KR100996846B1

KR100996846B1 - 비점막 상피세포를 이용한 각막 또는 결막 조직 시트

Info

Publication number: KR100996846B1
Application number: KR1020080019742A
Authority: KR
Inventors: 김재찬; 이수현; 정행선; 류양환; 박현숙
Original assignee: 주식회사 엠씨티티
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2008-03-03
Publication date: 2010-11-26
Anticipated expiration: 2028-03-03
Also published as: KR20090094664A

Abstract

본 발명은 양막 및 양막 상에서 증식시킨 비점막 상피세포를 포함하는 각막 또는 결막 조직 시트에 관한 것으로, 구체적으로는 양막 및 양막 상에 비점막 상피세포를 접종하고, 피더세포의 공존 하에서 배양하여 충층화시킨 비점막 상피세포 유래 각막 또는 결막 조직 시트에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 각막 또는 결막 조직 시트는 종래의 인공각막과 비교하여 실제 사람 각막 또는 결막과 매우 근접한 분자 마커 발현패턴을 보이고, 풍부한 뮤신분비 세포를 포함하여 안구표면 안정화에 기여하며, 이식 후 생착률과 지속성이 높은 영구적인 각막 또는 결막 이식재로서 이용될 수 있다.

비점막, 각막, 결막, 상피세포, 안구 표면 질환, 뮤신, 점막, 양막

Description

비점막 상피세포를 이용한 각막 또는 결막 조직 시트 {Tissue sheet of Cornea or Conjunctiva using Nasal mucosa epithelium}

본 발명은 양막 상에서 증식시킨 비점막 상피세포를 포함하는 각막 또는 결막 조직 시트에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 양막 상에 비점막 상피세포를 접종하고, 피더세포의 공존 하에서 배양하여 충층화시킨 비점막 상피세포 유래 각막 또는 결막 조직 시트에 관한 것이다.

스티븐슨 존슨 증후군이나 안천포창, 화학 화상 등에 의한 안구 표면 질환은 각막과 결막이 망가지면서 각막상피와 각막의 간세포(윤부)도 손상을 받게 되며, 손상된 안구표면으로 혈관들이 자라게 되고 각막에 혈관화 및 혼탁을 일으켜서 결국 실명에 이르는 치명적인 질환들이다. 이러한 질환들로 인한 시력상실에 대한 치료법으로 과거 10년 동안 동종 각막 이식술(타인의 기증각막을 이용한 이식술), 자가 각막 윤부(각막줄기세포가 있는 부분, 각막의 가장자리)이식술, 양막 이식술, 배양된 각막상피세포 이식술 등이 발전하였으나 여러 가지 한계점으로 인해 현실적 으로 불가능한 경우가 많다.

동종 이식의 경우, 각막 이식이 필요한 환자 중 각막 기증을 통해 각막 이식을 받을 수 있는 환자는 약 1% (WHO 보고)에 불과하며, 이식 후 장기적인 면역억제제의 사용으로 여러 부작용이 초래될 수 있다.

자가 각막 윤부 이식술 경우, 손상되지 않은 안구의 자가 윤부를 이식하는 시술로써, 대개의 경우 양쪽 눈을 침범하기 때문에 자가 이식이 힘들고, 만약 자가 이식이 가능하다고 하여도 공여조직이 충분하지 못하고, 손상되지 않은 안구의 간세포에도 손상을 주는 단점을 가지고 있다.

이에 인공각막 개발의 필요성이 제기되었고, 고분자로 이루어진 연질의 부드러운 합성 인공 각막(AlphaCor, 호주)등이 상용화 되었으나 인공 각막으로의 세포의 침윤, 단백질 침착으로 인해 인공각막 투명도 유지의 문제, 각막 하층인 기저층의 손실등과 같은 부작용이 일어나 영구적으로 안구에 이식되지 못하고 제한적인 수명을 가진 것으로 보고 되었다. 그러므로 조직 공학 인공 각막 필요성이 증폭되는 가운데, 양막에 각막 윤부 세포를 배양, 증식시켜 이식하는 연구와 구강상피를 배양하여 각막에 이식하는 연구가 최근 진행 중이다(Takahiro Nakamura, et al., IOVS, January 2003, Vol. 44, No.1; Kohji Nishida, M.D., et al., The new england journal of medicine 2004;351:1187-96. 2004;351:1187-96). 양막은 항원성이 없고, 생체콜라겐과 유사하며 여러 가지 사이토카인(cytokine) 및 성장인자(growth factor)를 가지고 있으며 혈관신생 억제인자를 함유하고 있어 각막 이식 및 조직재생(tissue engineering) 분야에서 좋은 재료로 유용하게 사용되고 있다.

구강점막 세포를 사용하는 이유는 접근이 용이하며 많은 양의 점막을 얻을 수 있고, 공여부위에 반흔이 남지 않으며 구강점막 상피세포는 교체시기가 짧아서 배양기간이 짧고 실험실 배양조건하에서 각질화 되지 않고 오랜 동안 유지가 가능하기 때문이었다. 그러나 본 발명자들은, 구강점막이 각막상피세포 재건에는 효과적일 수 있으나 뮤신을 분비하는 술잔세포를 함유하고 있지 않는데, 예를 들어 도 1에서와 같이, 사람 정상 결막(도 1의 a), 사람 정상 구강점막(도 1의 b) 및 사람 정상 비점막(도 1의 c)의 뮤신 염색 결과를 보면, 각각 도 1의 a에서는 보라색의 뮤신분비 술잔세포가 결막에서 발견되나, 도 1의 b에서는 구강점막에서는 발견되지 않으며, 도 1의 c에서는 비점막 상피에서는 풍부하게 발현됨을 확인할 수 있다. 따라서 술잔세포를 포함하여야 하는 결막상피세포의 재건에는 효과가 적으며 눈물의 안정화를 위해서 필요한 점액을 생성할 수 없다는 단점이 있음을 발견하고, 이러한 단점을 보완하기 위해서 술잔세포를 포함하는 비점막 상피세포를 이용하여 각막 또는 결막을 재건할 수 있는 방법을 연구하게 되었다. 또한 본 발명자들은, 안구손상이 각막에만 국한된 경우보다는 각막과 결막이 모두 손상된 경우가 대부분이기 때문에 각막 재건을 위한 각막이식술이나 윤부이식술 보다 먼저 안구 미세환경의 개선이 선행되어야 함을 인식하게 되었다. 특히 정상적인 눈물막의 유지는 안구표면 상피세포의 분화와 증식에 중요한 역할을 하며 건성안이 심화되면 각막상피의 탈락을 유발하고 각막의 간세포도 손상을 받게 되어 시력에도 심각한 영향을 주게 된다.

또한 건강한 술잔세포(goblet cell, 뮤신분비세포)를 포함한 정상결막세포를 배양, 이식하여 안구의 미세환경을 복구시킬 수 있다면 안구건조증의 근본적인 치료법이 될 수 있을 뿐만 아니라 난치성각결막염을 앓고 있는 환자에게도 가장 생체적합성이 우수하고 부작용이 적은 치료법으로써 기존의 인공각막 성공률도 높이고 나아가 영구적인 시력보존을 가능하게 할 것이다.

그리고, 전 세계적으로 동물보호와 복지라는 측면에서 동물실험이 사회적인 비판을 받음에 따라 동물실험을 제한하고 그 대안으로 동물실험을 대체할 수 있는 인비트로 시험법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 이러한 사람 유래 세포원으로부터 배양한 다양한 조직 모델을 이용한 대체시험법이 개발되어 있다. 특히 화장품 안전성 시험에 있어 인간의 질병 극복이 아닌 미용을 위한 제품 개발에 동물의 희생이 정당한가에 대한 윤리적 문제가 대두되고, 사람 배양 조직 모델을 이용한 대체시험법이 보급되면서, 유럽연합의 제7차 개정법령(Cosmetic Directive 76/768/EEC)은 2009년부터 동물실험 화장품의 생산과 판매를 금지하고 있으며, OECD 테스트 가이드라인(OECD TG 431) 에서는 인공 피부모델을 이용한 피부 부식성 시험을 표준시험법으로 채택하고 있다. 본 발명의 배양 비점막 상피의 경우 기관 상피와 동일한 조직학적 구조를 가지고 있어 흡입 약물의 흡수, 전달 호흡기 염증 등의 동물 대체법 개발에 응용 될 수 있을 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 술잔세포를 포함하는 비점막 상피세포를 이용하는 경우, 뮤신을 분비하는 각막 또는 결막조직 시트를 재구성할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 뮤신분비 세포를 포함하는 각막 또는 결막조직 시트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 각막 또는 결막조직 시트를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 양막에서 증식시킨 비점막 상피세포를 포함하는 각막 또는 결막 조직 시트를 제공한다.

본 발명에서, 용어 “각막 또는 결막 조직 시트(sheet)”란 비점막 상피세포 유래의 세포가 중층화한 세포층을 말하는 것으로, 비점막 상피부의 세포를 출발원료로 하여, 이것을 캐리어 상에서 배양해 증식시켜, 적어도 일부가 분화 및 중층화하여 형성된 세포층을 일컫는다. 여기서, 캐리어로는 양막 뿐 아니라 피브린, 콜라젠, 다양한 생물 유래의 실질조직, 또는 생체적합성 조직공학용 지지체가 사용될 수 있으나, 본 발명에서는 양막을 캐리어로 사용하였다. 이러한 각막 또는 결막 조직 시트는 각막 또는 결막이 손상, 결손된 환자에 대한 이식 재료(각막 또는 결막 상피의 대체)로서 이용될 수 있다. 이식 시에는, 수술용 봉합사를 이용해 이식편을 주위 조직에 고정하여 생존을 촉진하거나 의료용 접착제인 피브린 글루(fibrin glue)를 이용하여 생착시키는 것이 바람직하다. 또한, 이식 후에는, 치료용 콘택트 렌즈로 이식부 표면을 일시적으로 피복하여 보호하는 것이 바람직하다.

본 발명의 각막 또는 결막 조직 시트에서, 상기 비점막 상피세포는 뮤신분비세포를 포함하는 것을 특징으로 한다. 종래 알려져 있는 구강점막 유래 각막 재건용 시트는 뮤신을 분비하는 술잔세포(goblet cell, 뮤신분비세포)를 함유하고 있지 않아 눈물의 안정화를 위한 점액을 생성할 수 없다는 단점이 있었다. 그러나 본 발명의 비점막 유래 각막 또는 결막 조직 시트는 건강한 술잔세포를 포함하고 있으므로 각결막 조직으로의 이식 후 뮤신 분비가 가능하게 된다.(도 1 및 도 6 참조) 또한 본 발명의 시트를 이용한 인공각막 또는 인공결막을 이식하게 되면 안구 본래의 미세환경을 복구시킬 수 있어, 안구건조증 등의 근본적인 치료법이 될 수 있을 뿐만 아니라, 난치성 각결막염을 앓고 있는 환자에게도 적합하여 부작용이 적은 치료법으로서 사용될 것으로 판단된다.

본 발명의 실시예에서는 본 발명의 조직 시트를 이용할 경우, 안구 본래의 미세환경이 복구될 수 있는지를 확인하기 위하여, 상피 간세포 표지자인 p63(Chemicon), 각질화된 상피 표지자인 사이토케라틴 1(Novoco(a)stra)과 사이토케라틴 10(DAKO), 각막 상피 표지자인 사이토케라틴 3/12(Chemicon), 상피 기저층 표지자인 사이토케라틴 5(Abcam), 결막 상피 표지자인 사이토케라틴 13(Biogenex), 상피 기저층 표지자인 CD44(Bender Medsytem), 각막/결막/비점막에서 발현하는 뮤신5에 대한 표지자인 MUC5AC(LAB vision), 각막/결막/비점막에서 발현하는 뮤신1에 대한 표지자인 MUC1 (Novocastra), 각막의 혈관유입억제인자 thrombospondin-1 (TSP-1, SANTACRUZE) 에 대한 항체를 이용하여 상기 마커 단백질들의 발현을 조사 하였고, 그 결과 본 발명에서 목적으로 하는 조직학적 특성을 모두 가짐을 확인하였다.

또한, 최근 비점막 자체를 이식, 눈물의 안정화에 기여하고 건안을 해소하여 각막이식의 보조요법으로써 사용된 논문이 보고된 바 있다(Hartmut Wenkel, et al., Br. J. Ophthalmol. 2000;84;279-284). 그러나 본 발명은 비점막 조직 자체를 이식하는 것이 아닌, 비점막 상피세포를 배양하여 얻어진 상피세포 시트를 이용함으로써, 인체로부터 조직을 얻기 위해 필요한 기술적, 경제적 어려움이 적고 비교적 소량의 세포로부터 얻을 수 있으므로, 각막 또는 결막 재건에 보다 효과적인 생체재료라고 할 수 있다. 또한 본 발명에서 사용된 비점막 상피는 뮤신을 분비하는 술잔세포를 포함하고 있을 뿐 아니라 분화된 각막상피에서만 특이적으로 발현되는 케라틴 3을 발현하며 각질화된 케라틴인 케라틴 1, 케라틴 10을 발현하지 않는 특성이 있으므로, 비점막 세포를 이용한 인공각막 재건 시 실제 각/결막 상피와 구조 및 기능이 유사할 것으로 판단된다.

본 발명의 각막 또는 결막 조직 시트에서, 상기 양막은 본 발명의 비점막 상피세포의 배양을 위한 기질로서 그대로 이용할 수도 있으나, 양막으로부터 소파 처리 등에 의하여 상피를 제거한 양막을 이용하는 것이 바람직하다. 여기서, “양막”은 자궁과 태반의 최표층을 덮는 막으로서, 콜라겐이 풍부한 실질 조직상에 기저막, 양막 상피층으로 구성된다. 인체의 모든 상피 세포는 기저막, 혹은 기저층에 단단히 부착하여 시트를 이루고 있으며, 이러한 기저막의 성분은 콜라겐 타입 IV, 라미닌 5 등으로 구성되어 있다. 양막을 이용하는 이유 중 한 가지가 이러한 기저 막 성분을 이용하여 배양한 비점막 상피세포를 단단히 결합시키는 매개체로써 사용하기 위함이다. 비점막 상피가 부착할 수 있는 기저층이 드러나게 하기 위하여, 효소 처리하여 기저층은 남기고 양막 상피만을 선택적으로 제거하게 된다. 본 발명에서 사용하는 양막은 양막 상피세포만을 제거하고 기저막 성분이 잘 보존되어 있어 세포의 부착과 증식에 긍정적인 역할을 하게 된다. 본 발명에서 사용된 이러한 양막의 특징은 도 4에서 볼 수 있는데, 양막 상피세포는 남아있지 않고 기저막의 콜라겐 타입 IV는 보존되어 있음을 보여주고 있으며(도 4의 c), 기저막의 라미닌 5도 기저막 전층에서 발현됨을 보여주고 있다(도 4의 d).

본 발명에 사용된 양막은, 예를 들어 분만 시 산후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 등으로부터 수득할 수 있다. 구체적으로는 분만 직후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 및 제대(탯줄)로 이루어지는 일체물을 처리하여, 정제함으로써 인간 양막을 조제할 수 있다. 처리 및 정제방법은 당업계에 공지된 방법을 채용할 수 있다. 즉, 분만 시에 얻어지는 태아막으로부터 양막을 박리하고, 초음파 세정 등의 물리적 처리 및 효소 처리 등에 의해 잔존 조직을 제거하고, 적절하게 세정함으로써 인간 양막을 조제할 수 있다.

본 발명에서, 상기 양막 상에서 비점막 상피세포의 배양에 이용되는 배지는 상기 세포를 증식시키고 중층화할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상피 세포의 성장에 통상 이용되는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 햄 F12배지(Ham's F12 medium)를 소정의 비율로 혼합하고, FBS, 성장 인자, 항생 물질 등을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.

본 발명의 각막 또는 결막 조직 시트에서, 상기 비점막 상피세포는 양막 상에서 중층화된 것을 특징으로 한다. 여기서 “양막 상에서 중층화”란, 비점막 상피세포가 양막에 부착, 고르게 증식하여 단층의 컨플루언트(confluent)한 시트(sheet) 상태가 된 후, 상기 비점막 상피세포층이 공기 중에 완전히 노출된 과정을 거쳐 분화가 이루어져 3-5층의 세포층을 형성하게 되는 것을 의미한다(도 6의 b).

본 발명의 각막 또는 결막 조직 시트에서, 상기 양막 및 양막 상에서 증식은 피더세포(feeder cell)의 존재 하에서 배양하는 것이 바람직하다. 상기 피더세포는 다양한 성장인자를 분비하고 세포간물질을 제공함으로써 상피세포의 증식과 부착을 돕는 역할을 한다. 상기 피더세포층은 비활성 유사 분열상태를 나타내는데, 이러한 비활성 유사분열이 되도록 하는 방법은 감마선 조사 또는 마이토마이신-C 처리에 의해 수행될 수 있다. 이러한 비활성 처리는 피더세포 자체가 증식하여 비점막 상피세포의 증식을 저해하는 것을 방지하고, 비점막 상피세포의 증식 효율을 향상시키기 위해서이다.

본 발명에서, 상기 양막은 비점막 상피세포의 캐리어로서의 역할을 할 뿐만 아니라, 공배양시 피더세포가 비점막 상피세포로 침입하는 것을 방지하는 격리막으로서의 역할도 할 수 있다. 따라서, 최종적으로 얻어지는 각막 또는 결막 상피형 시트 내에 피더세포가 혼재할 우려가 없어진다. 이는 피더세포에 의한 면역 거부 반응의 문제가 없는 각막 또는 결막 상피형 시트의 제조가 가능하다는 것을 의미하고, 임상적으로 매우 의의가 있다.

본 발명의 실시예에서는, 상기 양막을 지지하기 위한 지지체로서 스테인레스 스틸 재질의 메쉬(TED PELLA사, stainless steel mesh, 150mm squares)를 사용하였다. 상기 지지체는 일정한 높이의 레그(leg)를 갖도록 디자인함으로써 바닥에 접종된 피더세포로부터 격리되며, 또한 피더세포가 분비한 다양한 성장인자의 투과를 돕는 역할을 한다. 도 3의 a는 스테인레스 스틸 메쉬를 배양접시에 넣은 측면의 모습이고, 도 3의 b는 스테인레스 스틸 메쉬 위에 지름 2 cm의 양막을 정치 고정시킨 모습을 보여준다.

본 발명에서, 피더세포의 밀도는, 예를 들면 약 1× 10² 개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1× 10² 개/cm² 내지 약 1× 10⁷ 개/cm², 더욱 바람직하게는 약 1× 10²개/cm² 내지 약 1× 10⁵ 개/cm²로 할 수 있다. 비점막 상피 세포수에 대한 비로 말하면, 사용하는 피더세포 수를, 예를 들면 비점막 상피 세포수에 대하여 0.001 내지 100배, 바람직하게는 0.01 내지 1배로 배양을 행할 수 있다. 피더세포수가 적으면 비점막 상피 세포의 증식율이 저하되며, 지나치게 적은 경우에는 양호한 비점막 상피 세포의 중층화가 얻어지지 않는다. 한편, 피더세포수가 지나치게 많은 경우에는, 오히려 비점막 상피 세포의 증식율을 저하시키므로 바람직하지 않다.

본 발명에 있어서, 상기 피더세포는 당업계에서 공지된 어떠한 세포도 가능하며, 그 예로서 마우스 3T3, 인간 섬유아세포, 인간 각막 케라토사이트, 양막 상피세포, 골수유래 줄기세포 및 지방유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.

본 발명의 각막 또는 결막 조직 시트에서, 상기 비점막 상피세포는 비중격(septum) 또는 비갑개(turbinate) 조직으로부터 유래된 것이 바람직하다. 상기 비중격 또는 비갑개 조직에서 메스 등으로 미세하게 절제하거나 수술용 칼날과 같은 도구를 이용하여 상피 표면을 수차례 긁어내는 방법 등으로 행할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 각막 또는 결막 조직 시트의 제조방법을 제공한다:

a) 비점막 상피세포를 제조하는 단계;

b) 상기 비점막 상피세포를 양막 상에 접종하는 단계; 및

c) 상기 접종된 비점막 상피세포를 피더세포와 함께 배양하여 중층화하는 단계.

본 발명에서, 상기 a)단계에서, 비점막 상피세포의 제조는 상술한 바와 같이, 비점막 조직을 작은 조직으로 절단하여 디스파아제를 처리하고 난 후 수술용 도구를 이용하여 조직 표면을 긁어내어 적절한 배지(예컨대, BEGM과 같은 기관상피 배양 배지)에서 배양함으로서 제조할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서, 상기 b)단계에서, 양막은 트립신-EDTA를 이용하여 양막 상피세포를 제거한 양막인 것인 것이 바람직하다. 상기 트립신-EDTA는 당업계에서 통상적으로 사용되는 트립신-EDTA 용액(Sigma 사, 미국)을 적절한 농도로 희석하여 사용할 수 있다. 상기 트립신-EDTA는 생리학적으로 적합한(physiologically compatible) 완충액, 예를 들어 인산 완충된 식염수(phosphate buffered saline) 혹은 배지로 세척함으로써, 제거할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서, 상기 c)단계에서, 배양은 DMEM과 Ham's F12의 혼합배양액으로 덮여있는 상태로 2-10일간 배양하여 양막상에 고르게 자라도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에서, 상기 c)단계 후, 중층화된 비점막 상피세포를 공기중에 노출시켜 2-14일간 배양하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 양막 상에 접종한 비점막 상피세포의 배양은 크게 2단계로 실시된다. 첫 번째 배양단계(양막에 비점막 상피세포층이 단층(monolayer)으로 컨플루언트(confluent)되는 시기까지의 배양)는 통상적인 배양조건인 서브머지(submerge) 배양조건에서 실시된다. 첫 번째 배양의 기간은 2-10일이 바람직하고, 7일이 가장 바람직하다. 두 번째 배양단계는 기-액(air-liquid) 배양 조건에서 실시되며, 두 번째 배양의 기간은 2-14일이 바람직하고, 7일이 가장 바람직하다. 본 발명에서, 서브머지 배양조건은 양막 상에 접종한 비점막 상피세포층이 배양액으로 덮여 있는 상태를 의미한다. 이 조건에서는 비점막 상피세포가 양막에 부착, 고르게 증식하여 단층의 컨플루언트(confluent)한 시트(sheet) 상태가 된다. 또한 기-액 배양조건은 양막 상에 접종한 비점막 상피세포층이 공기 중에 완전히 노출된 상태를 의미한다. 이 조건에서 컨플루언트한 상피세포층은 실제 인체에서와 같이 공기에 노출되게 되며, 영양분의 공급은 배지와 접촉하고 있는 양막을 통해서 이루어진다. 기-액 배양 과정을 거쳐 분화가 이루어져 중층화된 상피 시트를 형성하게 된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 양막 및 상기 양막 상에서 증식시 킨 비점막 상피세포를 포함하는 동물실험 대체용 인공 각막 또는 결막 조직 시트를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 인공 각막 또는 결막 조직 시트는 사람의 각막 또는 결막조직의 상피와 실제로 동일한 조직학적 구조를 가지고 있기 때문에 흡입 약물의 흡수, 전달 호흡기 염증 등의 동물실험이 필수적인 화장품, 의료용품, 의약품 등 분야에서 동물시험을 대체할 목적으로 사용되거나 대체시험법의 개발에 응용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 비점막 상피세포의 분리

코의 비중격(septum) 혹은 비갑개(turbinate) 조직으로부터 비점막 조직을 분리하였다. 분리된 비점막 조직을 50 μg/mL의 항생제(Gentamicin; Gibco)가 포함된 인산염 완충 염수(PBS)에서 세척하여 응고된 혈액과 오염물들을 제거하였다. 수세한 비점막 조직을 5mm의 작은 조직으로 절단한 다음, 1mg/mL 디스파아제(Dispase; Roche, 독일)를 37℃에서 2시간 처리 후 수술용 칼날을 이용하여 상피의 표면을 수차례 긁어 비점막 상피세포를 수득하였다. 이용되는 디스파아제는 상 피세포의 기저표면(basal surface)과 기저막(basement membrane) 사이의 경계면에 작용하여 상피와 기질의 결합력을 약화시켜 물리적 자극에 의한 상피세포의 탈락을 돕는다. 이렇게 분리된 비점막 상피세포는 배양을 거쳐 세포수를 확장하여 3차원 배양에 이용되거나 혹은 분리 직후 바로 3차원 배양에 이용될 수 있다.

실시예 2. 비점막 상피세포의 배양

실시예 1에서 분리된 비점막 상피세포는 기관상피 배양 배지인 BEGM(Bronchial epithelial growth media; Lonza, 미국)으로 고르게 현탁한 후, 5× 10³/cm²의 세포밀도가 되도록 접종(seeding)하여 배양하였다. 상기 BEGM에는 세포배양에 통상적으로 이용되는 성장인자인 EGF(epidermal growth factor)를 비롯하여 인슐린, 트랜스페린, 하이드로코티손, 레티노인산, 에피네프린, 뇌하수체추출물, 항생제 등이 포함되며, 접종 후 배양과정은 다음과 같다. 상기 접종한 비점막 상피세포를 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하고 배지는 2일에 한 번 교체하였으며, 배양접시의 세포가 과밀해지면 배양접시의 비점막상피 세포 배양배지를 제거하고, 인산염 완충 염수(PBS)로 한번 세척한다. 트립신-EDTA 용액 1.5mL을 첨가하여 배양기에서 10분간 2mL의 트립신-EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetic acid)로 처리하여 배양접시로부터 비점막 상피세포를 회수하였다. 비점막 상피세포의 수를 계산하고 300×중력가속도(g)에서 원심분리하여 비점막 상피 세포만을 남겼다. 원심분리한 상등액을 제거하고, 배양배지를 첨가하여 비점막 상피세포를 고르게 현탁한 후, 100mm 배양접시에 3× 10⁵개의 세포수가 되도록 세포현탁액을 첨가해 계대 배양하였다.

도 2는 비점막 상피세포의 초기 배양 결과를 보여준다. 도 2에서, (a)는 사람 정상 비점막 조직, (b)는 상피만 순수 분리된 후 남아있는 조직 염색 사진, 그리고, (c)는 분리 배양한 비점막 상피세포의 현미경 사진을 나타낸다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에서는 사람 정상 비점막 조직으로부터 디스파아제와 물리적 자극으로 비점막 상피세포만을 효과적으로 분리, 배양하였으며, 배양된 비점막 상피세포가 상피세포 특이 형태인 조약돌 모양을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3. 피더세포의 제조

비점막 상피세포의 배양은 피더세포를 이용하여 배양된다. 보다 바람직하게는 상기 피더 세포층은 비활성 유사상태(mitotically inactive)를 나타낸다. 유사분열 비활성이 되게 하는 방법은 감마선 조사 혹은 마이토마이신 C 처리에 의해 될 수 있으며 바람직하게는 유사분열 비활성상태의 피더세포는 마이토마이신 C 처리에 의해 된 것이다. 본 발명에서는 피더세포로서 섬유아세포(3T3 세포)를 사용하였다.

구체적으로, 100mm 배양접시에 10⁴cells/cm² 으로 3T3 세포를 접종하고 37℃, 5% CO² 배양기에서 18시간 부착시킨 3T3 세포를 4㎍/mL 마이토마이신 C 용액 10mL 에 2시간 침지시켜, 3T3의 증식 활성을 억제하였다. 마이토마이신 C용액 제조에 사용된 배양 배지는 통상적으로 섬유아세포 배양에 사용되는 F-배지를 사용하였다. F-배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 Ham's F12의 3:1 혼합배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 포함한다. 계속해서, 인산 완충액(PBS)으로 수회 세정하여 마이토마이신 C를 제거한 후, 다시 F-배지로 교환하여 피더세포를 준비하였다.

실시예 4. 비점막 상피세포를 이용한 비점막 상피 시트(인공 각막 또는 결막)의 형성

상기 실시예 1과 2에 의해 수득한 비점막 상피세포가 각막 혹은 결막으로 재생될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 양막 상에서 3차원 배양을 실시하고 면역 조직 염색으로 각막 혹은 결막 마커 발현을 확인하였다.

상피를 제거한 양막을 기질로 하여, 비점막 상피세포를 실시예 3에서 준비한 섬유아세포와 아래와 같이 공배양하였다. 배양기구는 100mm 배양용기(dish)와 도 3와 같은 형태의 스테인레스 스틸 재질의 메쉬(TED PELLA사, stainless steel mesh, 150mm squares)를 이용하였다. 또한 양막은 분만 후 자연적으로 적출되는 태반으로부터 분리하여 사용하였으며, 양막 상피세포(amnion epithelium)를 트립신-EDTA를 이용하여 제거한 후 사용하였다. 도 4b 내지 5d는 양막에서 양막상피세포만을 선택적으로 제거하고 난 후, 양막의 기저막 성분에 대한 조직 면역 염색 결과이다. 양막은 비점막 상피세포의 부착을 돕는 기저표면을 제공하며 배양 비점막 세포를 시트(sheet)형태로 전달하는 매개체로써 사용되었다.

구체적으로, 실시예 3에서 조제된 섬유아세포 피더에 스테인레스 스틸 재질의 메쉬를 얹고, 양막상피가 제거된 양막의 기저막이 윗면이 되도록 하여 메쉬 위에 양막을 정치하여 접착시킨다. 이 때 배양배지의 양은 최소한으로 양막 높이를 넘지 않는 범위에서 사용하여 이후 비점막 세포현탁액의 접종시 세포현탁액이 배양배지로 희석되지 않고 양막 표면에 머무를 수 있도록 한다. 상기 실시예 1 또는 실시예 2에 의해 수득된 비점막 상피세포 현탁액을 배양배지를 이용하여 약 1× 10⁴/cm² 내지 5× 10⁵/cm²의 세포밀도가 되도록, 50-100㎕의 부피로 희석하여 메쉬 위에 정착시킨 양막에 고르게 접종하였다.

상기와 같이, 접종된 비점막 상피세포는 섬유아세포의 존재 하에서 배양하게 되는데, 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하고 배지는 2일에 한 번 교체하며 배지로는 동물세포 배양을 위하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 Ham's F12의 3:1 혼합배지를 사용하였다. 이 배지는 동물세포 증식을 위해, 10% 우태아혈청(FBS), 5㎍/mL 인슐린, 5㎍/mL 트랜스페린, 400ng/mL 하이드로코티손, 10^-9M 콜레라독소, 10㎍/mL 상피성장인자(EGF), 10unit/mL 페니실린 및 10㎍/mL스트렙토마이신을 포함한다.

상기 배양액으로 덮여 있는 서브머지(submerge) 상태로 7일 배양하여 양막에 비점막 상피세포가 고르게 자라도록 한 후(도 2의 a), 비점막 상피세포층을 공기에 노출시키는 기-액 배양(air-liquid culture), 이른바 에어 리프팅법으로 7일 추가 배양하여 중층화된 상피 시트로의 분화를 유도하였다(도 2의 b). 에어 리프팅법이란, 배지의 액면을 양막 상에 형성된 비점막 상피세포 층면까지로 하여, 상기 세포층의 표면을 공기 중에 노출시키는 방법이다.

도 4에서, (a)는 양막의 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 사진이며, (b)는 트립 신-EDTA를 이용하여 양막 상피를 제거한 H&E 사진을 나타낸다. (c)와 (d)는 양막 상피만을 선택적으로 제거 한 후 양막에 남아있는 기저막 성분에 대한 면역 조직 염색에 대한 결과로, (c)는 콜라겐 타입 IV에 대한 면역 염색 결과이고 (d)는 라미닌-5에 대한 면역 염색 결과이다. 상피는 완벽히 제거되었으며 주요 기저막 성분인 콜라겐 타입IV 와 라미닌-5 가 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. (e)는 상피를 제거한 양막에 비점막 상피세포를 접종하여 48시간, (f)는 2주 배양 후 현미경 사진으로, (d)에서 양막 상피가 완벽히 제거되었음을 확인할 수 있었으며, (e)와(f)에서 비점막 상피 세포가 양막의 표면에 고르게 부착되어 시트를 형성함을 확인할 수 있었다.

도 5는, 3차원 배양된 비점막 시트를 링 형태의 니트로 셀룰로스 막에 부착시킨 모습이다. 기-액 배양으로 최종 분화된 비점막 세포가 얇고 투명한 시트를 형성함을 확인하였다. 비점막 세포가 부착된 면이 위가 되도록 니트로 셀룰로스 막에 부착시키며 시술시 적당한 크기로 자르거나 시료 채취용 펀치(biopsy punch)를 이용하여 잘라낸 후 사용할 수 있다.

실시예 5. 배양된 비점막 상피 시트의 조직학적 특성 확인

1)H&E 염색

파라핀에 포배된 3차원 배양물 조직을 두께 4 μm로 절편하여 슬라이드에 붙인 다음, 슬라이드를 자이렌(xylene)에 10분 동안 담궈 조직 주변의 파라핀을 제거하였다. 이어 100%, 90%, 80% 및 70% 에탄올을 2분씩 순차적으로 처리하여 조직을 수화시킨 다음, 흐르는 물에 슬라이드를 10분간 수세하였다. 헤마톡실린(Auto Hematoxylin, ResGen)을 5분 처리하여 핵을 염색하고, 흐르는 물에 슬라이드를 10분 수세하였다. 다음으로, 에오신(Eosin, Sigma)을 1분 처리하여 세포질을 염색하고, 흐르는 물에 슬라이드를 10분 수세하였다. 이어 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올을 2분씩 순차적으로 처리하여 조직을 탈수시키고, 자일렌에 10분 처리하였다. 슬라이드의 조직 부분에 마운팅 용액(Shandon Synthetic Mountant, Thermo)를 떨어뜨린 후 슬라이드 커버를 밀착하여 붙여 마운팅 하였다.

도 6의 (a)와 (b)는 각각 사람 정상 결막 조직과 양막에 3차원 배양된 비점막 상피의 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 결과를 보여주는 사진으로, (b)에서 비점막 상피세포가 양막에 고르게 부착되어 3-5 층의 세포층을 형성함을 확인할 수 있다.

2) 면역조직 염색

파라핀에 포배된 3-차원 배양물을 절편하여(4 μm) 슬라이드에 붙인 다음, 자일렌(xylene)으로 조직 주변의 파라핀을 제거하고 100%, 90%, 80%, 70%의 에탄올을 이용하여 순차적으로 조직을 수화시켰다. 상피 간세포 표지자인 p63(Chemicon), 각질화된 상피 표지자인 사이토케라틴 1(Novoco(a)stra)과 사이토케라틴 10(DAKO), 각막 상피 표지자인 사이토케라틴 3/12(Chemicon), 상피 기저층 표지자인 사이토케라틴 5(Abcam), 결막 상피 표지자인 사이토케라틴 13(Biogenex), 상피 기저층 표지자인 CD44(Bender Medsytem), 각막/결막/비점막에서 발현하는 뮤신5에 대한 표지자 인 MUC5AC(LAB vision), 각막/결막/비점막에서 발현하는 뮤신1에 대한 표지자인 MUC1 (Novocastra), 각막의 혈관유입억제인자 thrombospondin-1 (TSP-1, SANTACRUZE)에 대한 항체를 이용하여 제조사의 추천 타이터(1:50 혹은 1:100)로 하여 반응시켰다. 그리고 헤마톡실린(hematoxylin, ResGen)으로 카운터 염색하여 핵염색 하였다.

도 6의 (c) 내지 (r)은 각각 사람정상 결막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 표지인자들의 면역조직 염색결과를 비교하여 보여주는 사진으로, (d)와 (h)에서 각막, 결막상피의 특이적 표지인자인 사이토케라틴 3, 사이토케라틴 13의 발현을 확인하였다. 또한 (l)에서 상피 간세포 표지인자인 p63이 기저층에서 발현함을 확인함으로써 이식 후 생착과 증식에 효과적임을 알 수 있다.

도 6의 (m) 내지 (r)에서, 최근 보고된 구강점막을 이용한 시트의 경우는 뮤신분비 세포가 없으나 본 발명의 비점막을 이용한 시트의 경우 정상 결막에서 분비되는 것과 같은 종류의 뮤신을 동일한 양상으로 분비하고 있음을 알 수 있다. (m)에서, 뮤신 1은 세포막 사이에 존재하는 뮤신으로 정상 각막, 결막에서 발현하고 있으며, (n)에서 본 발명의 배양 비점막 시트에서도 동일한 양상으로 세포막 사이에서 염색됨을 확인하였다. 또한, 안구표면의 안정화에는 다양한 뮤신이 기여하고 있으나 가장 주요한 역할을 하는 뮤신은 뮤신5AC이다. 뮤신5AC는 젤 형성 분비 뮤신으로, 물을 흡수하여 안구 표면에 젤과 같은 성상의 수분층을 형성, 안구의 보호막 역할을 한다. (o)에서, 정상결막에서 주머니의 형태로 발현되고 있으며, (p)에서와 같이 본 발명의 배양 비점막 시트에서도 동일한 양상과 분포를 가짐을 확인하 였다.

또한, 도 6의 (s)와 (t)는 각각 사람 정상 각막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피 시트에서의 혈관신생억제인자 thrombospondin-1(TSP-1)의 면역조직 염색결과를 보여주는 사진으로, TSP-1은 각막으로의 혈관유입을 억제하는 가장 중요한 인자로 알려져 있다. 배양 비점막 시트에서도 실제 각막에서와 동일한 양상으로 실질층에 침착되고 있음을 확인하였으며, 이는 본 발명에 의한 비점막 상피시트가 각막 이식제로 이용될 경우 각막으로의 혈관의 유입이 억제되어 투명한 각막 유지 및 높은 지속성에 기여 할 것으로 판단할 수 있다.

이상에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 비점막 상피 시트는 실제 사람 각막 또는 결막과 동일한 양상으로 분자 마커 발현패턴을 보이고, 풍부한 뮤신분비 세포를 포함하여 안구표면 안정화에 기여하며, 이식 후 생착률과 지속성이 높은 영구적인 각막 또는 결막 이식제로써 이용될 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 종래 구강점막을 이용한 각막 상피형 시트는 뮤신분비세포를 함유하고 있지 않아 안구의 미세환경을 복구시키기 어려운 단점이 있었으나, 본 발명의 각막 또는 결막 조직 시트는 뮤신분비세포를 포함하고 있어 안구의 미세환경을 복구시키고 안구표면의 안정화에 기여할 수 있다. 따라서 본 발명의 각막 또는 결막조직 시트를 각막 또는 결막이 손상된 환자에게 이식하게 되면 이식 후 생착률과 지속성이 높은 영구적인 이식제로서 이용될 수 있 을 것으로 기대된다.

도 1은 PAS(periodic acid-Schiff) 염색으로 뮤신을 염색한 결과이다: (a)는 사람 정상 결막, (b)는 사람 정상 구강점막, (c)는 사람 정상 비점막의 뮤신 염색을 나타낸다.

도 2는 비점막 상피세포의 초기 배양 결과를 보여준다: (a)는 사람 정상 비점막 조직, (b)는 상피만 순수 분리된 후 남아있는 조직 염색 사진, 그리고, (c)는 분리 배양한 비점막 상피세포의 현미경 사진을 나타낸다.

도 3은 스테인레스 재질의 메쉬 위에 양막을 얹고 비점막 상피세포를 접종하여, 배양용기 바닥의 피더세포와 공배양하는 모습이다.

도 4는 양막 상에 3차원 배양된 비점막 상피의 모습이다:

(a)는 양막의 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 사진이고,

(b)는 트립신-EDTA를 이용하여 양막 상피를 제거한 후 H&E 염색한 결과이고,

(c)는 양막 상피를 제거한 후 양막에 남아있는 콜라겐 타입 IV의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(d)는 양막 상피를 제거한 후 양막에 남아있는 라미닌-5의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(e)는 양막 상피를 제거한 양막에 비점막 상피세포를 접종하여 48시간 서브머지 배양한 결과이고,

(f)는 7일간 서브머지 배양한 비점막 상피 시트(sheet)의 현미경 사진이다.

도 5는 3차원 배양된 비점막 시트를 링 형태의 니트로 셀룰로스 막에 부착시 킨 모습이다.

도 6은 3차원 배양된 비점막 상피의 면역 염색 사진이다:

(a), (b)는 각각 사람 정상 결막조직과 양막 상에 3차원 배양된 비점막 상피의 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(c), (d)는 각각 사람 정상결막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 사이토케라틴 3의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(e), (f)는 각각 사람 정상각막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 사이토케라틴 5의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(g), (h)는 각각 사람 정상결막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 사이토케라틴 10의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(i), (j)는 각각 사람 정상결막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 사이토케라틴 13의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(k), (l)는 각각 사람 정상각막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 p63의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(m), (n)은 각각 사람 정상결막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 MUC 1 의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(o), (p)는 각각 사람 정상결막 조직과 3차원 배양된 비점막 상피의 MUC 5AC의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(q), (r)는 각각 사람 정상각막 조직과 3-차원 배양된 비점막 상피의 CD44v6 의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이고,

(s), (t)는 각각 사람 정상각막 조직과 3-차원 배양된 비점막 상피의 thrombospondin-1의 면역 조직 염색 결과를 보여주는 사진이다.

Claims

양막 및 상기 양막 상에서 증식시킨 비점막 상피세포로 이루어진 각막 또는 결막 조직 시트.
제 1항에 있어서, 상기 비점막 상피세포는 뮤신분비세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 각막 또는 결막 조직 시트.
제 1항에 있어서, 상기 양막은 상피가 제거된 양막인 것을 특징으로 하는 각막 또는 결막 조직 시트.
제 1항에 있어서, 상기 비점막 상피세포는 양막 상에서 중층화된 것을 특징으로 하는 각막 또는 결막 조직 시트.
제 1항에 있어서, 상기 양막 및 양막 상에서 증식은 피더세포의 존재 하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 각막 또는 결막 조직 시트.
제 5항에 있어서, 상기 피더세포는 마우스 3T3, 인간 섬유아세포, 인간 각막 케라토사이트, 양막 상피세포, 골수유래 줄기세포 및 지방유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 각막 또는 결막 조직 시트.
제 1항에 있어서, 상기 비점막 상피세포는 비중격(septum) 또는 비갑개(turbinate) 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 각막 또는 결막 조직 시트.
하기 단계들을 포함하는 각막 또는 결막 조직 시트의 제조방법:

a) 비점막 상피세포를 제조하는 단계;

b) 상기 비점막 상피세포를 양막 상에 접종하는 단계; 및

c) 상기 접종된 비점막 상피세포를 피더세포와 함께 배양하여 중층화하는 단계.
제 8항에 있어서, 상기 b)단계에서, 양막은 트립신-EDTA를 이용하여 양막 상피세포를 제거한 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 c)단계에서, 배양은 DMEM과 Ham's의 혼합 배양액으로 덮여있는 상태로 2-10일간 배양하여 양막상에 고르게 자라도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 c)단계 후, 중층화된 비점막 상피세포를 공기 중에 노출시켜 2-14일간 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
양막 및 상기 양막 상에서 증식시킨 비점막 상피세포를 포함하는 동물실험 대체용 인공 각막 또는 결막 조직 시트.