KR101012325B1

KR101012325B1 - 알파-히드록시산 또는 베타-디케톤을 포함하는 용액에서글루코스의 검출방법

Info

Publication number: KR101012325B1
Application number: KR1020047014463A
Authority: KR
Inventors: 다닐로프조지와이.; 칼리브레테노스아리스토틀쥐.; 니콜라이트치크알렉산더브이.
Original assignee: 센서즈 포 메드슨 앤드 사이언스 인코포레이티드
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2011-02-08
Anticipated expiration: 2023-03-14
Also published as: WO2003078424A1; CA2478979A1; CA2478979C; AU2003220293A1; US20030082663A1; US6800451B2; EP1490359B1; AU2003220293B2; KR20040091138A; MXPA04008931A; BR0308412A; US20050043275A1; EP1490359A1; US7078554B2; JP4431398B2; EP1490359A4; JP2005530130A

Abstract

본 발명은 알파-히드록시산 또는 베타-디케톤과 같은 잠재적인 간섭 화합물을 포함할 수 있는 시료 내 글루코스의 존부 또는 농도를 결정하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 글루코스에 대한 둘 이상의 인식 요소를 갖는 화합물을 이용하는데, 상기 화합물은, 상기 화합물과 글루코스 간의 상호작용이 알파-히드록시산 또는 베타-디케톤과 화합물 간의 상호작용보다 안정하도록 배향되어 있음으로써, 알파-히드록시산 또는 베타-디케톤의 존재가 상기 결정을 실질적으로 방해하지 않는다.

Description

알파-히드록시산 또는 베타-디케톤을 포함하는 용액에서 글루코스의 검출방법 {Detection of glucose in solutions also containing an alpha-hydroxy acid or a beta-diketone}

본 발명은 미국 출원번호 10/029,184호(출원일: 2001년 12월 28일, 미국 출원번호 09/754,217호(출원일: 2001년 1월 5일)의 부분계속출원임)의 부분계속출원으로서, 미국 출원번호 60/363,885(출원일: 2002년 3월 14일), 미국 출원번호 60/329,746(출원일: 2001년 10월 18일) 및 미국 출원번호 60/269,887(출원일: 2001년 2월 21일)의 우선권을 주장한다.

본 발명은 α-히드록시산 또는 β-디케톤과 같은 잠재적인 간섭 화합물을 포함할 수 있는 시료 내 글루코스의 검출에 관한 것이다.

글루코스를 포함하는 탄수화물과 페닐보론산과의 결합반응(complexation)은 오래 전부터 알려져 왔으며, 상기 상호작용의 가역성은 당류의 크로마토그래피 분리를 위한 기준으로서 작용되어 왔다.

구체적으로는, 1959년에 로랜드(Lorand) 및 에드워드(Edwards)는 다양한 포화 폴리올류와 페닐보론산의 수계 결합반응시 결합상수; 매우 약한 범위(예를 들어 에틸렌 글리콜, K_d=360 mM)에서 적절히 강한 범위(예를 들어, 글루코스, Kd=9.1 mM)의 결합 상호작용을 보고하였다(참조 문헌: J. Yoon, et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry 1(4): 267-71 (1993)). 상기 결합 메카니즘은 보로네이트 부분의 히드록실기에 글루코스의 이웃자리 히드록실기가 결합함으로써 발생한다고 여겨진다.

미국특허 5,503,770호에는, 글루코스를 포함하는 사카라이드에 결합시 높은 강도의 형광을 방출하는 형광성 보론산-함유 화합물이 개시되어 있다. 상기 형광성 화합물은 형광 발생단, 적어도 하나의 페닐보론산 부분 및 적어도 하나의 아민-제공 질소원자를 포함하는 분자 구조를 가지며, 상기 질소 원자는 페닐 보론산 부분의 이웃자리에 위치하여 상기 보론산과 분자내부적으로 상호작용을 하게 된다. 상기 상호작용으로 인해 상기 화합물은 사카라이드 결합시 형광을 방출하게 된다. 참조(T. James, et al., J. Am. Chem. Soc. 117(35): 8982-87 (1995)).

부가적으로, 혈액 내 글루코스를 검출하기 위하여 안트릴보론산-함유 화합물을 사용하는 형광성 센서는 종래 기술에 알려져 있다. 예를 들어 문헌(J. Yoon, et al., J. Am. Chem. 114:5874-5875(1992))에는 글루코스와 프럭토스의 결합을 포함하는 탄수화물 결합을 신호화하기 위한 형광성 화학센서로서 안트릴보론산을 사용할 수 있다.

불행하게도, 상술한 방법으로 글루코스와 상호작용하는 화합물은 히드록실기를 갖는 다른 화합물과 상호작용하는 경향도 가지므로 글루코스의 분석시험의 특이 성을 감소시키게 되며, 특히 간섭가능한 함량의 락테이트, 아세토아세테이트 등을 포함하는 생리적 시료를 분석하는 경우 상기 특이성이 감소된다. 예를 들어 일부 당뇨병 환자들에게 혈액내 젖산 수준이 5mmol/리터 이상의 상태가 되는 젖산증(lactic acidosis)이 발현된다.

본 발명의 한 태양에 따르면, 본 발명은 α-히드록시산 또는 β-디케톤을 포함할 수 있는 시료에서 글루코스의 존부 또는 농도를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 검출 방법은,

a) 글루코스에 대한 둘 이상의 인식 요소를 갖는 화합물에 시료를 노출시키는 단계로서, 상기 화합물과 글루코스 간의 상호작용이 α-히드록시산 또는 β-디케톤과 화합물 간의 상호작용보다 안정하도록 배향되어 있고, 상기 화합물은 또한, 상기 화합물이 상기 시료 내 글루코스에 노출될 때 농도-의존적 방법으로 변화하는 검출가능 특성을 갖는 검출가능 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및

b) 상기 검출가능 특성의 변화를 측정함으로써 상기 시료 내 글루코스의 존부 및 농도를 결정하는 단계로서, α-히드록시산 또는 β-디케톤의 존재가 상기 결정을 실질적으로 방해하지 않는 것을 특징으로 하는 단계를 포함한다.

다른 태양에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 화합물을 제공한다:

상기 식 중,

-R₁ 및 R₂는 동일 또는 상이하며, i)수소, ii)R₈ 부분의 가수분해 안정성 및 pKa를 변경하는 치환기, iii)검출가능 부분, 또는 iv)고체 지지체 또는 폴리머 매트릭스에 부착할 수 있는 연결기로서, 상기 지지체 또는 매트릭스는 검출가능 부분을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 연결기로부터 선택되며,

-R₃는 수소, 또는 고체 지지체 또는 폴리머 매트릭스에 부착할 수 있는 연결기로서, 상기 지지체 또는 매트릭스는 검출가능 부분을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 연결기를 나타내며;

-R₄ 및 R₅는 동일 또는 상이하며, i)수소, ii)R₈ 부분의 가수분해 안정성 및 pKa를 변경하는 치환기, iii)검출가능 부분, 또는 iv)고체 지지체 또는 폴리머 매트릭스에 부착할 수 있는 연결기로서, 상기 지지체 또는 매트릭스는 검출가능 부분을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 연결기로부터 선택되며;

-각 Z는 독립적으로 탄소 또는 질소를 나타내고;

-R₆ 및 R₇는 동일 또는 상이하며, i)0 내지 10의 연속된 또는 분지된 탄소 및/또는 이종원자를 갖는 연결기, 또는 ii)고체 지지체 또는 폴리머 매트릭스에 부착할 수 있는 연결기로서, 상기 지지체 또는 매트릭스는 검출가능 부분을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 연결기를 나타내며;

-R은 i)탄소, 산소, 질소, 황, 및 인으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 내지 10의 연속된 원자를 포함하는 지방족 및/또는 방향족 스페이서, ii)검출가능 부분, 또는 iii)고체 지지체 또는 폴리머 매트릭스에 부착할 수 있는 연결기로서, 상기 지지체 또는 매트릭스는 검출가능 부분을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 연결기로부터 선택되며;

-각 R₈는 동일 또는 상이하며, 보호해제되는 경우 글루코스 내 존재하는 이웃자리(vicinal) 디올기와 상호작용이 가능한, 선택적으로 보호된 부분을 나타내며;

-R₉ 및 R₁₀는 동일 또는 상이하며, i)수소, ii)검출가능 부분, 또는 iii) a)고체 지지체 또는 폴리머 매트릭스에 부착할 수 있는 연결기로서, 상기 지지체 또는 매트릭스는 검출가능 부분을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 연결기, 그리고/또는 b)상기 화합물의 물리적 성질을 변경할 수 있는 작용기를 포함하는 작용기를 나타내며;

단, 인디케이터 화합물은, 직접 또는 고체 지지체나 폴리머 지지체의 일부로써 결합된 하나 이상의 검출가능 부분을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 상기한 화합물을 포함하는 검출 시스템에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

한 구현예에서, 본 발명은 α-히드록시산 또는 β-디케톤과 같은 간섭 화합물을 포함할 수 있는 시료 내 글루코스 존부 및 농도를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 상기 잠재적인 간섭 화합물에는, 락테이트, 아세토아세테이트, β-히드록시 부티르산 등이 포함된다.

본 발명은, 샘플 내 글루코스는 인식할 수 있지만, 샘플 내 간섭 화합물은 잘 인식하지 못하는 인디케이터 화합물을 사용하여 수행한다. 상기 인디케이터 화합물은 둘 이상의 글루코스 인식 요소를 가지며, 인디케이터 화합물과 간섭 화합물간의 상호작용보다, 글루코스와 인디케이터 화합물 간의 상호작용이 더 안정하도록 배향된다.

적절한 인식 요소는, 글루코스와, 특히 글루코스 내 존재하는 디올기와 바람직하게는 가역 상호작용이 가능한 부분을 포함하는 것들이다. 몇 가지 인식 요소들이 공지되어 있는데, 바람직하게는, 보론산, 보로네이트 이온, 아비산, 아비산염 이온, 텔루르산, 텔루레이트 이온, 게르만산, 게르마네이트 이온 등이 포함된다. 가장 바람직한 인식 요소는 보론을 포함하는 것이다. 사용시까지 인식 요소는 보호기로 캡핑할 수 있음을 알 수 있다. 상기 보호기는 주지되어 있으며, 네오펜틸 글리콜, 피나콜 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 캡핑된 인식 요소는 상기 화합물이 사용될 매질 내에서 캡핑을 없앤다(예를 들어 실시예 5 참조).

인디케이터 화합물 상에서 상기 인식 요소들은, 바람직하게는 서로 적절한 거리로 이격되어서, 인식 요소 중 둘 이상이 글루코스 분자와 상호작용이 가능하도록 함으로써 특이성을 증가시키는 결과를 얻는다. 일반적으로, 인식요소들은 약 30 원자 이하의 거리를 두고 떨어져 있을 수 있다. 바람직하게는, 인식 요소들은, 글루코스와의 상호작용시에 약 6Å 정도 이격될 수 있도록 배향된다.

본 발명의 인디케이터 화합물은, 글루코스를 포함하는 시료에 상기 화합물이 노출될 때 농도-의존적으로 변하는 검출가능 특성을 갖는다. 그러한 특성들은 다수 공지되어 있으며, 본 발명에 이용할 수 있다. 예를 들어, 인디케이터 화합물은, 발광성(형광성 또는 인광성) 또는 화학발광성 부분, 흡광계 부분 등을 포함할 수 있다. 인디케이터 화합물은, 글루코스와 상호작용시에 검출가능한 변화가 생길 수 있도록 각각 이격된, 에너지 공여 부분 및 에너지 수여 부분을 포함할 수 있다. 인디케이터 화합물은, 글루코스 부재시 형광발색단이 소광자에 의해 소광되는 구조를 갖는 형광발색단 및 소광자(quencher)를 포함할 수 있다. 상기 경우, 글루코스가 존재할 때는, 인디케이터가 구조적 변화를 겪음으로써 소광자가 형광발색단으로부터 충분한 거리를 두고 떨어지게 되고 따라서 형광이 방출된다. 반대로, 글루코스 부재시에는, 형광발색단 및 소광자가 충분히 떨어져서 형광발색단이 형광을 방출하다가, 글루코스와 상호작용시에는 형광발색단 및 소광자가 충분히 근접하게 이동함으로써 소광을 일으키는 구조일 수 있다. 상기 구조적 변화의 개념은, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는, 2001년 1월 5일자로 출원된, 본 출원인의 동시계류중인 출원 제 09/754,219 호, "Detection of Analytes"에 더욱 상세히 기재되어 있다.

선택적으로, 인디케이터는, 인식 요소와, 또는 인식 요소에 대하여 떨어진 위치에 있는 다른 부분과 상호작용이 가능한 형광발색단과 같은 부분을 포함함으로써, 글루코스 부재시에 형광발색단은 형광을 방출하게 된다. 글루코스를 첨가하면, 글루코스는, 인식 요소와 형광발색단 간의 상호작용, 또는 인식 요소에 대하여 떨어진 위치에 있는 다른 부분과 형광발색단 간의 상호작용과 경쟁하게 됨으로써 형광이 감소한다. 상기 개념의 예는 실시예 6에 설명되어 있다. 또한, 글루코스 부재 하에서, 인식 요소, 또는 인식 요소에 대하여 떨어진 위치에 있는 다른 부분과 형광발색단이 상호작용할 때, 형광발색단이 형광을 방출하지 않거나, 또는 비교적 낮은 수준의 형광을 방출하도록 인디케이터를 선택할 수도 있음을 알 수 있다. 글루코스를 첨가하면, 글루코스는, 인식 요소와 형광발색단 간의 상호작용, 또는 인식 요소에 대하여 떨어진 위치에 있는 다른 부분과 형광발색단 간의 상호작용과 경쟁하게 됨으로써 형광이 증가한다.

기타의 검출가능 부분은, 그 형광성이, 광유도 전자 이동 또는 유도 효과를 통한 글루코스 상호작용에 의하여 영향을 받는 것들을 포함한다. 여기에는, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는, 1999년 3월 11자로 출원된 동시계류 중인 미국 출원 제 09/265,979호(PCT 국제출원 WO 99/46600, 1999년 9월 16일)에 개시된 란탄계열 킬레이트; 다방향족(polyaromatic) 탄화수소 및 그 유도체; 쿠마린; BoDiPy; 단실; 카테콜; 등이 포함된다. 또 다른 부분 종류로는, Alizarin Red를 포함하여, 글루코스와 인디케이터 화합물의 상호 작용시 흡광 스펙트럼이 변화하는 것 등을 포함할 수 있다. 또 다른 종류의 부분으로는, 예를 들어, 단실/답실 등과 같은 에너지 공여체/수여체 짝과 같이, 근접 효과에 의하여 형광이 조절되는 것들을 포함한다.

바람직하게는, 검출가능 특성은, 예를 들면, 흡광 특성 변화(예를 들어, 흡광도 및/또는 스펙트럼 이동), 형광 붕괴 시간(시간 영역 또는 주파수 영역 측정에 의해 결정), 형광 강도, 형광 이방성 또는 극성의 변화; 방출 스펙트럼의 스펙트럼 이동; 시분할 이방성 붕괴 변화(시간 영역 또는 주파수 영역 측정에 의해 결정) 등과 같은, 검출가능 스펙트럼 변화이다.

본 발명의 인디케이터 화합물은, 가용성이라면, 원하는 경우 용액에 직접 사용할 수도 있다. 한편, 원하는 적용시 요구되는 경우라면, 인디케이터 화합물을, 유리, 플라스틱, 폴리머 물질 등과 같은 불용성 표면 또는 매트릭스 상에 또는 내부에 고정화(기계적 포집, 또는 공유 결합, 또는 이온결합) 할 수도 있다. 인디케이터 화합물이, 예를 들어 다른 폴리머 내에 포집된다면, 그 포집 물질은 바람직하게는 글루코스에 충분히 투과성이어서 글루코스와 인디케이터 화합물 간의 적절한 상호작용이 가능할 수 있어야 한다.

만약 인디케이터 화합물이 수용성이 낮거나 수불용성임에도 불구하고 수계 매질 내에서의 검출을 원할 경우에는, 인디케이터 화합물은 친수성 모노머와 공중합되어서 친수성 거대분자를 형성할 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는 2000년 8월 4일에 출원된 동시계류 미국 출원 제 09/632,624 호에 기재되어 있다.

바람직한 인디케이터 화합물은 하기 구조식을 갖는다.

상기 식 중;

-각 Z는 독립적으로 탄소 또는 질소를 나타내고;

R₈ 부분의 pKa 및 가수분해 안정성을 변경하는 적절한 작용기는, 당업자에게 명백하며, 할로겐; 니트로; 아미노; 할로겐으로 치환된 알킬; 선택적으로 치환된 카르복실; 아실; 케토; 니트릴; 아미드; 에스테르; 알콕시; 등과 같은 작용기를 포함한다.

어떠한 치환기에 대한 적절한 연결기는, 약 1 내지 약 20의 연속된 원자로부터의 작용기를 포함할 수 있는데, 이는 분지되거나 치환될 수 있고 하나 이상의 이종원자를 포함할 수 있으며, 폴리머 또는 지지체에 더 부착하거나 반응할 수 있는 작용기로 종결된다. 적절한 연결기의 예로는, 알킬; 아릴; 아실; 폴리아미드; 폴리에테르; 이들의 선택적 치환체, 및 이들의 조합을 포함한다.

R₉ 및 R₁₀은 용해도, pKa, 등과 같은 화합물의 물리적 성질을 변경할 수 있는 작용기를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 선택적으로 치환된 카르복실레이트, 아미노기, 4차 암모늄기, 설포네이트, PEG, 등이 포함된다.

치환기 중 일부가 검출가능 부분일 때, 인디케이터 화합물의 나머지와 검출가능 부분을 연결하는 적절한 연결기를 포함할 수도 있다는 것을 알 수 있다. 적절한 연결기는 상기 나열된 것들을 포함한다. 적절한 검출가능 부분은 상기 정의된 것들을 포함한다.

R₈은 바람직하게는, 보론산, 보로네이트 이온, 아비산, 아비산염, 텔루르산, 텔루레이트 이온, 게르만산, 게르마네이트 이온 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

상기 정의로부터, 본 발명의 화합물과 검출 시스템은 폴리머 형태일 수 있다 는 것이 이해될 것이다. 따라서, 온전한 화합물(인식 요소 및 검출가능 부분을 포함하는)을 존재하는 폴리머로 연결할 수도 있고, 또는 모노머 형태의 온전한 화합물을, 다른 적절한 모노머와 중합하거나 공중합하여 폴리머를 형성할 수 있다. 선택적으로, 두 개의 별도의 모노머 성분(예를 들어, 하나는 인식 요소를 포함하고, 하나는 검출 가능 부분을 포함)을 공중합함으로써, 생성된 폴리머에는 시스템의 모든 필수 요소를 포함하게 할 수 있다(실시예 6 참조)

에너지, 의약 및 농업 분야에서의 인디케이터로서의 사용을 포함하여, 본 발명의 인디케이터 화합물에 대하여 많은 이용이 가능하다. 예를 들어, 본 인디케이터 화합물은, 혈액, 혈장, 혈청, 간질액, 뇌척수액, 소변, 타액, 안구액, 림프, 누액, 또는 땀과 같은 생리 완충액 또는 생리액 내의 글루코스의 하위 레벨 또는 상위 레벨을 검출하는데 이용할 수 있으며, 따라서 당뇨 및 아드레날린 결핍(adrenal insufficiency)과 같은 질환의 진단 및 모니터링을 위한 가치있는 정보를 제공한다.

인간 치료적 적용을 위한 글루코스의 의학/약제학적 생산은 모니터링과 제어를 요구한다.

농업 분야에서의 본 발명의 이용은, 콩 및 기타 농업 생산물 내의 글루코스 레벨을 검출하는 것을 포함한다. 포도주 포도처럼 고가의 생산물에 대한 중요한 수확 결정에 있어서, 글루코스는 주의깊게 모니터링해야 한다. 발효 공정에 있어서, 글루코스는 가장 고가의 탄소원이자 공급원료이기 때문에, 최적의 반응기 공급 속도 제어를 위한 글루코스 모니터링은 강력한 알콜 생산에 있어서 중요하다. 반 응기 혼합과 글루코스 농도의 제어는 또한, 국제적으로 많은 양의 글루코스와 발효성(인접자리 디올) 당을 소모하는 소프트 드링크 및 발효 음료의 생산시, 품질 제어에 있어서 매우 중요하다.

인디케이터 화합물이 형광성 인디케이터 치환기를 포함하는 경우, 다양한 검출 기술이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 형광 감지 기기(예를 들어, 미국 특허 제 5,517,313 호)에 사용될 수 있으며, 또는 육안 검사를 위한 테스트 종이와 같은 폴리머 물질에 결합될 수 있다. 후자의 기술은, 예를 들면, 가느다란 리트머스 종이로써 pH를 측정하는 것과 유사한 방법으로 글루코스의 측정을 가능하게 한다. 본 명세서에 기술된 화합물은 또한, Shimadzu, Hitachi, Jasco, Beckman 외에 의해 만들어진 형광분광계 또는 임상 분석기와 같은 표준 벤치탑 분석 장치에 단순 시약으로 이용할 수도 있다. 상기 분자는 또한, Ocean Optics (Dunedin, Florida), 또는 Oriel Optics에 의해 만들어진 광섬유계 센서 및 분석 형광계에 이용되는, 분석물 특이적 화학/광학 신호 변환을 제공한다.

본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국 특허 제 5,517,313 호는, 액체 매질 내의 글루코스 존부 또는 농도를 측정하기 위하여 본 발명의 화합물을 이용할 수 있는 형광 감지 장치를 기재하고 있다. 감지 장치는, 적층된 형광 인디케이터 분자-함유 매트릭스(이하 "형광 매트릭스"라 칭함), 고역 통과 필터 및 광검출기를 포함한다. 이 장치에서, 인디케이터 물질 내에, 또는 인디케이터 매트릭스가 위에 위치하는 도파관 내에, 적어도 부분적으로, 광원, 바람직하게는, 발광 다이오드("LED")가 위치함으로써, 광원으로부터의 입사광으로 인하여 인디케이터 분 자에 형광이 생기게 된다. 고역 통과 필터는, 광원으로부터의 분산된 입사광을 걸러내면서, 방출된 빛이 광검출기에 도달하도록 한다. 미국 특허 제 5,517,313 호에 기재된 장치에 채용된 인디케이터 분자의 형광은, 글루코스의 국지적인 존재에 의하여, 예를 들어, 감쇠 또는 증강으로 조절된다.

미국 특허 제 5,517,313 호에 기재된 센서에서는, 인디케이터 분자를 포함하는 물질이 분석물에 대하여 투과성이다. 따라서, 분석물은 주위의 테스트 매질로부터 상기 물질 내로 확산될 수 있으며, 따라서, 인디케이터 화합물에 의하여 방출되는 형광에 영향을 줄 수 있다. 광원, 인디케이터 화합물-함유 물질, 고역 통과 필터 및 광검출기는, 인디케이터 화합물에 의해 방출된 형광의 적어도 일부가 광검출기에 영향을 줌으로써 주위 매질 내의 글루코스 농도를 나타내는 전기적 신호를 발생시킬 수 있도록 구성된다.

본 발명의 인디케이터 화합물을 이용하는 가능한 기타의 구현예에 따르면, 감지 장치는 본 명세서에 참고문헌으로써 포함된 미국 특허 제 5,910,661 호, 제 5,917,605 호 및 제 5,894,351 호에도 기재되어 있다.

본 발명의 화합물은 또한, 예를 들면 생체 내 혈당 레벨을 계속적으로 모니터링하기 위한 이식용 기기 내에 사용될 수도 있다. 적절한 장치는, 예를 들면, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는, 1999년 8월 26일에 출원된 동시 계류중인 미국 특허 출원 제 09/383,148 호 뿐만 아니라, 미국 특허 제 5,833,603 호, 제 6,002,954 호 및 제 6,011,984 호에도 기재되어 있다.

본 발명의 화합물은, 예를 들면, 하기하는 일반적인 과정과 일치하는 반응 메카니즘을 포함하여, 공지된 반응 메카니즘 및 시약을 이용하여, 많은 시행착오 없이도 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.

도 1은 실시예 1에 기재된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 420nm)을 나타낸 것이다.

도 2는 실시예 2에 기재된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 428nm)을 나타낸 것이다.

도 3는 실시예 3에 기재된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 428nm)을 나타낸 것이다.

도 4는 실시예 4에 기재된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 427nm)을 나타낸 것이다.

도 5는 실시예 5에 기재된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 540nm)을 나타낸 것이다.

도 6는 실시예 6에 기재된 인디케이터의 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 7-8은 실시예 6에 기재된 인디케이터의 흡광비(450nm/530nm)를 나타낸 것이다.

도 9는 실시예 6에 기재된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 550nm)을 나타낸 것이다.

도 10은 글루코스 부재시 및 100mM의 글루코스 존재시, 실시예 6에 기재된 인디케이터의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 11은 글루코스 및 락테이트의 존재시, 실시예 6에 기재된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 550nm)을 나타낸 것이다.

도 12은 실시예 10에 기재된 글루코스에 노출된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 525nm)을 나타낸 것이다.

도 13은 실시예 10에 기재된 락테이트에 노출된 인디케이터의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 530nm)을 나타낸 것이다.

도 14는 실시예 11에 기재된 글루코스 및 락테이트에 노출된 인디케이터의 상대적 형광 방출(I @ 430nm)을 나타낸 것이다.

도 15는 실시예 12에 기재된 글루코스 및 락테이트에 노출된 인디케이터의 상대적 형광 방출(I @ 430nm)을 나타낸 것이다.

도 16은 실시예 13에 기재된 글루코스 및 락테이트에 노출된 인디케이터의 형광도를 나타낸 것이다.

실시예 1

안트라센 유도체 및 MAPTAC의 수용성 코폴리머

I. 수용성 폴리머에 공중합된 모노-보로네이트-안트라센 인디케이터의 합성:

A. 9-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센

0℃의 CHCl₃ 250 mL 중의 N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 염산염(11.82 g, 66.0 mmol, 3.0 eq) 및 DBMP(억제제로서 10 mg)의 현탁액에 DIEA(18.5 g, 25.0 mL, 144 mmole, 6.5 eq)를 20 분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 25℃로 데운 다음 0℃로 다시 냉각하였다. 냉각된 그 혼합물에 CHCl₃(100 mL) 중의 9-클로로메틸안트라센(5.0 g, 22 mmole)의 용액을 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 25℃에서 1 시간동안, 50℃에서 12 시간동안, 그리고 70℃에서 2 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 물 4 x 60 mL로 세척하고, 그 합한 수층을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 데칸테이션 한 다음, 진공에서 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 크로마토그래피(플래시 실리카겔, 2-5% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 고체 생성물 2.44 g(33%)을 수득하였다.

TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, 90/10 CH₂Cl₂/CH₃0H 로 Rf 0.29, UV(254/366), 닌히드린 염색으로 관찰

B. 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센

0℃의 CHCl₃ 200 mL 중의 9-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센(2.44 g, 7.34 mmol) 및 DBMP(억제제로서 10 mg)의 현택액에 DIEA(2.85 g, 3.84 mL, 22.0 mmole, 3.0 eq)를 10 분에 걸쳐 나누어 가한 다음, 30 분에 걸쳐 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(2.49 g, 8.81 mmole, 1.2 eq)의 용액을 30 분에 걸쳐 적가하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 25℃에서 20 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 물로 세척하고, 그 합한 수성층을 CH₂Cl₂로 추출하였 다. 합한 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 데칸테이션 한 다음, 진공에서 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 크로마토그래피(플래시 실리카겔, 2-5% CH₃OH/CH₂Cl ₂)로 정제하여 연한 황색의 결정성 고체 2.50 g(76%)을 수득하였다.

Mp: 72-73℃

TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, 90/10 CH₂Cl₂/CH₃0H 로 Rf 0.36, UV(254/366), 닌히드린 염색으로 관찰

C. 9-[N-[2-(5,5-디메틸-보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센 및 MAPTAC(1:20 몰비)의 수용성 코폴리머

에틸렌 글리콜 1.5 mL 중의 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)-벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센(0.0490 g, 0.105 mmole) 및 [3-(메타크릴아미도)프로필]트리메틸암모늄 클로라이드(MAPTAC, 50 중량% 수용액, 0.90 mL, 2.1 mmole, 20 eq.)의 용액에 4,4'-아조비스(시아노발레르산)(0.008 g, 0.03 mmole, 총 모노머 1.4 mmole%)를 부가하였다. 그 용액을 아르곤 기체로 5 분간 퍼지한 다음, 암소에서 18 시간동안 60℃로 가열하였다. 그런 다음, 그 점성의 용액을 25℃로 냉각하고, 물 5 mL로 희석한 다음, 셀룰로오스 아세테이트 막(MWCO 3500)을 통해 물 3 x 4 L에 대해서 투석하였다. 그 투석된 물질을 농축하여 건조시켜 황색의 투명한 고체 0.339 g(68%)를 수득하였다.

Ⅱ. 글루코스 및 락테이트를 이용한 형광의 조절

이 실시예에서 제조된 코폴리머(하나의 인식 요소를 포함)의 글루코스 및 락 테이트에 의한 형광 조절을 결정하였다. 도 1은 a) 0-20 mM 글루코스; b) 0-20 mM 락테이트를 함유하는 PBS 중의 코폴리머 0.5 mg/mL 용액(1:20 몰비)의 표준화된 형광 방출을 나타낸다. 스펙트럼을 여기 365 nm; 여기 슬릿(slit) 1.5 nm; 여기 슬릿 5 nm; 주위온도로 하여 Shimadzu RF-5301 형광분광계(spectrafluorometer)를 이용하여 기록하였다. 오차 바(error bar)는 각 점에서의 이중 값의 표준편차이다. 코폴리머의 형광은 글루코스 및 락테이트의 존재에 의해 영향을 받는다.

실시예 2

수용성 폴리머에 공유결합된 비스-보로네이트-인디케이터의 글루코스에 의한 조절 및 잠재적 생리적 간섭인자(interferences)

I. 비스-보로네이트-안트라센 인디케이터의 단일-메타크릴레이트 모노머의 합성

A. 9,10-비스[[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센

23℃의 CHCl₃ 40 mL 중의 2-(2-아미노에톡시)에탄올(31.4 g, 30.0 mL, 299 mmole, 20.09 eq.)의 용액에 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(3.94 g, 14.3 mmole) 을 가하였다. 그 용액을 암소에서 67 시간동안 교반하였다. 그런 다음, CH₂Cl₂ 100 mL를 가하고 NaHCO₃(포화 수용액) 1 x 50 mL 및 2 x 100 mL로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 농축하여 황색 분말 4.67 g(79%)를 수득하였다. 생성물(RP-HPLC에 의해 ~ 85% 순도)을 다음 단계에서 사용하였다.

HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 15.6 분.

B. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센

23℃의 CHCl₃ 125 mL 중의 9,10-비스[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센(4.02 g, 9.75 mmole), DIEA(12.6 g, 17.0 mL, 97.5 mmole, 10.0 eq), 및 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(13.7 g, 48 mmole, 4.9 eq.)의 용액을 암소에서 46 분간 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 회전 증발법에 의해 처음으로 농축하고, 진공 펌프를 이용하여 DIEA를 제거하였다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(활성화된 중성 알루미나 150 g, 0-3% CH₃OH/CH₂Cl ₂)로 정제하여, 정치 시 고형화되는 점성 오일 5.67 g(70%)를 수득하였다. 생성물(RP-HPLC에 의해 ~ 85% 순도)을 다음 단계에서 사용하였다.

TLC: Merck 염기성 알루미나 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.33, UV(254/366)로 관찰.

HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 18.8 분.

C. 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)에틸아미노]메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센. (단일-메타크릴레이트 모노머)

23℃의 CH₂Cl₂ 15 mL 중의 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센(0.298 g, 0.359 mmole, 9.84 eq.), DCC(0.965 g, 4.68 mmole, 13.0 eq.), 및 N,N-디메틸아미노피리딘(0.020 g, 0.16 mmole, 0.46 eq.)의 용액을 암소에서 4 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 여과하고 회전 증발법으로 농축하였다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크 로마토그래피(활성화된 중성 알루미나 50 g, 0-4% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여, 황색 고체 0.150 g(47%)을 수득하였다.

FAB MS: C₅₂H₆₆B₂N₂O₉에 대한 계산치 [M] ⁺ 885; 관측치 [M+1]⁺ 886.

TLC: Merck 염기성 알루미나 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.45, UV(254/366)로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 21 분.

D. 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)에틸아미노]메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센 및 TMAMA의 수용성 코폴리머(1:50 몰비)

물 600 mL 중의 [2-(메타크릴옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드(TMAMA, 70 중량% 수용액, 0.344 g 모노머, 1.66 mmole, 50 eq.) 용액에 MeOH 3.00 mL 중의 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)에틸아미노]메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센(0.0024 g, 0.0033 mmole)을 부가하였다. 이 혼합물에 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.0075 g, 0.027 mmole, 총 모노머 1.6 mole%)를 부가하였다. 그 용액을 0.45 μ 멤브레인 필터를 통해 여과하고, 질소 기체로 퍼지한 다 음, 55℃의 암소에서 16 시간동안 가열하였다. 그런 다음, 그 점성의 용액을 25℃로 냉각하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 물 20 mL로 희석하고 0.2 μ 멤브레인 필터를 통해 여과하였다 그 폴리머 용액을 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인(MWCO 3500)을 통해 물 2 x 4 L에 대해서 투석하였다. 투석으로부터 폴리머 용액 38.5 mL를 획득하였다. 이 용액의 일부를 농축 건조한 결과, 용액 1.0 mL 당 0.0075 g 폴리머가 생성되었다. 모두 0.289 g(77%)의 폴리머를 수득하였다.

Ⅱ. 글루코스, 락테이트, 및 아세토아세테이트를 이용한 형광의 조절

글루코스, 락테이트, 및 아세토아세테이트에 의한, 이 실시예에서 제조된 코폴리머(2 개의 인식 요소를 포함)의 형광 조절을 결정하였다. 도 2는 a) 0-20 mM 글루코스; b) 0-20 mM 락테이트; c) 0-20 mM 리튬 아세토아세테이트를 함유하는 PBS 중의 안트라센 비스 보로네이트-TMAMA 코폴리머 1.5 mg/mL 용액(1:50 몰비)의 표준화된 형광 방출을 나타낸다. 스펙트럼을 여기 365 nm; 여기 슬릿(slit) 1.5 nm; 방출 슬릿 1.5 nm; 주위온도로 하여 Shimadzu RF-5301 형광분광계를 이용하여 기록하였다. 코폴리머의 형광은 글루코스의 존재에 의해 영향을 받았지만, 락테이트 또는 아세토아세테이트의 존재에 의해서는 영향을 받지 않았다.

실시예 3

비스-보로네이트-안트라센 인디케이터의 형광에 대한 글루코스의 용량 의존적 효과에 대한 용액 중의 락테이트의 효과

A. 9,10-비스[[2-(t-부톡시카보닐)에틸아미노]메틸]안트라센

23℃의 CHCl₃ 75 mL 중의 β-알라닌 t-부틸 에스테르 염산(3.06 g, 16.8 mmole, 5.09 eq.), DIEA(4.27 g, 5.75 mL, 33.0 mmole, 10.00 eq.), 및 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(0.910 g, 3.31 mmole)의 용액을 암소에서 93 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 용액을 여과하고 NaHCO₃(포화 수용액) 1 x 40 mL 및 2 x 60 mL 로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 농축하여 황색의 조 고체를 생성시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(30 g 중력 등급 겔, 0-3% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 점성의 주황색 생성물 1.06 g(65%)를 수득하였다 그 생성물을 다음 단계에서 사용하였다.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.33, UV(254/366)으로 관찰.

B. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(t-부톡시카보닐)에틸아미노]메틸]안트라센

23℃의 CHCl₃ 30 mL 중의 9,10-비스[2-(t-부톡시카보닐)에틸아미노]메틸]안트라센(1.60 g, 3.25 mmole), DIEA(4.45 g, 6.60 mL, 34.4 mmole, 10.6 eq), 및 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(4.80 g, 17.0 mmole, 5.22 eq.) 의 용액을 암소에서 4.5 일간 교반하였다. 그런 다음, 그 혼합물에 CHCl₃ 45 mL를 가하고, 그 혼합물을 NaHCO₃(포화 수용액) 2 x 25 mL로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 농축하여 적색의 조 고체를 생성시켰다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(100 g 활성화 중성 알루미나, 0-3% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 오렌지색 고체 ~ 3.5 g을 수득하였다 그 생성물을 용해 한 다음, 백색의 침전물(DIEA-HBr 염)이 형성되었다. 그 용액을 여과하고 여액을 농축하여 오렌지색 고체 2.72 g(93%)를 수득하였다. 생성물(RP-HPLC에 의해 >80% 순도)을 다음 단계에서 사용하였다.

TLC: Merck 염기성 알루미나 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.66, UV(254/366)로 관찰.

HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 23.9 분.

C. 9,10-비스[N-[2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]-메틸]안트라센

23℃의 20% TFA/CH₂Cl₂ 5 mL 중의 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(t-부톡시카보닐)에틸아미노]메틸]안트라센(0.556 g, 0.620 mmole) 용 액을 암소에서 25 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 N₂ 기체의 흐름 하에서 농축하였다. 잔류물을 3 x 10 mL의 에테르와 함께 분쇄하였다. 그 잔류물 고체를 진공 하에서 건조하여, 담황색의 분말 0.351 g(87%)을 수득하였다.

FAB MS: 글리세롤 매트릭스; C₄₂H₄₆B₂N₂O₁₀(비스 글리세롤 부가물)에 대한 계산치 [M]⁺ 760; 관측치 [M]⁺ 760.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.025 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 360 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 16.7 분.

D. 글루코스 및 락테이트를 이용한 형광의 조절

글루코스 및 락테이트에 의한, 이 실시예에서 제조된 인디케이터 화합물(2 개의 인식 요소를 포함)의 형광 조절을 결정하였다. 도 3은 a) 0-10 mM 글루코스, 0 mM 아세테이트; b) 0-10 mM 글루코스, 2 mM 락테이트; c) 0-10 mM 글루코스, 5 mM 락테이트를 함유하는 PBS 중의 카르복실레이트 비스-보로네이트-안트라센 인디케이터 75 μM 용액의 형광을 나타낸다. 스펙트럼을 여기 365 nm; 여기 슬릿 1.5 nm; 방출 슬릿 1.5 nm; 주위온도로 하여 Shimadzu RF-5301 형광분광계를 이용하여 기록하였다. 삼중으로 측정된 모든 포인트를 ±1 SD 오차 바와 함께 나타내었다. 락테이트의 존재는 실질적으로 글루코스에 의한 인디케이터의 형광 조절에 영향을 주지 않았다.

실시예 4

인디케이터가 히드로겔에 공유결합으로 고정될 때, 글루코스 vs. 락테이트 및 아세토아세테이트에 대한 비스-보로네이트-글루코스 인디케이터의 선택성

I. 듀얼-메타크릴아미드 모노머의 제조

A. 9,10-비스[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센

23℃의 CHCl₃ 200 mL 중의 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(1.5 g, 5.45 mmole), DIEA(28.17 g, 38.00 mL, 218 mmole, 40 eq.), N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 염산염(9.76 g, 54.5 mmole, 10.0 eq.), 및 BHT ~ 5 mg 현탁액을 40℃의 암소에서 4 일동안 교반하였다. 그런 다음, 온도를 45℃로 올리고, 그 혼합물을 3 일 더 교반하였다. 이 때, 침전물이 형성되었으며, 그 고체 생성물을 최소량의 CH₂Cl₂에 용해하였다. 원하는 생성물의 비스 염산염이 황색 결정의 고체로서 밤새 생성되었다(3.15 g, 정량).

TLC: Merck 염기성 알루미나 플레이트, 90/10 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.31, UV(254/366)으로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 360 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 15.0 분.

B. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프 로필아미노]메틸안트라센. (듀얼-메타크릴아미드 모노머)

23℃의 CHCl₃ 20 mL 중의 9,10-비스[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센(0.650 g, 유리 아민 1.34 mmole), DIEA(0.612 g, 0.825 mL, 4.74 mmole, 3.55 eq), (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(1.34 g, 4.74 mmole, 3.55 eq.), 및 BHT (억제제로서 5 mg)의 용액을 암소에서 5 일간 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 그 잔류물을 알루미나 크로마토그래피(200 g 활성화 중성 알루미나, 0-2% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 매우 점성이 있는 황색 오일 0.465 g(39 %)를 수득하였다.

TLC: Merck 염기성 알루미나 플레이트, 90/10 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.59, UV(254/366)로 관찰.

HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 360 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 16.9 분.

C. 글루코스 인디케이터으로 N,N-디메틸아크릴아미드 히드로겔의 제조

에틸렌 글리콜 중의 N,N-디메틸아미드(40 중량%) 및 N,N=-메틸렌비스아크릴아미드(0.8 중량%)의 용액을 제조하였다. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센(17.8 mg, 2x10^-5 mole) 및 암모늄 퍼술페이트 수용액(5 중량%) 40 ㎕를 에틸렌 글리콜 모노머 용액 1 mL와 함께 혼합하였다. 그 결과 생성된 용액을 질소로 퍼지한 글로브 박스(glove box)에 두었다. N,N,N=,N=-테트라메틸에틸렌디아민 수용액(80 ㎕, 5 중량%)를 상기 모노머 제조물에 부가하 중합을 가속화 하였다. 그 결과 생성된 제조물을 현미경 슬라이드 및 100 미크론 강철 스페이서로 구축된 몰드에 부었다. 8 시간동안 질소 대기 하에 둔 후, 몰드를 인산 완충액(PBS)(10 mM PBS, pH = 7.4)에 두고, 현미경 슬라이드를 분리시킨 다음, 히드로겔을 제거하였다. 그 히드로겔을 1 mM 라우릴 술페이트 소듐염 및 1 mM EDTA 소듐 염을 함유하는 PBS 100 mL로 3 일간 매일 갈아주면서 세척한 다음, DMF/PBS(10/90 부피비, 3 x 100 mL)로 세척하고, 최종적으로 PBS(pH= 7.4, 3 x 100 mL)로 세척하였다. 그 결과 형성된 히드로겔 폴리머를, 소듐 아지드 0.2 중량% 및 EDTA 소듐염 1 mM을 함유하는 PBS(10 mM PBS, pH = 7.4)중에 저장하였다.

글루코스, 락테이트, 및 아세테이트에 의한, 이 실시예에서 제조된 인디케이터 화합물(2 개의 인식 요소를 포함)의 형광 조절을 결정하였다. 도 4는 다양한 양의 소듐-L-락테이트, 리튬 아세토아세테이트, 또는 α-D-글루코스를 함유하는, 0.2% NaN₃ 및 1 mM EDTA를 함유하는 pH 7.4의 10 mM PBS 중에 이 실시예의 글루코스 인식 분자를 포함하는 히드로겔의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 427 nm)을 나타낸다. 데이터를 여기 365 nm(슬릿 3 nm) 및 방출 427 nm(슬릿 = 3 nm), 37℃에서 낮은 민감도에서, 온도 제어된 시료 홀더를 이용하여 Shimadzu RF-5301 형광분광계를 이용 하여 기록하였다. 원하는 용액 3 mL를 함유하는 큐벳을 측정 전에 15 분동안 37℃에서 평형화하였다. 각각의 히드로겔 시료를 4 개의 별도의 시료에서 측정하였다. 오차 바는 각각의 데이터 점에 대한 4 중 값의 표준편차이다. 글루코스 인식 분자를 포함하는 히드로겔을 상기한 바와 같이 제조하였다. 히드로겔을 글래스 슬라이드 상에 마운팅하고 45□ 입사광으로 하여 PMMA 큐벳에서 폴리에스테르 메쉬로 커버하였다. 1, 5, 10, 및 20 mM 소듐 L-락테이트[Aldrich] 용액, 5, 10, 및 20 mM 리튬 아세토아세테이트[Aldrich] 용액, 그리고 1, 2, 4, 5, 10, 및 20 mM α-D-글루코스 용액을 0.2% NaN₃ 및 1 mM EDTA를 함유하는 pH 7.4의 10 mM PBS에서 제조하였다. 코폴리머의 형광은 글루코스의 존재에 의해 영향을 받지만, 락테이트 또는 아세토아세테이트에 의해서는 영향을 받지 않는다.

실시예 5

비스-보로네이트 인식 및 근접 소광(quenching) 신호 생성을 이용한 글루코스 vs 락테이트 선택성

A. N-(2,2-디에톡시에틸)-4-브로모-1,8-나프탈이미드

EtOH 45 mL 중의 4-브로모-1,4-나프탈릭 무수물(10.0 g, 36.1 mmole) 및 아미노아세트알데히드 디에틸 아세탈(4.81 g, 5.26 mL, 36.1 mmole, 1 eq.) 현택액을 3 일동안 45℃에서 교반하였다. 그런 다음, 그 결과물인 현탁액을 EtOH로 세척하면서 여과하고 잔류물을 건조하여 연한 갈색의 고체 생성물 13.3 g(94%)를 수득하였다.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 98/2 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.17, UV(254/366)으로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 360 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 24.2 분.

B. N-(2,2-디에톡시에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드

8 mL NMP 중의 N-(2,2-디에톡시에틸)-4-브로모-1,8-나프탈이미드(0.797 g, 2.03 mmole) 및 n-부틸아민(1.48 g, 2.00 mL, 20.2 mmole, 9.96 eq.)의 용액을 45℃에서 66 시간동안 가열하였다. 그런 다음, 그 결과 현탁액을 25℃로 냉각한 다음, 여과하였다. 그 잔류물을 에테르 50 mL에 용해하고 3 x 50 mL 물로 추출하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 농축하여 조 황색 분말을 수득하엿다. 그 조물질을 실리카겔 크로마토그래피(25 g 중력 등급 겔, 0-1% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 황색 분말 0.639 g(82%)를 수득하였다.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.71, UV(254/366)로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 23.5 분.

C. N-(2-옥소에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드

아세톤 25 mL 중의 N-(2,2-디에톡시에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드(0.622 g, 1.62 mmole) 및 p-톨루엔-술폰산 모노 하이드레이트(0.010 g, 0.053 mmole, 0.032 eq.)의 용액을 18 시간동안 25℃에서 교반하였다. 그런 다음, 그 용액을 농축시키고, 그 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(25 g 중력 등급 겔, 0-1% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 오렌지색 고체 0.470 g(94%)를 수득하였다.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.61, UV(254/366)로 관찰.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃); δ 1.03 (t, 3H, J = 7.3 Hz), 1.53 (m, 2H), 1.78 (m, 2H), 3.38 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 5.02 (s, 2H), 6.64 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.52 (dd, 1H, J = 7.4, 8.3 Hz), 8.08 (dd, 1H, J = 1 Hz, 8.5 Hz), 8.38 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.46 (dd, 1H, J = 1.0, 7.3 Hz), 9.75 (s, 1H).

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 19.6 분.

D. N-(4-디메틸아미노벤질)-1,6-디아미노헥산

무수 EtOH 20 mL 중의 4-디메틸아미노벤즈알데히드(1.00 g, 6.70 mmole), Na₂SO₄(6.70 g, 47.2 mmole, 7.04 eq.), 및 1,6-디아미노헥산(3.89 g, 33.5 mmole, 5.00 eq.) 현탁액을 질소 기체 하에서 25℃의 암소에서 18 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 용액을 여과하고, NaBH₄(1.73 g, 45.8 mmole, 6.84 eq.)를 그 여액에 가하였다. 그 현탁액을 25℃에서 5 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 농축하고, 그 잔류물을 물 50 mL에 용해한 다음, 3 x 50 mL의 에테르로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 2 x 50 mL 물로 세척하였다. 합한 수성 추출물을 2 x 50 mL 에테르로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 점성이 있는 오일 1.35 g(81%)을 수득하였다.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 80/15/5 CH₂Cl₂/CH₃0H/iPrNH₂로 Rf 0.58, UV(254/366)로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 280 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 13.3 분.

E. N-2-[6-N(N-4-디메틸아미노벤질)아미노헥실]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드

무수 MeOH 25 mL 중의 N-(2-옥소에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드(0.346 g, 1.11 mmole) 현탁액에 무수 MeOH 20 mL 중의 N-(4-디메틸아미노벤질)-1,6-디아미노헥산(0.554 g, 2.22 mmole, 2.00 eq.) 및 아세트산(0.067 g, 1.1 mmole, 1.0 eq.)의 용액을 가하였다. 이 혼합물에 무수 MeOH 5 mL중의 NaCNBH₃(0.070 g, 1.1 mmole, 1.0 eq.) 용액을 가하였다. 그 반응 혼합물을 25℃에서 15 시간동안 교반하였다. 그런 다음, MeOH를 회전 증발법에 의해 제거하고, 그 잔류물을 물 30 mL에 용해하였다. 그 용액을 1 N HCl로 pH 2로 조정한 다음, 25℃에서 1 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 용액을 1N NaOH로 pH 12로 조정하고, 3 x 50 mL CH₂Cl₂로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 3 x 50 mL 물로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 농축하여 조 갈색 오일을 수득하였다. 그 조 물질을 실리카겔 크로마토그래피(35 g 플래쉬 등급 겔, 0-50% CH₃0H/CH₂Cl₂, 그런 다음 45/50/5 CH₃0H/CH₂Cl₂/iPrNH₂)로 정제하여 디아민 생성물 0.190 g(32%)을 수득하였다.

FAB MS: C₃₃H₄₅B₂N₅O₂에 대한 계산치 [M] ⁺ 544; 관측치 [M]⁺ 544.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 80/20 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.42, 닌히드린 염색 및 UV(254/366)로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 17.6 분.

F. N-2-[6-N-(N-4-디메틸아미노벤질)-6-N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질] 아미노헥실]-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드

CHCl₃ 5 mL 중의 N-2-[6-N-(N-4-디메틸아미노벤질)아미노헥실]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드(0.150 g, 0.276 mmole) 및 DIEA(0.355 g, 0.478 mL, 2.81 mmole, 10.0 eq.)의 용액에 CHCl₃ 2 mL 중의 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(0.390 g, 1.38 mmole, 5.00 eq.)의 용액을 가하였다. 그런 다음, 그 용액을 25℃에서 27 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 농축하고 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(100 g 활성화 중성 알루미나, 0-5% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 점성의 갈색 오일 0.024 g(19%)를 수득하였다.

FAB MS(글리세롤 매트릭스): C₅₃H₆₇B₂N₅O₈에 대한 계산치 [M]⁺ 924(보론산 네오펜틸 에스테르 대신 비스 글리세롤 부가물); 관측치 [M]⁺ 924.

TLC: Merck 중성 알루미나 플레이트, 80/20 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.62, UV(254/366)로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 20.7 분.

G. N-2-[6-N-(N-4-디메틸아미노벤질)-6-N-[2-(보로노)벤질]아미노헥실]-[2-( 보노로)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드(nBuF-헥사-Q 비스-보로네이트).

글루코스 연구 중에 사용되는 유리 비스 보론산 생성물은 MeOH/PBS 완충 시스템 중에 N-2-[6-N-(N-4-디메틸-아미노벤질)-6-N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노-헥실]-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드를 용해하는 것으로부터 유래한다.

H. 글루코스 및 락테이트를 이용한 형광의 조절

글루코스 및 아세테이트에 의한, 이 실시예에서 제조된 인디케이터 화합물(2 개의 인식 요소를 포함)의 형광 조절을 결정하였다. 도 5는 a) 0-20 mM 글루코스; b) 0-20 mM 락테이트를 함유하는 70/30 MeOH/PBS 중의 지식약 화합물의 0.015 mM 용액의 표준화된 형광 방출(I/Io @ 535 nm)을 나타낸다. 스펙트럼을 여기 450 nm; 여기 슬릿 1.5 nm; 방출 슬릿 1.5 nm; 주위온도로 하여 Shimadzu RF-5301 형광분광계를 이용하여 기록하였다. 오차 바는 각각이 데이터 점에서의 삼중 값에 대한 표준편차이다. 인디케이터의 형광은 글루코스의 존재에 의해 영향을 받지만, 락테이트의 존재에 의해서는 실질적으로 영향을 받지 않는다.

실시예 6

N-[3-(메타크릴아미도)프로필]-3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술폰아미드(Alizarin Red S 모노머) 및 α,α'-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]-1,4-크실렌(비스 보론산 모노머)를 함유하는 아크릴아미드 겔에 대한 글루코스 또는 락테이트의 효과:

A. 3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술포닐 클로라이드:

3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술폰산 소듐염(1.4 g, 3.9 mmole)을 클로로술폰산 30 mL와 혼합하고, 5 시간동안 90℃로 가열한 다음, 용액을 0℃로 냉각하고 얼음 100 g에 부었다. 얼음이 녹은 후에, 그 용액을 CH₂Cl₂(3 x 100 mL)로 추출하고, 메틸렌 클로라이드 추출물을 합하고, Na₂SO₄로 건조하고 증발시켜 고체 0.87 g을 수득하였다(수율: 66%).

B. N-[3-(메타크릴아미도)프로필]-3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술폰아미드:

3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술포닐 클로라이드(96 mg, 0.28 mmole) 및 N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 염산(108 mg, 0.6 mmole)을 CH₂Cl₂ 20 mL와 혼합하였다. 이 현탁액에 Et₃N(303 mg, 3 mmole)을 부가하였다. 그 혼합물을 실온에서 24 시간동안 교반하고, 여과한 다음, 용매를 증발시켯다. 그 결과물인 고체를 용리액으로서 CH₂Cl₂/MeOH (90/10)을 이용하여 SiO₂(10 g) 상의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 그 생성물을 적색의 고체로서 획득하였다(80 g, 64% 수율).

FAB MS: C₂₁H₂₀N₂O₇S에 대한 계산치 M⁺ 445; 관측치 M⁺ 445.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 17.67 분.

C. α,α'-비스[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]-1,4-크실렌

무수 MeOH 75 mL 중의 N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 염산염(3.00 g, 16.8 mmole, 2.21 eq.), DIEA(6.5 g, 8.8 mL, 50 mmole, 6.6 eq.), 테레프탈디카르복스알데히드(1.02 g, 7.60 mmole), 및 Na₂SO₄(10.7 g, 75.3 mmole, 9.91 eq.)의 용액을 25℃의 암소에서 18 시간동안 교반하였다. 그런 다음, Na₂SO₄(10.7 g, 75.3 mmole, 9.91 eq.)를 더 부가하고, 6 시간동안 교반을 더 계속하였다. 그런 다음, 용액을 여과하고 NaBH₄(1.73 g, 45.7 mmole, 6.01 eq.)를 조금씩 부가한 다음 25℃에서 21 시간동안 교반하였다. 그 현탁액을 셀라이트를 통해서 여과하고, 그 여액을 농축하였다. 그 잔류물을 CH₂Cl₂ 100 mL에 용해하고, NaHCO₃ 포화 수용액 1 x 25 mL로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 농축하여 점성의 오일을 수득하였다. 그 생성물을 다음 단계에서 사용하였다.

HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2.00 mL/분, 260 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 15.8 분.

D. α,α=-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도) 프로필아미노]-1,4-크실렌

25℃의 CH₂Cl₂ 75 mL 중의 α,α=-비스[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]-1,4-크실렌(2.94 g, 3.02 eq.), (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(6.50 g, 23.0 mmole, 3.02 eq.), 및 BHT(억제제로서 5 mg)의 용액을 암소에서 28 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 1 x 25 mL NaHCO₃ 포화 수용액으로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 농축하였다. 그 잔류물에 에테르 200 mL를 가하고, 그 현탁액을 18 시간동안 교반하였다. 그 현탁액을 여과하고, 그 잔류물을 CH₂Cl₂에 용해하고, 여과한 다음 여액을 농축하였다. 그 고체 잔류물에 에테르 150 mL를 부가하고, 그 현탁액을 18 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 현탁액을 여과하여 담분홍색의 분말 1.98 g(33%)을 수득하였다.

FAB MS: C₄₆H₆₄B₂N₄O₆에 대한 계산치 [M] ⁺ 790; 관측치 [M+1]⁺ 791.

HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 250 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 13.4 분.

E. N-[3-(메타크릴아미도)프로필]-3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술폰아미드(Alizarin Red S 모노머) 및 α,α'-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]-1,4-크실렌을 함유하는 아크릴아미드 겔 의 제조:

N-[3-(메타크릴아미도)프로필]-3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술폰아미드(1.5 mg, 3.38 x 10^-6 mole) 및 α,α'-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]-1,4-크실렌(28 mg, 3.54 x 10^-5 mole)을 에틸렌 글리콜 모노머 용액 800 ㎕ 및 암모늄 퍼술페이트 5 중량% 수용액 40 ㎕와 혼합하였다. 이 제조물을 글래스 현미경 슬라이드 및 100 미크론 강철 스페이서로부터 구축된 몰드와 함께 질소로 퍼지한 글로브 박스에 두었다. N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 수용액(40 ㎕, 5 중량%)을 상기 모노머 용액에 부가하여 중합을 가속화 하고, 최종 제조물을 글래스 몰드에 부었다. 그 몰드를 16 시간동안 질소 대기 하에 둔 후, 몰드를 PBS(pH = 7.4)에 침지시키고, 그 글래스 슬라이드를 분리시켜 히드로겔 폴리머를 박막 형태로 생성시켰다. 그 결과 형성된 히드로겔 박막을 1 mM 라우릴 술페이트 소듐염 및 1 mM EDTA 소듐 염을 함유하는 PBS 100 mL로 3 일간 매일 갈아주면서 세척한 다음, MeOH/PBS(20/80 부피비, 3 x 100 mL)로 세척하고, 최종적으로 PBS(pH= 7.4, 3 x 100 mL)로 세척하였다. 그 결과 형성된 히드로겔 폴리머를, 소듐 아지드 0.2 중량% 및 EDTA 소듐염 1 mM을 함유하는 PBS(10 mM PBS, pH = 7.4)중에 저장하였다.

F. 글루코스 및 락테이트에 의한 흡광도의 조절

글루코스 및 락테이트에 의한, 이 실시예에서 제조된 인디케이터 히드로겔(2 개의 인식 요소를 포함)의 흡광도 조절을 측정하였다. 아크릴아미드 겔을 실시예 4에 개시된 바와 같은 방식으로 PMMA 셀(cell)에 마운팅 하였다. 바람직한 양의 글루코스 또는 소듐 락테이트를 함유하는 pH 7.4의 인산 완충액(PBS)을 수조에서 37℃로 가열하고, 상기 겔을 함유하는 PMMA 셀에 둔 다음, PMMA 셀을 37℃에서 15 분간 평형화 하였다. 각각의 글루코스 또는 락테이트 농도에 대한 흡광도 측정을 삼중으로 수행하였다. 각각의 측정에 대하여, 650 nm에서의 흡광도를 블랭크로서 이용하고, A(450 nm) 및 A(530 nm)의 모든 값에서 A(650 nm)를 차감하였다.

도 6은 글루코스와 함께 그리고 글루코스가 없이 4 mM Alizarin Red S 모노머 및 44 mM 비스 보론산 모노머를 함유하는 아크릴아미드 겔(30%)의 흡광도 스펙트럼을 나타낸다. 도 7은 4 mM Alzarin Red S 모노머 및 비스 보론산 모노머 44 mM을 함유하는 아크릴아미드 겔(30%)의 흡광도에 대한 글루코스의 효과를 나타낸다. 도 8은 4 mM Alzarin Red S 모노머 및 비스 보론산 모노머 44 mM을 함유하는 아크릴아미드 겔(30%)의 흡광도에 대한 소듐 락테이트의 효과를 나타낸다. 지식약의 흡광도는 글루코스의 존재에 의해 영향을 받지만, 락테이트의 존재에 의해서는 실질적으로 영향을 받지 않았다.

G. 글루코스 및 락테이트에 의한 형광의 조절

실질적으로 이 실시예 6에 따라 합성된 아크릴아미드 겔(N-[메타크릴아미도)프로필]-3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술폰아미드 1.9 mg 및 α,α'-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]-1,4-크실렌 35 mg이 사용된 경우 제외)의 형광의 조절을 결정하였다.

그 실험을 다양한 온도를 갖는 Shimadzu RF-5301 형광분광계에서 수행하였다 (여기 470 nm, 슬릿 3/10 nm, 높은 감도). 아크릴아미드 겔을 PMMA 형광 셀에 45°각도로 부착된 글래스 슬라이드 조각에 부착하였다. 그 셀을 PBS(pH = 7.4) 2.5 mL로 채우고 37℃로 가열하였다. PBS(pH = 7.4) 중의 글루코스 스탁 용액(100 mM 및 500 mM)을 제조하고 수욕에서 37℃로 가열하였다. 550 nm에서의 형광 강도를 시간의 함수로서 모니터링 하면서, 가열된 글루코스 스탁용액의 분액을 PMMA 셀에 주기적으로 가하였다(2 분마다 1회 측정). PMMA 셀 중의 글루코스 농도를 YSI Model 2300 STAT 플러스 글루코스 분석기를 이용하여 측정하였다. 도 9에 나타낸 그 결과는 글루코스의 부가가 인디케이터 히드로겔의 형광 강도를 감소킨다는 것을 보여준다. 동일한 효과가 도 10에서 나타났으며, 이는 동일한 종류의 겔이 형광 스펙트럼에 대한 글루코스의 효과를 보여준다.

그 효과는 다음과 같은 이유 때문에 일어나는 것으로 여겨진다. Alizarin Red S의 메타크릴아미드 모노머(리포터 분자)는 인접한 디올 작용기 및 모노머 작용기를 함유한다(하기 구조식 참조). 수용액 및 유기 용매에서, Alizarin Red S 및 비스-보로네이트 인식 요소 모노머(하기 참조)는 서로 가역적 반응을 하여 보로네이트 에스테르를 형성할 수 있다. 이 가역적 반응에서 형성된 보로네이트 에스테르 분자는 형광성인데 반해, Alizarin Red S 모노머는 수용액 및 MeOH와 같은 유기 용매에서 실질적으로 그 자체가 아무런 형광 방출을 나타내지 않는다. 따라서, 글루코스 인식 요소에 결합 시, Alizarin Red S는 예를 들어, 흡광도 및 형광의 발생량과 같은 그 선택적 특성이 변화한다.

모노머 작용기 및 모노머 작용기와 함께 글루코스 인식 요소를 갖는 Alizarin Red S의 용액은 히드로겔 모노머 및 크로스링커와 함께 제조될 수 있다. 이러한 혼합물의 공중합은 다양한 작은 크기 및 중간 크기 분자에 확산 가능한 히드로겔 물질을 생성시켜서; 검출 및 정량 분석이 가능하다. 예를 들어, 글루코스와 같은 분석물은 히드로겔 매트릭스 내로 확산되어, 이미 인식 요소에 결합되어 있는 리포터 분자를 대체한다. 이로 인해 인식 부위에 결합되지 않는 더 많은 수의 리포터 분자를 함유하기 때문에 히드로겔 필름의 선택적 특성의 변화가 일어난다.

글루코스 및 락테이트에 의한, 이 실시예에서 제조된 인디케이터 화합물(2 개 이상의 인식부위를 함유)의 형광의 조절을 또한 측정하였다. 그 실험은 가변성 온도 부착물이 장착된 Shimadzu RF-5301 PC 형광분광계로 수행하였다(여기 470 nm; 슬릿 5/10 nm; 낮은 감도). 아크릴아미드 겔을 PMMA 형광 셀에 45°각도로 부착된 글래스 슬라이드 조각에 부착하였다. 그 셀을 PBS(pH = 7.4) 2.5 mL로 채우고, 수욕에서 37℃로 가열하였다. PBS(pH = 7.4) 중의 소듐 락테이트 스탁 용액(100 mM)을 제조하고 수욕에서 37℃로 가열하였다. PBS(pH = 7.4) 중의 글루코스 스탁 용액(100 mM 및 500 mM)을 제조하고 수욕에서 37℃로 가열하였다. 550 nm에서의 형광 강도를 시간의 함수로서 모니터링 하면서(2 분마다 1회 측정), 락테이트 농도가 8 mM에 도달할 때가지 가열된 글루코스 스탁용액의 분액을 PMMA 셀에 주기적으로 가하였다. PMMA 셀 중의 글루코스 농도를 YSI Model 2300 STAT 플러스 글루코스 분석기를 이용하여 측정하였다. 도 11에 나타낸 그 결과는 락테이트의 부가가 인디케이터 히드로겔이 형광 강도에 유의한 영향을 미치지 않으며, 그 이후의 글루코스의 부가가 인디케이터 히드로겔의 형광 강도를 감소시킨다는 것을 보여준다.

실시예 7

비스-보로네이트-안트라센의 단일-메타크릴아미드 모노머:

A. 9-클로로메틸-10-[[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센 염산염

NMP 200 mL 중의 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(5.18 g, 18.8 mmole, 3.99 eq.)의 현탁액에 2-(2-아미노에톡시)에탄올(0.495 g, 0.475 mL, 4.71 mmole)을 부가하였다. 그 혼합물을 암소에서 17 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 50℃ 진공 하에서 ~ 50 mL로 농축하였다. 그 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(150 g 중력 등급 실리카겔, 0-10% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 황색/오렌지색 고체 0.425 g(24%)을 수득하였다.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 70/30 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.72, UV(254/366), 닌히드린 염색으로 관찰.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 16.1 분.

B. 9-[[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]-10-[[(3-메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-안트라센

23℃의 CHCl₃ 125 mL 중의 N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 염산(3.80 g, 17.2 mmole, 4.2 eq.), DIEA(5.19 g, 7.00 mL, 40.1 mmole, 9.8 eq), 및 BHT ~ 3 mg의 현탁액에 CHCl₃ 25 mL 중의 9-클로로메틸-10-[[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센 염산염(1.56 g, 4.10 mmole) 용액을 적가하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 92 시간동안 암소에서 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 여과하고 NaHCO₃ 2 x 40 mL(포화 수용액)로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO ₄로 건조하고, 여과한 다음 농축하여 점성의 오렌지색 고체를 생성시키고, 그것을 알루미나 크로마토그래피(50 g 활성화 중성 알루미나, 0-5% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 오렌지색 고체 0.364 g(20%)를 수득하였다.

TLC: Merck 실리카겔 60 플레이트, 70/30 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.16, UV(254/366), 닌히드린 염색으로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 16.85 분.

C. 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센. (단일-메타크릴아미드 모노머)

23℃의 CHCl₃ 20 mL 중의 9-[[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]-10-[[(3-메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]안트라센(0.343 g, 0.763 mmole), DIEA(0.965 g, 1.30 mL, 9.8 eq.), 및 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(1.09 g, 3.85 mmole, 5.0 eq.)의 용액을 25 시간동안 암소에서 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 회전 증발법으로 처음으로 농축하고 나서, 진공 펌프를 이용하여 DIEA를 제거하였다. 그 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(40 g 활 성화 중성 알루미나, 0-10% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 주황색의 고체 0.299 g(46%)를 생성시켰다. 이 화합물을 상기한 바와 같이 적절한 모노머와 함께 공중합하고, 탈보호한 다음, 글루코스를 검출하는데 사용할 수 있다.

FAB MS: C₅₁H₆₅B₂N₃O₇에 대한 계산치 [M] ⁺ 854; 관측치 [M+1]⁺ 855.

TLC: Merck 염기성 알루미나 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H로 Rf 0.35, UV(254/366)로 관찰.

HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 19.7 분.

실시예 8

비스-보로네이트-안트라센의 듀얼-메타크릴레이트 모노머

A. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센

CH₂Cl₂ 5 mL 중의 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센(0.100 g, 0.120 mmole; 실시예 2 참조), 메타크릴산(0.112 g, 0.110 mL, 1.30 mmole, 10.8 eq.), DCC(0.316 g, 1.53 mmole, 12.8 eq.), 및 N,N-디메틸아미노-피리딘(0.014 g, 0.11 mmole, 0.92 eq.)의 용액을 0℃에서 1 시간동안 교반한 다음, 23℃에서 22 시간동안 교반하였다. 그런 다음, 그 반응 혼합물을 여과하고 회전 증발법에 의해 농축하였다. 그 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(30 g 활성화 중성 알루미나, 0-2% CH₃OH/CH₂Cl₂)로 정제하여 황색 고체 0.030 g(26%)를 수득하였다. 이 화합물을 상기한 바와 같이 적절한 모노머와 함께 공중합하고, 탈보호한 다음, 글루코스를 검출하는데 사용하였다.

FAB MS: C₅₆H₇₀B₂N₂O₁₀에 대한 계산치 [M] ⁺ 953; 관측치 [M]⁺ 951(약한 분자 이온 피크).

TLC: Merck 염기성 알루미나 플레이트, 95/5 CH₂Cl₂/CH₃0H 로 Rf 0.67, UV(254/366)로 관찰.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 370 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 19.6 분.

실시예 9

이중 5-아미노펜틸 비스-보로네이트-안트라센

A. 9,10-비스[[5-(t-BOC)-아미노펜틸아미노]메틸]-안트라센.

9,10-비스(클로로메틸)안트라센(0.28 g, 1 mmole), DIEA(7.0 mL, 40 mmole), 모노-t-부톡시카르보닐 1,5-디아미노펜탄(3.75 g, 10 mmole), 및 50 ml 의 CHCl₃ 의 현탁액을 45℃에서 2 일 동안 암소에서 교반하였다. 용액을 포화 H₂O/NaHCO₃ 로 세척하고, 유기상을 건조하고(Na₂SO₄), 용매를 증발시켰다. 잔류물을 알루미나 크로마토그래피(40 g 활성화된 중성 알루미나, 95/5 부피% CH₂Cl₂/MeOH)로 정제하여 0.55 g 의 점성 오일을 수득하였다. 이 물질을 다음 단계에 사용하였다.

B. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[5-(t-BOC)-아미노펜틸아미노]메틸]안트라센.

20 mL CH₂Cl₂ 중의 9,10-비스[[5-(t-BOC)-아미노펜틸아미노]-메틸]안트라센(0.3g, 0.49 mmole), DIEA(0.35 mL, 2 mmole), 및 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르(0.566 g, 2.0 mmole) 용액을 25℃에서 2 일 동안 암소에서 교반하였다. 이 때에, 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 잔류물을 알루미나 크로마토그래피(60 g 의 활성화된 중성 알루미나, 98/2 부피% CH₂Cl₂/MeOH)로 정제하여 0.401 g의 황색 오일을 수득하였다. 이 물질을 다음 단계에 사용하였다.

C. 9,10-비스[N-(2-보로노벤질)-N-[5-아미노펜틸아미노]-메틸]안트라센 트리플루오로아세트산 염.

9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[5-(t-BOC)-아미노펜틸아미 노]메틸]안트라센(0.4 g, 0.39 mmole)을 20 ml의 CH₂C1₂/TFA(80/20 부피%)에 용해하였다. 용액을 12 시간 동안 교반하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 10 ml 의 에테르로 세척하였다. 총 373 mg 의 고체를 수득하였다(72% 수율). 생성물을 RP-HPLC 에 의해 약 80% 순수하였다. 이 화합물은 전술한 탈보호된 적당한 모노머와 공중합될 수 있으며, 글루코스를 검출하기 위해 사용될 수 있다.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 360 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2분, 지연 시간 16.0 분.

실시예 10

A. N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-브로모나프탈렌-1,8-디카르복시 미드:

N-t-Boc-에틸렌디아민 (Fluka, 1.6 g, 10 mmole) 및 4-브로모-1,8-나프탈산 무수물(Aldrich, 2.77 g, 10 mmole)을 60 ml 의 무수 에탄올과 합하고, 현탁액을 20 시간 동안 60℃에서 교반하고, 실온으로 냉각하고, 여과하였다. 수득된 고체를 30 ml 의 냉 EtOH 로 세척하고, 진공하에 건조하였다.

수율 3.84g (91%). NMR(CDCl₃): 1.28(9H, s); 3.52(2H, t); 4.35(2H, t); 4.92(1H, s); 7.84(1H, t); 8.04(1H, d); 8.42(1H, d); 8.58(1H, d); 8.67(1H, d).

B. N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-(N'-메틸아미노에틸아미노)나프탈렌-1,8-디카르복시미드:

N-메틸에틸렌디아민(1.48 g, 20 mmole)을 2 ml 의 1-메틸-2-피롤리디논(NMP)과 합하고, N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-브로모나프탈렌-1,8-디카르복시미드(0.35 g, 0.845 mmole)을 첨가하였다. 생성 용액을 45℃에서 40 시간 동안 교반한 후, NMP 및 N-메틸에틸렌디아민을 진공하에 증발시켰다. 수득된 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (20g의 실리카 겔, 초기에 CH₂Cl₂/MeOH(90/10), 그리고 나서 CH₂Cl₂/MeOH/Et₃N(75/20/5))하였다. 황색 고체를 수득하였다(0.311 g, 89% 수율). 순도를 RP-HPLC 로 검사하였다.

C. N-아미노에틸-4-(N'-아미노에틸렌-N''-[2-(보로노)벤질]메틸아미노)나프탈렌-1,8-디카르복시미드 트리플루오로아세트산 염:

N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-(N'-메틸아미노에틸아미노)나프탈렌-1,8-디카르복시미드(0.3 g, 0.73 mmole), 2-브로모메틸페닐 보론산, 피나콜 에스테르(0.6 g, 2 mmole), N,N-디이소프로필-N-에틸아민(1.3 mL, 8 mmole), 및 10 ml 의 CH₂Cl₂ 를 합하였다. 용액을 20 시간 동안 교반 후에 2g 의 PS-트리스아민 수지(Argonaut Technologies, 3.38 mmol/g)를 첨가하였다. 반응 혼합물 및 수지를 10 시간 동안 교반 후에, 수지를 여과로 제거하고, CH₂C1₂(2X20 ml)로 세척하였다. 합한 CH₂C1₂ 용액을 증발시키고, 진공하에 건조하였다.

20 부피% TFA 및 5 부피% 트리이소프로필 실란을 포함하는 메틸렌 클로라이드 용액을 생성된 오렌지 잔류물에 첨가하였다. 생성 용액을 실온에서 10 시간 동안 교반 후에, 용매를 증발시키고, 잔류물을 에테르와 함께 분쇄하여 황색 고체를 수득하였다. 고체를 여과하고, 진공에서 건조하였다(수율 580 mg). 물질의 순도를 RP-HPLC 로 검사하였다. 고체를 다음 단계에 사용하였다.

D. N-(3-보로노-5-니트로벤즈아미도)에틸-4-(N'-아미노에틸렌-N"-[2-(보로노)벤질]메틸아미노)나프탈렌-1,8-디카르복시미드:

N-아미노에틸-4-(N'-아미노에틸렌-N''-[2-(보로노)벤질]메틸아미노)나프탈렌-1,8-디카르복시미드 트리플루오로아세트산 염(0.225 g, 0.4 mmole), 3-카르복시-5-니트로페닐보론산(0.085 g, 0.4 mmole), 디페닐포스포릴 아자이드(0.13 mL, 0.6 mmole), 및 2 ml 의 무수 DMF 를 합하였다. N,N-디이소프로필-N-에틸 아민(0.7 mL, 4 mmole)을 첨가하고, 용액을 20 시간 동안 교반하였다. 에테르(10 ml)를 반 응 혼합물에 첨가하고, 불용성 잔류물을 분리하고, 5 ml 의 CH₂Cl₂ 로 초음파 처리하여 여과되고 진공하에 건조된 오렌지 고체를 수득하였다 (38 mg, 15% 수율). 고체의 순도를 RP-HPLC 로 검사하였다. NMR(dmso-d6/D20, 90/10): δ 2.32(3H, s); 2.82(2H, t); 3.58(2H, t); 3.65(2H, t), 3.70(2H, s); 6.65(1H, d); 7.0-7.3(4H, m); 7.68(1H, t); 8.18(1H, d); 8.42(1H, d); 8.47(1H, d); 8.1-8.35(3H, m).

E. 형광으로 모니터링한 글루코스와의 상호작용에 대한 N-(3-보로노-5-니트로벤즈아미도)에틸-4-(N'-아미노에틸렌-N''-[2-(보로노)벤질]메틸아미노)나프탈렌-1,8-디카르복시미드의 시험

실험을 MeOH/인산염 완충액(PBS, 10 mM, pH=7.4)에서 수행하였다. MeOH/PBS(50/50 부피%) 중의 N-(3-보로노-5-니트로벤즈아미도)에틸-4-(N'-아미노에틸렌-N''-[2-(보로노)벤질]메틸아미노)나프탈렌-1,8-디카르복시미드의 농도는 15 M 이었다. 글루코스 농도는 0 mM 내지 50 mM 이었고, L-소듐 락테이트 농도는 0 mM 내지 7 mM 이었다. 실험을 Shimadzu RF-5301 PC 형광분광계에서 수행하였고: 여기 파장을 430nm 에 설정하고, 방출을 480-650nm 범위, 슬릿 폭 3/1.5nm, PMT의 고감도에서 모니터링하였다.

결과를 도 12 및 13에 보여주는데, 이는 본 실시예의 인디케이터의 형광이 글루코스의 존재로 영향을 받지만, 락테이트의 존재로 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.

실시예 11

6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아민 인디케이터 모노머

A. 9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-N-[(6-아미노헥실아미노)메틸]안트라센.

200 mL CHC1₃ 중의 3-아미노프로필메타크릴아미드(0.775 g, 5.45 mmol, 10.0 당량) 및 tert-부틸 N-(6-아미노헥실)카르바메이트(1.18 g, 5.45 mmol, 10.0 당량) 및 수 개의 결정의 BHT 용액에 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(0.150g, 0.545 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 4 일 동안 암소에서 교반하였 다. 이 때에, CHC1₃ 를 증발하고, 잔류물을 100 mL 에테르에 용해하였다. 유기층을 8 x 125 mL 포화 수성 NaHCO₃ 및 5 x 200 mL 인산 완충액(0.4 m, pH 7.0)으로 세척하였다. 합한 인산 완충액 세척액의 pH 를 Na₂CO₃(포화 수용액)의 첨가로 pH 11 로 조절한 후, 5 x 300 mL CH₂Cl₂ 로 추출하였다. 합한 유기층을 농축하고, 잔류물을 CH₂Cl₂ 중의 5 mL 의 20% TFA 용액에 용해하였다. 혼합물을 주위 온도에서 2 시간 동안 교반하였다. 이 때에, 반응 혼합물을 4 x 10 mL 포화 수성 NaHCO₃ 로 추출하였다. 합한 수성층의 pH 를 Na₂CO₃(포화 수용액)의 첨가로 pH 11 로 조절한 후, 4 x 75 mL CH₂Cl₂ 로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na₂SO₄ 로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 0.068 g(27%) 의 생성물을 수득하였다.

TLC: a) Merck 실리카 겔 60 플레이트, 70/30 CH₂C1₂/CH₃0H 로 Rf 0.16, UV(254/366)로 관찰, 탈보호전; 85/14.5/0.5 CH₂Cl₂/CH₃0H/iPrNH ₂ 로 Rf 0.27, UV(254/366)로 관찰, 최종 생성물.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 8 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 0.400 mL 주입 루프, 360 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 15.5 분.

B. 9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센.

주위 온도의 20 mL CH₂Cl₂ 중의 9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-N-[6-아미노헥실아미노)메틸]안트라센(1.68g, 3.63 mmol) 및 수 개의 결정의 BHT 용액에, 시클로헥산카르복실산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(0.845 g, 3.76 mmol, 1.03 당량) 용액을 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 암소에서 주위 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 이 때에, 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 잔류물을 105 mL 의 90/15 에테르/CH₂Cl₂용액에 용해하였다. 유기층을 4 x 225 mL 인산 완충액(0.4 m, pH 7.0)으로 추출하였다. 합한 인산 완충액 세척액의 pH 를 Na₂CO₃(포화 수용액)의 첨가로 pH 11 로 조절한 후, 6 x 500 mL CH₂Cl₂ 로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na₂SO₄ 로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 1.2 g(60%)의 생성물을 수득하였다.

TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, 85/14.5/0.5 CH₂C1₂/CH₃OH/iPrNH ₂로 Rf 0.30, UV(254/366)로 관찰

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 8 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.100 mL 주입, 0.75mL/분, 0.400 mL 주입 루프, 360 nm 검출, A= 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 17.4 분.

C. 9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]-메틸]안트라센.

30 mL CHC1₃ 중의 9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]-안트라센(1.0g, 1.8 mmol), DIEA(1.81 g, 2.44 mL, 14.0 mmol, 7.8당량), 2-브로모메틸페닐보론산 피나콜 에스테르 (2.14g, 7.20 mmol, 4.0 당량) 및 수 개의 결정의 BHT 용액을 주위 온도에서 60 시간 동안 암소에서 교반하였다. 이 때에, 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물 (9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센)을 150 mL 에테르에 현탁하였다. 유기층을 4 x 50 mL 인산 완충액(0.4 m, pH 7.0)으로 세척하였다. 유기층을 농축하고, 잔류물을 200 mL 0.1N 수성 HCl 중의 에테르에 용해하였다. 수성층을 3 x 50 mL 1:1 에테르:에틸 아세테이트로 세척하고, pH 를 Na₂CO₃(포화 수용액)의 첨가로 pH 11 로 조절한 후, 3 x 150 mL CH₂Cl₂로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na₂SO₄ 로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 적색 오일성 화합물을 수득하였다. 잔류물을 에테르에 용해하고, 진공에서 농축하여 1.17 g(85%)의 황색 고체 생성물을 수득하였다.

TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, 80/20 CH₂Cl₂/CH₃0H 로 Rf 0.59, UV(254/366)로 관찰

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 8 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.100 mL 주입, 0.75mL/분, 0.400 mL 주입 루프, 360 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 19.6 분.

¹H NMR(9:1 d₆-아세톤/D₂0): δ 0.90(m, 2H), 1.03(m, 2H), 1.18-1.30(m, 6H), 1.35-1.48(4H), 1.62(m, 1H, O=C-CH(CH₂)CH₂), 1.66-1.75(m, 7H), 1.77(m, 2H, N-CH₂-CH ₂-CH2-N), 2.52(m, 2H, N-CH ₂-CH₂-), 2.63(m, 2H, N-CH ₂-CH₂-), 2.98(m, 4H, -CH2-NH-C=0), 3.98(s, 4H, 벤젠-CH ₂-N), 4.57(s, 2H, 안트라센-CH ₂-N), 4.59(s, 2H, 안트라센-CH ₂-N), 5.20(t, 1H, J=1.5 Hz, C=CH ₂), 5.46(s, 1H, C=C H ₂), 7.4-7.5(m, 8H, Ar-H), 7.52(m, 2H, Ar-H), 7.95(m, 2H, Ar-H), 8.23(m, 4H, Ar-H)

D. 9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센과의 N,N-디메틸아크릴아미드 히드로겔.

인산 완충액, pH=7.4, 200 mM 중의 N,N-디메틸아크릴아미드(40중량%) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(0.8중량%) 용액을 제조하였다. 9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센(18 mg, 2.15X10^-5 mole) 및 60 mg 의 프럭토스를 2 mL 의 MeOH 과 합하였다. 이 용액을 모든 프럭토스가 용해될 때까지 초음파 처리하고, 증발시켜 고체를 수득하였다. 이 고체에, 모노머를 포함하는 1 mL 의 인산 완충액을 첨가하였다. 10분 동안 초음파 처리 후에, 이 용액을 0.2μM PTFE 멤브레인 필터를 통해 여과하였다. 수성 암모늄 퍼술페이트(20㎕, 5중량%)를 제조물과 합하였다. 생성 용액을 질소로 퍼징한 글로브 박스(glove box)에 위치하 였다. N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(40㎕, 5중량%) 수용액을 모노머 제조물에 첨가하여 중합을 가속하였다. 생성 제조물을 유리 현미경 슬라이드 및 100 μM 스테인레스 강철 스페이서로부터 구축된 주형내로 쏟았다. 질소 대기에서 8 시간 동안 유지한 후에, 주형을 인산염 완충액(pH=7.4)에 위치하고, 현미경 슬라이드를 분리하고, 히드로겔을 제거하였다. 히드로겔을 1 mM 라우릴 술페이트 나트륨염 및 1 mM EDTA 테트라소듐염을 포함한 100 mL 의 인산염 완충액(PBS)으로 3 일 동안 세척하고, 용액을 매일 교환한 후, EtOH/PBS(20/80 부피, 3 x 100 mL), 및 최종적으로 PBS(pH=7.4, 3 x 100 mL)로 세척하였다. 생성 히드로겔 필름을 0.02중량% 소듐 아자이드 및 1 mM EDTA 테트라소듐 염을 포함한 PBS(pH=7.4)에 저장하였다.

E. 글루코스를 이용한 형광의 조절

글루코스 및 락테이트에 의해서 상기 실시예에서 제조된 6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아민 인디케이터/DMA 히드로겔 필름의 형광의 조절을 결정하였다. 도 14 는 0 내지 20 mM α-D-글루코스, 0 내지 10 mM L-소듐 락테이트, 및 4 mM L-소듐 락테이트의 존재하의 0-20 mM α-D-글루코스를 포함한 PBS (pH 7.4, 0.02% NaN₃ 및 1 mM EDTA 를 포함)에서 히드로겔 필름의 상대적인 형광 발광 (I@ 430 nm)을 보여준다. 히드로겔 필름(100㎛ 두께, 8 mm 직경 디스크)을 45도 각도로 PMMA 큐벳에 마운팅하였다. 모든 측정을 낮은 PMT 감도로 370 nm(슬릿 = 3 nm)에서 여기 및 430 nm(슬릿 = 3 nm)에서 발광으로 Shimadzu RF-5301 형광분광계에서 37℃에서 수행하였다. 글루코스 및 L-소듐 락테이트 농도를 YSI Model 2300 STAT plus 글루코스 분석기를 이용하여 검사하였다. 오차 바는 각 데이타 포인트에 대한 3중 값을 갖는 표준편차이다. 형광은 글루코스의 존재로 영향을 받았지만, 락테이트의 존재로 영향을 받지 않았다. 더욱이, 락테이트(4 mM)의 존재는 0-20 mM 글루코스 보정곡선에 유효한 효과를 가지지 못하였다.

실시예 12

2-( 카르복시에틸 )아민 인디케이터 모노머

화합물명:9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센(캡핑되지 않음)

화학식:C₄₀H₄₅B₂N₃0₇

MW: 701.4

물리적 외관: 담황색 분말

용해도: PBS/메탄올, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄

캡핑된 인디케이터: 9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센.

I. 합성

A. 9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(tert-부톡시카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센.

700 mL CHCl₃ 중의 3-아미노프로필메타크릴아미드(12.9 g, 90.7mmol, 4.99 당량), β-알라닌 tert-부틸 에스테르(13.2 g, 90.9 mmol, 5.00 당량) 및 수 개의 결정의 BHT 용액에 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(5.00 g, 18.2 mmol)을 첨가하였 다. 반응 혼합물을 30℃에서 88 시간 동안 암소에서 교반하였다. 이 때에, CHCl₃ 를 증발시키고, 잔류물을 500 mL 에테르에 용해하였다. 용액을 1 시간 동안 교반하였는데, 이 때에 용액으로부터 염이 침전되었다. 에테르 용액을 여과하고, 10 x 350 mL 포화 수성 NaHCO₃ 로 추출하였다. 에테르층을 추가로 6 x 350 mL 인산 완충액(0.2 m, pH 6.5)으로 추출하였다. 합한 인산 완충액 세척액의 pH 를 Na₂CO₃ (포화 수용액)의 첨가로 pH 11-12 로 조절한 후, 6 x 500 mL CH₂Cl₂ 로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na₂SO₄ 로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 오일성 조(crude) 생성물을 수득하였다.

조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 (50 g 플래시(flash) 등급 실리카 겔, 0-5% MeOH/CH₂Cl₂ 단계 그래디언트)로 정제하여 2.04g 의 점착성 황색 고체(23%)를 수득하였다.

TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, 90/10 CH₂Cl₂/CH₃0H 로 Rf 0.29, UV(254/366)로 관찰 및 닌히드린 염색.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.500 mL 주입 루프, 280 nm 검출, A= 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 17.0 분.

B. 9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[2-(tert-부톡시카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센.

50 mL CHCl₃ 중의 9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(tert-부톡시카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센(1.5 g, 3.1 mmol), DIEA(3.16 g, 4.26 mL, 24.4 mmol, 7.9 당량), 2-브로모메틸페닐보론산 피나콜 에스테르(3.64 g, 12.2 mmol, 3.9 당량) 및 수 개의 결정의 BHT 용액을 주위 온도에서 16시간 동안 암소에서 교반하였다. 이 때에, 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 200 mL 에테르에 현탁하였다.

에테르층을 3 x 125 mL 인산 완충액(0.2 m, pH7.0)으로 추출하고, 무수 Na₂SO₄ 로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 잔류 물을 헥산으와 함께 분쇄하여 2.14 g(76%)의 백색 고체를 수득하였다.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.200 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.500mL 주입 루프, 280 nm 검출, A= 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 19.2 분.

C. 9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센.

5 mL 의 20% TFA/CH₂C1₂ 중의 9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[2-(tert-부톡시카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센(0.294 g, 0.319 mmol) 용액을 주위 온도에서 22 시간 동안 암소에서 교반 하였다. 이 때에, 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 에테르와 함께 분쇄하였다. 잔류물을 5 mL 90:10 아세톤/물에 용해하고, 2 시간 동안 교반하였다. 이 때에, 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 물 및 PBS (pH 7.4, 0.02% NaN₃ 및 1 mM EDTA 포함)와 함께 분쇄하여 0.062g (28%)의 담황색 고체를 수득하였다.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.500 mL 주입 루프, 280 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B =MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 17.4 분.

FAB MS: 글리세롤 매트릭스; C₄₆H₅₃B₂N₃O₇ (비스 글리세롤 부가물)에 대한 계산치 [M]⁺ 813; 관측치 [M+2]⁺ 815.

D. 9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센과의 N,N-디메틸아크릴아미드 히드로겔.

인산 완충액, pH=7.4, 200 mM 중의 N,N-디메틸아크릴아미드(40중량%) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(0.8중량%) 용액을 제조하였다. 9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센(14 mg, 2.0x10^-5 mole) 및 60 mg의 프럭토스를 2 ml 의 MeOH 과 합하였다. 이 용액을 모든 프럭토스가 용해될 때까지 초음파 처리하고, 증발하여 고체를 수득하였다. 이 고체에, 모노머를 포함한 1 ml의 인산 완충액을 첨가하였다. 10분 동안 초음파 처리 후에, 상기 용액을 0.2 μM PTFE 필터를 통해 여과하였다. 수성 암모늄 퍼술페이트(20㎕, 5중량%)를 제조물과 합하였다. 생성 용액을 질소로 퍼징한 글로브 박스에 위치하였다. N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(40㎕, 5중량%) 수용액을 모노머 제조물에 첨가하여 중합을 가속하였다. 생성 제조물을 현미경 슬라이드 및 100 μM 스테인레스 강철 스페이서로부터 구축된 주형내로 쏟았다. 질소 대기에서 8 시간 동안 유지한 후에, 주형을 인산염 완충액(pH=7.4)에 위치하고, 현미경 슬라이드를 분리하고, 히드로겔을 제거하였다. 히드로겔을 1 mM 라우릴 술페이트 나트륨염 및 1 mM EDTA 테트라소듐염을 포함한 100 mL 의 인산염 완충액(PBS)으로 3 일 동안 세척하고, 용액을 매일 교환한 후, EtOH/PBS(20/80 부피, 3 x 100 mL), 및 최종적으로 PBS(pH=7.4, 3 x 100 mL)로 세척하였다. 생성 히드로겔 필름을 0.02 중량% 소듐 아자이드 및 1 mM EDTA 테트라소듐 염을 포함한 PBS(10 mM, pH=7.4)에 저장하였다.

II. 글루코스를 이용한 형광의 조절

글루코스 및 락테이트에 의해서 상기 실시예에서 제조된 2-(카르복시에틸)아민 인디케이터/DMA 히드로겔 필름의 형광의 조절을 결정하였다. 도 15 는 0 내지 20 mM α-D-글루코스, 0 내지 10 mM L-소듐 락테이트, 및 3 mM L-소듐 락테이트의 존재하의 0-20 mM 글루코스를 포함한 PBS (pH 7.4, 0.02% NaN₃ 및 1 mM EDTA 를 포함)에서 히드로겔 필름의 상대적인 형광 발광 (I@ 430 nm)을 보여준다. 히드로겔 필름(100㎛ 두께, 8 mm 직경 디스크)을 45도 각도로 PMMA 큐벳에 마운팅하였다. 모든 측정을 낮은 PMT 감도로 370 nm(슬릿 = 3 nm)에서 여기 및 430 nm(슬릿 = 3 nm)에서 발광으로 Shimadzu RF-5301 형광분광계에서 37℃에서 수행하였다. 글루코스 및 L-소듐 락테이트 농도를 YSI Model 2300 STAT plus 글루코스 분석기를 이용하여 검사하였다. 데이타는 각 데이타 포인트에 대한 3중 값의 평균으로서 나타낸다. 형광은 글루코스의 존재로 영향을 받았지만, 락테이트의 존재로 영향을 받지 않았다. 더욱이, 락테이트(4 mM)의 존재는 0-20 mM 글루코스 보정곡선에 유효한 효과를 가지지 못하였다.

실시예 13

2 개의 검출가능한 부분을 포함하는 형광 글루코스 인디케이터 :

화합물명: 9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(N-6-(9-안트라센카르복사미도)헥실아미노카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센(캡핑되지 않음)

화학식: C₇₃H₈₇B₂N₅0₇

MW: 1168

물리적 외관: 담황색 분말

피나콜 캡핑된 화합물: 9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(N-6-(9-안트라센카르복사미도)헥실아미노카르보닐에틸아미노메틸]안트라센.

I. 합성

A. 9-안트라세노일 클로라이드:

안트라센-9-카르복실산(1.2 g, 5.4x10^-3 mole)을 15 ml의 티오닐 클로라이드 와 합하였다. 용액을 2시간 동안 환류 후에, 휘발성 성분을 증발시켰다. 수득된 고체를 고 진공하에 24시간 동안 건조하여 1.3 g 의 물질(정량적인 수율)을 수득하였다. 이 물질을 다음 단계에 사용하였다.

B. N-(6-아미노헥실)-안트라센-9-카르복사미드 염산 염:

50 ml 의 무수 CH₂Cl₂ 중의 9-안트라세노일 클로라이드(1.3 g, 5.4 mmole)을 0℃에서 100 ml의 CH₂Cl₂ 중의 11.6g 의 헥사메틸렌디아민(100 mmole)에 적가하였다. 용액을 1 시간 동안 0℃에서 교반 후, 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고, 200ml의 물을 잔류물에 첨가하였다. 이 혼합물을 초음파 처리하고, 1 시간 동안 교반 후, 여과하였다. 여과된 고체를 진공하에 24 시간 동안 건조하였다. MeOH(50 ml) 및 2 ml의 진한 HCl 을 고체에 첨가한 후, MeOH 을 증발시켰다. 생성 고체를 뜨거운 CH₂Cl₂/MeOH (90/10 부피%)로 세척하고, MeOH 로부터 재결정화하여, 0.51g 의 생성물(26%)을 수득하였다. 생성물의 순도를 HPLC 로 검사하였다.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼 럼, 0.1 mL 주입, 0.75 mL/분 유속, 2 mL 주입 루프, 280 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 16.5 분.

C. 9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(N-6-(9-안트라센카르복사미도)헥실아미노카르보닐에틸아미노메틸]안트라센:

9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노) 벤질]-N-[2-카르복시에틸아미노]메틸]안트라센(40 mg, 4.5x10^-5 mole)을 N-(6-아미노헥실)-안트라센-9-카르복사미드 염산 염(20 mg, 5. 6x10^-5 mole), 디페닐포스포릴 아자이드(15.4 mg, 5.6x10^-5 mole), 및 2 ml 의 DMF 와 합하였다. 디이소프로필에틸아민(39 20 L, 2.44x10^-4 mole)을 혼합물에 첨가하고, 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. DMF 를 고 진공하에 증발시키고, 잔류물을 50ml 의 EtOAc 에 용해하고, 물(3x10ml)로 세척하였다. EtOAc 용액을 분리하고, 건조하고(Na₂SO₄), 증발하여 46 mg 의 고체(87% 수율)를 수득하였다. 물질의 순도를 HPLC 로 검사하였다.

HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 칼럼, 0.1 mL 주입, 0.75 mL/분 유속, 2 mL 주입 루프, 280 nm 검출, A = 물(0.1% HFBA) 및 B = MeCN(0.1% HFBA), 그래디언트 10% B 2 분, 10-80% B 18 분, 80-100% B 2 분, 100% B 2 분, 지연 시간 20.42 분.

FAB 질량 스펙트럼, 글리세롤 매트릭스: C₆₇H₇₅B₂N₅0 ₉(비스 글리세롤 부가물)에 대한 계산치 [M]⁺=1116, 관측치 [M+1]⁺=1117.

II. 히드로겔 필름에 고정된 인디케이터의 형광에 대한 글루코스의 효과

글루코스 인디케이터과의 HEMA/메타크릴산 히드로겔의 제조:

인산 완충액, pH=7.4, 200 mM 중의 2-히드록시에틸메타크릴레이트(4.75 g) 및 메타크릴산(0.25 g)의 50 중량% 용액을 제조하였다. 글루코스 인디케이터(11 mg, 1.0x10^-5 mole) 및 60 mg의 프럭토스를 2ml의 MeOH 과 합하였다. 이 용액을 모든 프럭토스가 용해될 때까지 초음파 처리하고, 증발하여 고체를 수득하였다. 이 고체에, 모노머를 포함한 1 ml의 인산 완충액을 첨가하였다. 10분 동안 초음파 처리 후에, 상기 용액을 0.2 μM PTFE 필터를 통해 여과하였다. 수성 암모늄 퍼술페이트(20㎕, 5중량%)를 제조물과 합하였다. 생성 용액을 질소로 퍼징한 글로브 박스에 위치하였다. N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(40㎕, 5중량%) 수용액을 모노머 제조물에 첨가하여 중합을 가속하였다. 생성 제조물을 현미경 슬라이드 및 100 μM 스테인레스 강철 스페이서로부터 구축된 주형내로 쏟았다. 질소 대기에서 8 시간 동안 유지한 후에, 주형을 인산염 완충액(pH=7.4)에 위치하고, 현미경 슬라이드를 분리하고, 히드로겔을 제거하였다. 히드로겔을 1 mM 라우릴 술페이트 나트륨염 및 1 mM EDTA 테트라소듐염을 포함한 100 mL 의 인산염 완충액(PBS)으로 3 일 동안 세척하고, 용액을 매일 교환한 후, EtOH/PBS(20/80 부피, 3 x 100 mL), 및 최종적으로 PBS(pH=7.4, 3 x 100 mL)로 세척하였다. 생성 히드로겔 필름을 0.02 중량% 소듐 아자이드 및 1 mM EDTA 테트라소듐 염을 포함한 PBS(10 mM, pH=7.4)에 저장하였다.

글루코스 인디케이터를 포함한 히드로겔 필름에 글루코스 및 L-소듐 락테이트의 효과

실험을 가변성 온도 부착물로 장착된 Shimadzu RF-5301 PC 형광분광계에서 수행하였다. 여기 파장을 370 nm, 슬릿 3/3 nm, 낮은 PMT 감도에 설정하고, 발광을 400 내지 600 nm에서 스캔하였다. 글루코스 및 L-소듐 락테이트 농도를 YSI Model 2300 STAT plus 글루코스 분석기를 이용하여 검사하였다.

히드로겔 필름(100㎛ 두께, 둥근모양- 8mm 직경)을 45도 각도로 PMMA 큐벳에 마운팅하였다. 원하는 양의 글루코스, L-소듐 락테이트, 및 L-소듐 락테이트를 갖는 글루코스를 포함하는 인산염 완충액(PBS), pH=7.4 을 수조에서 37℃로 가열하고, 마운팅된 히드로겔을 포함한 PMMA 셀에 위치하였다. 각각의 첨가 후에, PMMA 셀을 37℃에서 45분 동안 평형화하였다. 각 글루코스/락테이트 농도에 대한 형광 강도 측정을 2 개의 상이한 시료에서 수행하고, 평균값을 보정곡선에서 사용하였다. 보정곡선(농도 대 430nm에서의 형광 강도)을 글루코스, L-소듐 락테이트, 및 3 mM L-소듐 락테이트의 존재하의 글루코스에 대해 수득하였다. 결과를 도 16에 보여준다.

실시예 14

6-(3-카르복시프로피온아미도)헥실아미노 인디케이터 모노머

피나콜 캡핑된 화합물: 9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[6-(3-카르복시프로피온아미도)헥실아미노]메틸]안트라센.

캡핑되지 않은 화합물:

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(3-카르복시프로피온아미도)헥실아미노]메틸]안트라센.

합성:

합성을 출발 물질로서 9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-N-[6-(헥실아미노)메틸]안트라센을 이용하여 실시예 11 과 유사한 방식으로 수행할 수 있다. 대조적으로, 아민 출발 물질은 실시예 11에 사용된 시클로헥산카르복실산의 NHS 에스테르 대신에 숙신산의 모노 메틸 에스테르의 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르와 반응한다. 부가적인 염기 가수분해 단계가 합성을 완성시키기 위해 요구된다.

실시예 15

가시광선으로 여기된 글루코스 인디케이터 / 모노머

화합물명: N-(3-메타크릴아미도프로필)-4-[2-N-[[2-(보로노)벤질]-[6-(N-[2-(보로노)벤질]-6-N-(3-카르복시프로판아미도에틸)아미노헥실]]아미노에틸아미노]나프탈렌-1,8-디카르복시미드

화학식: C₄₇H₆₀B₂N₆O_l0

M.W.: 890

화합물은 하기에 제시된 바와 같이 합성될 수 있다:

실시예 16

가시광선으로 여기된 대안적인 글루코스 인디케이터 / 모노머

화합물명: N-부틸-4-[2-N-[[2-(보로노)벤질]-[6-(N-[2-(보로노)벤질]-6-N-(2메타크릴아미도에틸)아미노헥실]]아미노에틸아미노]나프탈렌-1,8-디카르복시미드

화학식: C₄₄H₅₇B₂N₅0₇

M.W.: 789.5

화합물은 하기에 제시된 바와 같이 합성될 수 있다:

Claims

알파-히드록시산 또는 베타-디케톤을 포함할 수 있는 시료 내 글루코스의 존부 및 농도를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은,

a) 글루코스에 대한 둘 이상의 인식 요소를 갖는 화합물에 시료를 노출시키는 단계로서, 상기 화합물은 그 화합물의 글루코스와의 상호작용이 알파-히드록시산 또는 베타-디케톤과의 상호작용보다 안정하도록 배향되어 있고, 상기 화합물은 또한 상기 화합물이 상기 시료 내 글루코스에 노출될 때 농도-의존적 방법으로 변화하는 검출가능 특성을 갖는 검출가능 부분을 포함하는 단계; 및

b)상기 검출가능 특성의 변화를 측정함으로써 상기 시료 내 글루코스의 존부 또는 농도를 결정하는 단계로서, 알파-히드록시산 또는 베타-디케톤의 존재가 상기 결정을 실질적으로 방해하지 않으며, 상기 화합물은

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센 ;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센 ;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(N-6-(9-안트라센카르복사미도)헥실아미노카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(3-카르복시프로피온아미도)헥실아미노]메틸]안트라센 ;

N-(3-메타크릴아미도프로필)-4-[2-N-[[2-(보로노)벤질]-[6-(N-[2-(보로노)벤질]-6-N-(3-카르복시프로판아미도에틸)아미노헥실]]아미노에틸아미노]나프탈렌-1,8-디카르복시미드;

N-부틸-4-[2-N-[[2-(보로노)벤질]-[6-(N-[2-(보로노)벤질]-6-N-(2-메타크릴아미도에틸)아미노헥실]]아미노에틸아미노]나프탈렌-1,8-디카르복시미드; 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 시료는 생리액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 생리액은, 혈액, 혈장, 혈청, 간질액, 뇌척수액, 소변, 타액, 안구액, 림프, 누액, 땀 및 생리적 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물을 용액 중의 시료에 노출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물을, 고체 지지체 상에 또는 그 내부에 고정시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 폴리머 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 이식용 기기에 결합되고, a)단계는 생체 내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
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9-[N-[2-(5,5-디메틸[1,3,2]디옥사보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)에틸아미노]메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸[1,3,2]디옥사보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]-메틸]안트라센;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)-에틸아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센 ;

9,10-비스[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]-메틸]안트라센;

9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸[1,3,2]디옥사보리난-2-일)벤질-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸안트라센 ;

9,10-비스[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)-프로필아미노]메틸안트라센;

9-[N-[2-(5,5-디메틸[1,3,2]디옥사보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸[1,3,2]디옥사보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-히드록시에톡시)-에틸아미노]메틸]안트라센;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)-프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센;

9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸[1,3,2]디옥사보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센 ;

9,10-비스[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(2-메타크로일옥시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센;

9,10-비스[N-(2-보로노벤질)-N-[5-아미노펜틸아미노]-메틸]안트라센;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센;

9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센 ;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센;

9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-l,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센;

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(N-6-(9-안트라센카르복사미도)헥실아미노 카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센;

9-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(N-6-(9-안트라센카르복사미도)헥실아미노 카르보닐에틸아미노메틸]안트라센;

9-[N-[2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤라노)벤질]-N-[6-(3-카르복시프로피온아미도)헥실아미노]메틸]안트라센; 및

9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(3-카르복시프로피온아미도)헥실아미노]메틸]안트라센; 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물.
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9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-N-[(6-아미노헥실아미노)메틸]안트라센.
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9-[N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]메틸]안트라센.
9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[6-(시클로헥산카르복사미도)헥실아미노]-메틸]안트라센.
9-[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸]-10-[N-(2-보로노벤질)-N-[2-(카르복시에틸)아미노]메틸]안트라센.