KR101016708B1

KR101016708B1 - 항알러지 효과가 있는 ＰｒｏＡＬ 단백질을 암호화하는유전자

Info

Publication number: KR101016708B1
Application number: KR1020080042736A
Authority: KR
Inventors: 박영인; 우성식; 노재열; 이승기; 정명희; 조태형; 정연준; 이영철; 김미란
Original assignee: 주식회사 유니젠
Priority date: 2008-05-08
Filing date: 2008-05-08
Publication date: 2011-02-25
Anticipated expiration: 2028-05-08
Also published as: KR20090116922A; WO2009136757A1; TW200950797A

Abstract

서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 ProAL A 단백질; 상기의 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 ProAL B 단백질; 상기 ProAL A 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 ProAL B 단백질을 코딩하는 유전자; 상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

항알러지, ProAL A , ProAL B, 유전자

Description

항알러지 효과가 있는 ＰｒｏＡＬ 단백질을 암호화하는 유전자{Genes encoding ProAL protein with anti-allergic effect}

본 발명은 항알러지 효과가 있는 ProAL 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

알로에는 백합과 (또는 나리과 Liliaceae)에 속하는 다년생 초본식물로서 따뜻하고 건조한 기후의 아프리카 마다카스카르가 원산지로 알려져 있다. 알로에는 4~40℃의 온도에서 생장이 가능하고 건조한 환경에 대한 적응성이 뛰어나 한국을 비롯한 중국, 유럽, 미국, 인도 등 세계적으로 재배되고 있다. 현재 전세계적으로 약 300 여종 이상이 알려져 있으나 약용으로 쓰이는 것은 6~7종 정도가 되는 것으로 보고되고 있다. 알로에의 유고한 의료사적 기록과 경험을 통해서 고혈압, 저혈압, 동맥경화, 혈전에 의한 중풍, 류마티스성 관절염, 신장염, 당뇨병, 기관지 천식해소 등에 사용되어 왔으나 현대 과학적인 측면에서 알로에의 약효에 관한 연구는 미미한 실정이다.

지금까지 보고된 염증 반응에 대한 알로에의 억제효과를 살펴보면 알로에 아보레센스(Aloe arborescense)에서 분리한 당단백인 카복시펩티다제 (carboxypeptidase)가 염증매개체인 브래디키닌(bradykinin)을 분해하여 항 염증반응을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 알로에 베라(Aole vera)에서 분리한 뮤코폴리사카라이드(mucopolysaccharide)의 만노스-6-포스페이트 (mannose-6-phosphate) 잔기가 상처 치유와 항염증 효과를 보이며 알로에 성분의 스테롤(sterol) 또한 항 염증 작용을 가진다고 보고되고 있다. 50% 에탄올로 알로에를 추출할 때 분리되는 상등액은 항염증 효과를 나타내는데 당단백 (glycoprotein) 성분이 포함된 것으로 추정되고 있다. 최근에는 대한민국 등록특허 제035864호에서 알러지의 화학매개물질의 유리억제 효과로 인하여 항알러지제로서 유용하게 사용될 수 있는 알프로젠 단백질에 대하여 발표한바 있다. 그러나, ProAL 유전자에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 높은 활성의 항알러지 물질을 분리하고, 분리된 성분의 정보를 이용하여 Aloe cDNA library로부터 동정한 유전자를 제공함으로써 재조합 ProAL 단백질의 대량생산을 가능하게 하는데 기여하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 ProAL A 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 ProAL B 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 ProAL A 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 ProAL B 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 항알러지 효과가 있는 ProAL 단백질을 암호화하는 유전자를 제공함으로써 재조합 ProAL 단백질의 대량생산을 가능케 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 ProAL A (protein gene of aloe A)단백질을 제공한다. 본 발명은 상기의 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 ProAL B (protein gene of aloe B)단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 ProAL A와 ProAL B 단백질의 범위는 서열번호 3과 서열번호 4로 각각 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3과 서열번호 4로 각각 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 항알러지 활성을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 ProAL A 또는 ProAL B는 알로에 유래인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 상기 알러지 증상에는 감기로 인한 기침, 알러지성 기침, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 두드러기, 류마티스, 아토피, 천식, 피부 가려움 및 햇볕 알러지 증상 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 ProAL A와 ProAL B 단백질을 각각 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 ProAL A와 ProAL B 단백질을 각각 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1과 서 열번호 2로 각각 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1과 서열번호 2로 각각 표시되는 염기 서열과 적어도 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 ProAL A와 ProAL B 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 도 3에 기재된 재조합 대장균 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입 된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

시작 코돈은 단백질의 코딩 서열 내에, 그리고 보통 5' 말단에 위치하는 일반적으로 ATG인 코돈이고, 단백질 서열의 첫번째 아미노산을 신호한다.

정지 코돈은 단백질의 코딩 서열 내에, 그리고 보통 3' 말단에 위치하는 넌센스(nonsense) 코돈이고, 성장하는 폴리펩티드 사슬의 정지를 신호한다.

오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame; ORF)은 적절한 조절 서열의 제어하에 놓일 때 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 세포에서 아미노산 서열을 코드하는 이중쇄 DNA중의 코돈 트리플렛(triplet)의 선형 배열이다. ORF의 경계는 5'말단의 시작 코돈 및 3'말단의 정지 코돈에 의해 결정된다. 이는 "코딩 서열"로서도 역시 언급될 수 있다.

프로모터 서열은 세포내의 RNA 폴리머라제가 결합할 수 있고 하류(3' 방향)의 하나 이상의 구조 유전자의 오픈 리딩 프레임의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 보통 시그날 서열 또는 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치하고, 백그라운드 이상으로 검출될 수 있는 수준으로 폴리펩티드의 전사를 개시하는데 필요한 최소수의 염기 또는 요소를 포함하도록 5'방향의 상류로 뻗어 있다.

코딩 서열 또는 ORF는 RNA 폴리머라제가 코딩 서열을 mRNA로 전사할 때 프로모터 서열의 제어 하에 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명에서 상기 벡터로 형질전환될 수 있는 대장균주로는 BL21, BL21(DE3)등이 있으며, 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 사용된 대장균 BL21(DE3)이다. 벡터를 대장균으로 형질전환시키는 방법으로는 CaCl₂ 버퍼를 이용한 competent 세포 사용, 전기천공법(electroporation), 열 충격법(hear shock) 등의 당업계에 통상적으로 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 상기 형질전환 대장균을 배양하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 대장균의 배양법을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 재료

대장균(E. coli) DH5α와 BL21(DE3)은 플라스미드 구축과 단백질 발현을 위 해 사용하였다. 선별된 클론을 배양하기 위해 10㎍/㎖ 카베니실린이 포함된 LB 액체 배지를 사용하였다. 교정(proofreading) i-pfu DNA 중합효소와 I-Taq^TM DNA 중합효소는 인트론에서 구입하였다. 제한 효소(EcoRⅤ, NdeⅠ, XhoⅠ)는 엔지노믹스(Enzynomics)에서 구입하였다. T4 DNA 리가아제는 타카라(Takara)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 바이오니어(Bioneer)에서 합성하였다. 리소자임, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)와 다른 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)와 DTT(dithiothreitol)은 두쉐파(Duchefa)에서 구입하였다. SDS-PAGE와 단백질 농도의 정량 분석을 위한 브레드포드(Bradford) 시약은 바이오-라드(Bio-Rad)에서 구입하였다. HisTrap HP 컬럼과 슈퍼덱스 75 26/60은 아머삼-파마시아 바이오테크놀로지(Amersham-Pharmacia Biotechnology)에서 구입하였다.

2. 알로에의 cDNA 라이브러리 구축

모든 RNA는 PolyATrack 시스템 (Promega Biotech)이 제공하는 방법을 변형시켜 알로에 잎으로부터 추출하였다. 알로에 잎 1그람(g)에 액체 질소를 넣고 곱게 갈아서 4 M 구아니딘 티오시아네이트, 20 mM 소디움 시트레이트, pH 7.0, 0.5% 소디움 살코실, 0.1 M β머캅토에탄올, 20 mM 소디움 아세테이트를 포함하는 pH 4.8인 버퍼, 45% (v/v) 페놀과 5% (v/v) 클로로포름을 넣고 추출하였다. 추출된 모든 RNA의 상층액은 상온(room temperature)에서 2분 동안 100 pmol 의 바이오틴이 붙은 oligo-dT와 반응시켰다.

스트랍트아비딘 상자성의 입자(Straptavidin paramagnetic particle)를 혼합물에 넣고 반응 시킨 후, 상층액은 버리고, 잡힌 입자는 0.5 x SSC 버퍼로 세척했다. 마지막으로 mRNA은 멸균수로 녹였다. 5㎍ 알로에 총 mRNA는 ZAP-cDNA 합성 키트와 ZAP-cDNA Gigapack Gold cloning kit (Stratagene)를 이용하여 이중나선 cDNA를 합성하였고, Uni-ZAP 벡터에 클로닝하였다.

3. ProAL 유전자의 클로닝

사전연구를 통해 이미 밝혀진 알로에의 N-말단부의 15개 아미노산 서열을 바탕으로 codon usage를 고려하여 프라이머를 작성하고, 알로에 N-말단 시퀀스와 상동성을 가지고 있는 만노스-결합 렉틴 유전자(Crocus sativus)를 찾아내어 프라이머를 작성하여 nested PCR에 이용하였다.

위에서 합성한 1st 가닥 cDNA와 라이브러리를 주형으로 사용하고 15개의 아미노산 서열과 만노스 결합 렉틴(mannose-binding lectin) 유전자를 바탕으로 작성된 유전자 특이 프라이머(gene-specific primer)를 이용하여 forward PCR 및 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)를 수행하였다.

5’-RACE은 polyA+ RNA로부터 5’ RACE System (Invitrogen)을 사용하였다. PCR을 통해 얻어진 PCR 산물은 전기영동을 하여 확인하고 원하는 밴드를 젤에서 용출하여 pCR4-TOPO 벡터에 라이게이션(ligation) 하였다. 이중 일부를 DH5α 세포에 형질전환하고 얻어진 콜로니로부터 미니프렙(miniprep)을 하여 삽입을 확인하였고, 시퀀싱하여 염기서열을 확인하였다. 얻어진 시퀀스는 블라스트 서치(blast search)를 통하여 DNA 수준에서 프라이머의 존재를 확인하고 번역(translation)하여 단백 질 수준에서 프라이머의 존재를 확인하였다.

표 1. ProAL 유전자의 클로닝을 위해 사용한 프라이머 서열

Primer	Sequences
CvL-5(서열번호 5)	5’-ATG CAA GGC GAC TGC AAC TTG GT-3’
5R#4(서열번호 6)	5’-MAC YTC SCC SGT MAR MAR MAC-3’
Aloe1(서열번호 7)	5’-CAT ATG GCG AAA CAG ATG TC-3’
Aloe2(서열번호 8)	5’-GTT CTC GGC ACC GAT AGT CA-3’

4. ProAL 발현 플라스미드의 구축

ProAL cDNA가 클로닝 된 pCR4-TOPO는 주형으로 사용되었다. ProAL cDNA는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 디자인된 프라이머에는 N-말단에 NdeⅠ제한효소 자리를 포함시키고, C-말단에 정지코돈과 XhoⅠ 제한효소 자리를 포함시켰다. 증폭을 위한 20㎕ PCR 반응물은 Alp-pCR4-TOPO, 20mM Tris-HCl(pH8.75), 10mM KCl, 2mM MgSO₄, 10mM(NH₄)₂SO₄, 0.1% Triton-X-100. 0.1% BSA, 0.2mM dNTPs, 2.5U I-pfu DNA 중합효소와 10pM의 특이 프라이머를 포함한다. PCR 조건은 다음과 같다. 초기 변성 95℃, 10분; 증폭 95℃, 30 초; 60℃, 30초; 72℃, 30초; 30회. PCR 산물은 1%(w/v) 아가로스 EtBr 젤에서 전기영동으로 분석하였다. 젤로 정제한 산물은 EcoRⅤ로 절단하여 준비한 pGEM5zf(+) 벡터에 서브클론한 후, 증폭하는 동안에 어떠한 시퀀스 변형이 일어나지 않았는지를 시퀀싱을 통하여 분석하였다. 얻어진 플라스미드는 제한효소 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 절단하고, 얻어진 ProAL 절편은 젤로부터 정제한 뒤 제한효소 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 자른 pET-22b(+)벡터에 서브클로닝 하였다.

5. 발현 및 봉입체( inclusion bodies )의 정제

재조합 AS1, AS2 및 AT 단백질을 과발현시키기 위해, 배지, 배양 온도, 유도 시간 및 IPTG 농도와 같은 몇 개의 조건을 테스트하였다. 발현 플라스미드는 BL21(DE3)균주에 도입하였고, 싱글 콜로니를 10 ㎍/㎕ 카베니실린을 포함하는 TB 액체배지에서 37℃ 배양하였다. 밤새 배양한 10㎖액체 배양배지는 50 ㎍/㎕ 카베니실린을 포함하는 1L의 TB 액체에 접종하였고, 37℃에서 OD(optical absorbance)600nm에서 0.3이 될 때까지 배양하였다. 1mM IPTG로 30℃, 6시간동안 유도한 후에, 5000rpm에서 15분동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 이후의 실험은 4℃에서 수행하였다. 상층액을 제거하고 펠렛은 초음파분리 버퍼(sonication buffer, 1mM PMSF, 20mM Tris-HCL(pH8.0))로 섞은 후 냉동상태(on ice)에서 소니케이터(sonicator)로 세포를 파쇄하였다. 1% triton X-100, 5mM DTT, DNaseⅠ 30㎍/㎖, 5mM MgCl2 및 1㎎/㎖ 리소자임을 초음파 분리 후 첨가하였다. 가용성 단백질을 포함하는 상층액은 원심분리 후 수득하였다. 용해물(lysate)인 펠렛은 다음의 조성비를 갖는 분리버퍼(isolation buffer)에 녹였다; 2M urea, 20mM Tris-HCl(pH8.0), 0.5M NaCl, 2% TritonX-100, 5mM DTT. 용해물은 초음파 분리를 수행하고 난 후 세포 잔해물를 제거하기 위하여 3회 씻어주고 10000g, 4℃, 20분동안 원심분리하였다. 그 후 다음과 같은 조성을 갖는 변성버퍼로 녹였다; 8M 우레아, 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM 이미다졸, 1mM 2-머캅토에탄올(pH8.0)

6. 봉입체( inclusion bodies )의 재생

히스티딘이 붙은 재조합 ProAL의 용해성 봉입체는 미리 조정된 HisTrap HP 컬럼에 주입하였고, 10℃에서 16시간동안 반응시켰다. 그 후 컬럼은 20mM 이미다졸이 포함된 세척버퍼로 세척하였다. 단백질은 100mM 이미다졸이 포함된 버퍼 50㎖로 녹였고, 우레아 농도가 감소된 재접힘 버퍼(6M, 4M, 2M, 1M, 0.5M, 0.1M. 0M)를 2 시간마다 바꾸어주면서 4℃에서 재생시켰다. 샘플은 염이 제거되었고, Vivaspin 20(Sartorius)으로 농축하였고, PBS로 미리 조정된 Superdex75 26/60으로 필터링하였다. 유속은 0.2㎖/분이다.

7. 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)와 항원항체반응( immunoblotting )

기본적으로, PAGE는 생거와 게하드(Shagger H, Von Jagow G 1987 Anal Biochem 166: 368-379) 방법에 따라서 수행하였다. 샘플 분획 50㎕은 95% SDS와 5% β-머캅토에탄올이 포함된 가용성 액으로 1:1로 희석하였다. 단백질은 SDS-PAGE 로 분리하였고, 나이트로셀룰로스 막에 옮겼다. 막은 5% 스킴밀크(Skim milk) 블로킹(blocking) 버퍼(10mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 0.1% Tween20)로 상온에서 3시간동안 반응시켰고, 호스라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase)에 결합되는 이차항체로 항원항체반응(immunoblotting)을 시켰다. 블럿은 화학발광 검출 기질인 “Super Signal West Pico"로 5분 동안 반응시킨 후 관찰하였다.

8. 세포배양

쥐 호염기성 백혈병 세포(RBL-2H3;American Type Culture Collection)인 쥐 점막-타입의 비만 세포는 15% 소 태아 혈청(fatal bovine serum, JBI), 페니실린-스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 0.1mM 비필수 아미노산과 1mM 소디움 피루베이트(Gibco)을 포함하는 이글(Eagle)의 변형 필수 배지(EMEM; Gibco)로 37℃에서, 5% CO₂로 습한 조건에서 배양하였다. 세포는 일주일에 2-3번 계대배양하였다.

9. RBL -2 H3 세포에서 β- 헥소사미니데이스 항원-유도노출에서 저해효과

RBL-2H3 세포에서 β-헥소사미니데이스(β-hexosaminidase)의 노출에 대한 저해 효과는 다음과 같은 방법으로 측정하였다(Matsuda et al., 2003 Chem. Lett. 13: 3197-3202 and references cited therein). 10% FBS와 항-DNP IgE(0.20 ㎍/㎖)를 포함하는 MEM을 사용하여 48-웰 플레이트에 2×10⁵cells/well가 되도록 분배하였고, 37℃에서, 세포의 감작(sensitization)을 위해 5% CO₂에서 오버나잇 배양하였다. 세포는 250㎕의 Tyrodes 버퍼(130mM NaCl, 5mM KCl, 1.4mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 5.6mM 글루코스, 10mM HEPES, 0.1% BSA, pH7.4)로 두 번 씻어주었고, 200㎕ Tyrodes 버퍼를 넣고 37℃에서 10분 동안 추가적인 배양을 수행하였다. 흡입(aspiration)한 후, 200㎕의 테스트 분획 용액을 각각의 웰에 넣고 45분 동안 배양하였다. 그 후 degranulation을 위한 세포자극을 수행하기 위해 50㎕ 항원(DNP-HSA, 0.1㎍/㎖)을 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 상층액(50㎕)은 96-웰에 옮기고, 100㎕ 기질(1mM ρ-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드)을 0.1M 시트레이트버퍼(pH4.5)를 넣고 37℃에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 이러한 반응은 150㎕ 정지용액(0.2M 글리신 버퍼(pH10.7)을 넣어 반응을 중지시켰다. 405nm에서 마이크로 리더를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 1. ProAL cDNA 의 분석>

PCR로 클로닝된 ProAL A와 ProAL B 클론의 완전한 시퀀스(full sequence)를 결정하고 이들 cDNA가 암호화하고 있는 단백질의 특성을 조사하였다(도 1).

ProAL A cDNA는 1041bp로 278개의 아미노산으로 구성된 하나의 폴리펩티드를 암호화하고 있었으며, ProAL B cDNA는 1044bp로 277개의 아미노산으로 구성된 하나의 폴리펩티드를 암호화하고 있었다.

ProAL A와 ProAL B 폴리펩티드는 약 90.3%의 아미노산 시퀀스 상동성을 보였으며 특히 ProAL A에서는 Leu이 그리고 ProAL B 아르기닌(Arg)과 트레오닌(Thr)이 상대적으로 높은 비율로 존재하였다.

< 실시예 2. 발현 플라스미드 pET22b (+)/ AS1 , AS2 와 AT 의 구축>

대장균(E. coli)에서 재조합 ProAL-His6 단백질의 과발현을 위해, PCR에 의해 증폭된 ProAL 유전자를 유도성 T7 발현 시스템에 기초한 박테리아 발현 벡터 pET22b(+)로 클로닝하였다. 따라서, 재조합 ProAL 유전자는 C-말단 히스티딘 표지를 가지고 전사융합 되었다. 디자인된 재조합 ProAL은 세 개의 유형이고(도 2), 발현 플리스미드 pET22b(+)/AS1, AS2와 AT의 구조물의 제작에 관련된 모식도는 도 3에 있다. 재조합 구조물의 DNA 시퀀싱을 통하여 돌연변이가 일어나지 않았음을 확인하였다.

< 실시예 3. 재조합 ProAL 의 발현>

세 가지 유형의 재조합 ProAL은 N-말단에 추가적인 1 아미노산(Met)이 있는 완전한 형태의 ProAL, 추가적인 2 아미노산(Met)이 있는 완전한 형태의 ProAL, C-말단에 6 히스티딘 잔기가 부착된 완전한 형태의 ProAL을 발현할 수 있는 플라스미드로부터 발현된다. pET22b/재조합 ProAL이 형질전환된 E. coli BL21(DE3)은 빈 벡터가 형질전환된 E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)보다 성장 속도가 느렸다. 유도발현을 위해 액체 배양액에 IPTG을 첨가하고 난 후 약 30분부터 대장균(E. coli)의 성 장은 2시간동안 느려졌고, 그 후 더 늦은 성장이 계속되었다(데이타 미제시).

낮은 온도에서 대장균(E. coli)의 과발현 단백질은 용해성과 안정성을 나타낸다고 이미 알려져 있다(Shirano et al., 1990 FEBS Lett. 271: 128-130). 이와 같은 사실을 재조합 ProAL에서 확인하고자 E. coli BL21(DE3)를 0.1, 0.5, 1mM IPTG가 첨가된 배지에서 16, 30, 37℃에서 배양하였다. 각 온도에서 배양한 세포로부터 얻어진 샘플의 SDS-PAGE 결과에서 유사한 농도의 두꺼운 단백질 밴드가 관찰되는 것을 쿠마시 브릴리언트 블루(Commassic brilliant blue)로 염색하여 관찰하였다(데이타 미제시). 그러나 단백질 밴드는 세포가 없는 분획에서는 관찰할 수 없었다. 이것은 과발현 재조합 ProAL 단백질은 대게 원심분리한 후 만들어진 펠렛에서 봉입체(inclusion body)로 존재한다는 것을 알 수 있게 한다. 유도된 전체 세포는 SDS-PAGE를 수행하기 위해 분리하였다(도 4).

His 6(도 4)에 특이적으로 알려진 His-프로브 다클론성 항체로 분석한 항원항체 반응에서는 총 분획(total fraction)와 가용성 분획(soluble fraction)에서 재조합 단백질을 확인할 수 있었다. 그러나 SDS-PAFE 결과와 다르게도 가용성 분획에서 적은 양의 재조합 ProAL이 검출되었다. 이러한 웨스턴 블럿 결과는 대장균(E. coli)에서 발현된 단백질의 주요 형태는 봉입체인 것을 확인할 수 있게 한다.

< 실시예 4. 재조합 ProAL 의 정제>

발현된 재조합 단백질은 거의 불용성 분획(insoluble fraction)인 것으로 확인되었다(도 6). 봉입체로부터 활성을 갖는 형태의 재조합 ProAL로의 회복을 위해 몇가지 방법을 시도하였다. 과정은 도 5에 묘사하였다. 불용성 단백질은 변성 버퍼로 녹였다. 그러나, AS1는 6M 구아니딘-HCl뿐만 아니라 8M 우레아에서도 전혀 녹지 않았다. AS2와 AT 분획은 His-bind 컬럼에 부착되었고, 50, 100, 150mM 이미다졸을 포함하는 용출 버퍼로 녹였다. 유속은 0.5㎖/분이다. 100mM 용출 샘플은 다음 실험에 사용하였다.

샘플은 우레아의 농도를 점차적으로 감소시킨 8개의 재접힘 버퍼를 사용하면서 투석으로 변성시켰고 Vivaspin 20으로 농축하였다. 그러나, AS2는 몇 개의 테스트를 통하여 2M 우레아에서 재결집시켰다. 오리지널 ProAL은 두 개의 서브-폼인 AS1과 AS2는 불안정하였지만 천연 그대로의 ProAL 형태를 갖는 AT는 비교적 안정하였다.

RBL-2H3에서 항알러지 효과를 측정하기 위해, 비만세포 유사체의 계속적인 세포라인(continuous cell line)에서 β-헥소사미니데이스 분석을 수행하였다. 비만세포의 분비 미립자에 저장되는 β-헥소사미니데이스는 비만세포가 활성화되었을 때 히스타민을 가지고 분비된다(Marquartde et al., 1983 J. Immunol 131: 934-939). 그래서 배지에서 β-헥소사미니다제 활성은 비만세포의 degranulation의 마커(marker)로 사용된다.

< 실시예 5. 젤 여과 크로마토그래피>

Ni-NTA 컬럼 정제와 계속된 재접힘 후에, 단백질은 Superdex-75 컬럼을 사용하여 정제하였다. 앞서서, 재접혀진 AT는 size exclusion 크로마토그라피(Bio-Silect 125-5(분류 범위(5-100kDa), 30㎝×0.78㎝)를 적용시켰고, 분석을 위해 1× PBS(pH7.4)로 용출시켰다. 세 개의 피크가 관찰되었다. 피크의 분자량은 스탠다드 젤 여과 교정 키드(BioRad)의 용출점을 이용하여 계산하였다: 티로글로블린 670kDa, IgG 158kDa, 오발부민 44kDa, 미오글로빈 7kDa, 비타민 B12 1.3kDa(data not shown). 또한 분자량은 앞서서 수행한 SDS-PAGE에 의해 계산된 질량과 비교하였다. 피크 2의 질량은 약 60kDa이고, 이것은 AT 다이머(예상 값 57.6kDa)와 유사하다. 피크 1은 테트라머로 추측되고 피크 3은 모노머로 추측된다. 왜냐하면 세 개의 피크의 SDS-PAGE 밴드는 같은 자리에 위치하기 때문이다(데이타 미제시).

준비과정으로 Superdex 75가 사용되었다. 분획의 로딩 전에 9.3㎎/㎖ 농도의 AT 500ul을 컬럼에 로딩하였고 이것은 1×PBS로 교정하고, 400㎕ 분획용량이 되게 유속 0.2 ㎖/분으로 용출시켰다.

도 7은 프로필 패턴이고, 두 개의 피크(피크1, 3)가 더 좁고 더 높은 피크를 나타내었고, 하나의 피크(피크 2)가 더 넓고, 더 낮은 피크로 관찰되었다. Superdex 75의 패턴은 HPLC Bio-Silect 125-5 컬럼의 결과와 유사하다. β-헥소사미니데이스 분석은 예상했던 결과를 나타내었다. 정제된 AT를 많이 처리 할수록, 점점 증가된 저해율(%)을 보였다. 피크 2는 0.0001㎍/㎖인 AT가 활성화된 RBL-2H3에서 63%의 β-헥소사미니다제 방출 저해를 보임으로써 가장 높은 활성을 보였으며, 재조합 AT의 정제 회수율은 1.92%이다(표 2).

표 2. 대장균을 이용한 재조합 ProAL(AT)의 정제

도 1는 ProAL의 아미노산 시퀀스의 정렬을 나타내는 그림이다.

도 2은 재조합 ProAL의 구조를 보여주는 그림이다. (A); PRO-ProAL의 뉴클레오티드 시퀀스는 두 개의 분리된 탄수화물 인식영역(QXDXNXVXY)과 N-말단에 세포 밖으로의 분비 서열 펩티드 시퀀스를 나타낸다. 신호 펩티드를 제외한 PRO-ProAL의 모든 서열은 AT, 앞의 서브시퀀스는 AS1, 뒤의 서브시퀀스는 AS2이다. (B); 알로에 cDNA에서 PRO-ProAL을 주형으로 PCR에 의해 증폭된 ProAL 유전자의 크기이다.

도 3는 벡터의 구조이다.

도 4는 재조합 ProAL의 발현 결과이다. 재조합 ProAL-AS1, AS2와 AT는 대장균 (E.coli)에서 발현시켜 SDS-PAGE를 수행한 후, 쿠마시 블루로 염색한 결과이다. AT는 28.8kDa, AS1은 12.5kDA, AS2는 15.8kDa이다

도 5는 재조합 ProAL의 단백질 정제 방법이다.

도 6은 봉입체(inclusion body) 분리결과이다. 레인 1: 균질화된 AS1(homogenized AS1), 2: 세정한 AS1(washed AS1), 3: 세정한 AS2, 4: 세정한 AT. 순도는 대략 90%이다.

도 7은 수퍼덱스 75 젤 여과 크로마토그래피(Superdex 75 gel filtration chromatography)를 이용하여 AT를 정제한 결과를 나타내는 그림이다. (A): 수퍼덱스 75의 용출 프로필을 나타내는 그림이다. (B): 10% 아크릴아미드 젤을 이용한 SDS-PAGE 결과를 쿠마시 블루 염색을 통하여 관찰한 것이다. 레인 1: AT의 피크 1.다른 피크의 크기는 피크 1과 같이 28.8kDa이다. 순도는 97% 이상이다. (C): 항 _ProAL 토끼 항체를 이용한 항원항체반응결과이다. 레인 1: 피크1. 레인 2:피크 2. 레인 3: 피크 3. 레인 4: 음성대조구 ProAL.

도 8은 수퍼덱스 75에 의해 정제된 재조합 AT의 RBL-2H3 세포로부터 β-헥소사미니데이스의 방출 저해 효과를 나타내는 그림이다. 젤 여과 크로마토그래피에 의해 분리된 세 개의 다른 용출 시표는 앞의 결과에서 보여주었다. 각각의 분획은 같은 크기이고(data not shown), 기준 분자량 마커와 비교하여 사량체(tetramer), 이량체(dimer), 단량체(monomer)로 예상된다. 이들 중에서 단량체는 저해 활성이 없었고, 사량체가 이량체보다 저해 활성이 높았다. (A): 사량체, (B): 이량체, (C): 단량체 처리. 저해제의 농도는 0.000000001㎍/㎖~ 0.01㎍/㎖로 시험하였다. 0.0001㎍/㎖는 3.3fM이다: 재조합 ProAL(ac)의 처리 없이 DNP-HSA에 의해서만 활성화됨.

<110> Unigen Co., Ltd. <120> Genes encoding ProAL protein with anti-allergic effect <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1041 <212> DNA <213> Aloe arborescens <400> 1 caaacatatg gcgaaacaga tgtcttcttc ttctcttatc ctctcatcac tgctcatctc 60 ccttgccata acactcgtcc tcggaaacga catcaatgtc cttctcaccg gtgaggttct 120 cggcaccgat agtcagctgc actatggagg tgcatccttc ataatgcagg gtgactgtaa 180 cttggtcctc tacaacggag gcagaggatt ccaatccaac acccacggca gaggcagtga 240 ctgtaggctc acactcaacg accagggcca gctcgtcatc tccaccggcg acagcctaat 300 tgtctggaaa tcccaactct ctgagagcaa tcctaacgga aagtatgctg ccgtgctccg 360 gccagatgga caggttgcag tctacggccc catgatctgg tcgattccac cactagatat 420 gagcagtagc tcccatgatg cttggctcgc aaacatgctc cctagggtga tgaacgtgtt 480 gttctcgtcc cagactctct acaacaacgg ggagctggcg acgagggact acagcttcat 540 catgcaggat gactgcaacc tggttctcaa gaaagcttca tcatacaaca acgtgttatg 600 gcagtctcag accgcaggca acggtcagca ctgcttccta aggctggacc acaaaggcca 660 gctgagagtt ttggacgacg aatacaacac cgtctggctc agcggtgctg taggagacag 720 agttggggag tacgtgctca tcatgcagct cgatggacgg gctgccgtct atggtcctat 780 cgtctggtcc actgaacaac tgaacaacaa ttttggccaa ctgctcaagc cctctgcctg 840 aatgaaatat ttatgcttat tagtctccag tttgaacgta taataataag tcggtccgtg 900 ccgtcttaca tgtgtaatta attagtattg tactgtaatg ttactttgca tggcaaagtt 960 gttttatttc tatatgaaat aaaagacgtc gctggagata cttttgtaat taaaaaaaaa 1020 caaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1041 <210> 2 <211> 1044 <212> DNA <213> Aloe arborescens <400> 2 caaacatatg gcgaaacaga tgtcttcttc ttctctcatc ctctcatcac tgctcatctc 60 ccttgccata acactcgtcc tcggaaacga catcaatgtc cttctcaccg gtgaggttct 120 cggcaccgat agtcagctgc actatggagg tgcgtccttc ataatgcagg gcgactgtaa 180 cttggtcctc tataacggag gcagaggttt ccaatccaac accaacggca gaggcaaaga 240 ctgcagcctc acactcaacg accagggcca gctcgttatc aacaacggcg atggccaaac 300 tgtctggaga tcccaactct ccgagagaac tcctaacgga aagtatgccg ccgtgctccg 360 gccagacgga caggtggcag tctacggccc catgatctgg tcgactccac gattagggac 420 gagcatcagc agctcacatg atgattggct caccaacatg cttcctatgg tgaggaacgt 480 gctgttctcg tcacagattc tctacagcaa cgcggagctg gcgacgaggg actacagctt 540 catcatgcag gatgactgca acctggctct caagaaagct tctcacaacg tggtatggca 600 gtctcaaacc gcaggcaacg gccagcactg cttcctaagg ctggaccata aaggccagct 660 gagagttttg gatgacgaat acaacaccgt ctggcgcagc gatgctgaag gagacagagt 720 tggggagtac gtgctcatca tgcaggtcga cggacgggct gccgtctatg gtcctatcgt 780 ctggtccact gaacaaccga acaacaattt tggccgactg ctcaagccct ctgcctgaat 840 gaaatatgta tgcttatttt attagtctcc agtttgaacg tattagtaag tcggtccgtg 900 ccgtcttaca tgtgtagttn tagttcgcat ctaattaacg cgtactgtac tgtactgtaa 960 tgtaactttg catggcaaag ttgtttaata tctaaatgaa ataaaagacg tcgctggaga 1020 tactttcaaa aaaaaaaaaa aaaa 1044 <210> 3 <211> 277 <212> PRT <213> Aloe arborescens <400> 3 Met Ala Lys Gln Met Ser Ser Ser Ser Leu Ile Leu Ser Ser Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ala Ile Thr Leu Val Leu Gly Asn Asp Ile Asn Val Leu 20 25 30 Leu Thr Gly Glu Val Leu Gly Thr Asp Ser Gln Leu His Tyr Gly Gly 35 40 45 Ala Ser Phe Ile Met Gln Gly Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asn Gly 50 55 60 Gly Arg Gly Phe Gln Ser Asn Thr His Gly Arg Gly Ser Asp Cys Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Asn Asp Gln Gly Gln Leu Val Ile Ser Thr Gly Asp Ser 85 90 95 Leu Ile Val Trp Lys Ser Gln Leu Ser Glu Ser Asn Pro Asn Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Ala Val Leu Arg Pro Asp Gly Gln Val Ala Val Tyr Gly Pro 115 120 125 Met Ile Trp Ser Ile Pro Pro Leu Asp Met Ser Ser Ser Ser His Asp 130 135 140 Ala Trp Leu Ala Asn Met Leu Pro Arg Val Met Asn Val Leu Phe Ser 145 150 155 160 Ser Gln Thr Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Leu Ala Thr Arg Asp Tyr Ser 165 170 175 Phe Ile Met Gln Asp Asp Cys Asn Leu Val Leu Lys Lys Ala Ser Ser 180 185 190 Tyr Asn Asn Val Leu Trp Gln Ser Gln Thr Ala Gly Asn Gly Gln His 195 200 205 Cys Phe Leu Arg Leu Asp His Lys Gly Gln Leu Arg Val Leu Asp Asp 210 215 220 Glu Tyr Asn Thr Val Trp Leu Ser Gly Ala Val Gly Asp Arg Val Gly 225 230 235 240 Glu Tyr Val Leu Ile Met Gln Leu Asp Gly Arg Ala Ala Val Tyr Gly 245 250 255 Pro Ile Val Trp Ser Thr Glu Gln Leu Asn Asn Asn Phe Gly Gln Leu 260 265 270 Leu Lys Pro Ser Ala 275 <210> 4 <211> 260 <212> PRT <213> Aloe arborescens <400> 4 Met Ala Lys Gln Met Ser Ser Ser Ser Leu Ile Leu Ser Ser Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ala Ile Thr Leu Val Leu Gly Asn Asp Ile Asn Val Leu 20 25 30 Leu Thr Gly Glu Val Leu Gly Thr Asp Ser Gln Leu His Tyr Gly Gly 35 40 45 Ala Ser Phe Ile Met Gln Gly Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asn Gly 50 55 60 Gly Arg Gly Phe Gln Ser Asn Thr Asn Gly Arg Gly Lys Asp Cys Ser 65 70 75 80 Leu Thr Leu Asn Asp Gln Gly Gln Leu Val Ile Asn Asn Gly Asp Gly 85 90 95 Gln Thr Val Trp Arg Ser Gln Leu Ser Glu Arg Thr Pro Asn Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Ala Val Leu Arg Pro Asp Gly Gln Val Ala Val Tyr Gly Pro 115 120 125 Met Ile Trp Ser Thr Pro Arg Leu Gly Thr Ser Ile Ser Ser Ser His 130 135 140 Asp Asp Trp Leu Thr Asn Met Leu Pro Met Val Arg Asn Val Leu Phe 145 150 155 160 Ser Ser Gln Ile Leu Tyr Ser Asn Ala Glu Leu Ala Thr Arg Asp Tyr 165 170 175 Ser Phe Ile Met Gln Asp Asp Cys Asn Leu Ala Leu Lys Lys Ala Ser 180 185 190 His Asn Val Val Trp Gln Ser Gln Thr Ala Gly Asn Gly Gln His Cys 195 200 205 Phe Leu Arg Leu Asp His Lys Gly Gln Leu Arg Val Leu Val Gly Glu 210 215 220 Tyr Val Leu Ile Met Gln Val Asp Gly Arg Ala Ala Val Tyr Gly Pro 225 230 235 240 Ile Val Trp Ser Thr Glu Gln Pro Asn Asn Asn Phe Gly Arg Leu Leu 245 250 255 Lys Pro Ser Ala 260 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgcaaggcg actgcaactt ggt 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 macytcsccs gtmarmarma c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 catatggcga aacagatgtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gttctcggca ccgatagtca 20

Claims

서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 ProAL A(protein gene of aloe A) 단백질.
삭제
제1항에 있어서, 상기 ProAL A가 알로에 유래인 것을 특징으로 하는 단백질.
제1항의 ProAL A 단백질을 코딩하는 유전자.
삭제
제4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
삭제
제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제8항에 있어서, 상기 벡터는 도 3에 기재된 재조합 벡터.
삭제
제8항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제11항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
삭제