KR100982022B1 - 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제비꽃을 활성성분으로서 포함하는 신경세포 손상에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 신경세포 손상에 대한 보호 효과로 인하여 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따는 조성물을 포함하는 의약품 및 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 신경세포 보호 효과가 탁월하여 신경세포 손상으로 인한 각종 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 특히 제비꽃의 아세톤 추출물은 다른 용매의 추출물에 비해 신경세포 보호 효과가 탁월하여 보다 바람직하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 오랜 시간 동안 사용해 오면서 안전성이 입증된 식물 생약을 원료로 함으로써 종래 신경세포 보호 물질이 나타낼 수 있는 각종 부작용을 해소할 수 있는 장점이 있다.

Description

신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating damage of nerve cells}

본 발명은 신경세포 손상에 대한 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 식물 생약 또는 그의 추출물을 활성성분으로서 포함하는 퇴행성 뇌질환, 척수 손상, 및 말초신경 손상을 포함한 신경세포 손상에 대한 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

2003년 유엔의 발표에 의하면 오는 2050년 전 세계 인구는 100억명으로 증가하고 이 가운데 60세 이상 노령인구는 20억명에 이를 것으로 전망되었다. 또한, 2006년 10월 통계청과 보건복지부에 따르면 한국은 2000년에 이미 65세 이상 노령인구 비율이 7.2%로 고령화 사회에 접어든 것으로 나타났다. 이러한 급속한 고령화가 진행됨에 따라, 노인들의 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지에 대한 관심이 높아지고 있다.

급속한 노령 인구의 증가에 따라, 뇌, 척추, 말초신경의 손상을 포함한 퇴행성 신경질환이 계속해서 증가하고 있는 추세이다. 퇴행성 신경질환은 허혈에 기인한 신경손상 및 활성산소에 의한 신경손상과 관련된 질환을 포함한다.

지금까지 보편적으로 받아들여지는 뇌허혈에 대한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌 허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되면, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 신경세포사 기전(Kang TC, et al., Chronological changes of N-methyl-D-aspartate receptors and excitatory amino acid carrier immunoreactivities in CA1 area and subiculum after transient forebrain ischemia, J. Neurocytology, 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스런 산소 공급으로 인해 생체 내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경 세포사, 2 가지 기전이 있다(Won MH, et al., Immunohistochemical detection of oxidative DNA damage induced by ischemia-reperfusion insults in gerbil hippocampus in vivo, Brain Res., 836, pp70-78, 1999; Sun AY, Chen YM, Oxidative stress and neurodegeneration disorders, J. Biomed. Sci., 5, pp 401-414, 1998).

또한, 허혈에 의하지 않고, 혈중 활성산소의 증가에 의해서도 신경세포의 손상이 일어난다. 뇌는 활성산소에 의한 손상이 신체의 다른 어느 기관보다 크게 나타나는데 그 이유는 순환하는 O₂의 20%가 뇌에 집중되어 있고, 세포막에는 불포화 지방산 측쇄(polyunsaturated fatty acid side chain)가 풍부하며, 반응성 산소 유리기(free radical) 반응의 촉매인 철이 풍부하기 때문에 신경세포의 사멸 유도로 인한 퇴행성 신경질환과 관련이 큰 것으로 최근 여러 연구를 통해 보고되고 있다. 예를 들어, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 환자의 뇌 부위에 DNA 손상, 단백질 산화, 지질 과산화, AGE(advanced glycosylation end products) 등의 증가나 유리기 생산을 증가시키는 금속(철분, 구리, 아연, 알루미늄)의 수준이 증가되어 있어 산화적 손상이 증가될 가능성을 보여주는 것이 그것의 한 예이다.

현재, 이러한 퇴행성 신경질환을 치료하기 위해서 세포 이식, 외과적 수술 등 다양한 치료법이 제시되고 있지만 대부분이 위험요소와 부작용을 나타내고 있으며 손상 기전의 복잡성 등으로 실질적으로 신경세포의 손상을 보호하는 치료제는 개발되지 못하고 있는 실정이다.

지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로서 FDA 공인 시판 중인 조직플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전 용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당 공급을 유도하는 물질이다. 따라서, 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전 용해제라는 특징 때문에 과량의 사용이나 자주 사용 시에는 혈관벽이 얇아져 출혈성 뇌혈관질환을 유발할 수 있어 문제가 된다.

또한, MK-801은 초기의 세포내 칼슘 유입을 효과적으로 저해함으로써 글루타메이트 유도 세포독성을 억제하는 것으로 알려졌으나(Inyoung Whang, et al., Intracellular calcium concentration in the glutamate-induced cytotoxicity in PC12 cell, Journal of Toxicology and Public Health Vol. 18 No. 4, 2002, 12, pp 355-362), 임상시험 결과 부작용이 발견되어 폐기된 바 있다.

한편, 국내의 경우에는 다수의 천연 물질이 뇌졸증의 예방에 효과가 있는 건 강식품으로서 시판되고 있으나, 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며, 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다. 따라서, 오랫동안 사용되어 그 안정성이 입증된 천연 생약을 객관적으로 검증하여 신경세포의 손상에 대한 보호 약물을 개발하는 것이 요구된다.

한편, 제비꽃(Viola mandshurica)은 제비꽃과에 속하는 다년생 표본으로 줄기가 없고 잎은 뿌리로부터 총생하며 엽병이 길고 날개가 있다. 한국, 일본, 만주, 중극 등에 분포하며, 꽃은 보통 4~5월에 농자색으로 핀다. 과실은 원추형으로 성숙하면 3열로 갈라지며 다갈색의 종자가 튀겨서나간다. 제비꽃은 전초 및 뿌리를 이용하는 것으로 알려져 있으며, 주요성분으로서 전초에 플라본 배당체로 오리엔틴(orientin), 이소오리엔틴(isoorientin) 등을 함유하고 있으며, 약리작용으로는 적리균, 황색포도상구균, 폐렴구균, 피부진균, 결핵간균 등의 성장을 억제하고 소염효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한국특허공개 2005-0030361은 제비꽃 추출물이 암세포의 성장을 저해하며 탁월한 암 예방 및 치료효과를 가지며, 제비꽃으로부터 항암 활성을 갖는 물질을 추출하는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 제비꽃에 관한 생리·약리학적 연구는 아직 초보적인 단계에 불과하며, 특히 신경세포 보호 효과와 관련된 연구는 전혀 수행된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 신경세포 보호 활성을 가지면서 장기간 복용하더라도 독성이나 부작용이 낮은 식물 생약을 발굴하기 위해 국내·외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물을 대상으로 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경세포 손상에 보호 활성을 갖는 식물 생약 유래의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 의약품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제비꽃을 활성성분으로서 포함하는 신경세포의 손상에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신경세포의 손상에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 의약품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신경세포의 손상에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된 다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명자들은 신경세포 보호 활성을 갖는 식물 생약을 발굴하기 위해 국내·외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 뇌신경세포계 하이브리도마 N18-RE-105 세포주와 PC12 세포주를 이용하여 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도한 결과, 제비꽃 추출물이 탁월한 신경세포 보호 활성을 갖는다는 것을 발견하게 되었다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 제비꽃을 활성성분으로서 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물의 활성성분인 제비꽃은 추출물의 형태로 포함되거나, 생약 자체의 분쇄물 또는 생약의 건조 분쇄물로서 포함될 수도 있다.

상기 제비꽃의 추출물은 물, C₁-C₄ 알콜, 아세톤 및 이들이 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용매의 추출물일 수 있다. 상기 제비꽃의 추출물은 바람직하게는 C₁-C₄ 알콜 추출물 또는 아세톤 추출물일 수 있으나, 가장 바람직하게는 아세톤 추출물일 수 있다. 하기 실시예에서 기재한 바와 같이, 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포계 하이브리도마 N18-RE-105 세포주 및 PC12 세포주의 신경손상에 대한 보호 효과를 시험한 결과, 제비꽃의 아세톤 추출물이 다른 메탄올 또는 에탄올 용매에 의한 추출물에 비해 현저히 우수한 신경세포 보호 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명은 특히 제비꽃의 아세톤 추출물을 활성성분으로서 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

용매로 추출 시, 추출은 가열 추출, 상온 추출, 환류냉각 추출, 또는 초음파 추출 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상온 추출이 이용될 수 있다. 추출시간은 1일 이상, 바람직하게는 3일 이상 동안 수행할 수 있으며, 추출 용매 및 추출 온도 등의 조건에 따라 달라질 수 있다. 상기 추출은 활성성분을 보다 다량 수득하기 위해 1 회 이상 여러 번 추출할 수 있으며, 여러 번 추출하여 얻어진 각각의 추출액을 합한 추출액을 이용할 수 있다.

상기한 바와 같은 방법에 의해 추출한 추출물은 그대로 사용할 수도 있으나, 농축한 엑스 형태로 사용될 수도 있다. 바람직하게는, 충분한 농도로 사용될 수 있도록 농축된 형태로서 사용한다. 상기 농축은 추출액을 30℃의 온도에서 감압농축함으로써 이루어질 수 있다. 농축한 다음 동결 건조하여 동결건조물의 형태로서 이용될 수도 있다.

상기 제비꽃 추출물을 활성성분으로 하는 본 발명의 조성물은 신경세포 손상을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다. 상기 신경세포 손상은 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상에 의해 유발될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의해 유발되는 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 신경세포 보호 활성이 있다는 것은 하기 실시예에 서 입증하였다. 구체적으로는, 본 발명의 일 구현예에 따라 추출한 제비꽃의 메탄올, 에탄올, 및 아세톤 각각의 추출물을 대해 산화적 스트레스(글루타메이트 또는 과산화수소 처리)를 받은 뇌신경세포계 하이브리도마 N18-RE-105 세포주 및 PC12 세포주의 신경손상에 대한 보호 효과를, 형태학적 변화의 관찰, MTT 환원 어세이 및 LDH(lactate dehydrogenase) 방출량 측정에 의해 확인하였다. 그 결과, 본원발명의 추출물을 처리한 세포군에서의 생존율이 현저히 높았고, LDH의 함량이 현저히 낮게 나타나 신경세포보호효과가 탁월한 것으로 나타났다. 형태학적 변화의 관찰에 있어서도, 본원발명의 추출물을 처리한 세포군에서는 신경세포의 생존율이 처리된 추출물의 농도 의존적으로 현저히 높게 나타났고, 세포 손상으로 인한 형태학적 변화가 거의 없는 것으로 관찰되었다.

상기 본 발명에 따른 제비꽃을 활성성분으로 하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물은 신경세포 손상에 대한 치료 또는 예방에 효과가 있는 의약품의 원료로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 상기 제비꽃을 포함하는 조성물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 의약품을 제공한다.

상기 의약품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 의약품은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화 시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 의약품은 퇴행성 뇌질환, 척수 손상, 및 말초신경 손상 등에 의해 유발되는 신경세포 손상의 예방 또는 치료 효과를 얻기 위하여, 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량이 추출물로서 0.1~0.8 mg/kg, 생약으로서 10∼80 mg/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 신경세포 손상을 유발한 질병의 종류, 질병의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 제비꽃을 활성성분으로 하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물은 신경세포 손상에 대한 개선 또는 예방에 효과가 있는 건강기능식품의 원료서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 상기 제비꽃을 포함하는 조성물, 및 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

본원발명에서 "건강기능식품"이란 건강기능식품에 관한 법률 제3727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

이러한 건강보조식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강보조식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강보조식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 엑스, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있 는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 건강보조식품은 신경세포 보호 작용에 의해 퇴행성 뇌질환, 척수 손상, 및 말초신경 손상을 포함한 각종질환의 예방 및 개선에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 복용이 용이하여 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 제비꽃은 오랫동안 한약재 또는 식품으로서 오랫동안 이용되어 왔던 것이어서, 이로부터 유래된 제비꽃 추출물 역시 독성 또는 부작용의 문제가 없다고 볼 수 있으므로, 본 발명에 따른 의약품 및 건강보조식품은 질병의 예방 또는 치료 목적으로 장시간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 장점이 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 제비꽃을 활성성분으로서 포함하는 조성물은 신경세포 보호 효과가 탁월하여 신경세포 손상으로 인한 각종 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 특히 제비꽃의 아세톤 추출물은 다른 용매의 추출물에 비해 신경세포 보호 효과가 탁월하여 보다 바람직하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 오랜 시간 동안 사용해 오면서 안전성이 입증된 식물 생약을 원료로 함으로써 종래 신경세포 보호 물질이 나타낼 수 있는 각종 부작용을 해소할 수 있는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 제비꽃 추출물의 제조(1)

경상남도 산청군 지리산 근처에서 채집하여 음건한 제비꽃 5 g에 메탄올 100 mL 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출 한 후, 여과지(5C. 110 mm, Advantec, Tokyo Roshi Kaish, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 여과된 추출여액은 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 40℃에서 감압 농축하여 용매 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물을 25 mg/mL로 DMSO에 녹여 적절한 농도로 희석하였고, 1% DMSO가 되도록 처리하여 제비꽃의 메탄올 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 제비꽃 추출물의 제조(2)

상기 실시예 1에서 메탄올 대신 에탄올을 사용하는 것만을 제외하고는 실시예 1과 같이 수행하여, 제비꽃의 에탄올의 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 제비꽃 추출물의 제조(3)

상기 실시예 1에서 메탄올 대신 아세톤을 사용하는 것만을 제외하고는 실시예 1과 같이 수행하여, 제비꽃의 아세톤의 추출물을 제조하였다.

실험예: 신경세포 보호 효과 확인시험

1. 재료 및 방법

(1) 시약 및 실험 재료

신경세포 보호 효과 실험에 사용된 L-글루탐산, MTT, H₂O_2, 아스코르빈산, 디메틸술폭시드(DMSO)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였으며, LDH(lactate dehydrogenase) 방출양 어세이 키트는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum), HS(horse serum) 및 HAT 서플리먼트(supplement) 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)에서 구입하였으며, 그 외의 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

(2) 세포주 및 배양방법

본 실험에서는 세포주로서 하이브리도마 N18-RE-105 및 랫트 갈색세포종 PC12을 사용하였다. 하이브리도마 N18-RE-105는 한국생명공학연구원에서 분양받아 DMEM 배지에 10% FBS, 5% HS 및 1×HAT 서플리먼트를 첨가하여 배양하였고, 랫트 갈색세포종 PC12는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 DMEM 배지에 10% FBS, 5% HS 및 100 유닛/mL의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신을 첨가하여 배양하였다. 세포주들은 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO₂ 배양기(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

(3) 신경세포의 형태학적 변화 관찰

제비꽃 추출물에 대한 세포주의 형태학적 변화의 관찰을 위해 6-웰 플레이트 에 1×10⁵ 세포/웰로 24시간 동안 배양하였다. 세포주에 제비꽃 추출물을 농도별로 처리한 후 20 mM 글루타메이트 또는 0.5 mM H₂O₂를 24시간 노출시켜 위상차 현미경(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)으로 각 웰의 세포형태를 관찰하고 100 배로 사진 촬영하였다.

(4) MTT 환원 분석을 통한 세포 생존율 측정

제비꽃 추출물의 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 MTT 환원 분석을 실시하였다. 세포주를 5×10⁴ 세포/mL로 맞추고 96-웰 플레이트에 각각 100 μL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, 상기 실시예에서 제조된 DMSO에 녹인 제비꽃 추출물을 농도별로 처리하였다. 30분 동안 배양한 후 20 mM 글루타메이트를 24시간 또는 0.5 mM H₂O₂를 2시간 처리하여 배양하고 각 웰에 PBS 완충액에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액을 10 μL씩 첨가하여 1 시간 동안 다시 배양하였다. 반응 후 웰 바닥에 형성된 포르마잔(formazan)이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 μL 첨가하여 녹이고 ELISA 판독기(Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.

(5) LDH 측정에 의한 세포독성 확인

제비꽃 추출물의 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 LDH 방출량 분석을 실시하였다. 세포주를 5×10⁴ 세포/mL로 맞춘 후, 100 μL씩 96-웰 플레이트에 분 주하여 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 뒤 상기 실시예에서 제조된 DMSO에 녹인 제비꽃 추출물을 세포주에 처리하였다. 30분 후 20 mM 글루타메이트 또는 0.5 mM H₂O₂를 처리하여 24시간 배양한 다음, 배양액을 새로운 96-웰 플레이트에 50 μL 분주하고, 이 배양액에 LDH 시약을 50 μL씩 첨가하여 상온에서 정치시키고, 20 분간 반응시켰다. 반응이 완료되면 반응 정지액(stop solution)인 1 N HCl을 100 μL씩 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

살아남은 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 제거한 후, 0.5% Triton X-100용액을 50 μL 첨가하여 40 rpm으로 10분 동안 진탕시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH 시약 50 μL를 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 대조군과 비교한 값을 나타내었다.

(6) Hoechst 33342 염색

6-웰 플레이트에 2×10⁵ 세포/웰로 24시간 동안 배양하고 제비꽃 추출물을 농도별로 처리한 후, 0.5 mM H₂O₂를 처리하여 2시간 반응시켰다. PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% 포르말린을 처리하여 4 시간 고정한 후 다시 PBS로 세척하고 Hoechst 33342(Sigma, MO, U.S.A)로 30분 동안 염색하였다. 염색 후 PBS로 세척하 고 형광 현미경 하에서 400배로 관찰하였다.

(7) 통계처리

신경세포 보호효과 데이터 처리는 SPSS-PC+ 통계 팩키지를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 일방향 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F 값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.

2. 결과 및 고찰

(1) 제비꽃 추출물에 대한 신경세포 PC12의 보호 효과

- 형태학적 변화의 관찰

신경세포가 외부환경에 민감하게 자극을 받으면 신경상해를 입는 것과 동시에 세포사의 발생으로 인한 세포의 형태학적인 변화가 나타난다. 따라서, H₂O₂로 유도된 스트레스 상태의 PC12 세포주에서 제비꽃의 아세톤 추출물이 세포의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 광학 현미경 하에서 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바에 따르면, H₂O₂를 처리하지 않은 정상 대조군에 비해 H₂O₂ 처리군은 스트레스로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포가 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있다. 이에 반해, 제비꽃의 아 세톤 추출물을 100, 250 μg/mL 처리하였을 때는 농도 의존적으로 신경세포가 생존하는 것을 확인 할 수 있다.

이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 제비꽃의 아세톤 추출물은 H₂O₂에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

- MTT 환원 분석 및 LDH 방출량 측정

H₂O₂에 의해 유도되는 PC12 세포주의 손상에 대한 신경세포 보호효과를 확인하기 위해, PC12 세포주에 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, H₂O₂ 처리군, 그리고 H₂O₂와 제비꽃의 아세톤 추출물을 농도별로 처리한 실험군에 대해 MTT 환원분석의 결과를 비교하였다. 그 결과를 도 2의 A에 나타내었다.

도 2의 A에 나타난 바와 같이, H₂O₂ 처리군의 세포 생존율은 53.7% 수준으로 떨어졌으나, 이 때 제비꽃의 아세톤 추출물 100, 250 μg/mL를 세포주에 처리했을 때 신경세포 생존율은 각각 62%, 66%인 것으로 나타나 농도 의존적으로 세포가 회복된다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 동일한 조건 하에서 세포의 손상 정도를 확인하기 위하여 배양액 중에 들어 있는 LDH(lactate dehydrogenase)의 방출 양을 측정한 결과를 도 2의 B에 나타내었다. 정상 대조군에 비해 H₂O₂ 처리군은 약 40% 정도의 LDH 방출을 확인 할 수 있는데 반해 제비꽃의 아세톤 추출물 100, 250 μg/mL을 처리했을 때는 각각 34.2%, 31.2%로 감소하였다. 이러한 결과는 제비꽃의 아세톤 추출물이 H₂O₂에 의해 유도된 PC12 신경세포 손상을 억제한다는 것을 시사한다.

- Hoechst 33342 염색

다음으로 아폽토시스의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바에 따르면, 정상 대조군의 세포의 핵은 타원형의 온전한 핵 모양을 나타낸 반면 과산화수소로 처리된 세포의 핵은 응축과 분절화로 인한 아폽토시스 바디(apoptotic body)가 핵 주변에 나타나는 전형적인 아폽토시스 특징을 나타내었다. 그러나, 제비꽃의 아세톤 추출물을 처리한 결과 핵의 응축 현상과 분절화가 현저히 감소하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 H₂O₂에 의한 세포의 독성이 아폽토시스스에 기인한다는 것을 나타내며, 제비꽃의 아세톤 추출물은 이러한 조건에서 신경세포를 보호하는 효과를 나타낸다고 할 수 있다.

(2) 제비꽃 추출물에 대한 신경세포 N18-RE-105의 보호 효과

- MTT 환원분석

상기 실시예 1, 2, 및 3에서 제조된 제비꽃 추출물 각각을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 N18-RE-105 세포주에 처리하여, 글루타메이트에 의해 유도된 스트레스 상태에 대한 신경세포 보호효과를 MMT 환원분석을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 결과에 따르면, 메탄올 추출물 및 아세톤 추출물 10 μg/mL에 서는 39.3%, 49.4%로 약한 활성을 보이지만, 100 μg/mL로 처리했을 때에는 각각 72.1%, 79.4%로 급격히 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 특히 아세톤 추출물의 경우 50 μg/mL에서도 76.8%의 생존율을 보이면서, 다른 용매의 추출물에 비해 현저히 높은 세포 보호 효과를 나타내었다.

- 형태학적 변화의 관찰

글루타메이트로 유도된 세포독성 상태에서 활성이 가장 좋은 제비꽃의 아세톤 추출물을 대상으로 N18-RE-105 세포주의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 광학 현미경 하에서 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바에 따르면, 정상 대조군에 비해 글루타메이트 처리군은 신경세포의 큰 형태학적 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, 제비꽃의 아세톤 추출물을 50, 100 μg/mL 처리하였을 경우에는 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다. 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 제비꽃의 아세톤 추출물은 글루타메이트 독성에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신할 수 있었다.

- LDH 방출양 측정

제비꽃의 아세톤 추출물을 대상으로 N18-RE-105 세포주의 세포의 손상 정도를 확인하기 위하여, LDH의 방출양을 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 따르면, 글루타메이트가 처리된 N18-RE-105 세포주에 제비꽃의 아세톤 추출물을 10, 50, 100 μg/mL로 처리하여 글루타메이트 처리군과 비교한 결과, LDH 방출량이 67.5%, 57.8%, 52.1%로 감소하여 정상 대조군의 수준으로 회복되었다 는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 제비꽃의 아세톤 추출물이 글루타메이트에 의해 유도된 스트레스로부터 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 시사한다.

도 1은 과산화수소로 유도된 스트레스 상태의 PC12 세포주에 본 발명의 일 구현예에 따른 제비꽃의 아세톤 추출물을 처리한 경우의 세포의 형태학적 변화를 위상차 현미경으로 100배로 촬영한 사진이다.

도 2의 A는 과산화수소로 유도된 스트레스 상태의 PC12 세포주에 본 발명의 일 구현예에 따른 제비꽃의 아세톤 추출물을 처리한 경우의 MTT 환원분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2의 B는 과산화수소로 유도된 스트레스 상태의 PC12 세포주에 본 발명의 일 구현예에 따른 제비꽃의 아세톤 추출물을 처리한 경우의 LDH의 방출량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 과산화수소로 유도된 스트레스 상태의 PC12 세포주에 본 발명의 일 구현예에 따른 제비꽃의 아세톤 추출물을 처리한 경우에 Hoechst 33342로 핵을 염색한 다음 형광 현미경으로 400 배로 촬영한 사진이다.

도 4는 글루타메이트로 유도된 스트레스 상태의 N18-RE-105 세포주에 본 발명의 일 구현예에 따른 제비꽃의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 및 아세톤 추출물을 처리한 경우에 MTT 환원분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 글루타메이트로 유도된 스트레스 상태의 N18-RE-105 세포주에 본 발명의 일 구현예에 따른 제비꽃의 아세톤 추출물을 처리한 경우에 세포의 형태학적 변화를 위상차 현미경으로 100배로 촬영한 사진이다.

도 6은 글루타메이트로 유도된 스트레스 상태의 N18-RE-105 세포주에 본 발 명의 일 구현예에 따른 제비꽃의 아세톤 추출물을 처리한 경우에 LDH의 방출량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims (9)

1. 제비꽃을 활성성분으로서 포함하는 퇴행성 뇌질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 제비꽃은 생약 자체의 분쇄물, 생약의 건조 분쇄물, 또는 물, C₁-C₄ 알콜, 아세톤, 및 이들이 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용매의 추출물로서 함유되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 제비꽃 추출물은 아세톤 용매의 추출물로서 함유되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의해 유발되는 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 의약품.
7. 제 6 항에 있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피 투여제, 또는 좌제의 형태인 것을 특징으로 하는 의약품.
8. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및, 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 퇴행성 뇌질환에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품.
9. 제 8 항에 있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료의 형태인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.

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