다섯째, 생강에 함유된 6-Gingerol(6-진저롤)은 프로스타글란딘 합성 억제작용, 항궤양작용, 간독성 해독작용, 담즙분비 촉진작용, 심장기능 강화작용을 하며, Zingerol(진저롤)이 혈관운동중추를 강화하여 혈액순환을 촉진하고 소화액 분비를 항진하여 소화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. Shogaol(쇼가올)은 간독성 해독작용을 가지고 있고, Acetaldehyde(아세트알데히드)는 진통작용 및 진경작용을 가지 고 있으며 신장사구체 혈류량을 증가시켜 이뇨작용을 나타낸다. Furfural(푸르푸랄)은 점막자극작용을 가지고 있고, Caffeic acid(카페인산)는 혈중지질 저하작용을 나타낸다. 한편 생강의 특이취를 나타내는 Allylmethyl sulfide(알릴메칠 설파이드), Isopropyl sulfide(이소프로필 설파이드) 및 Diethyl sulfide(디에칠 설파이드)는 항균작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

여섯째, 대조에는 당류, 칼슘, 비타민 C, 단백질, 지방 등이 풍부하여 세포에 영양을 공급하고 대사를 활성화한다. Ethyl-α-D-Fufuctofuranoside(에칠알파디후룩토후라노시드)는 Cyclic AMP(사이클릭 AMP)를 증가시켜 항알러지작용을 나타내고, Nornuciferine(노르누씨페린)은 강력한 최면작용과 진경작용을 가지고 있다. Oxonuciferine(옥소노르누씨페린)는 최면작용을 가지고 있고 C-AMP는 비만세포막을 강화하여 항알러지작용을 나타내며 소변의 배설을 촉진시킨다. Maslinic acid(마스리닌산)는 항염작용을 가지고 있으며 히스타민에 의한 장 경련을 억제하고 스트레스성 궤양을 막아주며 진경작용을 나타낸다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법은 아래와 같은 실시예들에 의해 달성되며, 구성비율은 본 발명에 해당되는 것이고, 구성량에 대해서는 ± 10% 범위에서 실시가 가능하다.

제 1실시예;

감초 400그램에 70% 알코올 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 300밀리리터 및 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

인삼 600그램에 70% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 40밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 400밀리리터 및 효소용액20밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

복령 1.0킬로그램에 70% 알코올 1.2리터 및 1% 염산 60밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 800밀리리터 및 효소용액40밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생지황 1.6킬로그램에 70% 알코올 2.2리터 및 1% 염산 110밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 1리터 및 효소용액 50밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생강 400그램에 70% 알코올 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 300밀리리터 및 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

대조 400그램에 70% 알코올 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 300밀리리터 및 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

위에서 각각 알코올용액으로 추출하고 발효시킨 감초, 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조액을 모두 한 용기에 혼합하고 수욕 상에서 80~90℃로 4시간동안 가온하여 알코올 성분을 완전히 휘발시킨 다음 남아있는 생약 복합 농축물을 기밀용기에 충전하여 최종 제조물로 하였다.

효소용액 ; β-glucuronidase(베타글루쿠로니다제) 50,000unit(역가)를 취하고 정제수를 넣어 100밀리리터로 한다.

제 2실시예;

감초 400그램에 35% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

인삼 600그램에 35% 알코올 1.2리터 및 1% 염산 40밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액20밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

복령 1.0킬로그램에 35% 알코올 2리터 및 1% 염산 60밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액40밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생지황 1.6킬로그램에 35% 알코올 3.2리터 및 1% 염산 110밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액50밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생강 400그램에 35% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

대조 400그램에 35% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

위에서 각각 알코올용액으로 추출하고 발효시킨 감초, 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조액을 모두 한 용기에 혼합하고 수욕 상에서 80~90℃로 4시간동안 가온하여 알코올 성분을 완전히 휘발시킨 다음 남아있는 생약 복합 농축물을 기밀용기에 충전하여 최종 제조물로 제조하였다.

제 3실시예;

감초 400그램에 정제수 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 300밀리리터 및 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

인삼 600그램에 정제수 800밀리리터 및 1% 염산 40밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 400밀리리터 및 효소용액20밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

복령 1.0킬로그램에 정제수 1.2리터 및 1% 염산 60밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 800밀리리터 및 효소용액40밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생지황 1.6킬로그램에 정제수 2.2리터 및 1% 염산 110밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 1리터 및 효소용액50밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생강 400그램에 정제수 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 300밀리리터 및 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

대조 400그램에 정제수 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 300밀리리터 및 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

위에서 각각 정제수 및 알코올용액으로 추출하고 발효시킨 감초, 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조액을 모두 한 용기에 혼합하고 수욕 상에서 80~90℃로 4시간동안 가온하여 알코올 성분을 완전히 휘발시킨 다음 남아있는 생약 복합 농축물을 기밀용기에 충전하여 최종 제조물로 제조하였다.

이하 본 발명에 따른 추출물 또는 발효 및 가수분해물의 작용 및 실험결과에 대해 설명한다.

1. 감초 및 그 가수분해물의 확인 및 정량

감초의 주성분인 Glycyrrhizin(글리시리진)과 그 가수분해물인 Glycyrrhetinic acid(글리시레틴 산)의 함량은 HPLC 분석방법을 응용하여 실험하였고 그 조건은 다음과 같다.

Glycyrrhizin ;

Column; Nucleosil C₁₈ (4.0 × 250 mm)

Mobile phase; the mixture of HOH ; CH₃CN ; AcOH (560.0 ; 400.0 ; 40.0 )

Flow rate; 1.2 mL/min

Injection volume; 20 μl

Detector; UV detector (λ_max = 254 nm)

Glycyrrhetinic acid;

Column;Spherisorb ODSI column C₁₈ (4.0 × 250 mm)

Mobile phase; the mixture of HOH ; CH₃CN ; AcOH (170.0 ; 830.0 ; 5.0 )

Flow rate; 1.2 mL/min

Injection volume; 20 μl

Detector; UV detector (λ_max = 254 nm)

Glycyrrhizin(글리시리진) 및 Glycyrrhetinic acid(글리시레틴 산)의 함량 분석 결과

감초의 주성분인 Glycyrrhizin(글리시리진)과 그 가수분해물인 Glycyrrhetinic acid(글리시레틴 산)의 함량을 HPLC 분석방법으로 실험한 결과, 파장 245 nm에서 Glycyrrhizin의 chromatogram을 나타내었고 검량선의 작성결과 y = 367.5x + 53.2 , R² = 0.999 이었으며 50 μg/mL까지 양호한 직선성을 나타내었다.

[그림1] Glycyrrhizin의 HPLC 크로마토그램

Column: Nucleosil C₁₈ (4.0 × 250 mm)

Mobile phase: the mixture of HOH : CH₃CN : AcOH(560.0 : 400.0 : 40.0)

Flow rate: 1.2 mL/min

Injection volume: 20 μl

Detector: UV detector (λ_max = 254 nm)

한편 Glycyrrhetinic acid(글리시레틴 산)의 chromatogram은 파장 245nm에서 나타났고 검량선의 작성결과 y = 74.95x - 14.5, R² = 0.999 이었다.

[그림2] Glycyrrhetinic acid의 HPLC 크로마토그램

Column:Spherisorb ODSI column C₁₈ (4.0 × 250mm)

Mobile phase: the mixture of HOH : CH₃CN : AcOH (170.0 : 830.0 : 5.0)

Flow rate: 1.2 mL/min

Injection volume: 20 μl

Detector: UV detector (λ_max = 254 nm)

2. 주성분 가수분해 실험

1) 산에 의한 가수분해물의 제조 및 측정

감초추출물을 pH1, 3, 5, 7, 9 (90% ethanol)에 용해시킨 후 40 ± 2 ℃ 에 서 2일간 반응시킨 후 각 시간별로 가수분해율을 측정하였다.

2) 1% HCl(염산) , 1% NaOH(수산화나트륨), β-glucuronidase(β-글루쿠로니다제 )를 이용한 가수분해 측정

감초추출물을 90% Ethanol 에 용해시킨 후, 1% HCl, 1% NaOH,

β-glucuronidase(베타글루쿠로니다제)를 이용하여 가수분해율을 측정하였다.

3) 주성분의 가수분해율 측정결과

pH 1.0 에서 가수분해에 의한 glycyrrhetinic acid(글리시레틴 산)의 증가율은 24시간 후 82.67%, 48시간 후 98.28%로 다른 pH 영역에서 실험한 군보다 높게 나타났으며, pH 9.0 에서는 가수분해는 거의 이루어지지 않았다.

[표1]

40℃에서 90% ethanol 용액 중 여러 가지 pH 조건 하에서 Glycyrrhizin의 가수분해율 비교

	pH1	pH3	pH5	pH7	pH9
24 hr	82.67± 2.41%	9.85± 2.51%	10.66± 2.55%	18.95± 1.98%	26.64± 1.37%
48 hr	98.28± 5.88%	25.44± 1.88%	13.88± 3.70%	45.30± 2.76%	73.04± 4.02%

Each data represents the mean± SE from 5 experiments.

1% HCl을 이용한 가수분해율은 1% NaOH, β-glucuronidase(1000 unit(역가))을 사용하였을 때보다 2 ~ 5배 정도로 높았다.

[표2]

40℃에서 90% ethanol 용액 중 효소, 산 및 염기 조건 하에서 Glycyrrhizin의 가수분해율 비교

	B-glucuronidase	1% HCI	1% NaOH
24hr	61.25±2.44%	66.49± 3.56%	12.5±1.55%
48hr	85.23±4.50%	180.28±1.22%	15.75±2.18%
72hr	118.78±3.21%	240.09±4.62%	24.57±1.61%

Each data represents the mean± SE from 5 experiments.

3. DPPH 법에 의한 항산화 실험

주성분 및 히드로겔의 free radical(유리기) 소거활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil(1,1디페닐-2-피크릴히드라질,DPPH)을 사용하였으며 먼저 0.2 mM DPPH 메탄올 용액 0.5mL에 시료를 여러 농도로 희석한 용액 1mL를 가하고 vortex mixer(와류믹서)로 10초간 진탕한 후 20℃에서 30min 간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교 표준물질로는 butylated hydroxy anisole(부칠히드록시아니솔, BHA)를 사용하였다. 그 활성의 크기는 DPPH에 대한 전자공여능(Electron Donating Ability, EDA%)로 나타내었다.

EDA(%) =

× 100

Sample ABS ; 시료를 가한 시험액의 흡광도

Control ABS ; 시료 대신 Methanol을 가한 시험액의 흡광도

항산화 효과 비교

주성분의 free radical(유리기) 소거 활성은 비교해 보면, 1000μg/ml 농도에서 BHA 70.41 ± 5.20% 이었으며 감초추출물은 55.67 ± 3.89%로 비교적 높은 수소공여능을 보여주었으며 감초가수분해추출물에서는 55.05 ± 6.56으로써 감초추출물과 큰 차이를 나타내지는 않았다.

[표3]

DPPH법에 의한 활성산소 억제효과 비교

Sample	EDA(1000μg)	EDA(100μg)
BHA	70.41±7.25	67.56±3.58
감초추출물	55.67±3.89	38.11±5.12
감초 가수분해추출물	55.05±6.56	32.27±7.14

EDA ; 수소공여능 (%)

Each data represents the mean± SE from 5 experiments.

4. 항염효과 측정실험

1) 부종억제 실험

히드로겔의 부종억제 실험은 카라기난으로 유발된 랫트 족부종에 의한 항염효과 측정방법을 응용하여 실험하였다. 부종유발은 랫트의 오른쪽 족 저부에 1% λ-carrageenan(λ-카라기난)과 1% kaolin(카올린)을 PBS(phosphate buffered saline)에 녹여 0.1mL를 주사하여 유발시켰다. 약물 도포는 유발 1시간 전에 오른 쪽 족 저부에 각각 1회씩 도포하였다.

부종측정은 plethysmometer(부종측정기)를 이용하여 1% λ-carrageenan(카라기난)과 1% kaolin(카올린)의 투여전과 투여 후 6, 12, 24 및 48시간대에서 3회 반복측정 하여 평균값으로 하였다. 부종율은 λ-carrageenan주사 직후 및 각 시간대의 발 부피의 변화를 이용하여 다음 식으로 부종률(%, swelling) 및 부종 억제율(%, inhibition)을 산출하였다.

부 종 률(%)⁼

× 100

부종억제율(%) = [ 1 -

] × 100

V 는 6, 12, 24 및 48시간 후의 발 부피이며, V₁는 주사직후 발 부피, V_c는대조군의 부종률, V_d 는 처치군의 부종률이다.

2) 항염 효과 비교

카라기난 유발 부종에 대한 치료계수 측정방법을 응용하여 히드로겔제의 부종 및 억제효과를 비교했을 때, 카라기난 투여 6시간 후에, 대조군에서 2.3 mL로 부종이 최대치를 나타내었고, 12시간 이후부터 부종률이 서서히 감소되기 시작하였다. 감초엑스의 부종억제 효과는 12시간 이후부터 나타나기 시작하였는데, 대조군에서 2.01 ± 0.03ml로 나타난 반면, 대조약물인 트리암시놀론에서는 1.77 ± 0.04 mL 감초엑스에서는 1.80 ± 0.23mL, 감초가수분해추출물에서는 1.75 ± 0.12ml 로 부종 억제효과에 대한 유의성을 보여주었다.

[표4]

카라기난으로 유발된 흰쥐의 족부종에 대한 감초 가수분해추출물의 억제효과

Formulation (㎖)	Time(hr)
Formulation (㎖)	0 hr	6 hr	12 hr	24 hr	48 hr
Control	1.14±0.05	2.3±0.08	2.01±0.12	1.70±0.05	1.35±0.05
감초추출물	1.12±0.03	2.06±0.03^*	1.80±0.04	1.49±0.02	1.18±0.07
감초가수분해 추출물	1.18±0.08	2.11±0.01^*	1.75±0.06^*	1.40±0.02^*	1.20±0.06^*

Each data represents the mean ± SE from 5 experiments.

Statistically significantly value compared with control group data by T test(^*P<0.05, ^**P<0.01)

감초추출물, 감초가수분해추출물 및 트리암시놀론의 부종률은 12시간 후에 급격히 감소되었고 48시간까지 부종억제효과가 유지되었다.

한편 12시간 후 대조군에 대한 부종 억제율을 비교해 보면, 감초엑스에서 20.44%에 불과 하였으나 트리암시놀론에서 29.36%를 나타내었고 감초가수분해추출물에서는 36.7 %로 가장 높은 성적을 보여 주었으며, 48시간 후에 부종 억제율은 감초엑스가 70.91 %인 반면, 트리암시놀론이 85.83%, 감초가수분해추출물이 90.8%로 나타났다.

[그림3] 카라기난으로 유발된 흰쥐의 족부종에 대한 감초가수분해추출물의 억제효과

(GR:감초엑스, GHT:감초가수분해추출물, TA:트리암시놀론)

Each bar represents the mean± SE from 5 experiments.

Statistically significantly value compared with GR group data by

Student's - t test (^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001).

5. 진통효과 측정실험

1) 열 통각 역치 측정실험

열 통각 역치는 민감성을 높인 새로운 열 통각 역치 측정 방법을 응용하여 실험하였다. 먼저 probe tip(프로브팁)의 직경 2mm인 Thermode (터모드, Quck-Korea704D, Quick Electonic Equipment Factory, Korea)를 50℃로 고정하여 흰쥐의 일차 통각과민대와 이차통각 과민대에 가볍게 접촉하여 회피반응이 일어나기까지의 시간을 측정하였다. 측정은 흰쥐의 열에 대한 적응을 위하여 30℃의 hot plate 위에서 10분간 적응시킨 후 실험하였으며, 5회 측정하여 평균값을 이용하였다.

측정은 통각과민 유발 전, 유발 후 3시간, 유발 후 6시간, 유발 후 9시간에 실시하였다.

2) 기계적 통각 역치 측정 실험

기계적 통각 역치 측정은 급성압축방법에 의한 기계적 통각 역치 측정방법을 응용하여 실험하였다. 먼저 Von Frey filament(본 후레이 휠라멘트, North Coast Medical Inc., Touch-Test Sensory Evaluation, USA)를 이용하여 흰쥐의 회피 반사 유발 횟수를 측정하였다. 먼저 흰쥐를 대상으로 1.4, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 26 g의 monofilament(모노필라멘트)를 사용하여 압력이 낮은 것부터 자극하여 최소 압통각의 일차 통각과민대와 이차통각과민대에 monofilament(모노필라멘트)의 끝이 접촉된 상태에서 약간 휘어질 정도의 압력으로 적용하였다. 총 5회 적용하여 회피반사가 일어나는 횟수를 측정하였으며, 흰쥐의 적응을 막기 위해 실험간 간격은 최소 2분으로 하였다.

측정은 통각과민 유발 전, 유발 후 3시간, 유발 후 6시간, 유발 후 9시간으로 실시하였다.

3) 유해성 굴곡 반사 측정 실험

유해성 굴곡회피반사의 측정은 염증 동물 모델에서 전기적 신경 자극에 의한 유해성 굴곡 반사 측정 방법을 응용하여 실험하였다. 먼저 흰쥐를 ether(에테르)로 흡입 마취를 지속적으로 진행하면서 마취시킨 후 유해성 굴곡회피반사 활동전위는 한 쌍의 EL450 monopolar needle(모노폴라니들, Biopac system, USA)을 이용하여 흰쥐의 대퇴이두근에 삽입하고 EMG100C amplifier module(앰플리화이어모듈, Biopac system, USA)을 통하여 기록하였다. 접지전극은 꼬리에 부착하였다.

STIM100C stimulator module(스티뮬리이터 모듈)과 STIMSOC(스팀속, Biopac system, USA)를 이용하여 한 쌍의 monopolar needle(모노폴라니들)을 통각과민 유발부위인 족저부에 삽입한 후 전기자극하여 회피반사가 유발되는 적기적 통각역치를 결정한 다음, 통각역치의 1.5배로 자극하여 근전도 모니터에서 유해성 굴곡회피반사 활동전위가 나타나면 저장하였다.

활동전위를 기록하기 위한 조건은 high pass filter(하이패스휠터), 500Hz, low pass filter(로우패스휠터, 10Hz, gain(게인) 1000㎶, sample rate(쌤플레이트) 1000Hz, 하였고 noise voltage(노이즈볼티지)는 0.2㎶이었고 60Hz의 notch-filter(노치휠터)를 사용하였다. 검사자극은 단일 사각형파로 2ms 맥동기간으로 하였다.

반응의 크기는 RMS(알엠에스, root mean squre, mV)로 구하였다. 유해성 굴곡회피반사의 기록과 분석은 Acknowledge(애크놀리지)3.8.1.Software program(3.8.1.소프트웨어프로그램)을 이용하였다. 측정은 통각과민 유발 전, 유발 후 9시간에 실시하였다.

4) 진통효과 비교

열통각역치의 변화는 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의한 차이가 나타났으며, 유발 후 9시간 후에 대조약물인 트리암시놀론 및 감초추출물에서 25%정도의 진통억제효과가 나타났으며 감초가수분해추출물에서는 45%정도로 가장 좋은 성적을 보여주었다.

[그림4] 흰쥐의 열통각 역치에 대한 감초가수분해추출물의 진통효과

(GR:감초엑스, GHT:감초가수분해추출물, TA:트리암시놀론)

Each bar represents the mean± SE from 5 experiments.

Statistically significantly value compared with Blank group data by Student's - t test (^*P<0.05, ^**P<0.01).

기계적 통각역치의 변화는 통증 유발 후 6시간 후부터 모든 실험군에서 대조 군에 비해 유의한 차이가 나타나기 시작하였으며, 9시간 후에는 대조약물인 트리암시놀론이 20%정도의 통증억제효과를 나타낸 반면 감초추출물에서 75%정도의 진통억제효과가 나타났고 감초가수분해추출물에서는 160%정도로 월등하게 높은 성적을 보여주었다.

[그림5] 흰쥐의 기계적 통각 역치에 대한 감초가수분해추출물의 진통효과

(GR:감초엑스, GHT:감초가수분해추출물, TA:트리암시놀론)

Statistically significantly value compared with Blank group data by Student's- t test (^*P<0.05, ^**P<0.01).

염증 동물 모델에서 전기적 신경자극에 의한 유해성 굴곡반사 반응시간에 변하는 9시간 후에 대조군에서 69.19밀리볼트인 반면 대조약물인 트리암시놀론에서는 41.39밀리볼트, 감초추출물에서 40.15밀리볼트, 감초가수분해추출물에서는 40.46밀 리볼트로 나타나 모든 군에서 유의성있는 수치를 보여주었으며 실험군간의 차이는 별로 크게 나타나지 않았다.

[표5]

흰쥐의 유해성굴곡 회피반사의 반응시간에 대한 감초가수분해추출물의 진통효과

	pre	9h
Blank	37.03	69.19
감초추출물	33.84	40.15^***
트리암시놀론	33.7	41.39^***
감초가수분해추출물	38.83	40.46^***

Each data represents the mean± SE from 5 experiments.

Statistically significantly value compared with Blank group data by Student's - t test (^***P<0.001).

한편 유해성 굴곡회피반사의 실효치 진폭변화는 통증유발 후 9시간 후에 대조군에서 0.45초로 나타난 반면 트리암시놀론에서 0.41초, 감초추출물 및 감초가수분해추출물에서는 모두 0.36초로 나타났다.

[표6]

흰쥐의 유해성굴곡 회피반사의 실효치 진폭변화에 대한 감초가수분해추출물의 진통효과

	pre	9h
Blank	0.41	0.45
감초추출물	0.35	0.36^*
트리암시놀론	0.38	0.41
감초가수분해추출물	0.35	0.36^*

Each data represents the mean± SE from 5 experiments.

Statistically significantly value compared with Blank group data by Student's - t test (^*P<0.05).

Claims

감초 400그램에 70% 알코올 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 300밀리리터 및 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

인삼 600그램에 70% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 40밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 400밀리리터 및 효소용액 20밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

복령 1.0킬로그램에 70% 알코올 1.2리터 및 1% 염산 60밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 800밀리리터 및 효소용액40밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생지황 1.6킬로그램에 70% 알코올 2.2리터 및 1% 염산 110밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 1리터 및 효소용액 50밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생강 400그램에 70% 알코올 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 300밀리리터 및 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

대조 400그램에 70% 알코올 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 정제수 300밀리리터 및 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

위에서 각각 알코올용액으로 추출하고 발효시킨 감초, 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조액을 모두 한 용기에 혼합하고 수욕 상에서 80~90℃로 4시간동안 가온하여 알코올 성분을 완전히 휘발시킨 다음 남아있는 생약 복합 농축물을 기밀용기에 충전하여 최종 제조물로 하는 것을 특징으로 하는 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 효소용액은β-glucuronidase(베타글루쿠로니다제)50,000unit(역가)를 취하고 정제수를 넣어 100밀리리터로 구비되는 것을 특징으로 하는 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법.
감초 400그램에 35% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

인삼 600그램에 35% 알코올 1.2리터 및 1% 염산 40밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액 20밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

복령 1.0킬로그램에 35% 알코올 2리터 및 1% 염산 60밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액40밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생지황 1.6킬로그램에 35% 알코올 3.2리터 및 1% 염산 110밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액 50밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생강 400그램에 35% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

대조 400그램에 35% 알코올 800밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 효소용액15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

위에서 각각 알코올용액으로 추출하고 발효시킨 감초, 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조액을 모두 한 용기에 혼합하고 수욕 상에서 80~90℃로 4시간동안 가온하여 알코올 성분을 완전히 휘발시킨 다음 남아있는 생약 복합 농축물을 기밀용기에 충전하여 최종 제조물로 하는 것을 특징으로 하는 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 효소용액은β-glucuronidase(베타글루쿠로니다제)50,000unit(역가)를 취하고 정제수를 넣어 100밀리리터로 구비되는 것을 특징으로 하는 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법.
감초 400그램에 정제수 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 300밀리리터 및 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

인삼 600그램에 정제수 800밀리리터 및 1% 염산 40밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 400밀리리터 및 효소용액 20밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

복령 1.0킬로그램에 정제수 1.2리터 및 1% 염산 60밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 800밀리리터 및 효소용액 40밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생지황 1.6킬로그램에 정제수 2.2리터 및 1% 염산 110밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 1리터 및 효소용액50밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

생강 400그램에 정제수 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 300밀리리터 및 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

대조 400그램에 정제수 500밀리리터 및 1% 염산 25밀리리터를 가하여 수욕 상에서 50~60℃로 4시간동안 가온하고 여과지로 여과한 후 여액을 취하여 95% 알코올 300밀리리터 및 효소용액 15밀리리터를 넣고 28~32℃에서 30일 동안 발효시키는 단계;

위에서 각각 정제수 및 알코올용액으로 추출하고 발효시킨 감초, 인삼, 복령, 생지황, 생강 및 대조액을 모두 한 용기에 혼합하고 수욕 상에서 80~90℃로 4시간동안 가온하여 알코올 성분을 완전히 휘발시킨 다음 남아있는 생약 복합 농축물을 기밀용기에 충전하여 최종 제조물로 하는 것을 특징으로 하는 감초 및 그 복합생약의 가수분해 추출물을 함유하는 내복용의 농축시럽 제조방법.