KR101037002B1

KR101037002B1 - 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법

Info

Publication number: KR101037002B1
Application number: KR1020080096153A
Authority: KR
Inventors: 서동삼; 이준근; 고창권; 장동일; 이은영; 최민정; 장정호
Original assignee: 세원셀론텍(주)
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2008-09-30
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2028-09-30
Also published as: KR20100036773A

Abstract

본 발명은 슬(무릎)관절 또는 족관절 등에 임상적 증세가 있는 대퇴골 관절 연골 (외측, 내측, 활차면) 결손 부위 및 거골의 골연골 결손 부위에 임상적으로 사람의 연골 세포를 이식할 수 있는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법에 관한 것이다.

이는 특히, 임상적으로 이식을 위해 채취된 연골조직으로부터 분리된 연골세포를 체외에서 배양하는 과정에서 기존 상용화된 배지를 이용하여 연골세포를 배양하는 것보다 연골세포의 증식률을 높여 채취에서 이식까지의 시간 단축뿐만 아니라 이식 가능한 세포수를 하여 빠른 시간에 얻을 수 있다.

연골세포, 연골세포 특이적 배양배지.

Description

연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법{The Specific Culture Media for Chondrocyte Cells and Methods of Uses Thereof}

본 발명은 인간의 손상된 관절 연골 부위로부터 채취된 연골조직에서 연골세포를 분리하여 임상적으로 이식 가능한 세포수 만큼 체외에서 배양하는 과정에서 기존 상용화된 배양배지보다 높은 증식률을 보이는 연골세포에 특이적 배양배지를 이용하여 배양함으로써 보다 빠른 시간 내에 많은 세포수를 확보할 수 있는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법에 관한 것이다.

사람의 관절 연골 조직은 한번 손상이 되게 되면 생체 내에서 정상적으로 재생이 되지 않는 특징을 갖고 있다. 이렇듯 관절 연골이 손상되면 일상적으로 생활에 제한 받을 정도로 심한 통증이 동반되며 만성화될 경우 치명적인 퇴행성관절염을 유발하게 한다.

최근 조직공학 분야의 급속한 발전에 따라 관절 연골의 손상을 치료하기 위해 환자 자신의 정상적인 연골 조직 일부를 채취하여 연골세포를 분리 및 배양하여 이식하는 기술이 New York에 있는 Hospital for Joint Disease에서 처음 연구되었으며 스웨덴(Sweden)에 있는 University of Gothenburg와 Sahlgrenska University Hospital에서 그 기술을 발전시켰으며 세계의 많은 산업체에서 연골세포치료제를 GMP 시설에서 의약품으로 생산하고 있다.

이렇듯 손상된 관절 연골의 치료는 무릎 관절 연골이 손상된 환자로부터 사용을 하지 않는 관절의 연골을 일부 채취하여 세포배양기 내에서 연골세포에 적절한 영양성분이 공급되는 배양배지에서 이식에 필요한 수로 연골세포를 증폭하여 환자의 연골 결손부에 주입 또는 이식하는 방법으로 환자의 손상된 관절 연골을 재생시키는 것이다.

그러나, 연골세포는 부착성 세포로써 그 증식도가 매우 느리고 단층배양과정에서 배양 과정 중 세포주변의 환경조건에 따라 연골세포의 모양이 변화하는 고유의 특징을 지니고 있으며, 200∼300mg 정도의 작은 연골조직으로부터 세포를 분리하여 이식에 충분한 세포수인 1,200∼6,000만개 이상의 연골세포로 증식시키기 위해서는 특별한 배양기술과 배양배지가 필요하다.

포유동물세포 배양 배지의 구성물질은 약 50 여종의 성분으로 이루어져 있으며 이들은 크게 보아 세포의 생합성에 이용되는 부분과 생물학적 에너지 대사에 이용되는 부분, 그리고 여러 가지 대사 작용의 촉매 역할을 하거나 세포 내 생리적 현상을 조절하는데 이용되는 부분 등으로 나눌 수 있다. 즉, 세포 배양에 사용되는 배지는 등장용액 성분과 완충용액 성분, 그리고 에너지 공급원인 아미노산, 비타민, 그리고 무기염류를 포함하는 영양성분과 그 외의 다양한 종류의 첨가제(supplement)들로 구성되어 있다. 또한, 세포의 특성에 따라 5∼20％ 정도의 혈청을 공급해 줌으로서 세포증식에 적합한 각종 호르몬, 성장인자, 지방, 비타민들을 공급해 주고 단백질 분해효소의 활성을 억제하며, pH 조절용 완충제 역할을 하는 등의 포유동물세포의 성장과 활성을 촉진시킨다. 포유동물세포를 배양하기 위한 배지를 구성하는 성분들은 농도뿐만 아니라 그 조성면에서도 각 배지의 종류에 따라 달라진다. 배지의 종류는 크게 Minimal essential medium (MEM), Rosewel Park Memorial Institute (RPMI)-1640 그리고 Dulbecco's modification of Eagle's medium (DMEM)과 같이 보다 단순하고 세포배양에서 공통적으로 사용되는 배지와 Iscove's modification of DMEM (IMDM), Ham's F-12 그리고 Connaught Medical Research Laboratories (CMRL)-1666과 같이 보다 복잡하고 여러 가지 성분이 강화된 배지로 나눌 수 있다.

포유동물 세포의 성장곡선은 보통 2∼3일 정도의 지연기 (Lag phase)를 가지며 글루타민 대사산물인 암모늄과 포도당 대사산물인 젖산의 축적으로 인하여 지연기 말부터 살아 있는 세포의 농도가 급격히 감소한다. 포유동물세포의 주요 대사경로에는 포도당과 글루타민 (glutamine)이 주요 탄소원 및 에너지원으로 사용된다. 포유동물세포에 의해 포도당이 대사되면 해당과정을 거쳐 피루브산이 된다. 또한, 인산오탄당 경로 (pentose phosphate pathway)에 의해 오탄당을 만들어 핵산을 합성한다. 해당과정에서 만들어진 피루브산은 TCA회로에 의해 이산화탄소와 물로 분해되기도 하고 젖산으로 되기가 하며, 또한 지방산이 되기도 한다. 포유동물세포 대사에 사용되는 탄소원 중에서 특이한 것은 글루타민 (glutamine)으로서 대사과정 중에 일부는 글루타메이트 (glutamate)가 되고 글루타메이트는 TCA 회로로 들어가 다른 아미노산 합성을 위한 탄소골격 (carbon skeleton)을 만든다. 포유동물 세포의 중요 배설물은 젖산과 암모니아이며 알라닌 (alanine)의 배출 또한 중요한다. 젖산염 (lactate)과 암모니아는 세포 내부와 리소좀의 pH를 변화시키기 때문에 세포에 독성으로 작용하기도 한다.

이렇듯, 배양되는 세포의 종류에 따라 생리적 기전과 영양적 요구량이 서로 다르기 때문에 세포배양에 사용되는 배지의 종류도 특성에 따라 달라져야 한다. 따라서 사람에서 유래된 세포를 배양하기 위해서는 세포의 종류와 상태에 따른 성장조건 및 각각 요구되는 배지의 조성은 서로 다를 것이다. 이에 본 발명서에서는 사람의 연골세포의 특성에 맞는 연골세포배양배지를 개발하기 위한 것이다.

본 발명은 다양한 연령과 인체의 건강상태를 갖는 환자의 관절연골조직으로부터 분리된 세포를 상기와 같은 세포의 생리 및 영양적 제한점의 한계를 개선하고자 창안한 것으로, 임상적으로 이식에 거부 반응이 거의 없는 환자 자신의 연골세포를 기존의 상업용으로 판매되어 사용되고 있는 배지의 성능보다도 가능한 짧은 시간에 임상적으로 이식에 필요한 세포수를 확보하기 위해 연골세포의 생존률, 증식률 뿐만아니라 분화도를 높이고 연골세포의 고유 특성을 유지하는 사람의 연골세포에 특이적 배양배지 조성분을 구성하고, 이 배지를 이용하여 배양시간을 단축하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 Rosewel Park Memorial Institute (RPMI)-1640과 Dulbecco's modification of Eagle's medium (DMEM)을 1:1 비율로 혼합된 DR을 만들고, 상기 DR의 조성을 다시 DMEM과 RPMI-1640 배지와 비교하여 각 배지내 중복된 성분들은 높은 농도를 선택하는 동시에 둘 중 하나의 배지에만 들어 있는 성분들은 그 농도 그대로를 유지하고 같은 공급원인 성분들은 둘 중 택 1하여 Advanced Basic Media(ABM)-Chondrocyte (ABM-C) 배지를 조성하는 단계; 및 이후 상기 ABM-C 배지를 이용하여 연골세포를 배양하는 단계 또는 ABM-C 배지를 이용한 Short-term 연골세포를 배양하는 단계 또는 ABM-C 배지를 이용한 3차원 연골세포를 배양하는 단계 중에서 어느 하나의 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법을 제공한다.

본 발명은 연골조직에서 연골세포를 분리하여 DMEM 배지를 이용한 자가 연골세포치료제를 제조하기 위해서는 4-5주 동안의 배양기간과 단층 연속배양을 3차까지 배양하는 반면, 연골세포에 특이적인 배지인 ABM-C 배지를 이용함으로써 연골세포의 doubling time을 획기적으로 단축하여 단층연속배양을 2차 배양까지 하여 자가 연골세포치료제를 제조함으로써 짧은 시간 내에 대량의 연골세포를 배양할 수 있어 손쉽게 연골손상을 입은 환자에게 이식시켜 줄 수 있으며, 짧은 배양기간으로 제조과정 중 소모되는 원자재의 사용량이 감소함으로서 제조원가가 절감되어 저가의 연골세포치료제를 공급할 수 있다.

삭제

본 발명은 슬(무릎)관절 또는 족관절 등에 임상적 증세가 있는 대퇴골 관절 연골 (외측, 내측, 활차면) 결손 부위 및 거골의 골연골 결손 부위에 임상적으로 사람의 연골 세포를 이식할 수 있는 연골세포 조기배양이 가능한 연골세포 특이적 배양배지를 제공한다.

상기 발명을 위해서 먼저, 기존 이미 상용화된 배지인 DMEM과 RPMI-1640을 1:1의 비율로 혼합된 배지 조성 ABM-Chondrocyte을 확립하였다. (표 1).

표1. 상용화된 배지의 조성 및 Advanced Basic Media(ABM)-Chondrocyte (ABM-C)의 조성

연골세포배양을 위한 기본배지의 조성 (Advanced Basic Media, ABM)은 DMEM과 RPMI-1640 배지조성에서 출발하였다. DMEM과 RPMI-1640을 1:1 비율로 혼합한 DR을 만들고 DR의 조성을 다시 DMEM과 RPMI-1640 배지와 비교하여 각 배지내 중복된 성분들은 높은 농도를 선택하였으며 둘 중 하나의 배지에만 들어 있는 성분들은 그 농도 그대로를 유지하고, 같은 공급원인 성분들은 둘 중 택 1하여 ABM-C 배지 조성을 완성하였으며 (표 1) 연골세포는 세포의 증식 및 합성이 활발하지 못한 somatic cell로 분류가 되며 이에 적합한 배지는 DMEM이였으며 이 배지의 성분은 표 1에서 보듯이 DMEM high-glucose 배지는 필수 아미노산이 RPMI1640 배지보다 2배가 첨가되어 있는 배지로 아미노산 15, 무기염 6, 비타민 9, 기타 4 가지의 성분을 함유하고 있다. ABM-C 배지는 DMEM 배지에는 없는 asparagine anhydrous, aspartic acid, glutamic acid, hydroxy-proline, proline이 추가되었으며 arginine monohydrochloride외 arginine free base를 더 추가하였다.

조성된 ABM-C 배지의 세포 증식률을 확인하기 위하여 ABM-C, DMEM high-glucose (GIBCO)와 Advanced DMEM high-glucose (GIBCO) 배지에 10％ 우태아 혈청을 첨가하여 세포 접종수 (2500 cells/㎠, 5000 cells/㎠, 10000 cells/㎠)별로 11일 동안 배양하여 매일 세포수를 측정하여 연골세포의 증식률을 확인한 결과, 본 발명인 ABM-C 배지의 증식률을 높았다 (도면 2). 이는 Proline과 Hydroxy-proline은 collagen 단백질 (Pro-Hyp-Gly) 구성 요소로 이들 아미노산을 추가하여 연골세포의 성장을 촉진하였으며 아미노산 이외에 비타민류인 d-biotin, aminobenzoic acid, vitamine B12가 추가하여 연골세포의 증식을 강화하였다. Ascorbic acid는 proline 잔기에 hydroxylation에 의한 수소결합을 형성시켜 collagen fiber의 구조를 안정화시키며, 또한 잘 알려진 항산화제로써 연골세포에 도움을 준다. DMEM배지에 추가적으로 ascorbic acid-2-phosphate를 추가적으로 첨가하여 ABM-C 배지에도 첨가하였다.
단층 배양을 통한 연골세포 배양은 사용되는 혈청(FBS)의 농도에 따라 영향을 받는다. ABM-C 배지의 FBS 농도의 영향은 표 2에서 2.5％와 5.0％의 FBS가 함유된 ABM-C은 배양 6일 이후 연골세포의 증식이 감소하는 경향을 보여 배양 6일째를 기준으로 하여 doubling time을 계산해 본 결과, 2.5％ FBS가 함유된 ABM-CBM과 CI의 doubling time이 같은 3.2days로, 5％ FBS가 함유된 ABM-CBM배지는 2.7 days를 보였으나 배양 7일째부터 연골세포의 증식이 떨어지는 것을 확인하였으며, ABM-C 배지는 FBS 농도에 매우 의존적으로 5％ 이하의 농도에서는 세포의 증식률이 낮았다.
표 2. ABM-C 배지내 FBS의 농도에 따른 연골세포 증식 비교

Insulin은 배양 중인 연골세포의 DNA 합성에 대한 비교적 적은 촉진 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 (Prins 등, 1982) 여러 가지 성장 인자와 상승 작용을 하여 세포 증식에 적지 않은 도움을 주며 (Adolphe 등 1984), Swarm rat chondrosarchoma에서 5～10ng/mL의 W1이 proteoglycan 합성과 증식에 적은 효과가 있다(Stevens 등, 1981)고 보고하였다. ABM-C내 insulin의 연골세포 증식을 비교하기 위하여 insulin이 첨가된 CI (DMEM) 배지에서 배양된 passage 2의 연골세포를 75㎠의 세포배양용기에 5,000cell/㎠되게 접종하여 각각 ABM-C과 CI (DMEM-high glucose) 배지 내 insulin을 첨가한 배지와 첨가되지 않은 배지의 연골세포 증식을 비교하였다. Insulin이 첨가되지 않은 CI배지에서 배양된 연골세포와 비교하여 insulin이 첨가된 CI배지는 117.4％, W1이 첨가되지 않은 ABM-C 배지는 483.36％, insulin이 첨가된 ABM-C 배지는 591.7％의 증식률을 보였으며, insulin이 첨가된 ABM-C 배지는 insulin이 첨가되지 않은 ABM-C 배지에서 배양된 연골세포보다 122.43％ 증식률을 보였다. 이는 insulin의 의한 연골세포의 증식률 보다 ABM-C 배지에 의해 연골세포의 증식률이 높아짐을 알 수 있었다. 또한 Doubling time을 비교해 보면, insulin이 첨가된 배지는 첨가되지 않은 배지보다 각각 0.2～0.3일이 빠른 것을 보였으며 insulin이 첨가된 CI배지보다 insulin이 첨가되지 않은 ABM-C 의 doubling time이 약 1 day 빠른 것으로 나타나 insulin이 첨가되지 않은 ABM-C 배지를 이용하여 연골세포치료제 배양도 가능할 것으로 생각되었다.
표 3. ABM-C 배지내 FBS의 농도에 따른 연골세포 증식 비교

본 발명은 관절이 손상된 환자로부터 채취된 연골조직으로부터 분리된 연골세포를 체외에서 배양 시 기존 상용화된 배지에 비해 연골세포의 증식률이 높아 임상적으로 이식에 필요한 세포수 확보가 빠른 시간에 용이하다는 것이 특징이다.

본 발명의 연골세포 특이적 배양배지는 손상된 연골조직으로부터 분리된 연골세포를 배양하기 위한 것으로, 필요에 따라 한가지 이상의 성분을 첨가할 수 있는데, 태아 송아지, 말 또는 사람의 혈청을 비롯하여 미생물의 오염 방지를 위한 항생제 및 항진균제를 첨가하여 사용할 수 있으며 10％ FBS를 첨가하는 것이 바람직하다.

이하 바람직한 실시 예를 들어 본 발명을 상세히 설명하나 본 발명이 이에 국한된 것은 아니다.

[실시예 1] ABM배지를 이용한 연골세포배양

＜실시예 1-1＞ 연골세포 분리

채취된 연골조직을 50mL 원심분리튜브로 옮겨 10ug/mL Gentamycin이 들어 있는 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) 25mL을 넣고 세게 수십회 흔들어 준 후, HBSS를 제거하여 채취된 연골 조직을 수세하였다. 이러한 과정을 6회 반복하였다. 수세된 연골조직을 petridish에 옮겨 담은 후 채취된 연골조직으로부터 뼈 조직을 제거하고 연골조직만 잘라냈다. Petridish에 담긴 연골조직을 약 1-2mm의 크기로 자른 후, 15mL 원심분리튜브로 옮겨 HBSS를 넣고 수십회 흔들어 준 후, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이러한 수세과정을 3회 반복하였다. 침전된 연골조직을 0.1％ 콜라게나제를 함유한 HBSS 용액에 부유한 후, 25㎠ 세포배양용기에 넣고 37℃에서 16-18시간 정치시켰다.

＜실시예 1-2＞ 1차 배양

0.1％ 콜라게나제 용액에서 정치된 연골조직으로부터 분리된 연골세포를 40um 나일론망으로 걸러 새로운 15mL 원심분리튜브로 옮겨 원심분리하고 상층액을 제거한 후 20％ FBS (Fetal Bovine Serum, 우태아혈청)을 함유하는 DMEM 또는 ABM 배지로 부유한 후, 5ug/mL의 Gentamycin을 첨가하여 25㎠ 세포배양용기 1-3개에 나누어 37℃, 8％ 이산화탄소 농도의 배양기에서 배양하였다. 2-3일 마다 배양용기별로 20％ FBS가 함유된 DMEM배지나 ABM배지 5mL로 배양액을 교환하며 9-11일간 배양하였다.

아스피레이터를 이용하여 배양용기의 배양액을 흡인하고 배양용기당 5mL HBSS를 분주하고 배양용기를 약하게 50회 흔들어 준다. 세척된 HBSS를 아스피레이터를 이용하여 흡입한 후 다시 세척과정을 2회 더 반복한다. 0.25％ 트립신 용액 1mL을 각 배양용기에 가한 후 1-2분간 37℃에서 정치하여 연골세포를 배양용기 바닥면으로부터 유리시켜 15mL 원심분리튜브에 옮겨 원심분리한 상층액은 아스피레이터를 이용하여 제거하였다. 10％ FBS를 함유한 DMEM 또는 ABM 배지 10mL을 15mL 원심분리튜브에 넣고 세포를 부유한 후 세포부유액 200uL를 취하여 9.8mL ISOTON 용액이 들어있는 15mL 원심분리튜브에 부유시켜 Coulter counter기를 이용하여 세포수를 측정하였다. 1차 배양에서 수집된 연골세포를 5,000 cells/㎠ 의 밀도로 75㎠ 세포배양용기 5개에 나누어 37℃, 8％ 이산화탄소 농도의 배양기에서 배양하였다.

상기 ABM 배지를 이용하여 1차 배양된 연골세포수는 DMEM배지내에서 배양된 연골세포보다 2배의 증식률을 보였다 (표 4).

표 4. 1차 배양 후 수확된 총 세포의 배지별 비교

＜실시예 1-3＞ 2차 배양

1차 계대배양 후, 배양 중 연골세포에 2-3일 마다 배양용기별로 10％ FBS가 함유된 DMEM배지나 ABM배지 15mL로 배양액을 교환하며 5-7일간 배양하였다. 배양용기에 90-100％ confluence 세포성장이 관찰될 때 계대배양을 실시하였다.

아스피레이터를 이용하여 배양용기의 배양액을 흡인하고 배양용기당 5mL HBSS를 분주하고 배양용기를 약하게 50회 흔들어 준다. 세척된 HBSS를 아스피레이터를 이용하여 흡입한 후 다시 세척과정을 2회 더 반복한다. 0.25％ 트립신 용액 2mL을 각 배양용기에 가한 후 1-2분간 37℃에서 정치하여 연골세포를 배양용기 바닥면으로부터 유리시켜 15mL 원심분리튜브에 옮겨 원심분리한 상층액은 아스피레이터를 이용하여 제거하였다. 10％ FBS를 함유한 DMEM 또는 ABM 배지 10mL을 15mL 원심분리튜브에 넣고 세포를 부유한 후 세포부유액 200uL를 취하여 9.8mL ISOTON 용액이 들어있는 15mL 원심분리튜브에 부유시켜 Coulter counter기를 이용하여 세포수를 측정하였다. 1차 배양에서 수집된 연골세포를 5,000 cells/㎠ 의 밀도로 175㎠ 세포배양용기 6개에 나누어 37℃, 8％ 이산화탄소 농도의 배양기에서 배양하였다.

상기 ABM 배지를 이용하여 2차 배양된 연골세포수는 DMEM배지내에서 배양된 연골세포보다 약 1.9배의 증식률을 보였고 (표 5)

표 5. 2차 배양 후 수확된 총 세포의 배지별 비교

＜실시예 1-4＞ 3차 배양

2차 계대배양 후, 배양 중 연골세포에 3-4일 마다 배양용기별로 10％ FBS가 함유된 DMEM배지나 ABM배지 20mL로 배양액을 교환하며 9-11일간 배양하였다. 배양용기에 90-100％ confluence 세포성장이 관찰될 때 계대배양을 실시하였다.

아스피레이터를 이용하여 배양용기의 배양액을 흡인하고 배양용기당 5mL HBSS를 분주하고 배양용기를 약하게 50회 흔들어 준다. 세척된 HBSS를 아스피레이터를 이용하여 흡입한 후 다시 세척과정을 2회 더 반복한다. 0.25％ 트립신 용액 4mL을 각 배양용기에 가한 후 1-2분간 37℃에서 정치하여 연골세포를 배양용기 바닥면으로부터 유리시켜 15mL 원심분리튜브에 옮겨 원심분리한 상층액은 아스피레이터를 이용하여 제거하였다. 10％ FBS를 함유한 DMEM 또는 ABM 배지 10mL을 15mL 원심분리튜브에 넣고 세포를 부유한 후 세포부유액 200uL를 취하여 9.8mL ISOTON 용액이 들어있는 15mL 원심분리튜브에 부유시켜 Coulter counter기를 이용하여 세포수를 측정하였다.

상기 ABM 배지를 이용하여 3차 배양된 연골세포수는 DMEM배지와 거의 같은 증식률을 보였다 (표 6).

표 6. 3차 배양 후 수확된 총 세포의 배지별 비교

상기 실시 예 1은 각 배양별로 한정된 배양용기를 이용하여 배양한 결과(도면 3)이다. 본 발명은 빠른 시간 내에 이식이 가능한 세포수를 확보하기 용이한 배지를 개발하기 위함으로 상기 실시 예 1-2의 1차 배양 결과를 기초로 하여 이론적 생산량을 산출하였다 (표 7). 표 7에서 보듯이, ABM을 이용하여 배양한 연골세포의 경우, 2차 배양 후 이론적으로 수확된 세포의 수는 DMEM 배지를 이용하여 배양한 CI보다 3.5배의 많은 세포수를 확보할 수 있다.

표 7. 1차 배양결과를 바탕으로 각 배지별 이론적 생산량 비교

＜실시예 1-5＞ 배양배지에 따른 연골세포의 특성변화 확인

FBS가 첨가된 ABM에서 배양된 연골세포의 특성 변화를 확인하기 위하여 FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양된 연골세포와 비교하였다. 배양배지별 배양단계로 배양된 세포의 분자생물학적 수준의 gene 발현을 확인한 결과, 도면 4처럼 DMEM에서 배양된 연골세포와 크게 차이를 보이지 않았다.

표 8. RT-PCR 반응 조건

표 9. 각 Gene의 PCR Primer 염기서열

표 10. 각 Gene의 PCR 반응조건

일반적으로 혈청이 첨가된 배지에서 단층배양으로 연속적으로 배양하면 passage 4～5 이후 연골세포의 특성을 잃어버리는 dedifferentiation이 일어난다 (Benya and Shaffer, 1982; Schulze-Tanzil 등, 2002). 각각 배지로 배양된 연골세포의 passage별 세포특성을 분자생물학적으로 gene의 발현율을 GAPDH와 비교한 결과 (도면 5), 검체 모두 계대배양 수가 증가됨에 따라 거의 gene의 발현도가 떨어지는 경향을 나타내며 hypertrophic marker인 Collagen type X, activated functional marker인 collagen type Ⅱ와 aggrecan, dedifferentiated marker인 collagen type Ⅰ 역시 두 배지 모두에서 감소하는 경향을 보였다. . 이와 마찬가지로 ABM-C 배지에서 연속적인 단층배양에서도 passage 3에서 collagen type Ⅱ의 합성 능력을 상실하였으나 (도면 5) ABM-C을 이용한 연골세포의 배양은 passage 2에서 CI배지에서 배양한 연골세포보다 activated functional chondrocyte의 표지인 aggrecan의 발현이 높게 나타났다. 이를 바탕으로 하여 ABM-CBM 배지를 이용하여 연골세포를 연속적으로 배양하여 연골세포치료제를 제조하기 위해서는 passage2에서 최종제품을 생산하는 short-term culture 법을 확립이 필요하였다.

[실시예 2] ABM-C 배지를 이용한 Short-term 연골세포배양
Insulin이 첨가되지 않은 ABM-C 배지의 경우도 insulin이 첨가된 CI배지 빠른 증식률을 보여 insulin이 첨가되지 않은 ABM-CBM을 이용하여 현재의 연골세포 배양방법과short-term culture방법을 비교 분석하였다. 연골조직을 일차배양, 이차배양, 삼차배양 방법으로 25, 75, 175㎠의 세포배양용기에 제조된 연골세포 배양액 내 W1의 증식효과를 비교하기 위하여 배지를 교환하며 연골세포 배양을 실시하였다. 채취된 연골조직을 collagenase를 이용하여 연골세포를 분리하여 25㎠의 세포용기 3개 접종하여 1차 배양을 실시한 후, 2차 배양은 75㎠의 세포배양용기, 3차 배양은 175㎠의 세포배양용기에서 각각 배양하여 수확되는 세포수를 측정하였다. 세포 배양용기 내 연골세포의 증식을 비교하기 위하여 배양용기 바닥면에 고정점을 잡아 세포수를 매일 관찰, 측정하였고 각 배양단계별로 마지막 배양일에 연골세포를 회수하여 세포수를 측정하여 cell growth graph를 작성하였다(도면 6a, 표 11). 이를 이용하여 연골세포의 doubling time을 계산하였다 (표 11). CI 배지의 P1, P2, P3 단계에서의 doubling time은 2.4, 4.8, 2.3 days였으며 ABM-CBM의 doubling time은 1.5, 2.0, 3.8 days로 passage2까지는 빠른 doubling time을 보였다. 배양단계가 늘어날수록 doubling time이 증가하는 추세를 보였다.
표 11. Insulin이 첨가되지 ABM-C 배지를 이용한 연골세포 증식 비교

DMEM high-glucose를 이용한 연골세포배양방법과 동일하게 1차 배양은 25㎠의 세포용기 3개 접종하여 배양을 실시한 후, 2차 배양은 75㎠의 세포배양용기 5개, 3차 배양은 175㎠의 세포배양용기 6개에서 각각 배양하여 수확되는 세포수를 측정하였다(표 12). 총 배양일은 CI의 경우, 33일 소요된 반면, ABM-CBM은 26일 이였다. 그러나 W1이 첨가되지 않은 ABM-CBM 배지는 P3에서 수확된 연골세포가 3.93×10⁷ cell로 4 vial 기준의 연골세포치료제를 제조할 수 없는 반면, W1이 함유된 CI배지 모두 P3에서 수확된 연골세포만 최소 4.8×10⁷cells 이상 (4 vials 기준으로, ＞ 1.2×10⁷cells/vial)이 수확되었다 (표 12, 도면 6b).
표 12. DMEM 배지를 이용한 연골세포배양법과 동일한 ABM-C의 연골세포 증식비교

ABM-CBM을 이용하여 연골세포를 short-term culture 방법의 효율성을 CI (DMEM) 배지를 이용하여 연골세포를 비교 배양하였다 (표 13, 도면 1). 두 배지 모두 1차 배양은 25㎠의 세포용기 3개 접종하여 배양을 실시한 후, 1차 배양에서 배양된 연골세포들 중 50％를 동결보관하고 나머지 50％의 연골세포를 최소 4.8×10⁷cells 이상의 연골세포를 수확하기 위하여 ABM-C 배지는 2차 배양을 CI (DMEM) 배지는 2차 및 3차을 실시하였다. ABM-C 배지를 이용한 short-term 연골세포 배양은 2차 배양에서 5.26×10⁷cells를 얻을 수 있었으나, CI (DMEM) 배지를 이용한 short-term 연골세포 배양은 2차 배양에서 4.8×10⁷cells 이하인 1.34×10⁷cells의 세포를 얻어 3차 배양을 실시하였다. 이와 같이, W1이 첨가되지 않은 ABM-C 배지를 이용하여 연골세포를 배양하여 CI (DMEM) 배지 보다 17일의 배양기간을 단축하였다 (도면 1).
표 13. ABM-C 배지를 이용한 short-term culture법

[실시예 3] ABM-C 배지를 이용한 3차원 연골세포배양
ABM-C 배지를 이용하여 연골세포를 collagen sponge에 접종하여 TGF-b1과 BMP-2와 같은 세포성장인자의 유무에 따른 3차원 배양 가능여부를 확인하기 위하여 pore size가 50～100um되는 10mm×10mm×2mm 크기의 collagen sponge에 연골세포를 1.0×10⁵ cells를 접종한 후, 표 14와 같은 배양 조건으로 20일 동안 배양하였다. Collagen sponge내 연골세포의 생존 및 배양여부를 확인하기 위하여 20일 동안 배양된 collagen sponge를 H＆E 염색하여 현미경으로 관찰한 결과, ABM-C 배지를 이용하여 collagen sponge 내 연골세포의 3차원 배양가능성도 확인하였다 (도면 7).
표 14. collagen sponge내 연골세포의 배양조건

본 발명 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양배지 및 배양방법의 기술적 사상은 실제로 동일결과를 반복 실시 가능한 것으로, 특히 이와 같은 본원발명을 실시함으로써 기술발전을 촉진하여 산업발전에 이바지할 수 있어 보호할 가치가 충분히 있다.

도1은 본 발명에 따른 short-term culture 방법과 현재 DMEM 배지를 이용하여 연골세포치료제 배양을 분석한 그래프.

도 2는 본 발명에 따른 연골세포의 접종수별 세포배양배지의 연골세포 증식을 분석한 그래프로, 도 2a는 2,500 cells/㎠를, 도 2b는 5,000 cells/㎠를, 도2c는 10,000 cells/㎠를 접종하여 연골세포의 증식곡선.

도 3은 본 발명에 따른 각 배양단계별 세포배양용기내 연골세포의 증식을 분석한 그래프.

도 4은 본 발명에 따른 각 배양단계별 연골세포의 분자생물학적 특성을 분석한 결과사진.

도 5는 본 발명에 따른 각 배양단계별 연골세포의 분자생물학적 특성을 나타내는 유전자의 발현률 그래프.
도 6은 본 발명에 따른 각 배지별에 대한 배양단계별 세포배양용기내 연골세포의 증식 곡선 도 6a 그래프와 현 제조방법 적용시 제조되는 전체 연골세포의 증식 곡선 도 6b 그래프.
도 7은 본 발명에 따른 collagen sponge내 연골세포 배양 20일째의 H＆E 염색사진.

Claims

Rosewel Park Memorial Institute (RPMI)-1640과 Dulbecco's modification of Eagle's medium (DMEM)을 1:1 비율로 혼합된 DR을 만들고, 상기 DR의 조성을 다시 DMEM과 RPMI-1640 배지와 비교하여 각 배지내 중복된 성분들은 높은 농도를 선택하는 동시에 둘 중 하나의 배지에만 들어 있는 성분들은 그 농도 그대로를 유지하고 같은 공급원인 성분들은 둘 중 택 1하여 Advanced Basic Media(ABM)-Chondrocyte (ABM-C) 배지를 조성하는 단계; 및

이후 상기 ABM-C 배지를 이용하여 연골세포를 배양하는 단계 또는 ABM-C 배지를 이용한 Short-term 연골세포를 배양하는 단계 또는 ABM-C 배지를 이용한 3차원 연골세포를 배양하는 단계 중에서 어느 하나의 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 1 청구항에 있어서,

상기 ABM-C 배지를 이용하여 연골세포를 배양하는 단계에는,

연골세포 분리단계와 1차, 2차, 3차 배양단계 및 배양배지에 따른 연골세포의 특성변화를 확인하는 단계;가 순차적으로 이루어짐을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 2 청구항에 있어서,

상기 연골세포 분리단계는,

채취된 연골조직을 50mL 원심분리튜브로 옮겨 10ug/mL Gentamycin이 들어 있는 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) 25mL을 넣고 세게 수십회 흔들어 준 후 HBSS를 제거하여 채취된 연골 조직을 수세하는 단계;

상기 과정을 6회 반복하고 수세된 연골조직을 petridish에 옮겨 담은 후 채취된 연골조직으로부터 뼈 조직을 제거하고 연골조직만 잘라내는 단계;

이어서 Petridish에 담긴 연골조직을 1-2mm의 크기로 자른 후 15mL 원심분리튜브로 옮겨 HBSS를 넣고 수십회 흔들어 준 후 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계;

싱기한 수세과정을 3회 반복하고 침전된 연골조직을 0.1％ 콜라게나제를 함유한 HBSS 용액에 부유한 후 25㎠ 세포배양용기에 넣고 37℃에서 16-18시간 정치시키는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 2 청구항에 있어서,

상기 1차배양 단계는,

0.1％ 콜라게나제 용액에서 정치된 연골조직으로부터 분리된 연골세포를 40um 나일론망으로 걸러 새로운 15mL 원심분리튜브로 옮겨 원심분리하고 상층액을 제거한 후 20％ FBS (Fetal Bovine Serum, 우태아혈청)을 함유하는 DMEM 또는 ABM 배지로 부유하는 단계;

이후 5ug/mL의 Gentamycin을 첨가하여 25㎠ 세포배양용기 1-3개에 나누어 37℃, 8％ 이산화탄소 농도의 배양기에서 배양하는 단계;

이어서 2-3일 마다 배양용기별로 20％ FBS가 함유된 DMEM배지나 ABM배지 5mL로 배양액을 교환하며 9-11일간 배양하는 단계;가 포하됨을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 2 청구항에 있어서,

상기 2차배양 단계는,

1차 계대배양 후, 배양 중 연골세포에 2-3일 마다 배양용기별로 10％ FBS가 함유된 DMEM배지나 ABM배지 15mL로 배양액을 교환하며 5-7일간 배양하고, 배양용기에 90-100％ confluence 세포성장이 관찰될 때 계대배양을 실시함을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 2 청구항에 있어서,

상기 3차배양 단계는,

2차 계대배양 후, 배양 중 연골세포에 3-4일 마다 배양용기별로 10％ FBS가 함유된 DMEM배지나 ABM배지 20mL로 배양액을 교환하여 9-11일간 배양하고, 배양용기에 90-100％ confluence 세포성장이 관찰될 때 계대배양을 실시함을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 2 청구항에 있어서,

상기 배양배지에 따른 연골세포의 특성변화를 확인하는 단계는,

FBS가 첨가된 ABM에서 배양된 연골세포의 특성 변화를 확인하기 위하여 FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양된 연골세포와 비교하고, 배양배지별 배양단계로 배양된 세포의 분자생물학적 수준의 gene 발현을 확인함을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 1 청구항에 있어서,

상기 ABM-C 배지를 이용한 Short-term 연골세포를 배양하는 단계는,

연골조직을 일차배양, 이차배양, 삼차배양 방법으로 25, 75, 175㎠의 세포배양용기에 제조된 연골세포 배양액 내 W1의 증식효과를 비교하기 위하여 배지를 교환하며 연골세포 배양을 실시하는 단계;

이후 채취된 연골조직을 collagenase를 이용하여 연골세포를 분리하여 25㎠의 세포용기 3개 접종하여 1차 배양을 실시한 후, 2차 배양은 75㎠의 세포배양용기, 3차 배양은 175㎠의 세포배양용기에서 각각 배양하여 수확되는 세포수를 측정하는 단계;

이어서 세포 배양용기 내 연골세포의 증식을 비교하기 위하여 배양용기 바닥면에 고정점을 잡아 세포수를 매일 관찰, 측정하였고 각 배양단계별로 마지막 배양일에 연골세포를 회수하여 세포수를 측정하여 cell growth graph를 작성하는 단계;가 포하됨을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.
제 1 청구항에 있어서,

상기 ABM-C 배지를 이용한 3차원 연골세포를 배양하는 단계는,

ABM-C 배지를 이용하여 연골세포를 collagen sponge에 접종하여 TGF-b1과 BMP-2와 같은 세포성장인자의 유무에 따른 3차원 배양 가능여부를 확인하기 위하여 pore size가 50～100um되는 10mm×10mm×2mm 크기의 collagen sponge에 연골세포를 1.0×10⁵ cells를 접종한 후 배양하는 단계; 및

Collagen sponge내 연골세포의 생존 및 배양여부를 확인하기 위하여 20일 동안 배양된 collagen sponge를 H＆E 염색하여 현미경으로 관찰한 결과 ABM-C 배지를 이용하여 collagen sponge 내 연골세포를 3차원으로 배양하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법.