KR100983475B1

KR100983475B1 - 당뇨병성 망막증 진단용 바이오마커

Info

Publication number: KR100983475B1
Application number: KR1020080005162A
Authority: KR
Inventors: 김찬화; 김판겸; 유현석; 박혜원; 김미령; 김재찬
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2008-01-17
Filing date: 2008-01-17
Publication date: 2010-09-24
Also published as: EP2081029A3; EP2081029B1; EP2081029A2; US20090186032A1; EP2267457A1; EP2267457B1; US20110269248A1; JP2009168819A; KR20090079294A

Abstract

본 발명은 눈물을 이용한 당뇨병성 망막증의 진단용 마커로 사용 될 수 있는 단백질에 관한 것으로, 구체적으로는 당뇨병 환자 보다 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 그 발현양이 감소 또는 증가되는 바이오마커 단백질과 이를 이용한 당뇨병성 망막증의 진단 키트에 관한 것이다. 또한 그 발현양이 증가 또는 감소되는 단백질은 당뇨병성 망막증의 치료제로서도 그 가치가 인정되는 바이다.

본 발명에 따르면, 사람의 눈물로부터 당뇨병성 망막증을 진단하여 그 증상의 경도를 파악할 수도 있다. 또한 본 발병의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 면역분석 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 당뇨병성 망막증의 진단 및 진행정도를 판단하고, 치료용 목적으로는 신약 개발에 사용될 수 있다.

당뇨병성 망막증, 바이오마커, 항체, 진단키트

Description

당뇨병성 망막증 진단용 바이오마커 {Bio-marker for diagnosing diabetic retinopathy}

본 발명은 당뇨병성 망막증 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 더 많이 혹은 적게 발현되는 바이오마커 단백질과 이를 이용한 당뇨병성 망막증 환자의 조기진단을 위한 진단키트에 관한 것이다.

당뇨병(糖尿病, diabetes mellitus)이란 혈액 속에 포도당 농도(당분)가 비정상적으로 증가하고 장기간 지속되어 유도되는 대표적 대사이상으로, 전신적인 비전염성 만성질병이다. 인슐린은 췌장의 베타세포에서 생성되어 탄수화물이 소화 흡수되어 만들어지는 포도당의 대사에 중추적인 역할을 수행하며, 고혈당이 되지 않도록 혈중 포도당 농도를 일정범위 내로 조절하는 호르몬이다. 당뇨병은 자가면역 기작에 의해 췌장의 베타세포가 파괴되어 유도되는 인슐린의 절대적 또는 상대적 생산 결핍의 결과이거나, 인슐린이 분비된다고 해도 표적장기에서의 인슐린의 효과 적 작용저하(인슐린 저항성)의 결과에 의한 것으로, 혈당은 지속적인 상승 상태를 보이고 체내의 포도당 대사를 포함한 신진대사 기능이 원활하게 이루어 질 수 없게 된다. 당뇨병 환자는 인체의 에너지가 되는 당을 이용하지 못해 몸의 균형이 깨지면서 여러 합병증이 생기고 생명을 위협받게 된다.

당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy)은 당뇨병의 3대 미세혈관 합병증(microvascular complications) 중의 하나로서 지속적인 고혈당과 이에 따른 대사 이상으로 망막의 미세혈관이 점진적으로 변형, 폐쇄되어 순환장애가 일어나 망막으로의 원활한 혈액공급이 되지 않아 발병하는 질병이다. 65세 이하 성인에서 실명의 가장 흔한 원인이 되는 무서운 질환으로 발생 빈도가 점차 증가되고 있다. 당뇨병성 망막증의 발생과 진행에 영향을 끼치는 요인으로는 당뇨병의 유병기간, 혈당 조절 정도, 고혈압, 임신, 신장질환, 고지혈증 등이 있다. 가장 중요한 위험인자는 당뇨 이환기간으로 20년간 당뇨를 앓으면 제 1형 당뇨병에서는 거의 100%에서 나타나고 제 2형 당뇨병에서는 40~60%에서 나타나며, 이들 중 약 10%가 심각한 시력장애를 일으키게 된다. 당뇨병성 망막증은 당뇨병을 앓은 기간이 길수록 그 빈도가 증가하기 때문에 처음 당뇨병을 진단 받았을 때부터 주기적으로 안저 검사를 통해 당뇨병성 망막 변화를 관찰해야 한다.

대표적 대사질환인 당뇨병의 발병률 증가와 함께 당뇨병의 대표적 합병증인 당뇨병성 망막증을 가진 환자의 수도 계속 증가될 것으로 예상된다. 정기검진 및 광응고(술)를 이용한 치료에 의해 당뇨병성 망막증에 의한 실명률이 낮아지고 있으므로, 최근 당뇨병성 망막증의 조기 발견을 위한 진단 마커를 찾고자하는 시도와 효과적인 mass screening 방법의 개발이 요구되고 있다. 더욱이 당뇨병성 망막증은 조기 진단과 관리에 의해 충분히 예방될 수 있다고 제시되어 왔다. 그러나 영구적인 실명이나 시력저하를 유도하는 당뇨병성 망막증의 정확한 병리학적 특성과 분자적 지표들에 대한 충분한 이해가 부족한 상황이며, 이것은 당뇨병성 망막증의 진단과 치료에 있어 주요 장애요인으로 작용해왔다. 더욱이 endothelin-1 (ET-1), protein kinase C (PKC), E-selectin를 포함한 vascular adhesion molecule들, thrombin-cleaved osteopontin과 phosphoinositides, thrombin-stimulated platelet aggregation, vitreous VEGF, circulating soluble ICAM-1 (sICAM-1), advanced glycation end products (AGEs), nitric oxide, IL-1, 6, 8와 tumor necrosis factor-α 등의 cytokine들, HLA DR1, A9, B40 allele들, glycosylated haemoglobin (HbA1c), microalbuminuria, aldose reductase (AR), Fas, PEDF 등이 당뇨병성 망막증의 마커로서 제시되어 왔음에도 불구하고, 이들 모두가 당뇨병성 망막증만을 위한 특이성을 나타내지는 못하며, 이는 당뇨병성 망막증의 진단에 있어 모호성을 유도하고, 치료에 있어 효율성 저하의 원인이 되었다. 본 발명에서는 당뇨병성 망막증의 높은 발병률과 특이 바이오 마커의 부족으로 인한 발병과정의 이해 및 진단에 대한 한계를 고려하여, 현재 전체적인 발병과정을 조절하고 있는 조기 진단 바이오마커의 정의가 요구된다고 판단하였다. 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규진단 마커와 아울러 이를 검출할 수 있는 단클론항체를 개발할 경우, 당뇨병성 망막증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 할 수 있는 키트의 개발을 도모할 수 있다고 판단했다. 또한 당뇨병성 망막증의 바이오마커를 특성화하는 작업에 있어서 단백체학(proteomics)적 접근을 통한 large-scale analysis의 본질적인 가치를 인정하며, 이를 당뇨병성 망막증의 효과적인 진단과 치료 사이의 연결을 위한 최선의 방법으로 선택하였다.

과거에는 당뇨병성 망막증의 조기 발견을 위한 진단 바이오마커를 주로 혈청을 이용하여 분석해왔다. 그러나 그러한 연구의 경우, 혈청 내 단백질의 글리코실화(glycosylation)와 알부민(albumin)과 면역 글로블린(immunoglobulin)과 같은 abundant 단백질들의 존재에 의해 분석에 있어서의 많은 어려움이 제시되어왔다. 그러므로 당뇨병성 망막증의 영역에서, 바이오마커의 정의를 위한 보다 정확하고, 효율적이며 새로운 접근 방법으로서, 본 발명은 눈물 단백질의 분석을 제시한다. 일반적으로 눈물은 점액소(mucin), 지질(lipid), 염(salt), 당단백질(glycoprotein) 및 그 외의 다양한 단백질로 구성된다. 주요 눈물 단백질에는 arelysozyme, lactoferrin, secretory immunoglobulin A (sIgA), lipocalin, albumin, lipophilin이 있으며, 이들의 양 또는 질적인 변화는 우리의 다양한 병리학적 상태의 변화로 해석될 수 있다. 그러나 눈물 단백질에 대한 연구가 지속적으로 진행되어 왔음에도 불구하고, 대부분이 단일 단백질과 특정 질환과의 상호 연관성을 밝히는데 한정되어왔으며, 이를 통해 얻어진 제한적 지식은 질환에 대한 제한적 이해만을 가능하게 했다. 본 발명에서는 최근 부각되는 2차원 전기영동기술 (two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)을 이용한 눈물의 분석이 구성 단백질의 종합적인 이해를 가능하게 함을 제안한다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 당뇨병성 망막증의 조기진단을 위한 새로운 바이오마커 또는 그 면역원성 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커 단백질에 대한 항체 및 이를 이용한 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 당뇨병 환자의 눈물보다 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 발현이 상대적으로 증가하는 하기 군에서 선택된 단백질을 포함하는 당뇨병성 망막증 진단용 바이오마커를 제공한다:

서열번호 1과 2의 트립신 분해된 서열을 가지고 24-26 kDa의 분자량 및 5.83-6.83의 pI를 갖는 DJ-1 단백질(DJ-1 protein); 및

서열번호 3과 4의 트립신 분해된 서열을 가지고 15-17 kDa의 분자량 및 5.27-6.27의 pI를 갖는 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin, B2M).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 당뇨병 환자의 눈물보다 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 발현이 상대적으로 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 포함하는 당뇨병성 망막증 진단용 바이오마커를 제공한다:

서열번호 5와 6의 트립신 분해된 서열을 가지고 27-29 kDa의 분자량 및 6.5-7.5의 pI를 갖는 엔빌롭 단백질(envelope protein);

서열번호 7의 트립신 분해된 서열을 가지고 19-21 kDa의 분자량 및 4.24-5.24의 pI를 갖는 단백질 SAP1(protein SAP1);

서열번호 8의 트립신 분해된 서열을 가지고 20-23 kDa의 분자량 및 4.13-5.43의 pI를 갖는 리포칼린 1-유사 1(lipocalin 1-like 1);

서열번호 9의 트립신 분해된 서열을 가지고 20-22 kDa의 분자량 및 4.3-5.3의 pI를 갖는 리포칼린(lipocalin(hCG201503), LCN-1);

서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15의 트립신 분해된 서열을 가지고 20-22 kDa의 분자량 및 4.64-5.64의 pI를 갖는 시토케라틴(cytokeratin 4);

서열번호 16의 트립신 분해된 서열을 가지고 21-23 kDa의 분자량 및 6.01-7.01의 pI를 갖는 S100 칼슘 결합 단백질 A8(S100 calcium-binding protein A8 );

서열번호 17의 트립신 분해된 서열을 가지고 21-23 kDa의 분자량 및 4.89-5.89의 pI를 갖는 리포칼린 1 전구체(lipocalin 1 precursor);

서열번호 18과 19의 트립신 분해된 서열을 가지고 27-29 kDa의 분자량 및 4.34-5.34의 pI를 갖는 케라틴 31(ketain 31);

서열번호 20, 21 및 22의 트립신 분해된 서열을 가지고 30-32 kDa의 분자량 및 7.53-8.53의 pI를 갖는 열쇼크 단백질(heat shock protein 27, Hsp27);

서열번호 23의 트립신 분해된 서열을 가지고 19-21 kDa의 분자량 및 5.28-6.28의 pI를 갖는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 이소폼(adenine phosphoribosyltransferase isoform);

서열번호 24의 트립신 분해된 서열을 가지고 19-22의 분자량 및 4.70-5.80의 pI를 갖는 인산화히스티딘 인산 가수분해 효소(phosphohistidine phosphatase);

서열번호 25, 26 및 27의 트립신 분해된 서열을 가지고 18-21 kDa의 분자량 및 5.96-6.96의 pI를 갖는 베타 글로빈(beta globin);

서열번호 28과 29의 트립신 분해된 서열을 가지고 18-20 kDa의 분자량 및 6.5-7.5의 pI를 갖는 리소자임 전구체(Lysozyme precursor);

서열번호 30, 31 및 32의 트립신 분해된 서열을 가지고 14-16 kDa의 분자량 및 5.21-6.21의 pI를 갖는 S100 칼슘 결합 단백질 A9(S100 calcium-binding protein A9);

서열번호 33의 트립신 분해된 서열을 가지고 13-15 kDa의 분자량 및 5.21-6.21의 pI를 갖는 크리스탈 구조 칼프로텍틴(Crystal Structure Of Human Calprotectin); 및

서열번호 34의 트립신 분해된 서열을 가지고 11-13 kDa의 분자량 및 6.28-7.28의 pI를 갖는 S100 칼슘 결합 단백질 A4(S100 calcium-binding protein A4).

본 발명에서, 상기 트립신 분해된 펩타이드란 MALDI-TOF 또는 MS/MS 분석을 위해 트립신(trypsin)으로 분해된 단백질의 펩타이드를 의미한다. 또한 상기 분자량과 pI는 2차원 전기영동(Two-dimentional electrophoresis) 상에서 확인된 값으로서 일반적으로 허용되는 실험상의 오차범위를 포함한다.

본 발명에서는 눈물 단백질체가 당뇨병성 망막증의 진단에 유용한 정보의 저장소로서 가치가 있다는 판단 하에, 단백체학 기술을 이용하여 조기 당뇨병성 망막증의 진단 마커 눈물 단백질들을 선발하고, 이를 기반으로 당뇨병성 망막증의 전반 적인 발병과정을 이해하고자 시도하였다. 망막증 증상이 없는 당뇨환자, 비증식성 당뇨병성 망막증환자, 정상인 사이의 눈물 단백질 유형을 비교하는데 있어서, 세 개 그룹에서의 눈물 단백질이 2차원 전기영동에 의해 분리되었고, 발현에 차이를 보인 단백질들이 ESI-MS/MS 분석에 의해 비교, 확인되었다. 본 발명에서는 세 그룹의 눈물 단백질의 성분 및 발현이 차이를 보임을 밝혔으며, 따라서 단백질체 분석에 의한 눈물 단백질의 정의가 당뇨병 환자에서의 조기 망막증을 위한 바이오마커를 찾는 수단으로서 적합함을 보여주었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 망막증 진단제를 제공한다.

본 발명에서, 상기 면역원성 단편이란 본 발명의 바이오 마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오 마커 단백질의 단편을 의미한다.

본 발명의 당뇨병성 망막증 진단제에서, 상기 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되면, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상 된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리·정제한다.

상기 모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495))에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 ㎍을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 망막증 진단키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 당뇨병성 망막증 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에도 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 당뇨병 환자의 눈물보다 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 망막증 치료 및 예방용 조성물을 제공한다:

서열번호 24의 트립신 분해된 서열을 가지고 19-22 kDa의 분자량 및 4.70-5.80의 pI를 갖는 인산화히스티딘 인산 가수분해 효소(phosphohistidine phosphatase);

본 발명의 바이오마커 단백질들은 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 부족한 성분들이므로 이를 안약으로 환자의 눈에 보충하여 주면 당뇨병성 망막증 예방 및 치료에 효과를 발휘할 것이다.

본 발명의 안약 조성물은 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 점안용 액제의 제형으로 제조될 수 있다. 이들은 눈에 직접 점적하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 안약 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인 기준으로 1일 0.1-0.5 mg의 단백질을 안약 형태로 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 시료준비 (Sample preparation)

본 발명에서는 중앙대학교 병원에서 공급된 14명의 정상인, 10명의 제2형 당뇨병 및 17명의 당뇨병성 망막증 환자의 눈물을 사용하였다. 눈물(tear fluid)은 내부 눈물 반월판(반월연골, meniscus)에서 폴리에스테르 심지(polyester wick)를 사용하여 얻었다. 심지를 1.5 ㎖ 튜브안의 마이크로파이펫 팁 끝에 놓고, 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리(Union-55R centrifuge, 한일과학, Korea)하였다. 눈물 시료 내 단백질을 브래드퍼드 방법(Bradford method)으로 정량하고 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 2: 이차원 전기영동(Two-Dimensional Electrophoresis)

가. 일차원 전기영동(Isoelectroforcusing, IEF)

눈물 단백질의 양을 60 ㎍으로 하여 일차원 전기영동을 실시하였다. 시료의 총 부피가 450 ㎕가 되게 rehydration 완충액(8 M urea, 2% CHAPS, 13 mM DTT, 1 % IPG buffer, BPB(Bromophenol Blue))을 섞어 일차원 전기영동을 할 수 있는 24 ㎝ strip holder에 넣은 뒤, pH 4-7 범위의 Drystrip(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 strip holder에 장착하였다. Strip을 전류 없이 5시간, 80 V 전류에서 5시간 동안 rehydration한 후, IPGphore IEF system(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 사용하여 총 100,000 Vhr로 일차원 전기영동을 수행하였다.

나. 이차원 전기영동

(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)

이차원 전기영동을 하기 위해 일차원 전기영동이 끝난 strip을 cap tube에 넣고 일차 평형화 용액(6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 20% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) 10 ㎖에 15분간 반응시킨 후, 다시 이차 평형화 용액(6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA) 10 ㎖을 넣고 10분간 재 반응시켰다. 11~16%로 만들어진 Polyacylamide 젤(gradient, 25×30 ㎝) 위에 반응이 끝난 strip을 장착하고 0.5% 아가로즈로 sealing하였다. 이차원 전기영동은 Ettan Dalt(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 전기영동 완충액(24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고 전기영동을 실시하였다. 전기영동 조건은 다음과 같다: 70 V 1시간, 140 V 2시간, 320 V 5시간.

다. 염색(Staining)

이차원 전기영동이 끝난 뒤 젤을 가시화하기 위해 silver 염색을 하였다. Silver 염색과정은 다음과 같다. 50% methanol, 12% acetic acid, 0.05％　formaldehyde로 이루어진 용액에 2시간 이상 반응시켜 고정화(Fixation)하고, 50% ethanol로 20분간 3회 세척(Washing)한 후, 0.2% Sodium thiosulfate 용액으로 1분간 반응시켜 민감화(Sensitizing)시켰다. D.W.로 세척(Washing)한 다음, 0.1% Silver nitrate, 0.075% formaldehyde(37%) 용액으로 20분간 반응시켜 반응화 (Improving)하고, D.W.로 다시 세척(Washing)한 후, 미리 차게 만든 6% Sodium carbonate, 0.075% formaldehyde(37%) 용액으로 약 7분간 반응시켜 가시화(Developing)하고, 50% methanol, 12% acetic acid 용액으로 처리하여 반응을 정지시켰다.

라. 이미지 분석(Image Analysis)

실험한 젤들을 분석하기 위해 먼저 ImageScanner (Amersham Pharmacia Bio-tech, Uppsala, Sweden)로 스캔하였다. 단백질 발현이 차이나는 점들을 분석하기 위해 이차원 전기영동 분석 전용 프로그램인 ImageMaster 2D Platinum version 6.0 (GE Healthcare, UK)으로 분석을 수행하였다.

실시예 3: 질량분석기를 이용한 단백질 동정(ESI-Q-TOF/MS/MS Analysis)

이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 점(spot)들을 오려냈다. 먼저 silver를 없애기 위해 30 mM Potassium Ferricyanide와 100 mM Sodium Thiosulfate 용액이 1:1로 섞인 탈염색 용액 100 ㎕을 젤 조각에 5분간 처리하였다. 이후에 400 ㎕의 물로 3번 세척하였다. 다시 200 mM ammonium bicarbonate로 반응한 뒤 물로 세척하였다. Acetonitrile을 넣어 젤이 하얗게 변할 때까지 탈수시켰다. 이 젤을 진공 원심분리기(Speed vacuum centrifuge)에 넣어서 젤로부터 용액을 완전히 없앴다. 건조된 젤 조각은 0.2 ㎍의 trypsin (promega)이 들어있는 50 mM의 ammonium bicarbonate 20 ㎕로 얼음(ice)상에서 45분간 함수시켰다. 반응용액을 제거 후 50 mM의 ammonium bicarbonate 30 ㎕를 넣은 후 37℃로 밤새 반응시켰다. 그 펩타이드 용액은 C18 nano column(home made)를 이용하여 염분을 제거하였다.

Custom-made chromatographic columns은 질량분석 이전에 펩타이드 염분제거와 농축용으로 사용되었다. Poros reverse R2 material(20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems)의 100-300 nL로 구성된 column은 단단히 조여진 GELoader tip(Eppendorp, hamburg, Germany)에 팩킹하였다. 10 mL syringe는 공기압으로 column을 통해 물질을 통과시켰다. 펩타이드 용액 30 ㎕는 5% formic acid 용액 내에서 희석되고, column안으로 이동된 후, 5% formic acid 용액으로 세척하였다. MS/MS분석을 위해 펩타이드는 borosilicate nanoelectrospray needle(Micromass, Manchester, UK)에 50% methnol/49% H₂0/1% formic acid와 섞여 용출하였다.

MS/MS는 Q-TOF2 mass spectrometer(Micromass, Mancheser, UK)상에서 nano-ESI로 수행하였다. 그 소스(source)온도는 80℃이다. 1 kV의 전압은 안정된 flow rate(10-30 nL/min)를 생성하기 위해 0-5 psi의 nitrogen back-pressure와 혼합되어진 이온 소스(ion source)에서 borosilicate nanoelectrospray needles(EconoTipTM, New Objective, USA)에 적용하였다. 그 원뿔(cone) 전류는 40 V로 하였다. Quardrupole analyser는 hexapole collision cell에서 분절화를 하기위해 전구 이온(precursor ion)을 선택하는데 사용되었다. 충돌가스(collision gas)는 6-7× 10^-5 mbar의 아르곤(Ar)이며 출동 에너지(collision energy)는 20-30 V였다. 생성 이온은 반사기(reflector)와 작은 통로판 검사기(micro channel plate detector), 그리고 time-to-digital 변환기에 맞추어지는 TOF 분석기를 이용하여 분석하였다. 그 자료는 Mass Lynx Widows NT PC system을 이용하여 분석하였다.

단백질을 동정하기 위해 모든 MS/MS 스펙트럼은 MASCOT search program(www.matrixscience.com)을 이용하여 NCBInr 데이터베이스에서 단백질 서열을 조사하였다.

상기와 같이 당뇨병성 질환의 진행시 다르게 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 3a 내지 3t에 나타내었다.

실시예 4: Western blotting

가. SDS-PAGE 전기영동

당뇨병 및 당뇨병성 망막증 환자의 눈물 단백질 40-50 ㎍을 12% SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 눈물 시료에 SDS-PAGE loading 완충액(60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8)을 섞어 mini gel(6× 8㎝)에서 분자량별(separating gel상에서 120 V로 내린다.)로 분리하였다. 이때 사용한 running 완충액의 조성은 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS(pH 8.3)였다.

나. Blotting

SDS-PAGE가 끝난 뒤 gel의 단백질을 Semi-dry 형태의 transfer kit(Bio-rad)을 이용하여 NitroCellulose 막으로 옮겨, 50 mA에서 1시간 30분 동안 실시하였다.

다. 항체반응

LCN-1, Hsp27, B2M을 대상으로 하여 실시하였다. Membrane을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 동안 blocking시켰다. LCN-1(1:1000), Hsp27(1:1000), B2M(1:500)을 위한 일차 항체를 blocking 용액과 함께 사용하였고, 4℃에서 24시간동안 반응시켰다. 각 항체는 monoclonal antibody를 사용하였다. TBS/T(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 washing한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시킨다. 이차항체는 anti-rabbit를 사용하고, 희석농도는 1/10,000이었다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.)로 가시화 하였다.

상기와 같이 이차원 전기영동실험을 수행한 결과, 다음과 같이 당뇨병 환자에서 보다 당뇨병성 망막증 환자에서의 눈물에서 새롭게 발현되거나 발현양이 감소 및 증가하는 단백질들이 동정되었다.

1. 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 발현이 변화된 단백질

당뇨병성 망막증 환자군(개체군)을 대상으로 전기영동을 수행한 결과 18개의 발현이 감소한 단백질(#10699, #10861, #11035, #11038, #11055, #11056, #11057, #11069, #11078, #10530, #10765, #11051, #10825, #10852, #10889, #10894, #10927, #11058)과 2개의 증가한 단백질(#10688, #11046)을 찾을 수 있었다(도 1a, 1b, 1c 및 도 2a, 2b 참조). 발현이 감소한 단백질은 당뇨병 환자군의 단백질보다 약 50% 이상 감소하였으며, 증가한 단백질은 약 300% 이상 증가하였다. ESI-Q-TOF/MS/MS를 수행 한 결과 당뇨병에서 당뇨병성 망막증으로 진행시 발현이 감소 및 증가한 단백질을 아래 표 1과 같이 동정하였다.

[표 1]. 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 발현이 변화된 단백질

2. 단백질의 아미노산 서열의 결정

당뇨병에서 당뇨병성 망막증으로 진행시, 발현 양에 변화를 나타내는 단백질들을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 동정하여 도 3a 내지 3t의 결과를 얻었다. 도면에서 빨간색은 매치된 트립신 분해 펩타이드의 서열을 나타낸다. 이들 단백질의 아미노산 서열은 NCBInr 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 DJ-1 protein (서열번호 35), beta 2-microglobulin (서열번호 36), envelope protein (서열번호 37), protein SAP1 (서열번호 38), lipocalin 1-like 1 (서열번호 39), lipocalin(hCG201503)(서열번호 40), cytokeratin 4 (서열번호 41), S100 calcium-binding protein A8 (서열번호 42), lipocalin 1 precursor(서열번호 43), ketain 31 (서열번호 44), heat shock protein 27 (서열번호 45), adenine phosphoribosyltransferase isoform (서열번호 46), phosphohistidine phosphatase (서열번호 47), beta globin (서열번호 48), Lysozyme precursor (서열번호 49), S100 calcium-binding protein A9 (서열번호 50), Crystal Structure Of Human Calprotectin (서열번호 51) 및 S100 calcium-binding protein A4 (서열번호 52)를 가짐을 확인하였다.

하기 표 2 및 표 3은 당뇨병성 망막증 환자에서 다르게 발현하는 단백질들의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 나타낸다.

[표 2]. 발현이 증가한 단백질의 트립신 분해된 펩타이드 서열

[표 3]. 발현이 감소한 단백질의 트립신 분해된 펩타이드 서열

3. Western blotting 시험결과

상기 발현이 변화된 단백질들 중 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 동정된 단백질인 LCN-1, Hsp27, B2M를 western blot을 한 실험 결과를 도 4a에 나타내고, 그 상대적인 강도를 도 4b, 4c, 4d에 나타내었다. 결과에서 보는 바와 같이 망막증 의 진행정도에 따라 LCN-1와 Hsp27의 양이 유의적으로 감소하고, B2M의 양이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 2차 전기영동의 결과와 일치하였다. 이것으로 보아 눈물의 LCN-1, Hsp27, B2M는 망막증의 조기진단 바이오 마커로서 매우 유용할 것으로 생각되며, 또한 당뇨병성 망막증 치료 및 예방용 조성물로서의 가능성을 나타내었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 결과로 얻어진 당뇨병성 망막증에서 발현이 증가한 단백질 2개와 발현이 감소한 단백질 16개는 당뇨병성 망막증의 조기진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 바이오마커 단백질은 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 당뇨병성 망막증의 조기진단을 위한 immunoassay 키트에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 당뇨병성 망막증 조기진단을 위한 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에 이용될 수도 있다.

도 1a는 정상인의 눈물에서 발현하는 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,

도 1b는 망막증 증상이 없는 제2형 당뇨병 환자의 눈물에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,

도 1c는 비증식성 당뇨병성 망막증을 가지는 제2형 당뇨병 환자의 눈물에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,

도 2a는 도 1a, 1b, 1c에서 나타난 단백질들을 상세하게 보여주는 확대 이미지이고(Healthy: 정상인, No DMR: 망막증 증상이 없는 당뇨병 환자, NPDR: 비증식성 당뇨병성 망막증을 가지는 당뇨병 환자),

도 2b는 도 2a의 상대적인 강도를 나타낸 결과이고,

도 3a 내지 3t는 각각 DJ-1 protein, beta 2-microglobulin, envelope protein, protein SAP1, lipocalin 1-like 1, lipocalin(hCG201503), cytokeratin 4, S100 calcium-binding protein A8, lipocalin 1 precursor, ketain 31, heat shock protein 27, adenine phosphoribosyltransferase isoform, phosphohistidine phosphatase, beta globin, Lysozyme precursor, S100 calcium-binding protein A9, Crystal Structure Of Human Calprotectin 및 S100 calcium-binding protein A4의 ESI-Q-TOF/MS/MS 결과이고,

도 4a는 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 동정된 단백질인 LCN-1, Hsp27, B2M을 western blot을 통해 확인한 실험 결과 이미지이고,

도 4b, 4c, 4d는 도 4a의 상대적인 강도를 나타낸 결과이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Bio-marker for diagnosing diabetic retinopathy <160> 52 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ala Glu Glu Met Glu Thr Val Ile Pro Val Asp Val Met Arg 1 5 10 15 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Gly Pro Tyr Asp Val Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala 1 5 10 15 Gln Asn Leu Ser Glu Ser Ala Ala Val Lys 20 25 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile 1 5 10 15 Glu Val Asp Leu Leu Lys 20 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu 1 5 10 15 Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg 20 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Ile Pro Gly Gly Ile Tyr Asp Ala Asp Leu Asn Asp Glu Trp Val 1 5 10 15 Gln Arg <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Gln Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Trp Asn Leu Leu Gln Gln Gln Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Leu Glu Pro Leu Phe Glu Thr Tyr Leu Ser Val Leu Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Asp Ser Leu Asn Asp Glu Ile Asn Phe Leu Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asn Leu Asp Leu Asp Ser Ile Ile Ala Glu Val Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Gln Gln Leu Gln Ile Ser Val Asp Gln His Gly Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu 1 5 10 15 Ile Leu Val Ile Lys 20 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Asn Gln Glu Tyr Gln Val Leu Leu Asp Val Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Asn Val Glu Val Asp Ala Ala Pro Thr Val Asp Leu Asn Arg 1 5 10 15 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Leu Phe Asp Gln Ala Phe Gly Leu Pro Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Val Ser Leu Asp Val Asn His Phe Ala Pro Asp Glu Leu Thr Val Lys 1 5 10 15 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Ala Thr Gln Ser Asn Glu Ile Thr Ile Pro Val Thr Phe Glu Ser 1 5 10 15 Arg <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Leu Gln Ala Glu Val Leu Glu Cys Val Ser Leu Val Glu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Leu Lys <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Leu Ile Pro Asp Val Asp Leu Asp Ser Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala Ala Tyr Gln Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly 1 5 10 15 Asn Pro Lys <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile Met Leu Met Ala Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Asn Ile Glu Thr Ile Ile Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 32 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Val Ile Glu His Ile Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile Met Leu Met Ala Arg 20 25 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile Met Leu Met Ala Arg 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ala Leu Asp Val Met Val Ser Thr Phe His Lys 1 5 10 <210> 35 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Ala Ser Lys Arg Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu 1 5 10 15 Met Glu Thr Val Ile Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys 20 25 30 Val Thr Val Ala Gly Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg 35 40 45 Asp Val Val Ile Cys Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu 50 55 60 Gly Pro Tyr Asp Val Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln 65 70 75 80 Asn Leu Ser Glu Ser Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu 85 90 95 Asn Arg Lys Gly Leu Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu 100 105 110 Leu Ala His Glu Ile Gly Phe Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu 115 120 125 Ala Lys Asp Lys Met Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn 130 135 140 Arg Val Glu Lys Asp Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr Ser 145 150 155 160 Phe Glu Phe Ala Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu Val 165 170 175 Ala Ala Gln Val Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp 180 185 <210> 36 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro 1 5 10 15 Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val 35 40 45 Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp 50 55 60 Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu 65 70 75 80 Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val 85 90 95 Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 100 105 110 <210> 37 <211> 500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr 20 25 30 Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile 35 40 45 Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser 50 55 60 Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala 65 70 75 80 His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe 85 90 95 Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg 115 120 125 Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His 130 135 140 Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile 165 170 175 Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro 180 185 190 Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser 195 200 205 Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro 210 215 220 Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met 225 230 235 240 Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly 245 250 255 Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val 260 265 270 Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg 275 280 285 Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys 290 295 300 Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly 305 310 315 320 Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys 325 330 335 Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly 340 345 350 Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser 355 360 365 Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val 370 375 380 Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly 385 390 395 400 Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg 405 410 415 Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly 420 425 430 Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala 435 440 445 Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met 450 455 460 Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile 465 470 475 480 Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr 485 490 495 Asn Val His Ala 500 <210> 38 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ile Ile Pro Gly Gly Ile Tyr Asp Ala Asp Leu Asn Asp Glu Trp Val 1 5 10 15 Gln Arg Ala Leu His Phe Ala Ile Ser Glu Tyr Asn Lys Ala Thr Glu 20 25 30 Asp Glu Tyr Tyr Arg Arg Pro Leu Gln Val Leu Arg Ala Arg Glu Gln 35 40 45 Thr Phe Gly Gly Val Asn Tyr Phe Phe Asp Val Glu Val Gly Arg Thr 50 55 60 Ile Cys Thr Lys Ser Gln Pro Asn Leu Asp Thr Cys Ala Phe His Glu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Leu Gln Lys Lys Gln Leu Cys Ser Phe Glu Ile Tyr Glu 85 90 95 Val Pro Trp Glu Asp Arg Met Ser Leu Val Asp Ser Arg Cys Gln Glu 100 105 110 Ala <210> 39 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Met Lys Pro Leu Leu Leu Ala Ile Ser Leu Ser Leu Ile Ala Ala Leu 1 5 10 15 Gln Ala His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser 20 25 30 Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Leu Pro Glu 35 40 45 Met Asn Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Ile Leu Glu Gly 50 55 60 Gly Asn Leu Glu Ala Lys Ala Thr Met Leu Ile Ser Gly Gln Cys Gln 65 70 75 80 Glu Val Lys Val Ile Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr 85 90 95 Ala Asn Arg Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Met Lys 100 105 110 Asp His Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu 115 120 125 Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser 130 135 140 Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly 145 150 155 160 Ser Asp <210> 40 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Lys Pro Leu Leu Leu Ala Ile Ser Leu Ser Leu Ile Ala Ala Leu 1 5 10 15 Gln Ala His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser 20 25 30 Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Leu Pro Glu 35 40 45 Met Asn Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Ile Leu Glu Gly 50 55 60 Gly Asn Leu Glu Ala Lys Ala Thr Met Leu Ile Ser Gly Gln Cys Gln 65 70 75 80 Glu Val Lys Val Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr 85 90 95 Ala Asn Arg Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys 100 105 110 Asp His Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Ile 115 120 125 Arg Gly Ala Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala 130 135 140 Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp 165 170 175 <210> 41 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ser Leu Asn Gln Ser Leu Leu Thr Pro Leu His Val Glu Ile Asp Pro 1 5 10 15 Glu Ile Gln Lys Val Arg Thr Glu Glu Arg Glu Gln Ile Lys Leu Leu 20 25 30 Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Gln Phe Leu Glu Gln 35 40 45 Gln Asn Lys Val Leu Glu Thr Lys Trp Asn Leu Leu Gln Gln Gln Thr 50 55 60 Thr Thr Thr Ser Ser Lys Asn Leu Glu Pro Leu Phe Glu Thr Tyr Leu 65 70 75 80 Ser Val Leu Arg Lys Gln Leu Asp Thr Leu Gly Asn Asp Lys Gly Arg 85 90 95 Leu Gln Ser Glu Leu Lys Thr Met Gln Asp Ser Val Glu Asp Phe Lys 100 105 110 Thr Lys Tyr Glu Glu Glu Ile Asn Lys Arg Thr Ala Ala Glu Asn Asp 115 120 125 Phe Val Val Leu Lys Lys Asp Val Asp Ala Ala Tyr Leu Asn Lys Val 130 135 140 Glu Leu Glu Ala Lys Val Asp Ser Leu Asn Asp Glu Ile Asn Phe Leu 145 150 155 160 Lys Val Leu Tyr Asp Ala Glu Leu Ser Gln Met Gln Thr His Val Ser 165 170 175 Asp Thr Ser Val Val Leu Ser Met Asp Asn Asn Arg Asn Leu Asp Leu 180 185 190 Asp Ser Ile Ile Ala Glu Val Arg Ala Gln Tyr Glu Glu Ile Ala Gln 195 200 205 Arg Ser Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Tyr Gln Thr Lys Val Gln Gln 210 215 220 Leu Gln Ile Ser Val Asp Gln His Gly Asp Asn Leu Lys Asn Thr Lys 225 230 235 240 Ser Glu Ile Ala Glu Leu Asn Arg Met Ile Gln Arg Leu Arg Ala Glu 245 250 255 Ile Glu Asn Ile Lys Lys Gln Cys Gln Thr Leu Gln Val Ser Val Ala 260 265 270 Asp Ala Glu Gln Arg Gly Glu Asn Ala Leu Lys Asp Ala His Ser Lys 275 280 285 Arg Val Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Gln Ala Lys Glu Glu Leu Ala 290 295 300 Arg Met Leu Arg Glu Tyr Gln Glu Leu Met Ser Val Lys Leu Ala Leu 305 310 315 320 Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Tyr 325 330 335 Arg Met Ser Gly Glu Cys Gln Ser Ala Val Ser Ile Ser Val Val Ser 340 345 350 Gly Ser Thr Ser Thr Gly Gly Ile Ser Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ser 355 360 365 Gly Phe Gly Leu Ser Ser Gly Phe Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Phe 370 375 380 Gly Phe Gly Gly Ser Val Ser Gly Ser Ser Ser Ser Lys Ile Ile Ser 385 390 395 400 Thr Thr Thr Leu Asn Lys Arg Arg 405 <210> 42 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr 1 5 10 15 His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly 50 55 60 Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val 65 70 75 80 Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu 85 90 <210> 43 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Lys Pro Leu Leu Leu Ala Val Ser Leu Gly Leu Ile Ala Ala Leu 1 5 10 15 Gln Ala His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser 20 25 30 Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu 35 40 45 Met Asn Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly 50 55 60 Gly Asn Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln 65 70 75 80 Glu Val Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr 85 90 95 Ala Asp Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys 100 105 110 Asp His Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val 115 120 125 Arg Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala 130 135 140 Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp 165 170 175 <210> 44 <211> 416 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met Pro Tyr Asn Phe Cys Leu Pro Ser Leu Ser Cys Arg Thr Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Arg Pro Cys Val Pro Pro Ser Cys His Ser Cys Thr Leu Pro 20 25 30 Gly Ala Cys Asn Ile Pro Ala Asn Val Ser Asn Cys Asn Trp Phe Cys 35 40 45 Glu Gly Ser Phe Asn Gly Ser Glu Lys Glu Thr Met Gln Phe Leu Asn 50 55 60 Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Lys Val Arg Gln Leu Glu Arg Asp 65 70 75 80 Asn Ala Glu Leu Glu Asn Leu Ile Arg Glu Arg Ser Gln Gln Gln Glu 85 90 95 Pro Leu Leu Cys Pro Ser Tyr Gln Ser Tyr Phe Lys Thr Ile Glu Glu 100 105 110 Leu Gln Gln Lys Ile Leu Cys Thr Lys Ser Glu Asn Ala Arg Leu Val 115 120 125 Val Gln Ile Asp Asn Ala Lys Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys 130 135 140 Tyr Gln Thr Glu Leu Ser Leu Arg Gln Leu Val Glu Ser Asp Ile Asn 145 150 155 160 Gly Leu Arg Arg Ile Leu Asp Glu Leu Thr Leu Cys Lys Ser Asp Leu 165 170 175 Glu Ala Gln Val Glu Ser Leu Lys Glu Glu Leu Leu Cys Leu Lys Ser 180 185 190 Asn His Glu Gln Glu Val Asn Thr Leu Arg Cys Gln 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Leu Ala Leu Ile Pro Asp Val Asp Ile Asp Ser 1 5 10 15 Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu Ile Arg Val His Ser Ala Pro Arg 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Ala Ala Glu Ser Lys Glu Ile Val Arg Gly Tyr Lys 35 40 45 Trp Ala Glu Tyr His Ala Asp Ile Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met 50 55 60 Gln Lys Gln Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser 65 70 75 80 His Gln Ser Gln Asp Lys Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Ala 85 90 95 Tyr Gly Pro Ala Gln His Ala Ile Ser Thr Glu Lys Ile Lys Ala Lys 100 105 110 Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asn Asp Gly Tyr 115 120 125 <210> 48 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Val His Leu Thr Pro Lys Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp 65 70 75 80 Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 100 105 110 Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 115 120 125 Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His 130 135 140 Lys Tyr His 145 <210> 49 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Val 1 5 10 15 Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg 20 25 30 Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys 35 40 45 Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg 65 70 75 80 Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His 85 90 95 Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Ala Ala 100 105 110 Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Val Arg Ala Trp Ala 115 120 125 Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asp Arg Asp Val 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Claims

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당뇨병 환자의 눈물보다 당뇨병성 망막증 환자의 눈물에서 발현이 상대적으로 감소하는, 서열번호 9의 트립신 분해된 서열을 가지고 20-22 kDa의 분자량 및 4.3-5.3의 pI를 갖는 리포칼린(lipocalin(hCG201503), LCN-1) 단백질을 포함하는 당뇨병성 망막증 진단용 바이오마커 조성물.
서열번호 9의 트립신 분해된 서열을 가지고 20-22 kDa의 분자량 및 4.3-5.3의 pI를 갖는 리포칼린(lipocalin(hCG201503), LCN-1) 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 망막증 진단제.
제 3항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 진단제.
서열번호 9의 트립신 분해된 서열을 가지고 20-22 kDa의 분자량 및 4.3-5.3의 pI를 갖는 리포칼린(lipocalin(hCG201503), LCN-1) 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 망막증 진단키트.
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