KR100987004B1

KR100987004B1 - Ａｉｄｓ 예방 및 치료 물질 스크리닝용 재조합 포유동물세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR100987004B1
Application number: KR1020080013918A
Authority: KR
Inventors: 유지창
Original assignee: (주) 에빅스젠; 유지창
Priority date: 2007-02-27
Filing date: 2008-02-15
Publication date: 2010-10-11
Also published as: GB0916740D0; KR20080079592A; GB2460977A; GB2460977B

Abstract

본 발명은 AIDS 예방 및 치료 물질 스크리닝용 재조합 포유동물 세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, HIV NC 단백질을 발현하는 HIV NC 단백질 발현카세트(expression cassette)와 HIV Psi(Ψ) 서열 및 리포터 유전자를 발현하는 리포터 유전자 발현카세트(expression cassette)로 형질전환된 재조합 포유동물 세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 포유동물 세포 및 스크리닝 방법은 진핵세포를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 물질을 탐색할 수 있는 시스템을 제공하는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명은 HIV의 포장에 관여하는 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 새로운 물질을 탐색할 수 있는 새로운 수단을 제공할 뿐만아니라 AIDS 예방 및 치료 효과를 가지는 물질을 탐색할 수 있는 새로운 스크리닝 방법을 제공하는 효과가 있다.

HIV NC 단백질, HIV Psi 서열, AIDS, 스크리닝

Description

ＡＩＤＳ 예방 및 치료 물질 스크리닝용 재조합 포유동물 세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법{Recombinant mammalian cell for screening a substance preventing and treating AIDS and screening method using the same}

본 발명은 AIDS 예방 및 치료 물질 스크리닝용 재조합 포유동물 세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, HIV NC 단백질을 발현하는 HIV NC 단백질 발현카세트(expression cassette)와 HIV Psi(Ψ) 서열 및 리포터 유전자를 발현하는 리포터 유전자 발현카세트(expression cassette)로 형질전환된 재조합 포유동물 세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

AIDS(acquired immune deficiency syndrome)는 1980년대 초에 처음으로 발견된 이래, 세계적으로 중요한 질병 중의 하나이다. 현재까지 개발된 AIDS의 치료제는 주로 프로테아제 억제제(protease inhibitor), 역전사효소(reverse transcriptase) 억제제로서, AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, 네비라핀 등의 역전사 효소억제제 또는 사키나비르, 인디나비르, 리토나비르 등의 프로테아제 억제제가 있다. 이들 치료제는 단독으로 사용할 경우 별 효과가 없으나, AZT, 3TC 등 두 개의 역전사효소 억제제와 하나의 프로테아제 억제제를 복합 처방할 경우 높은 수준의 치료 효과를 보이는 것으로 알려졌다.

그러나 복합 처방을 받은 모든 환자의 병세가 다 호전되는 것은 아니며, 그 가격이 비싸고 구토, 고열 등 심각한 부작용이 있으며, 이들 약제에 대한 저항성을 가지는 변종 바이러스가 나타나는 등의 문제점이 있다.

따라서 더 나은 치료법을 위해 약효가 훨씬 강하며 독성이 적은 새로운 계통의 치료제 개발의 필요성이 요구되고 있다.

AIDS는 HIV(human immunodeficiency virus)의 감염에 의해서 발병하는데, HIV에 의해 감염되면 3~6주 후 감기 몸살같은 증세를 1~2주 정도 앓다가 회복되며, 그 후 증상없는 잠복기가 10여년 간 지속된다. 긴 잠복기 동안 바이러스는 감염자의 면역 세포를 파괴하면서 지속적으로 증식하기 때문에 환자의 면역 기능이 점차 손상되어 잠복기 말기에는 AIDS 증상이 나타난다.

HIV1 의 유전자는 9개의 ORF를 가지고, 이 중 3가지는 Gag, Pol 및 Env이며, 나머지 6가지는 조절기능을 담당한다. 특히, Gag 및 Env는 구조성분(structural component)으로서, Gag는 MA(matrix), CA(capsid), NC(nucleocapsid) 및 p6의 4종 단백질을 발현시키고, Env는 SU(surface or gp120) 및 TM(transmembrane or gp41)의 2종 단백질을 발현시킨다. 또한, Pol은 PR(protease), RT(reverse transcriptase) 및 IN(integrase)의 3종 단백질을 발현시키는데, 이들 단백질은 효소활성을 나타낸다.

HIV의 단백질 중 NC(nucleocapsid)는 55개의 아미노산으로 구성되고, 약 6kDa의 분자량을 가지는 염기성 단백질로서, 두개의 징크핑거 도메인(zinc finger domain)을 포함하는데, 바이러스 개체형성을 위한 구조적 역할뿐만 아니라, 바이러스의 생활주기(viral life cycle)에 대하여 기능적으로도 중요한 역할을 한다. HIV NC 단백질의 주요 기능을 살펴보면, 첫째, NC 단백질은 바이러스의 유전적 포막(genomic encapsidation)에 관여한다. 이러한 기능은 독특한 Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys 모티프(CCHC 모티프)로 구성되는 두 개의 징크핑거 도메인으로부터 기인하는데, 상기 도메인은 모든 레트로바이러스(retrovirus)에서 높은 보존성을 나타내며, HIV RNA 포장(packaging)과 감염성 바이러스 생산에 필수적인 것으로 알려져 있다. 둘째, NC 단백질은 바이러스의 역전사 반응(reverstranscription, RT)동안 tRNA 프라이머 어닐링(annealing)과 가닥 이동(strand transfer)을 촉진한다고 알려져 있으며, 이로부터 NC 단백질이 바이러스 복제(viral replication)에 중요한 기능을 한다는 것을 알 수 있다. 셋째, NC 단백질은 바이러스의 생활주기에 필요한 핵산 샤페론(chaperone) 활성을 가지며, 최근에는 바이러스 DNA가 숙주세포 염색체에 삽입될 때에도 NC 단백질이 소정의 역할을 담당한다고 보고되고 있다.

따라서, 이러한 NC 단백질의 기능을 저해하여 HIV-1을 무력화시키려는 연구 가 수행되고 있으며(참조: Lener, D. et al., FEBS Letters.,361:85-88, 1995; Dexter, T. K. et al., J. Virol.,70:6607-6616, 1996; Tanchou, V. et al., J. Virol.,72:4442-4447, 1998; Rong, L.et al., J. Virol.,72:9353-9358, 1998; Berthoux, L. et al., J. Virol.,71:6973-6981, 1997; Berthoux, L. et al., J. Virol.,73:10000-10009, 1999; Clever, J. L.et al., J. Virol.,74:541-546, 2000; Cimarelli, A. et al., J. Virol.,74:3046-3057, 2000). 예를 들어, 대한민국 특허출원 제 01-52594호에는 NC 단백질과 결합가능한 RNA에 대하여 개시하고 있는데, RNA는 작업하기에 어려움이 있어, HIV-1의 치료에 실질적으로 이용할 수 없다는 단점이 있었다.

NC 단백질에 의한 HIV 바이러스의 유전적 포막은 NC 단백질과 HIV Psi 서열간의 상호작용이 관여한다. HIV Psi 서열은 HIV 게놈 RNA의 5'말단에 위치하는 125개의 염기로 구성된 서열로서, NC 단백질과 특이적으로 결합하여, HIV의 게놈 패키지를 수행하게 된다.

이에 본 발명자들은 HIV NC 단백질의 생리학적 활성을 연구하던 중 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 포유동물세포에서 번역과정의 저해 활성이 나타난다는 점을 알아내어 이를 이용하는 재조합 포유동물 세포 및 상기 세포를 이용한 AIDS의 예방 및 치료 물질의 스크리닝 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 AIDS 예방 및 치료 물질 스크리닝용 재조합 포유동물 세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV NC 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오티드와 HIV Psi(Ψ) 서열 및 리포터 유전자를 발현하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 재조합 포유동물 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 세포를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi(Ψ) 서열의 상호작용에 영향을 미치는 물질을 탐색하는 AIDS 예방 및 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 세포는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 HIV NC(nucleocapsid) 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 HIV NC 발현카세트 및 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 HIV Psi(Ψ) 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 유전자 발현카세트로 형질전환된 재조합 포유동물 세포이다.

본 발명자들은 포유동물세포에서 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 HIV Psi 서열 하부에 존재하는 유전자의 전사가 저해되는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명자들에 의해 최초로 발견된 것이다. 본 발명자들은 실시예 1 및 2에서 각각 포유동물 세포에서 HIV Psi 서열의 하부에 유전자 발현여부를 확인할 수 있는 리포터 유전자를 가지는 발현벡터와 HIV NC 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하였으며, 이를 실시예 3에서 동일한 포유동물세포에 형질전환시켜 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 인한 리포터 유전자의 발현여부를 확인하였다.

그 결과 HIV Psi 서열과 HIV NC 단백질의 상호작용으로 인해 HIV Psi 서열의 하부에 존재하는 리포터 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과와 비교하기 위하여 HIV Psi 서열이 존재하지 않는 벡터를 사용한 경우에는 리포터 유전자의 발현이 잘 되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 인해 HIV Psi 서열의 하부에 존재하는 유전자의 번역이 저해됨으로 일어나는 것이다.

본 발명자에 의해 이미 원핵생물인 대장균에서 HIV Psi 서열과 HIV NC 단백질의 상호작용으로 인해 HIV Psi 서열의 하부에 존재하는 리포터 유전자의 발현이 감소하는 현상이 알려진 바가 있다(대한민국 특허 제360,275호). 하지만, 본원발명 에서는 진핵생물인 인간의 T-Rex293세포(293 세포의 일종)에서 이러한 현상을 최초로 확인하였으며, 이는 원핵생물과 진핵생물의 번역과정이 서로 상이하다는 점에 비추어 볼 때, 당업자에게 자명한 것이 아니다.

원핵생물과 진핵생물의 번역과정은 그 기작과 관여하는 인자(factor)들에 있어서 서로 차이를 보인다. 원핵생물의 번역과정의 경우 리보솜 30S 소단위체(subunit)에 IF(initialtion factor) 1, IF2-GTP, IF3가 결합하고, 여기에 IF3에 의해 유도된 mRNA와 IF2에 유도된 fMet-tRNA가 결합하여 30S 개시복합체 형성된 후 리보솜 50S 소단위체가 결합하여 70S 개시복합체 형성하여 번역과정이 일어나는 데에 비해 진핵세포의 번역과정의 경우 리보솜 40S 소단위체에 eIF3, eIF1A가 결합한 뒤 여기에 eIF2-GTP-Met-tRNAi 복합체가 결합해 43S 복합체를 형성하게 되고, eIF4의 도움으로 mRNA가 결합해 48S 복합체 형성하게 되며, 이 48S 복합체에서 ATP를 소모하며 mRNA를 탐색(scanning)하여 개시코돈 부위를 탐색한 후 60S 소단위체가 eIF5의 도움을 받아 상기 48S 복합체에 결합하고 개시복합체를 형성하여 번역과정이 일어나게 된다. 이렇듯 원핵생물에서의 번역과정과 진핵생물에서의 번역과정은 그 관여하는 인자 및 개시복합체의 형성과정을 비롯하여, 개시코돈을 탐색하기 위한 방법 등이 상이하다. 따라서, 원핵생물에서 적용된 번역저해 기작이 진핵생물에서도 동일하게 적용된다고 볼 수 없다.

더욱이 본 발명에서 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용은 상기 48S 복합체의 탐색(scanning)과정을 저해하는데, 이와 같은 탐색과정은 원핵생물의 번역과정에서는 존재하지 않는 기작이므로 본 발명에서의 번역 억제활성은 당업자에게 자명하다고 할 수 없다.

상기 "HIV의 NC 단백질”은 AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome, 후천성 면역결핍증)을 일으키는 병원체인 HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질을 의미하며, 상기 단백질은 바이러스 게놈 RNA에 강하게 결합하여 리보 핵산단백질 코어 복합체(ribonucleoprotein core complex)를 형성한다.

바람직하게는 HIV NC 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, Genbank Accession No. P03349, P03366, P04585, P03367, P12497, P03369, P04587, P04584, P35963, P24740, P05961, P04591, Q73368, P20892, P20875, P12498, P05888, P12493, Q9QBZ5, Q9QBY3, O89940, Q9WC63, Q9WC54, Q75002, P24736, Q9QBZ1, O89290, Q9QBZ6, Q9QBY4, P12499, P05959, P18802, P04588, P04589, P05960, Q70622, P20889, P12494, P03347, Q9QSR3, Q9Q720, Q9IDV9, Q9WC62, Q9WC53, Q9Q721, Q74230, Q73367, O12157, P35962, P18800, P04592, P20873, P05887, P03348, P04593, Q89928, Q79666, Q77373, O41798, O93215, O91080, P05962, Q9QBZ2, Q9QC00, O89291, P05891, P15833, P17757, P18096, Q9QSR4, Q9IDV8, Q75001, O89939, P18095, P05890, P04594, P12495, Q76634, P20876, P18042, P0C1K7, Q79665, Q77372, O93182, O91079, P05889, P12451, P24107, Q76633, P12450, P18041, P15832, P24106, P17756, Q69383, Q74120, Q74119, P20874, P04590, P03363, Q0R5R2, Q1A268, Q1A250, Q1A267, P03353, Q0R5R3, Q1A249에 기재된 NC 단백질(예를 들면, P03349의 경우 380 내지 434번째 아미노산 서열)일 수 있다.

아울러, 본 발명의 HIV NC 단백질 자체외에도 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드에 대해서도 본원발명의 HIV NC 및 HIV Psi 서열 상호작용으로 인한 전사 저해 활성이 나타났으며(실시예 3 참조), 이에 따라 본 발명의 스크리닝 방법은 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드에 의해서도 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 이에 한정되지는 않으나, HIV GAG 또는 HIV GAG+POL일 수 있다.

HIV Psi(Ψ) 서열은 HIV 게놈 RNA의 5'말단에 위치하는 125개의 염기로 구성된 서열로서, HIV NC 단백질과 특이적으로 결합하여, HIV의 게놈 패키지에 관여한다. 바람직하게 HIV Psi 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

리포터 유전자는 그 발현여부를 탐색할 수 있는 통상적인 리포터 유전자를 사용할 수 있으며, 상기 리포터 유전자의 예로, 이에 한정되지는 않으나, EGFP(enhanced green fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), 루시퍼라제(luciferase), 가우시아 루시퍼라제(gaussia luciferase, gaussian luciferase), β-갈락토시다제(galactosidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)가 있다. 다만, 적절한 항체를 보유하는 경우 공지된 면역화학적 분석 방법 등에 의해 그 유전자의 발현정도를 측정할 수 있으므로 상기 리포터 유전자는 제한없이 사용될 수 있다.

상기 “발현카세트”는 목적하는 구조 유전자를 발현할 수 있는 핵산 구조체를 말하는 것으로, 세포에 따라 적절한 프로모터 및 이와 작동가능 하게 연결된 구조 유전자를 포함할 수 있다. 상기 발현카세트는 하나 이상의 코딩 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 다른 요소(예, 폴리아데닐화 시퀀스, 막-삽입 신호 혹은 분비 선도를 암호화하는 시퀀스, 리보솜 침입 시퀀스, 전사조절요소(예, 인핸서, 사일렌서, 등)등을 추가로 포함할 수 있다. 아울러, 발현카세트는 바람직하게는 복제원점, 선별 마커 및 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등와 더불어 벡터를 구성하여, 재조합 발현벡터를 이룰 수도 있다. 본 발명에서 HIV NC 단백질 발현카세트 및 리포터 유전자 발현카세트는 바람직하게는 별개의 발현벡터를 이룰 수 있으나, 하나의 발현벡터에 혼입되어 있는 별개의 발현 카세트(cassette)로서 존재할 수도 있다.

바람직하게는 상기 HIV NC 단백질 발현카세트는 pLP1, pLP1/GAG(ΔPOL) 또는 pLP1/optiNC일 수 있으며, 리포터 유전자 발현카세트는 바람직하게는 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra), pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra), pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(-extra) 또는 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra)일 수 있다. 이 때, 상기에서 pLP1/GAG(ΔPOL) 또는 pLP1/optiNC는 상용의 벡터인 pLP1 벡터(invitrogen, 미국)를 기반으로 하여 제조된 벡터이며, pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra), pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra), pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(-extra) 또는 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra)는 상용의 벡터인 pcDNA4TO 벡터(invitrogen, 미국)를 기반으로 하여 제조된 벡터로서 각각의 제조방법은 실시예 1 및 실시예 2에 상세히 나타나 있다.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy , 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이 스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol . Biol . 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

한편, 본 발명은 본 발명의 형질전환된 재조합 포유동물 세포를 이용하여 AIDS의 예방 및 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 HIV NC 단백질과 HIV Psi(Ψ) 서열의 상호작 용(interaction)에 영향을 미치는 물질을 탐색하는 방법이다. 따라서, HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용은 HIV의 증식과정에서 포장(packaging)에 필요적인 현상이므로 이들 상호작용을 저해 여부를 확인할 수 있도록 본 발명의 재조합 포유동물 세포를 이용하면 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용에 영향을 미치는 물질의 스크리닝에 이용될 수 있어, AIDS 예방 및 치료물질을 스크리닝할 수 있게 된다.

구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법은

(a) 본 발명의 형질전환된 재조합 포유동물 세포에 후보물질을 처리하여 배양하는 단계; 및

(b) 상기 배양된 세포의 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 리포터 유전자의 ‘발현 수준’이란 리포터 유전자의 발현 양을 말하는 것으로, 이는 리포터 유전자의 종류에 따라서 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 직접적 또는 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 리포터 유전자로 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 또는 GFP(green fluorescent protein)을 사용하는 경우 발생되는 형광의 양을 측정할 수 있으며, 리포터 유전자로 루시퍼라제(luciferase) 또는 β-갈락토시다제(galactosidase)를 사용하는 경우 공지된 루시퍼라제 또는 β-갈락토시다제 활성 측정법에 따라 측정 할 수 있으며, 공동-면역침전법(co-immunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)에 의해서도 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다.

또한, 본 발명의 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용을 표적으로 한 스크리닝 방법은 고효율 스크리닝(high throughput screening; HTS)을 적용할 수 있다. HTS는 다수의 후보물질을 병행 시험하여, 다수의 후보물질의 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법이다. 특정 양태로서, 96-웰 미세역가 플레이트 또는 192-웰 미세역가 플레이트에서 세포주를 배양하고, 여기에 다수개의 후보물질을 처리한 다음 면역화학적 방법에 의해 HIV NC 단백질의 발현정도를 측정할 수 있다. 이 포맷에서는, 96회의 독립적인 시험을 96개의 반응 웰을 함유하는 단일 8cm×12cm 플라스틱 플레이트 상에서 동시에 수행할 수 있다. 상기 웰은 전형적으로 50㎕ 내지 500㎕에 이르는 검정 용적을 필요로 한다. 플레이트 이외에, 96-웰 포맷을 광범위한 균일계 및 불균일계 검정에 적합하게 하기 위해 다수의 계기, 기구, 피펫터, 로봇, 플레이트 세척기 및 플레이트 판독기가 상업적으로 이용 가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 HIV Psi 서열을 포함하고 있는 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터, pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터, pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(-extra) 벡터 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra) 벡터와 HIV Psi 서열을 포함하고 있지 않은 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터, pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터, pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra) 벡터 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Gaussia(-extra)를 제작하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 pLP1/GAG(POL)벡터 및 pLP1/optiNC 벡터를 각각 제작하였다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 상기 벡터의 조합을 각각 사용하여 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용시 리포터 유전자의 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용이 있는 경우에는 리포터 유전자가 발현되지 않고, 상호작용이 없는 경우에는 리포터 유전자의 발현되는 것을 확인하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용이 번역 억제 활성이 있음을 알 수 있었다(실시예 3, 도 1 내지 도 3 및 도 6참조).

본 발명의 또다른 실시예에서는 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 물질을 이용하여 상기 상호작용이 가지는 번역 억제 활성에 미치는 영향을 알아 보았다. 그 결과 리포터 유전자의 발현이 다시 이루어져 번역 억제 활성이 감소됨을 확인하였으며, 이러한 리포터 유전자의 재발현 여부를 AIDS 억제 및 예방 물질의 스크리닝에 이용할 수 있음을 알 수 있었다(실시예 4 및 도 4 참조).

따라서, 본 발명의 재조합 포유동물 세포 및 스크리닝 방법은 진핵세포를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 물질을 탐색할 수 있는 시스템을 제공하는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명은 HIV의 포장에 관여하는 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 새로운 물질을 탐색할 수 있는 새로운 수단을 제공할 뿐만아니라 AIDS 예방 및 치료 효과를 가지는 물질을 탐색할 수 있는 새로운 스크리닝 방법을 제공하는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

리포터 유전자 발현벡터의 제조

<1-1> pcDNA4TO - Psi (Ψ)-(- ATG ) EGFP (- extra ) 벡터의 제조

pcDNA4TO 벡터(Invitroren, 미국)를 기초으로 하고, Psi (Ψ) 서열 및 ATG가 제거된 EGFP(enhanced green fluorescent protein)를 포함하고 있는 본원발명의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터를 다음과 같은 과정으로 제조하였다.

pcDNA4TO 벡터에서 HIV Psi 서열의 이차 구조 형성을 방해하는 부위를 제거하기 위하여 제한효소 NdeI(483) and HindIII(978)로 절단되는 부위 사이를 서열번호 3의 정방향 프라이머(483-NdeI: 5’-GTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATT-3’) 및 서열번호 4의 역방향 프라이머(859-HindIII: 5’-GCGGATCCAAGCTTTCTCTATCACTGATAGGGAG-3’)를 이용하고 pcDNA4TO 벡터(Invitroren, 미국)를 주형으로 하여 PCR로 증폭한 다음 증폭된 산물(376bp)을 상기 NdeI 및 HindIII 제한효소 부위에 삽입하였다(이를 중간벡터 1이라고 함). 이 때, 상기 제한효소 부위에 삽입은 서로 연결시킬 각각의 단편을 제한효소로 처리한 다음 각각 상보적인 응집말단(cohesive end)간 연결시킨 것으로 특별한 언급이 없는 한 이하에서도 동일한 의미로 사용된다.

Psi(Ψ) 서열은 HIV ARV-2/SF2(서열번호 5; CTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACAGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAATTTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCGGTATTA)를 주형으로 하고, 서열번호 6의 정방향 프라이머(HindIII :5’-CCAAGCTTACGCAGGACTCGGCTTGCTG-3’) 및 서열번호 7의 역방향 프라이머(BamHI:5’-CCGGATCCTAATACCGACGCTCTCGCAC-3’)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물을 상기 중간벡터 1의 HindIII 및 BamHI 제한효소 부위에 삽입하였다(이를 중간벡터 2라고 함).

EGFP(Enhanced green fluorescence protein) 서열은 pEGFP-C1 벡터(BD Science, 미국)를 주형으로 하고, 서열번호 8의 정방향 프라이머(BamHI : 5’-CCGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’) 및 서열번호 9의 역방향 프라이머(XhoI : 5’-TACTTCTCGAGCTCTGTACATGTCCGCGG-3’)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물을 상기 중간벡터 2의 BamHI 및 XhoI 제한효소 부위에 삽입하여(이를 중간벡터 3이라고 함) pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터를 제조하였다.

이 때, EGFP에서 개시서열인 ATG를 제거하기 위하여 상기 EGFP를 주형으로 하는 PCR 증폭시의 프라이머가 EGFP에서 ATG가 제거된 부위가 증폭이 되도록 디자인된 것이다.

<1-2> pcDNA4TO -Δ Psi (Ψ)- EGFP (- extra ) 벡터의 제조

대조군으로 사용된 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터, 즉 상기 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터에서 Psi(Ψ) 서열이 삽입되지 않고, EGFP의 개시서열이 제거되지 않은 벡터는 상기 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터의 제조방법에서 Psi(Ψ) 서열을 삽입하는 단계를 제외한 것과 (-ATG)EGFP 단편 대신 EGFP 단편이 PCR에 의해서 증폭되도록 서열번호 10의 정방향 프라이머(5’-CCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’)와 서열번호 9의 역방향 프라이머를 사용하여 증폭시킨 것을 제외하고 상기 실시예 <1-1>에서와 동일하게 하여 제조 되었다.

<1-3> pcDNA4TO -R- U5 - Psi (Ψ)-(- ATG ) EGFP (- extra ) 벡터의 제조

상기 실시예 <1-1>의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터에서 Psi(Ψ) 서열이 R-U5-Psi(Ψ)서열로 대체된 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.

R-U5-Psi(Ψ)서열은 서열번호 11의 정방향 프라이머(HindIII: 5’-CCAAGCTTGGGTCTCTCTGGTTAGACCA-3’) 및 서열번호 12의 역방향 프라이머(BamHI: 5’-CCGGATCCTAATACCGACGGTCTCGCAC-3’)를 이용하고, pNL4-3 벡터를 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 수득하였다. 이 때, 상기 R-U5-Psi(Ψ)서열은 pNL4-3 벡터의 454 내지 813bp에 해당하는 영역이며, 상기 pNL4-3 벡터는 Nef 유전자의 절반이 EGFP 리포터 유전자로 대체된 것을 제외하고는 모든 HIV-1의 유전자를 포함하고 있어 재조합 HIV 바이러스를 생산할 수 있는 벡터로서, 공지된 문헌(Lee et al., 1997, Biochem. Biophy. Res. Comm., 233: 288-292)에 상세히 기재되어 있는 벡터이다.

PCR로 수득한 단편 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터를 각각 HindIII 및 BamHI으로 처리하고 Psi(Ψ) 서열 대신 R-U5-Psi(Ψ)서열을 삽입하여 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터를 제조하였다.

<1-4> pcDNA4TO -R- U5 - Psi (Ψ)- EGFP (- extra ) 벡터의 제조

상기 실시예 <1-2>의 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터에 R-U5 단편을 삽입하기 위하여 서열번호 13의 정방향 프라이머(R-U5-F; 5′-CCAAGCTTGGGTCTCTCTGGTTAGACCA-3′) 및 서열번호 14의 역방향 프라이머(R-U5-R; 5′-CCGGATCCCGAGAGATCTCCTCTGGCTT-3′)를 이용하여 R-U5단편을 증폭하고, 이를 HindIII 및 BamHI으로 처리하고 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터에 삽입하여 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터를 제조하였다.

<1-5> pcDNA4TO - Psi (Ψ)-(- ATG )- Fluc (- extra ) 벡터의 제조

리포터 유전자로 EGFP 대신 루시퍼라제(luciferase)를 사용한 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(-extra) 벡터를 제조하기 위하여 상기 실시예 <1-1>에서 EGFP를 삽입하는 대신에 다음과 같이 루시퍼라제를 삽입하였다.

루시퍼라제는 pGL3(Promega, 미국)을 주형으로 하고, 서열번호 15의 (ATG)luc-F 프라이머(5′-CCGGATCCGAAGACGCCAAAAACATAAA-3′) 및 서열번호 16의 luc-R 프라이머(5′-TACTCGAGTTACACGGCGATCTTTCCGC-3′)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 BamHI 및 XhoI 제한효소 부위에 삽입하였다.

<1-6> pcDNA4TO - Psi (Ψ)- Fluc (- extra ) 벡터의 제조

실시예 <1-2>의 벡터에서 리포터 유전자로 EGFP 대신 루시퍼라 제(luciferase)를 사용한 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra) 벡터를 제조하기 위하여 상기 실시예 <1-2>의 방법에 따라 실시예 <1-5>에서 수득한 루시퍼라제 단편을 삽입하여 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra) 벡터를 제조하였다.

<1-7> pcDNA4TO - Psi (Ψ)- Gaussia (- extra ) 벡터의 제조

리포터 유전자로 가우시아 루시퍼라제(Gaussia luciferase)를 사용한 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra) 벡터(도면에서 pcDNA4/TO/atg.Psi/-Gau(-ex)로 표시)를 제조하기 위하여 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra) 벡터(도면에서 pcDNA4/TO/del.psi/F-luc(-Extra)로 표시)에 Psi(Ψ) 서열을 삽입하고, F-luc 유전자 대신 가우시아 루시퍼라제 단편을 대체하여 다음과 같이 제조하였다.

우선, pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra)를 HindIII 및 XhoI 제한효소를 처리하여 F-luc 유전자가 제거된 단편(단편 I)을 제조하였다.

Psi(Ψ) 서열은 pcDNA4/TO 벡터(Invitrogen, 미국)를 주형으로 하고 서열번호 18(Psi HindIII-F, 5'-CCAAGCTTACGCAGGACTCGGCTTGCTG-3') 및 서열번호 19(Psi BamHI-R, 5‘-CCGGATCCTAATACCGACGGTCTCGCAC-3')의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭하였으며, 이를 HindIII 및 BamHI 제한효소로 처리한 다음 상기 단편 I과 결합하였다(단편 II). 그런다음 가우시아 루시퍼라제 단편은 pBasicGau 벡터(Targeting system Inc.)를 주형으로 하고, 서열번호 20(Gau BamHI-F, 5’- CCGGATCCGGAGTCAAAGTTCTGTTTGC-3‘) 및 서열번호 21(Gau XbaI-R, 5'-AATCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCT-3')의 서열의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 얻었으며, 이를 BamHI 및 XhoI 제한효소로 처리한 다음 상기 단편 II와 결합하여 본 발명의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra) 벡터를 제조하였다.

<1-8> pcDNA4TO - Psi (Ψ)- Gaussia (- extra ) 벡터의 제조

리포터 유전자로 가우시아 루시퍼라제(Gaussia luciferase)를 사용하고, Psi (Ψ) 서열이 제거된 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Gaussia(-extra) 벡터(도면에서 pcDNA4/TO/del.psi/gaussia(-extra)로 표시)를 제조하기 위하여 상기 실시예 <1-6>에서 제조한 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra)의 BamHI 및 XbaI 제한효소 부위 사이의 루시퍼라제 단편(Fluc)을 제거한 부위에 가우시아 루시퍼라제 단편을 삽입하여 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Gaussia(-extra) 벡터를 제조하였다. 이 때 삽입된 가우시아 루시퍼라제 단편은 상기 실시예 <1-7>에서와 같이 PCR을 수행한 다음 BamHI 및 XbaI 제한효소를 처리하여 얻었다.

상기의 모든 벡터는 제조된 이후 염기서열분석을 통해 정상적으로 제조되었는지 검증하였다(결과미도시).

< 실시예 2>

HIV NC 단백질 발현 벡터의 제조

<2-1> pLP1 / GAG ( POL ) 벡터의 제조

pLP1 벡터(Invitrogen, 미국)에 제한효소 BclI(2994)와 BspEI(5672)를 처리하여 POL 서열을 제거한 다음 이를 Klenow 효소로 처리한 후, 자가연결(self-ligation)시켰다. 이와 같이 제조된 벡터를 pLP1/GAG(POL)이라고 하였다.

<2-2> pLP1 / optiNC 벡터의 제조

pLP1/optiNC 벡터는 다음과 같은 방법으로 제조되었다: 서열번호 17의 코돈 최적화된 HIV NC 유전자(OptiNC DNA)를 EcoRI/HindIII로 제한효소 처리한 다음 상기 제한효소 처리된 단편을 먼저 준비해 둔 EcoRI/HindIII로 처리된 pUC57 벡터(Genescript, 미국)에 클로닝하였고 이를 pUC57/OptiNC라 명명하였다. 상기 pUC57/OptiNC와 pcDNA4/TO(Invitrogen, 미국)를 HindIII와 EcoRI으로 절단한 다음 라이게인션하여 pcDNA4/TO/OpicNC를 제작하였다. 상기 pcDNA4/TO/OptiNC를 HindIII와 NotI으로 처리한 다음 절단된 HIV NC 유전자가 포함된 DNA 단편을 클리나우(Klenow)로 중합하여 평활말단으로 하였다. pCMV(-HA) 벡터(Clontech Laboratories, Inc., 미국)도 EcoRI 및 NotI으로 처리한 다음 벡터부위의 DNA 단편에 클리나우(Klenow)로 중합하여 평활말단으로 하였다. 상기 클리나우(Klenow) 단편이 처리된 두 단편을 라이게이션하여 이를 pCMV(-HA)/OptiNC라 명명하였다. pLP1 벡터(Invitrogen사)에 PmlI/AvrII/BspEI 을 처리하여 GAG-POL 유전자를 잘라내고, OptiNC 폴리뉴클레오티드는 pCMV(-HA)/OptiNC 벡터에서 XmaI/EcoRI 처리하여 수득 하였다. 상기 pLP1 벡터와 수득한 OptiNC 폴리뉴클레오티드 모두 클리나우(Klenow)로 중합하여 평활말단을 만들고, 평활말단 라이게이션(Blunt end ligation)하여 이를 pLP1/optiNC 벡터라 명명하였다.

< 실시예 3>

HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용의 확인

<3-1> HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용의 확인

실시예 <1-1>에서 제조한 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터 및 실시예 <1-2>에서 제조한 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터와 실시예 2에서 제조한 pLP1, pLP1/GAG(POL), pLP1/optiNC로 각각 공동 형질전환(Co-transfection)시켜 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 EGFP의 발현여부로 확인하였다.

형질전환을 위하여 T-Rex293 세포(Invitrogen, 미국)를 10%(v/v) 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 1% 스트렙토마이신/페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지에서 37˚C, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 상기 세포를 60~70% 정도의 조밀도(confluency)를 가질 때까지 배양한 후 형질전환할 벡터를 이용하여 jetPEI 제제(Polyplus, 프랑스)와 혼합하여 제조사의 지침에 따라 형질전환하였다. 이 때, 형질전환할 벡터의 조합은 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)- EGFP(-extra) 벡터(1μg) 및 각각 대조군 벡터(control, pLP/con, pLP1 벡터에 제한효소 PmlI(1321)와 BspEI(5672)를 처리하여 GAG-POL 서열 부분을 제거한 뒤 평활말단이 되도록 처리한 다음 평활말단연결을 통해 제조한 벡터), pLP1, pLP1/GAG(POL), pLP1/optiNC 벡터를 양을 달리하여(0.5μg, 1μg, 2μg) 사용한 조합과 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터(1μg) 및 각각 대조군 벡터(control, pLP/con), pLP1, pLP1/GAG(POL), pLP1/optiNC 벡터를 양을 달리하여(0.5μg, 1μg, 2μg) 사용한 조합으로 하였다. 형질전환된 세포를 16~18시간 배양 후 1μg/ml 농도의 테트라싸이클린(tetracycline)로 처리하고 밤새 배양하였다.

배양된 세포들에서의 EGFP는 형광현미경(Axiovert 200M, Zeiss, 독일)을 사용하여 감지하였다.

그 결과, 도 1에서 보듯이, Psi 서열이 포함되지 않은 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터로 형질전환시킨 T-REx293 세포(A)에서는 EGFP의 발현이 크게 영향을 받지 않아 형광이 잘 나타나는 데에 비해, Psi 서열을 포함하는 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터로 형질전환시킨 T-REx293 세포(B)에서는 NC 단백질 또는 NC 단백질을 포함하는 부분인 GAG+POL, GAG 단백질과 Psi 서열이 서로 상호작용을 하여 EGFP의 발현이 농도의존적으로 저해되는 것을 알 수 있었다.

<3-2> HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용의 확인

HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터대신 상기 실시예 <1-3>의 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터를 사용하고, pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터대신 상기 실시예 <1-4>의 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터를 사용한 것 및 HIV NC 발현벡터의 양을 각각 0.5μg, 0.75μg 및 1.0μg을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <3-1>과 동일하게 하여 수행하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, Psi 서열이 포함되지 않은 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터로 형질전환시킨 T-REx293 세포(A)에서는 EGFP의 발현이 크게 영향을 받지 않아 형광이 잘 나타나는 데에 비해, Psi 서열을 포함하는 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터로 형질전환시킨 T-REx293 세포(B)에서는 NC 단백질 또는 NC 단백질을 포함하는 부분인 GAG+POL, GAG 단백질과 Psi 서열이 서로 상호작용을 하여 EGFP의 발현이 농도의존적으로 저해되는 것을 알 수 있었으며, R-U5가 추가로 포함되어 있는 HIV Psi 서열도 상기 실시예 <3-2>에서의 결과와 유사하게 나타나는 것을 알 수 있었다.

<3-3> 루시퍼라제를 이용한 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용의 확인

HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터대신 상기 실시예 <1-5>의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(- extra) 벡터를 사용하고, pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터대신 상기 실시예 <1-6>의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra) 벡터를 사용하여 상기 실시예 <3-1>의 방법에 따라 수행하였다.

이 때, 형질전환에 사용된 각각의 벡터의 양은 다음과 같다: pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(-extra) 벡터 500ng; pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra) 벡터 200ng; 대조군 벡터(control) 2μg, pLP1 2μg, pLP1/GAG(POL) 2μg, pLP1/optiNC 2μg.

형질전환된 세포에서 나타나는 루시퍼라제 활성은 제조사(Promega, 미국)의 지침에 따라 다음과 같이 측정하였다: 형질전환된 T-Rex293 세포들을 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척하고 PBS를 완전히 제거한 후, PLB(passive lysis buffer) 제제(reagent)로 상기 세포가 있는 배지를 15분동안 상온에서 흔들어 주었다. 이를 4°C에서 12000 rpm으로 30초 동안 원심분리하여 상등액을 루시페라제 이중분석(dual-luciferase assay)을 하기 위하여 시험관에 담았다. 세포 상층액 20μl를 LAR II(luciferase assay reagent II)이 담겨있는 시험관에 옮기고 혼합하였다. 발광하는 루시페라제(firefly luciferase)활성은 루미노메터(luminometer; TD-20/20, Turner designs, 미국)를 사용하여 측정되었다. 이후 Stop & Glo 제제(reagent) 100μl를 트랜스펙션 효율을 중화시키기 위하여 상기 시험관에 추가하고 레닐라(renilla) 루시페라제 활성을 측정하였다. 결국 루시페라제 활성은 레닐라 루시페라제 대 발광하는 루시페라제의 비율로 결정되었다.

그 결과, 도 3에서 보듯이 HIV Psi 서열이 존재하지 않는 경우 HIV NC 단백질 또는 이를 포함하는 GAG, GAG+POL 단백질이 발현되어도 대조군에 비해서 루시퍼라제 비율이 그다지 감소하지 않았으나, HIV Psi 서열이 존재하는 경우, HIV NC 단백질 또는 이를 포함하는 GAG, GAG+POL 단백질과 HIV Psi 서열이 상호작용하여 대조군에 비해서 루시퍼라제 비율이 크게 감소하는 것을 알 수 있었다. 한편, 본 실험으로 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용을 EGFP 대신 루시퍼라제 활성으로도 측정할 수 있다는 점을 알 수 있었다.

<3-4> 가우시아 루시퍼라제를 활용한 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용의 확인

HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터대신 상기 실시예 <1-7>의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra) 벡터를 사용하고, pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터대신 상기 실시예 <1-8>의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Gaussia(-extra) 벡터를 사용하여 다음과 같이 가우시아 루시퍼라제 분석을 수행하였다.

이 때, pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra) 벡터 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Gaussia(-extra) 벡터는 각각 1μg을 사용하였으며, 대조군 벡터(pLP/Con) 및 pLP/OptiNC 벡터는 양을 달리하여(500ng, 1μg, 1.5μg, 2μg)하여 사용하였다.

형질전환을 위하여 T-Rex293 세포(Invitrogen, 미국)를 10%(v/v) 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 1% 스트렙토마이신/페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지에서 37˚C, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 상기 세포를 60~70% 정도의 조밀도(confluency)를 가질 때까지 배양한 후 형질전환할 벡터를 이용하여 jetPEI 제제(Polyplus, 프랑스)와 혼합하여 제조사의 지침에 따라 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 16~18시간 배양 후 2μg/ml 농도의 테트라싸이클린(tetracycline)로 처리하고 밤새 배양한 다음, 배양된 세포들에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, HIV Psi 서열이 존재하지 않는 경우(도 6A) HIV NC 단백질이 발현되어도 대조군에 비해서 가우시아 루시퍼라제 활성이 그다지 감소하지 않았으나, HIV Psi 서열이 존재하는 경우(도 6B), HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열이 상호작용하여 대조군에 비해서 가우시아 루시퍼라제 활성이 크게 감소하는 것을 알 수 있었다. 한편 본 실험으로 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용을 가우시아 루시퍼라제 활성으로도 측정할 수 있다는 점도 알 수 있었다.

< 실시예 4>

HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용 저해물질의 탐색

본원발명의 HIV NC 단백질을 발현하는 발현벡터와 HIV Psi 서열을 포함하는 발현벡터로 동시에 형질전환된 세포가 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 물질의 탐색에 이용될 수 있는지 확인하기 위하여 HIV NC 단백질 저해제인 하기 <화학식 1>의 아연 킬레이터(zinc chelator; William G. Rice et al., Science, 270: 1194, 1995)를 처리하였을 때 리포터 유전자의 발현을 다음과 같이 확인하였다.

<화학식 1>

상기 실시예 3에서와 같이 T-Rex293 세포에 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터 250ng 및 상기 실시예 <3-1>에서의 대조군 벡터(control) 1μg을 이용하여 형질전환시킨 후 배양하여 EGFP의 발현을 형광현미경으로 살펴보았다.

아울러, 실시예 3에서와 같이 T-Rex293 세포에 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터 250ng 및 pLP1/optiNC 1μg을 이용하여 형질전환시킨 후 배양하여 EGFP의 발현을 형광현미경으로 살펴보았다.

아연 킬레이터의 탐색 효과를 살펴보기 위하여 상기 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터 250ng 및 pLP1/optiNC 1μg로 형질전환시킨 T-Rex293 세포에 아연 킬레이터를 양을 달리하여(0.1μM 및 1μM) 상기 실시예 <3-1>의 방법과 동일하게 배양하였다. 이 때 아연 킬레이터의 첨가는 테트라싸이클린 처리시 같이 첨가되었다.

그 결과, 도 4에서 보듯이, HIV NC 단백질을 발현하지 않은 대조군에서는 EGFP에 의한 형광이 잘 관찰되었으나(A), HIV NC 단백질이 발현되는 경우 HIV NC 단백질와 HIV Psi 서열간의 상호작용에 의해 EGFP가 발현되지 않음을 알 수 있었다(B). 이 때, HIV NC 단백질의 저해제인 아연 킬레이터를 첨가하는 경우 농도 의존적으로 다시 EGFP의 발현으로 인한 형광이 관찰됨을 알 수 있었다(C). 따라서, 본원발명의 시스템를 이용하는 경우 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 물질의 스크리닝을 할 수 있게 된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 포유동물 세포 및 스크리닝 방법 은 진핵세포를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 물질을 탐색할 수 있는 시스템을 제공하는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명은 HIV의 포장에 관여하는 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용을 저해하는 새로운 물질을 탐색할 수 있는 새로운 수단을 제공할 뿐만아니라 AIDS 예방 및 치료 효과를 가지는 물질을 탐색할 수 있는 새로운 스크리닝 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터(A) 및 pcDNA4TO-ΔPsi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터(B)를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 인한 번역억제 효과를 나타낸 결과이다.

도 2는 본 발명의 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra) 벡터(A) 및 pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-EGFP(-extra) 벡터(B)를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 인한 번역억제 효과를 나타낸 결과이다.

도 3은 본 발명의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(-extra) 벡터(A) 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Fluc(-extra) 벡터(B)를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 인한 번역억제 효과를 나타낸 결과이다.

도 4는 본 발명의 형질전환 세포를 이용한 스크리닝 시스템에서 HIV NC 단백질 및 HIV Psi 서열의 상호작용 저해시 번역이 이루어지는 것을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra) 벡터(A) 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Gaussia(-extra) 벡터(B)의 제조 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 6는 본 발명의 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra) 벡터(A) 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-Gaussia(-extra) 벡터(B)를 이용하여 HIV NC 단백질과 HIV Psi 서열의 상호작용으로 인한 번역억제 효과를 나타낸 결과이다.

<110> AVEXGEN Inc. YOU, Ji Chang <120> Recombinant mammalian cell for screening a substance preventing and treating AIDS and screening method using the same <130> NP08-0003 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV optiNC <400> 1 Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe 1 5 10 15 Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg 20 25 30 Lys Lys Gly Cys Trp Arg Cys Gly Arg Glu Gly His Gln Met Lys Asp 35 40 45 Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn 50 55 <210> 2 <211> 131 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 2 ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacagca agaggcgagg ggcggcgact 60 ggtgagtacg ccaatttttg actagcggag gctagaagga gagagagatg ggtgcgagag 120 cgtcggtatt a 131 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 gtatcatatg ccaagtacgc cccctatt 28 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gcggatccaa gctttctcta tcactgatag ggag 34 <210> 5 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV ARV-2/SF2 <400> 5 ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacagca agaggcgagg ggcggcgact 60 ggtgagtacg ccaatttttg actagcggag gctagaagga gagagagatg ggtgcgagag 120 cgtcggtatt a 131 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for psi <400> 6 ccaagcttac gcaggactcg gcttgctg 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for psi <400> 7 ccggatccta ataccgacgc tctcgcac 28 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for (-ATG)EGFP <400> 8 ccggatccgt gagcaagggc gagga 25 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for EGFP <400> 9 tacttctcga gctctgtaca tgtccgcgg 29 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for EGFP <400> 10 ccggatccat ggtgagcaag ggcgagga 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for R-5U-psi <400> 11 ccaagcttgg gtctctctgg ttagacca 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for R-U5-psi <400> 12 ccggatccta ataccgacgg tctcgcac 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for R-U5 <400> 13 ccaagcttgg gtctctctgg ttagacca 28 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for R-U5 <400> 14 ccggatcccg agagatctcc tctggctt 28 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> luc-F primer <400> 15 ccggatccga agacgccaaa aacataaa 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> luc-R primer <400> 16 tactcgagtt acacggcgat ctttccgc 28 <210> 17 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV optiNC <400> 17 atgcagcggg gaaacttcag gaaccagcga aaaactgtga agtgcttcaa ttgcggaaag 60 gagggccaca tcgctaagaa ctgccgggcc cccagaaaga aaggctgctg gagatgcggc 120 agagagggcc accagatgaa ggactgcact gagcggcagg caaac 165 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psi HindIII-F <400> 18 ccaagcttac gcaggactcg gcttgctg 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psi BamHI-R <400> 19 ccggatccta ataccgacgg tctcgcac 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gau BamHI-F <400> 20 ccggatccgg agtcaaagtt ctgtttgc 28 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gau XbaI-R <400> 21 aatctagatg catgctcgag cggccgct 28

Claims

(a) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 HIV NC(nucleocapsid) 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 pLP1/optiNC; 및

(b) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 HIV psi(Ψ) 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 유전자 발현카세트로 형질전환된 재조합 포유동물 세포.
제1항에 있어서, 상기 형질전환세포는 T-Rex293 세포인 것을 특징으로 하는세포.
제1항에 있어서, 상기 HIV NC 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 세포.
삭제
제1항에 있어서, 상기 HIV psi(Ψ)은 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 세포.
제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 EGFP(enhanced green fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), 루시퍼라제(luciferase), 가우시아 루시퍼라제(gaussia luciferase, gaussian luciferase), β-갈락토시다제(galactosidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 세포.
제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자 발현카세트는 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra), pcDNA4TO-R-U5-Psi(Ψ)-(-ATG)EGFP(-extra), pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Fluc(-extra) 및 pcDNA4TO-Psi(Ψ)-(-ATG)-Gaussia(-extra)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 세포.
(a) 제1항의 세포에 후보물질을 처리하여 배양하는 단계; 및

(b) 상기 배양된 세포의 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함 하는 것을 특징으로 하는 AIDS의 예방 및 치료 물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 형광 검출, 루시퍼라제 활성 측정, β-갈락토시다제 활성 측정, 알칼라인 포스파타제 활성 측정, 공동-면역침전법(co-immunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.