KR100983182B1

KR100983182B1 - 신규 펩타이드 및 그 용도

Info

Publication number: KR100983182B1
Application number: KR1020090075142A
Authority: KR
Inventors: 김해진; 문은정; 김양선; 권영준
Original assignee: (주)엔솔테크
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2010-09-20
Anticipated expiration: 2029-08-14
Also published as: JP5475131B2; HK1168363A1; RU2012108179A; AU2010283169C1; MX2011013972A; ES2548527T3; EP2464656A1; AU2010283169B2; AU2010283169A1; US8691749B2; CA2770018C; CN102482323B; CN102482323A; EP2464656A4; JP2013501711A; US20120190625A1; RU2498992C1; EP2464656B1; PL2464656T3; CA2770018A1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 그 변이체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.

본 발명의 신규한 펩타이드, 그 변이체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염은 퇴행성 디스크 치료 및/또는 예방, 신체 기관 섬유증 치료, 암 치료, 신사구체병증 치료에 효과적이며, 티지에프-베타원 시그널링 억제에 효과적이다.

펩타이드, 티지에프-베타원 시그널링, 퇴행성 디스크, 신체 기관 섬유증, 암, 신사구체병증

Description

신규 펩타이드 및 그 용도{A novel peptide and use thereof}

본 발명은 퇴행성 디스크 질환 치료 및/또는 예방, 신체 기관 섬유증 치료, 암 치료, 신사구체병증 치료 등에 유효한 신규 펩타이드에 관한 것이다.

퇴행성 디스크 질환 (degenerated disc disease : DDD)은 만성요통의 원인 중 하나로, 나이가 들어감에 따라 디스크의 탈수현상(특히 수핵 부분에서)으로 디스크변성이 있거나 디스크의 높이가 감소하면서 디스크에 금이 가고 갈라지게 되며 허리 통증을 동반하는 것이다. 변성된 디스크에는 비정상적인 신경과 혈관 생성이 증가되어 있고, 세포의 수와 기능이 변화 (cluster formation, necrosis, apopsosis 등)되어 있다. 퇴행성 디스크의 중요한 분자적 특징 중 하나는 aggrecan의 감소이다. 디스크가 하중을 견딜 수 있게 하는 중요한 역할을 담당하는 aggrecan이 감소함으로써 디스크의 삼투압이 떨어지고 더 이상 수분을 유지할 수 없게 되어 기존 섬유륜을 비롯한 기존 디스크 퇴행을 가속화시키고 후관절 및 황색인대를 변성 및 비대화 시키는 것과 같이 다른 척추 구조와 기능에 큰 영향을 미친다.

현재 이러한 퇴행성 디스크 질환을 비롯한 병적인 만성요통에 대한 치료는 진통제를 포함하는 약물치료와 운동 재활치료 등이 있으나 재발이 흔하고 오랜 시간과 노력이 필요하며, 또한 장기간의 투약에 따른 합병증의 발병 가능성이 있다.

이러한 장기간의 보존적인 치료 후에도 효과가 없는 경우 수술적인 치료를 하게 되며 대표적인 방법으로 병든 디스크 조직을 완전히 제거한 후 골편을 이식하여 고정하는 고식적인 요추 유합술과 최근의 인공디스크 삽입술이 있다. 하지만 이 수술법들은 비용이 비교적 많이 들며 또한 수술에 따른 초기 및 후기 합병증의 병발 가능성이 상존하며 요추 유합술은 인접부 변성으로 주기적인 재수술을 요하는 경우가 많고 이를 줄이기 위해 개발된 인공디스크는 장기추적 임상결과가 좋지 않아 최근 들어 잘 시행되지 않는 추세이다. 이렇듯 퇴행성 디스크 질환으로 인한 만성 요통은 그 치료에 있어 어려움이 많은 실정이다. 이에 따라 보전적인 치료 및 수술적인 치료의 대안으로 디스크 자체의 변성을 최소화 하고 재생을 시키고자 하는 여러 실험적인 치료법들이 시도되고 있다.

최근 디스크 변성을 치료하기 위한 생물학적 치료방법들로 중요한 매트릭스단백질{예, 어그리칸(aggrecan)} 생산을 상향조절(up-regulate)하거나 프로-염증싸이토카인(pro-inflammatory cytokines) {예, 인터루킨-1 (IL-1), 종양괴사인자-알파(TNF-α)}에 의해 유도되는 이화작용을 하향조절(down-regulate)시키는 방법들을 시도하고 있다 (Ahn, SH et al ., Spine 27:911917, 2002; Burke JG et al ., Spine 28:26852693, 2003; Kang JD et al ., Spine 21:271277, 1996; Weiler C et al ., Spine 30:4453, 2005; Igarashi T et al ., Spine 25:29752980, 2000; Olmarker K et al ., Spine 23:25382544, 1998; Le Maitre CL et al ., Arthritis Res Ther 7:R732R745, 2005; Seguin CA et al ., Spine 30:19401948, 2005)

이러한 생물학적인 치료법은 주로 국외에서 이루어지고 있는데 골성장인자(Bone morphogenic protein; BMP) 의 디스크 내로의 직접투입이나 치료 유전자를 주입시킨 디스크 세포를 이식하는 방법이 각광을 받고 있다 (Masuda K et al ., Spine 31:742-745, 2006; Imai Y et al ., Spine 32: 1197-1205, 2007; Zhang Y et al ., Spine 33:831-838, 2008). 하지만 이 방법은 물리적인 재생을 통해 디스크 구조를 물리적으로 변화시키는 방법일 뿐, 환자의 통증을 완화시키거나 제거하는 방법은 아니며, 경우에 따라 과도 증식하는 경우 신경의 압박으로 인한 신경학적 증상의 악화 가능성이 존재한다.

한편, 티지에프-베타원 시그널링(TGF-beta1 signaling)은 Fibrosis, Apoptosis, Angiogenesis, Tumor cell invasion and metastasis 등에 관여하는 것으로, 그 억제시 신체 기관 섬유증, 암, 및/또는 신사구체병증의 치료가 가능한 것이 알려져 있다 (Prud'homme GJ, Lab Invest 87:1077-1091, 2007).

따라서, 디스크 자체의 변성을 최소화하고 디스크 재생을 촉진시켜 퇴행성 디스크 질환에 효과적이며, 티지에프-베타원 시그널링을 억제하여 신체 기관 섬유증, 암, 신사구체병증 등을 치료할 수 있는 생물학적 신물질의 개발이 필요하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 디스크 자체의 변성을 최소화하고 디스크 재생을 촉진시킬 수 있는 신규 펩타이드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 신체 기관 섬유증, 암, 또는 신사구체병증 치료에 효과적인 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열(LQVVYLH)을 포함하는 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.

상기 아미노산 서열의 L은 루이신(Leu), Q는 글루타민(Gln), V는 발린(Val), Y는 타이로신(Tyr), H는 히스티딘(His)을 의미한다.

상기 펩타이드를 구성하는 아미노산에는 L-체, D-체, DL-체가 존재하며, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산은 이들을 모두 포함한다.

상기 변이체는 자연적 변이 또는 인공적 변이에 의하여 주요 활성에 변화를 주지 않으면서 본 발명 펩타이드 구조의 일부가 변이된 것으로, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 중 글루타민, 타이로신, 히스티딘 위치의 아미노산 중 하나 이상이 이종 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 중 글루타민이 아스파라긴으로 치환, 타이로신이 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환, 및/또는 히스티딘이 라이신 또는 아르기닌으로 치환된 것이다.

상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 염산염, 황산염, 인산염, 젖산 염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있다.

본 발명은 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 퇴행성 디스크 질환 치료 및/또는 예방용도, 신체 기관 섬유증 치료용도, 암 치료용도, 및 신사구체병증 치료용도를 제공한다. 상기 신체 기관 섬유증, 암, 신사구체병증 치료는 티지에프-베타원(Transforming Growth Factor-beta1; TGF-β1) 시그널링 억제에 의한 것이다.

티지에프-베타는 apoptosis control, angiogenesis, wound healing, immune regulation, tumor biology에 중요하며 높은 다면 발현성(pleiotropic)을 가진 cytokine으로 알려져 있다.

티지에프-베타에는 세가지 isoforms이 존재한다. 즉, 티지에프-베타원 (TGF-β1), 티지에프-베타투 (TGF-β2), 티지에프-베타쓰리 (TGF-β3)이며, 세가지 모두 같은 수용체(receptor)를 사용한다. 티지에프-베타 수용체는 세가지로 구성되어 있다. 즉, 타입원 (RI 또는 ALK5), 타입투 (RⅡ), 타입쓰리 (RⅢ 또는 betaglycan)이다. 티지에프-베타원 (또는 모든 isoforms)이 RⅢ에 결합하면 RⅡ를 끌어들이고, 그 다음 RI을 인산화시켜서 heterotetrameric serine/threonine kinase complex를 형성한다. 그 다음 RI이 Smad2와 Smad3를 인산화시키고 (receptor-associated Smads (R-Smads)), Smad2P/Smad3P는 Smad4와 결합하여 heteromeric complex를 형성한다. 그 다음 Smad2P/Smad3P/Smad4 complex가 핵으로 이동하여 DNA에 결합함으로써 전사(transcription)를 조절한다 (Prud'homme GJ, Lab Invest 87:1077-1091, 2007).

‘티지에프-베타원 시그널링 억제’는 티지에프-베타원이 그 수용체에 결합하지 못하여 Smad2와 Smad3이 인산화 되지 못하고, Smad4와 complex를 형성하지 못하기 때문에 핵으로 이동 그리고 전사(transcription) 조절을 못하는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 퇴행성 디스크 질환 치료 및/또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 신체 기관 섬유증 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 신사구체병증 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 펩타이드 화학에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조한 수 있다. 예를 들어, 펩타이드를 Schroder and Lubke 저, 「The Peptides」제 1 권, Acadmeic Press, New York (1965) 등에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있고, 용액상 합성 또는 고체상 합성 둘 중 하나에 의해 제조할 수 있다.

펩타이드 결합을 형성하기 위한 방법의 예는 아지드법 , 산클로라이드법, 대칭적 무수물법, 혼합 무수물법, 카르보디이미드법, 카르보디이미도-부가물법, 활성 에스테르법, 카르보디이미다졸법, 산화-환원법, 및 Woodward 시약 K 를 사용하는 방법 등이 있으며, 펩타이드의 합성에서, 본 발명의 펩타이드를 형성하는 아미노산인 시스틴 부위를 시스틴 유도체를 사용함으로써 또는 펩타이드 사슬을 형성시킨 후 펩타이드의 시스테인 잔기를 통상적인 방법에 의해 시스틴 잔기로 전환시킴으로써 형성시킬 수 있다.

축합 반응을 수행하기 전에, 반응에 관여하지 않은 카르복실기, 아미노기, 구아니디노기, 히드록실기 등을 보호시킬 수 있고, 축합 반응에 관여하는 카르복실기 및 아미노기를 당 분야에 공지된 방법으로 활성화시킬 수 있다.

카르복실기를 보호하는 기의 예는 메틸, 에틸, 벤질, p-니트로벤질, t-부틸 및 시클로헥실과 같은 에스테르-형성기를 들 수 있다.

아미노기를 보호하는 기의 예는 벤질옥시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 및/또는 9-플루포로에닐메틸옥시카르보닐 등을 들 수 있다.

구아니디노기를 보호하는 기의 예는 니트로, 벤질옥시카르보닐, 토실, p-메톡시벤젠술포닐 및/또는 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 등을 들 수 있다.

히드록실기를 보호하는 기의 예는 t-부틸, 벤질, 테트라히드로피라닐 및/또는 아세틸 등을 들 수 있다.

카르복실기의 활성 형태의 예는 대칭적인 무수물, 아지드 및 활성 에스테르[알코올 (예를 들어,펜타클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알코올, p-니트로페놀, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복실이미드, N-히드록시숙신이미드, N-히드로옥시프탈아미드 및 1-히드록시벤조트리아졸)과의 에스테르] 등을 들 수 있 다.

활성화 아미노기의 예는 아미드 포스페이트이다.

반응을 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸슬폭시드, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란, 물, 메탄올 및 이들의 혼합물과 같은 용매에서 수행한다.

반응 온도는 반응에 일반적으로 사용되는 약 -30℃～50℃의 범위일 수 있다.

본 발명의 펩타이드 보호기를 제거하는 반응은 보호기의 종류에 따라 다르지만, 펩타이드 결합에 아무런 영향을 주지 않고 보호기를 이탈시킬 수 있는 것이어야 한다.

보호기를 산처리 예를 들어, 염화 수소, 브롬화수소, 플루오르화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 및 이들 산의 혼합물로 처리함으로써 제거시킬 수 있다. 또한, 액체 암모니아에서 나트륨 금속을 사용하는 환원 또는 팔라듐-탄소를 사용하는 촉매성 환원을 사용할 수 있다.

상기 산처리로 보호기를 제거하는 반응을 수행할 때, 아니솔, 페놀 및 티오아니솔 등을 첨가할 수 있다.

반응 완결후, 본 발명의 제조된 펩타이드를 통상적인 펩타이드 정제 방법 예를 들어, 추출, 분배, 재침전, 재결정 또는 컬럼 크로마트그래피에 의해 회수할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드를 통상적인 방법에 따라 상술된 그 변이체 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염으로 전환시킬 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의해서도 생산할 수 있다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여 융합파트너와 본 발명의 펩타이드로 된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 그것으로 숙주 미생물을 형질전환시킨 후 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현시킨 후 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 펩타이드를 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다.

본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC_IUB 명명법에 따라 다음과 같이약어로 기재하였다.

알라닌 A, 아르기닌 R, 아스파라긴 N, 아스파틴 산 E, 시스테인 C, 글루타민 산 D, 글루타민 Q, 글라이신 G, 히스티딘 H, 아이소루이신 I, 루이신 L, 라이신 K, 메티오닌 M, 페닐알라닌 F, 프롤린 P, 세린 S, 트레오닌 T, 트립토판 W, 타이로신 Y, 발린 V

상기 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 투여량은 비경구 투여시 50㎍/일 ~ 1mg/일이며, 바람직하게는 0.5mg/일 ~ 1mg/일이다. 경구 투여의 경우, 투여량은 비경구 투여량의 1.2 ~ 1.5배이고, 직장 투여의 경우, 투여량은 비경구 투여량의 2~5배이다. 본 발명의 펩타이드를 주로 비경구적인 방법으로, 예를 들면 국소주사(퇴행성 디스크의 경우는 디스크 내 주사, 기타 신체 기관 섬유증 및 암에서는 국소 병변내 주사), 정맥 또는 피하주사, 대뇌실내 또는 척수강내 투여, 혹은 경비투여 및 직장내 투여로 투여한다. 또한, 경우에 따라 경구적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화하여 주사제, 좌제, 분말, 점비제, 과립, 정제 등의 형태로 만들 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 제조될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 담체에는 D5W(물 중에서 5% 포도당), 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액 등을 포함하며, 병소 내 국소주사의 경우 치료 효과를 증진시키고 지속시간을 증가시키기 위하여 여러 가지 주사가능한 하이드로겔(hydrogel)을 사용할 수 있다. 또한 약학적으로 이용가능한 담체에는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 해당분야의 적절한 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA(최근판) 등에 개시되어 있는 방법을 참조하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 생리 식염수 용액으로 보관할 수 있고 만니톨 또는 소르비톨의 첨가후 앰플(ample)에 동결 건조시킬 수 있으며, 이것을 투여하기 위해 사용할때는 생리 식염수 등에 용해시킬 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 디스크 질환, 신체 기관 섬유증, 암, 및/또는 신사구체병증의 치료 및/또는 예방법을 제공한다.

상기 신체 기관 섬유증, 암, 및/또는 신사구체병증의 치료는 티지에프-베타원 시그널링 억제에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 신규한 펩타이드, 그 변이체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 퇴행성 디스크 질환, 신체 기관 섬유증, 암, 및/또는 신사구체병증의 치료 및/또는 예방에 효과적이며, 티지에프-베타원 시그널링 억제에 효과적이다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 펩타이드의 제조

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드(LQVVYLH: 서열번호 1)를 (주)펩트론(Peptron Inc)에 의뢰하여 제조하였다. 구체적으로 자동합성기(ASP48S, Peptron Inc)를 사용하여 Fmoc SPPS (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 C-말단부터 하나씩 커플링(coupling) 하였다.

펩타이드의 C-말단 첫 번째 아미노산이 수지(resine)에 부착(attached)된 NH₂-His(Trt)-2-chloro-Trityl Resin을 사용하였다. 펩타이드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 트리틸(Trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), t-부틸(t-Bu) 등으로 protection된 것을 사용하였다. Coupling reagent로는 HBTU(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)/HOBt(Hydroxxybenzotriazole)/NMM(N-methylmorpholine)을 사용하였다. (1)Protected amino acid (8당량)와 coupling reagent HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF(Dimethylformamide)에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하였다. (2)Fmoc 제거는 20% piperidine in DMF를 가하여 상온에서 5분간 2회 반응하였다. (1)과 (2)의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격을 만든 후, TFA(trifluoroacetic acid)/EDT(1,2-ethanedithiol)/Thioanisole/TIS(triisopropylsilane)/H₂O=90/2.5/2.5/2.5/2.5을 사용하여 펩타이드를 Resin에서 분리하였다. Vydac Everest C18 column (250 mm × 22 mm, 10 μm)을 사용하여 reverse phase HPLC 방법으로 정제한 후, 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid를 포함하고 있는 water-acetonitrile linear gradient (10~75% (v/v) of acetonitrile) 방법으로 분리하였다. 정제된 펩타이드의 분자량은 LC/MS (Agilent HP1100 series)를 사용하여 확인하고 동결건조하였다.

<실시예 2> 디스크 재생 효과 확인

2-1. 디스크변성 모델 동물 준비 및 실험용 디스크 채취

체중 3-3.5kg의 토끼(New Zealand whites rabbits; (주)오리엔트바이오)를 암수 구분없이 30마리를 준비하였다.

준비된 토끼에 xylazine(Rompun, Bayer) 5mg/kg과 ketamine hydrochloride(Ketalar, Pfizer) 35mg/kg을 근육주사하여 마취시켰다. 시술 전 X 선 투시기(도시바, model DRX-61A)로 촬영을 시행하여 baseline control를 정하였다. 상기 baseline control은 디스크 간격 측정을 위한 기준을 의미한다. 토끼를 실험대 위에 위치시킨 후, C-arm 으로 L23, L34, L45, L56 디스크 레벨을 확인한 후, L23, L45, 및 L56 레벨에 바늘(needle)로 섬유륜(anulus fibrosus)을 디스크의 후외측(posterolateral side)으로 찔러 넣었다. 마취로부터 회복 후에는 케이지에서 사육하였다. 사육조건은 온도 20-25℃, 습도 10%~50%, 조명 오전 8시~오후 8시이며, 먹이는 하루에 한번 공급하였다. 처음 시술 후, 그로부터 2주와 4주 후 각각 X-ray를 촬영하였다. X-ray 촬영은 마취 후에 시행하였다. X-레이 촬영결과로부터 추간판 높이(IVD height; Intervertebral Disc height)를 측정하였다. 측정결과로부터 디스크의 변성 유무와 그 정도를 정량화 하였으며, Lu등(Lu et al., Spine. 22:1828-34, 1997)의 방법을 변형 이용하였다.

그 후 DMSO를 투여한 대조군과 실시예 1의 펩타이드를 투여한 실험군으로 나누어 실험을 시행한 후 계획된 스케줄에 따라 ketamine(25mg/kg)과 sodium pentobarbital(Nembutal, Ovation) 1.2g/kg을 이용하여 토끼를 안락사시킨 다음 병리 및 생화학 실험용 디스크를 각각 적출하였다.

2-2. 디스크 조직 염색법에 의한 디스크 재생 효과 측정

상기 2-1에서 디스크가 변성된 토끼를 두 군으로 나누어 각각의 군에 대해 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 실시예 1의 펩타이드(0.5mM/개체)를 국소적인 디스크 주사방법으로 두 번 투여하였다. 각각의 군에 대한 투여시기는 처음 디스크 변성을 시킨 후 4주 경과시와 그 후 다시 2주 경과시였으며, 2번째 투여 후 각각 4주, 6주, 10주간 더 사육하였다. 실시예 1의 펩타이드와 DMSO 각각을 처음 투여한 시기부터 4주, 6주, 10주째에 각각 해당 디스크 조직을 적출하여 포르말린에 고정하였다. 고정된 디스크 조직을 파라핀에 포매시켜 조직표면부터 4um 두께의 연속 절편들을 만들고, 이들 중 수핵과 섬유륜이 존재하는 절편을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. 정상 디스크 조직과의 대조를 위하여 변성시키지 않은 토끼를 사용하여 상기 기술한 동일한 방법으로 디스크를 적출하고 처리하여 염색하였다.

10주째에 적출하여 염색한 각각의 디스크 조직을 현미경으로 촬영한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 A, B는 정상 디스크 조직, C, D는 DMSO 투여 조직, E, F는 실시예 1의 펩타이드 투여 조직을 나타내며, A, C, E는 40배, B, D, F는 400배 확대한 사진이다. 400배 사진에서 화살표는 디스크 세포핵을 가리키는 것이다.

그 결과 정상 디스크 조직에서는 수핵과 섬유륜 부분이 뚜렷하게 구분이 되며 세포외기질 성분이 풍부하게 존재하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 1의 A, B). 또한, 정상 디스크 조직의 수핵 부분에 세포핵이 뚜렷하게 염색되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 1의 B).

이와 달리 DMSO를 투여한 디스크 조직에서는 디스크의 크기가 감소되어 있으며, 섬유륜과 수핵부분의 구분이 모호하며 세포외기질의 성분이 빈약함을 관찰할 수 있었다(도 1의 C와 D). 그리고, 수핵 부분에서 염색된 세포핵을 찾아보기 어려웠다(도 1의 D). 즉, 이와 같은 결과는 수핵에 존재했던 세포들이 사멸된 것을 의미한다. 퇴행성 디스크 변성으로 인한 세포사멸은 이미 알려진 바와 같으며, 세포가 없기 때문에 세포외기질 성분을 만들 수 없어 더욱 디스크 변성이 악화되는 것으로 볼 수 있다.

실시예 1의 펩타이드를 투여한 디스크 조직을 보면 디스크의 크기가 DMSO를 투여한 것에 비하여 증가되어 있으며, 수핵과 섬유륜 부분의 구분이 식별가능하고 세포외기질 성분이 풍부하게 존재하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 1의 E, F). 그리고, 수핵 부분에 세포핵들이 뚜렷하게 염색되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 1의 F).

상기 결과로부터, 실시예 1의 펩타이드는 디스크 변성으로 인한 세포외기질 성분의 감소와 세포사멸을 막아 디스크를 치료하는 효과가 있음을 확인하였다.

<실시예 3> 디스크 조직 중 어그리칸(aggrecan) 유전자 발현 증가 확인

디스크 조직 중 대표적인 세포외기질 성분인 어그리칸(aggrecan) 유전자 발현 정도를 조사하기 위하여 리얼타임 PCR을 실시하였다.

3-1. 디스크변성 모델 동물 준비 및 실험용 디스크 채취

실시예 2-1과 동일한 방법으로 동물을 준비하고, 두 군으로 나누어 각각의 군에 대해 DMSO와 실시예 1의 펩타이드(0.5mM/개체)를 국소적인 디스크 주사 방법으로 투여하였다. 각각의 군에 대한 투여시기는 처음 디스크 변성을 시킨 후 4주 경과시와 그 후 다시 2주 경과시였으며, 2번째 투여 후 각각 4주, 6주, 10주간 더 사육하였다. 실시예 1의 펩타이드와 DMSO 각각을 처음 투여한 시기부터 4주, 6주, 10주째에 각각 해당 디스크 조직을 적출하여 수핵과 섬유륜 부분을 분리하여 각각 튜브에 담아 액체질소에서 급속냉동시킨 후, -70℃ 초저온냉동고에 보관하였다.

급속 냉동 보관된 디스크 조직에서 Trizol reagent (Invitrogen)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA (2 μg)를 oligo dT와 MMLV-Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

PowerSYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems Inc)를 이용하여 Prism 7900HT(ABI)로 GAPDH, aggrecan의 mRNA 양을 조사하였다. 25ng cDNA와 3ul의 10uM Primers, 2X PowerSYBR Green PCR Master Mix를 혼합하여 총 10 ul를 만들었다. Real Time PCR 반응조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 효소의 활성을 유도시켰고 95℃ 15초, 60℃ 1분을 45번 반복하여 각각의 CT(threshold cycle)값을 측정하였다. GAPDH를 reference gene으로 선택하여 reference gene과 aggrecan gene의 CT값 차이(△CT)를 계산하였고, 다시 정상 디스크와 실시예 1의 펩타이드를 투여한 디스크 (또는 DMSO를 투여한 디스크)의 CT값 차이(△△CT)를 계산하였다. 그리고 2^(-△△ ^CT ⁾를 계산하여 정상 디스크 값에 대한 백분율로 표기하였다.

Real-Time PCR 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 디스크 변성모델에서 DMSO 투여 디스크군 및 실시예 1의 펩타이드 투여 디스크군에 있어, 정상 디스크군을 기준으로 어그리칸 유전자 발현량을 대비하여 처리시간별로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 보는 바와 같이 실시예 1의 펩타이드를 투여한 디스크 조직에서 aggrecan 유전자 발현이 DMSO에 비하여 증가되어 있음을 알 수 있다. 6주와 10주에서 실시예 1의 펩타이드가 DMSO와 비슷한 발현량을 보인 것은 실시예 1의 펩타이드를 0주와 2주째만 투여하고 그 이후에는 그대로 두었기 때문에 4주째는 실시예 1 펩타이드의 약효에 의하여 aggrecan 유전자가 증가 되었다고 볼 수 있으며, 6주와 10주째까지 aggrecan 유전자 발현을 유지시키지 못한 것으로 보인다. 상기 결과로부터 본 발명의 펩타이드는 디스크 재생에 필수적인 디스크 조직 중 대표적인 세포외기질 성분인 어그리칸(aggrecan) 유전자 발현을 증가시킴으로써 디스크 재생 효과를 나타내며, 어그리칸 유전자 발현 증가 효과의 지속시간이 지나치게 길지 않아 지나친 증가로 인한 부작용을 배제할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 4> TGF-beta1 시그널링 억제 확인

실시예 1의 펩타이드가 TGF-beta1 signaling을 억제함을 하기 실험방법으로 확인하였다.

HepG2 cell에 TGF-beta1를 처리하면 apoptosis가 일어나고, 그 과정에서 가장 먼저 Smad2가 인산화 되는 것이 알려져 있다 (Park TJ. et al., Mol Carcinog. 47:784-796, 2008; Gressner AM. et al., J Hepatol . 26:1079-1092, 1997). 이와 같은 성질을 이용하여 하기와 같이 실험하였다. HepG2 cell(ATCC; American Type Culture Collection)을 60 mm dish에 1x10⁶개를 심어서 over-night 안정화 시킨 후 24시간동안 serum free media (SFM)으로 영양분을 고갈 시켰다. 실시예 1의 펩타이드를 세포에 처리하기 전에 TGF-beta1(PromoKine, 독일) 5ng/ml와 상기 펩타이드(1, 5, 25uM)를 37℃에서 1시간동안 pre-incubation하였다. DMSO(2ul/ml)도 TGF-beta1(5ng/ml)과 37℃에서 1시간동안 pre-incubation하였다. 그리고 pre-incubation 한 용액을 세포에 30분간 처리한 후 단백질을 분리하였다. 또한, TGF-beta receptor의 inhibitor인 SB431542(TOCRIS, 미국) 10μM만 세포에 미리 처리하여 1시간 incubation 한 후 TGF-beta1 (5ng/ml)를 30분간 처리한 후, 세포를 RIPA(Radioimmunoprecipitation) Lysis Buffer(Millipore사){50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.25% deoxychloic acid, 1% NP-40, 1mM EDTA(ethylenediaminetetra acetic acid), 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 40mM NaF, 1mM Na₃VO₄, 1mM DTT(dithiothreitol)}로 얼음 위에서 균질화하였다. 균질액을 BRANSON SONIFIER 450을 사용하여 Output control 2.56, Duty cycle (%) 20, Timer 6으로 초음파분쇄를 5회 반복하였다. 분쇄액을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 웨스턴 블럿에 사용하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법을 사용하여 정량하였고, 30 ug의 단백질을 2-mercaptoethanol이 포함된 SDS sample buffer에 넣고 95℃에서 5분간 방치 후 10% SDS-PAGE로 분획한 후 western blot을 실시하였다. 웨스턴 블럿은 분획된 단백질은 nitrocellulose membrane (Bio-Rad Lab)으로 전이시킨 후, 5% Skim milk in PBS-T를 이용하여 차단시켰고 1차 항체를 5% Skim milk in PBS-T에 1:3,000으로 희석하여 넣고 4℃에서 다음날까지 반응시켰다. 다음으로 PBS-T로 5분간 3번 세척하고 HRP(horseradish-peroxidase)가 붙어있는 anti-rabbit 2차 항체 (Bio-Rad Lab, 1706515)를 5% Skim milk in PBS-T에 1:5,000으로 희석하여 넣고 실온에서 1시간 동한 처리한 후 ECL (Amershamphamacia)을 이용하여 발색시킨 후 현상하였다. TGF-beta1과 TGF-beta receptor의 결합과 동시에 가장 먼저 Smad2가 인산화 되기 때문에 인산화된 Smad2를 검출할 수 있는 phospho-Smad2 (ser465/467) antibody (Cell Signaling, 3101, 8)를 1차 항체로 사용하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 웨스턴블럿 결과로, 1레인은 아무것도 처리하지 않은 HepG2 세포, 2레인은 TGF-beta1 처리 세포, 3레인은 TGF-beta1 과 SB431542 처리 세포, 4, 5, 6레인은 각각 TGF-beta1과 펩타이드 1, 5, 25uM 처리 세포, 7레인은 TGF-beta1와 DMSO 처리 세포에서 발현된 인산화-Smad2를 나타낸다. 도 3의 '+'는 해당 물질 처리, '-'는 해당 물질 미처리를 의미한다. 도 3의 하단은 웨스턴 블럿에 사용된 membrane을 코마시블루로 염색한 것으로써 전체 레인의 단백질 양이 동일함을 보여준다.

도 3을 보면 lane 1은 아무것도 처리하지 않은 HepG2 cell에서 분리한 단백질로써 아주 소량만 인산화되어 있으며, lane 2는 TGF-beta1에 의하여 다량 인산화 되어 있음을 관찰할 수 있었다. 그리고 lane 3에서는 SB431542에 의하여 인산화가 완전히 억제되었음을 관찰할 수 있었다. 실시예 1의 펩타이드를 1 μM, 5 μM, 25 μM 처리하였을 때 농도 의존적으로 인산화 정도가 감소하였음을 확인할 수 있었다. DMSO를 처리한 lane 7에서는 TGF-beta1을 처리한 것과 같은 양상을 보였다.

상기 결과로부터 본 발명의 펩타이드는 농도의존적으로 TGF-beta1 signaling을 억제하므로, 상기 억제에 의해 치료가 가능한 질환 즉, 신체 기관 섬유증, 암, 및/또는 신사구체병증의 치료가 가능함을 알 수 있다(Prud'homme GJ, Lab Invest 87:1077-1091, 2007). 또한, 실시예 1의 펩타이드는 SB431542처럼 TGF-beta1 signaling을 완전하게 억제하지 않음을 알 수 있다. TGF-beta1 signaling은 인간 몸에서 중요한 조절 기작이므로 SB431542와 같이 완전하게 억제하면 부작용이 생길 수 있으나, 본 발명의 펩타이드는 농도 의존적으로 TGF-beta1 signaling을 감소시키기 때문에 관련된 질병의 치료를 위해 사용시 농도를 조절할 수 있어 부작용을 줄일 수 있는 장점을 갖는다.

도 1은 정상 디스크 조직, DMSO 투여조직, 및 실시예 1의 펩타이드 투여 조직을 염색한 후, 촬영한 사진이다.

도 2는 디스크 변성모델에서 DMSO 투여 디스크군 및 실시예 1의 펩타이드 투여 디스크군에 있어, 정상 디스크군을 기준으로 어그리칸 유전자 발현량을 대비하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 아무것도 처리하지 않은 HepG2 세포, TGF-beta1 처리 세포, TGF-beta1 과 SB431542 처리 세포, TGF-beta1과 실시예 1의 펩타이드 처리 세포, TGF-beta1와 DMSO 처리 세포에서 발현된 인산화-Smad2를 확인하기 위한 웨스턴블럿결과이다.

<110> Ensoltek Co., Ltd. <120> A novel peptide and use thereof <130> P09-057-ENS <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Leu Gln Val Val Tyr Leu His 1 5

Claims

하기 식으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염:

L-(Q 또는 N)-VV-(Y, F, 또는 W)-L-(H, K, 또는 R)

상기 식에서, L은 루이신, Q는 글루타민, N은 아스파라긴, V는 발린, Y는 타이로신, F는 페닐알라닌, W는 트립토판, H는 히스티딘, K는 라이신이고 R은 아르기닌이다.
제1항의 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 퇴행성 디스크 치료 및 예방용 조성물.
제1항의 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 신체 기관 섬유증 치료용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 신체 기관 섬유증 치료는 티지에프-베타원 시그널링 억제에 의한 것인 조성물.
제1항의 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 암 치료용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암 치료는 티지에프-베타원 시그널링 억제에 의한 것인 조성물.
제1항의 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 신사구체병증 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 신사구체병증 치료는 티지에프-베타원 시그널링 억제에 의한 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염.
제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
제3항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.