KR100980312B1 - Composition comprising inhibitors of adiponectin for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아디포넥틴(adiponectin) 억제제를 함유하는 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아디포넥틴이 TNBS 처리에 의해 유도된 IBD에서 현저히 생성되고, 크론병(Crohn) 환자의 장 육아종(granuloma)에서 발견되며, 미성숙 수지상세포를 활성화시켜 T 세포 증식을 유발하며, 항아디포넥틴 중화 항체를 이용한 아디포넥틴의 중화가 TNF α, IL-1β 및 ICAM-1의 발현을 억제하여 IBD를 현저하게 개선시킴으로써, 상기 아디포넥틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 염증성 대장 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to a composition for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease (IBD) containing adiponectin inhibitor, more specifically, adiponectin is significantly produced in IBD induced by TNBS treatment, Crohn's disease It is found in the granuloma of patients with Crohn, activates immature dendritic cells, induces T cell proliferation, and neutralization of adiponectin with anti-adiponectin neutralizing antibodies stimulates the expression of TNFα, IL-1β and ICAM-1. By suppressing and significantly improving IBD, the adiponectin protein expression or activity inhibitor can be usefully used as an active ingredient for the composition for preventing and treating inflammatory bowel disease.
Description
본 발명은 염증성 대장 질환 예방 및 치료용 조성물, 장 육아종 진단 방법, 미성숙 수지상세포의 활성화 또는 분화 촉진 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for preventing and treating inflammatory bowel disease, a method for diagnosing intestinal granulomas, and a method for promoting activation or differentiation of immature dendritic cells.
염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 다양한 종류의 염증세포들의 연속적인 유입을 유발하는 초기 원인으로서 대량의 림프구의 침입에 의해 특정되고, 이는 내장 조직의 파괴를 유발한다. IBD의 병인 중 하나인 점막 항상성의 불균형의 주요 원인은 대식세포 및 림프구에 의한 사이토카인 생성과 세포부착분자의 발현의 변화이다(Strober, W., et al., Scand J Immunol 48, 453-458, 1998). 트리니트로벤젠 설폰산(trinitrobennzene sulfonic acid, TNBS)에 의해 유도된 대장염은 임상 및 조직학적으로 크론병과 유사하며, 대장 손상의 원인이다(Elson, C.O. et al.,. Gastroenterology 109, 1344-1367, 1995; Fiocchi, C. Gastroenterology 115, 182-205, 1998). 대장염 모델에서, TNF-α 및 IL-1β 등의 점막 호염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 증가는 염증 반응을 유지시키는데 중요한 역할을 한다(Elson, C.O. et al.,. Gastroenterology 109, 1344-1367, 1995; Fiocchi, C. Gastroenterology 115, 182-205, 1998). 상기 대장염 모델에서, TNF-α 및 IL-1β의 수준은 IBD 환자의 대장 조직에서 증가한다(Rogler, G. & Andus, World J Surg 22, 382-389, 1998).Inflammatory bowel disease (IBD) is an early cause of the continuous influx of various types of inflammatory cells and is characterized by invasion of large numbers of lymphocytes, which leads to destruction of visceral tissue. The main cause of the imbalance of mucosal homeostasis, one of the etiologies of IBD, is the alteration of cytokine production and expression of cell adhesion molecules by macrophages and lymphocytes (Strober, W. , et al., Scand J Immunol 48, 453-458). , 1998). Colitis induced by trinitrobennzene sulfonic acid (TNBS) is clinically and histologically similar to Crohn's disease and is responsible for colon damage (Elson, CO et al., Gastroenterology 109, 1344-1367, 1995; Fiocchi, C. Gastroenterology 115, 182-205, 1998). In colitis models, increased mucosal pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β play an important role in maintaining the inflammatory response (Elson, CO et al., Gastroenterology 109, 1344-). 1367, 1995; Fiocchi, C. Gastroenterology 115, 182-205, 1998). In this colitis model, levels of TNF-α and IL-1β are increased in colon tissue of IBD patients (Rogler, G. & Andus, World J Surg 22, 382-389, 1998).
IBD는 많은 종류의 염증 세포들이 개시 및 지속과 관련된 과면역 증식 질환의 발병과 관련된 것으로서 만성 염증성 질환이다(Zenewicz, L.A., et al., Trends Mol Med 15, 199-207, 2009). 상기 염증 세포들 중 CD4+ T 세포는 IBD의 개시 및 IBD의 전체 면역 반응의 경로 조절에 중요한 역할을 한다. 특히, CD4, CD25 및 foxp3를 연속적으로 발현하는, 자연 발생하는 조절 T 세포(Treg)는 IBD에 매우 관련이 있다(Boden, E.K. & Snapper, S.B., Curr Opin Gastroenterol 24, 733-741, 2008; Yuan, Q., et al., J Exp Med 204, 1327-1334, 2007).IBD is a chronic inflammatory disease associated with the development of hyperimmune proliferative diseases in which many types of inflammatory cells are associated with initiation and persistence (Zenewicz, LA, et al., Trends Mol Med 15, 199-207, 2009). Of these inflammatory cells, CD4 + T cells play an important role in initiation of IBD and in the regulation of the pathway of the overall immune response of IBD. In particular, naturally occurring regulatory T cells (Tregs), which continuously express CD4, CD25 and foxp3, are highly involved in IBD (Boden, EK & Snapper, SB, Curr Opin Gastroenterol 24, 733-741, 2008; Yuan , Q. , et al. , J Exp Med 204, 1327-1334, 2007).
Treg의 고갈은 IBD를 유발하고, IBD에 걸린 마우스내로 Treg의 면역입양은 IBD의 심각성을 매우 감소시킨다. 이는 Treg 기능 조절이 IBD의 항염증 양상을 제공할 수 있음을 제시하는 것이다. TH1, 또는 최근에 보고된 염증성 T 세포 부분인 TH17은 IBD의 원인과 관련이 있다(Abraham, C. & Cho, J., Inflamm Bowel Dis 15, 1090-1100, 2009; Powrie, F., et al., Immunity 1, 553-562, 1994). 장 상피세포(gut epithelial cell, IEC)는 정상 미소형-생물상(micro-biota) 또는 감염성 미생물에 의해 접촉되기 때문에, 만성 염증 상태로 될 가능성을 항상 가지고 있다. LPS, 펩티드글리칸(Peptidoglycan), 핵산 또는 박테리아 단백질 등의 장 미생물 산물을 인식하고 염증을 개시하거나 조절하기 위해, 장에 잔여하는 고유층 수지상세포는 면역감시를 수행한다. 따라서, IEC, DC 및 T 세포 간에 상호작용은 장 면역 항상성에 중요한 역할을 한다(Shale, M. & Ghosh, S., Gut 58, 1291-1299, 2009; Hisamatsu, T. et al., Curr Opin Gastroenterol 24, 448-454, 2008).
Depletion of Tregs leads to IBD, and the immunoadoption of Tregs into mice with IBD greatly reduces the severity of IBD. This suggests that regulating Treg function may provide an anti-inflammatory aspect of IBD. TH1, or the recently reported portion of inflammatory T cells, is associated with the cause of IBD (Abraham, C. & Cho, J., Inflamm Bowel Dis 15, 1090-1100, 2009; Powrie, F. , et al. ,
아디포넥틴(Adiponectin)은 서브트랙티브 지방세포 cDNA 라이브러리(subtractive adipocyte cDNA library)를 스크리닝함으로써 지방 조직 특이적 유전자로서 동정되었다(Berg, A.H., et al., Trends Endocrinol Metab 13, 84-89, 2002). 마우스 상동체로부터 다양한 군을 분리하였으며, 이들을 각각 Acrp30(adipocyte complement-related protein of 30kDa), APM1(adipocyte most abundant protein-1) 또는 AdipoQ로 명명하였다. 아디포넥틴은 다양하게 명명됨에도 불구하고, 공통적으로 지방세포 특이적이며 주요 혈청 단백질이다. Adiponectin was identified as adipose tissue specific gene by screening a subtractive adipocyte cDNA library (Berg, AH, et al., Trends Endocrinol Metab 13, 84-89, 2002). Various groups were isolated from mouse homologues, and they were named Acrp30 (adipocyte complement-related protein of 30kDa), APM1 (adipocyte most abundant protein-1) or AdipoQ, respectively. Although adiponectin is named variously, it is commonly adipocyte specific and a major serum protein.
아디포넥틴의 대사 기능에 관한 첫번째 증거는 Matsuzawa 등에 의해 아디포넥틴의 혈장내 수준이 비만인 사람에서 현저하게 감소된 것으로 보고되었다(Hu, E., et al., J Biol Chem 271, 10697-10703, 1996). 이런 관찰 후, 일련의 임상적 연구들은 혈장 아디포넥틴의 수준이 관상동맥질환(coronary artery disease, CAD), 본태성 고혈압(essential hypertension) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 등의 비만 관련 질환에서 감소하된 것을 확인하였다(uchi, N., et al., Circulation 100, 2473-2476, 1999; Patel, J.V., et al., J Intern Med 264, 593-598, 2008). 이는 혈장 아디포넥틴 수준이 상기와 같은 심장혈관질환들의 발병을 암시할 수 있는 것을 제시하는 것이다. The first evidence on the metabolic function of adiponectin was reported by Matsuzawa et al. To have markedly reduced plasma levels of adiponectin in obese people (Hu, E., et al., J Biol Chem 271, 10697-10703, 1996). After this observation, a series of clinical studies have shown that plasma adiponectin levels have decreased in obesity-related diseases such as coronary artery disease (CAD), essential hypertension and atherosclerosis. (Uchi, N. , et al.,
아디포넥틴이 LPS 또는 TNF-α에 의해 NF-kB 활성을 억제할 수 있음이 보고된 바 있다(Tomizawa, A., et al., Diab Vasc Dis Res 5, 123-127, 2008; Ajuwon, K.M. & Spurlock, M.E., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288, R1220-1225, 2005). 이는 혈장 아디포넥틴 수준의 감소가 많은 염증성 질환에 관한 중요한 역할을 할 수 있음을 제시하는 것이다. 이에 대한 직접적인 증거로는, 혈장 아디포넥틴의 수준이 염증의 지표로서 제공하는 단백질인 C 반응성 단백질(C-reactive protein, CRP)에 대해 역으로서 관련성이 있으며, 아디포넥틴의 주입이 아포지질단백질 E(apolipoprotein E) 결핍 마우스에서 죽상동맥경화증을 감소시키는 것이 보고된 바 있다(Ouchi, N., et al., Circulation 107, 671-674, 2003; Yamauchi, T., et al., J Biol Chem 278, 2461-2468, 2003). 이들 연구는 염증성 질환이 혈장 아디포넥틴의 수준을 회복시킴으로써 치료할 수 있음을 제시하는 것이다. 내장지방조직이 아디포넥틴을 발현하기 때문에, 내장지방세포 유래 아디포넥틴은 IBD의 염증을 감소시키는 역할을 하는 것으로 추측되고 있다.
It has been reported that adiponectin can inhibit NF-kB activity by LPS or TNF-α (Tomizawa, A., et al., Diab Vasc Dis Res 5, 123-127, 2008; Ajuwon, KM & Spurlock , ME, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288, R1220-1225, 2005). This suggests that reduction of plasma adiponectin levels may play an important role for many inflammatory diseases. Direct evidence for this is that plasma adiponectin levels are inversely related to C-reactive protein (CRP), a protein that serves as an indicator of inflammation, and infusion of adiponectin is associated with apolipoprotein E. It has been reported to reduce atherosclerosis in mice deficient (Ouchi, N. , et al., Circulation 107, 671-674, 2003; Yamauchi, T. , et al., J Biol Chem 278, 2461-). 2468, 2003). These studies suggest that inflammatory diseases can be treated by restoring plasma adiponectin levels. Since visceral adipose tissue expresses adiponectin, adiponectin derived from visceral fat cells is believed to play a role in reducing inflammation of IBD.
이에, 본 발명에서는 아디포넥틴이 잠재적 항염증 단백질이며 내장지방세포에 의해 발현되기 때문에, IBD에서 아디포넥틴 발현에 대한 역할을 조사하던 중, 기존에 알고 있었던 아디포넥틴이 항염증 단백질이라는 발상과 반대로, 아디포넥틴이 수지상세포의 활성화를 매개하여 IBD를 유발하는 병리적 단백질이며, 아디포넥틴의 중화는 IBD 치료를 위한 치료학적 간섭이 될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
In the present invention, since adiponectin is a potential anti-inflammatory protein and is expressed by visceral fat cells, adiponectin is dendritic in contrast to the idea that adiponectin is an anti-inflammatory protein while investigating a role for adiponectin expression in IBD. The present invention has been completed by the discovery that neutralization of adiponectin may be a therapeutic intervention for the treatment of IBD by mediating the activation of cells to induce IBD.
본 발명의 목적은 아디포넥틴(adiponectin) 억제제를 이용한 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD) 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a composition for preventing and treating inflammatory bowel disease (IBD) using adiponectin inhibitor.
본 발명의 또다른 목적은 아디포넥틴을 이용한 내장 육아종(intestinal granuloma)의 진단 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for diagnosing intestinal granuloma using adiponectin.
본 발명의 또다른 목적은 아디포넥틴을 이용한 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell, iDC)의 활성화 또는 분화 촉진 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method for promoting activation or differentiation of immature dendritic cells (iDC) using adiponectin.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아디포넥틴(adiponectin) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating Inflammatory bowel disease (IBD) containing an inhibitor of the expression or activity of adiponectin protein.
또한, 본 발명은 1) 피검대상으로부터 유래한 내장 조직 또는 이의 절편에 표지물질을 결합시킨 항-아디포넥틴 항체를 처리하는 단계; 2) 상기 조직 또는 이의 절편에서 표지를 검출하는 단계; 및, 3) 상기 표지가 정상인 대조군에 비해 유의적으로 검출되는 부위를 육아종(granuloma)인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 시험관내(In vitro)에서 육아종을 진단하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of: 1) treating an anti-adiponectin antibody conjugated with a label to a visceral tissue or a fragment thereof derived from the subject; 2) detecting the label in the tissue or fragment thereof; And 3) provides a method for diagnosing granulomas in vitro ( in vitro ) comprising the step of determining that the label is a granuloma significantly detected compared to the control group is normal.
또한, 본 발명은 1) 표지물질을 결합시킨 항-아디포넥틴 항체를 피검대상의 장내에 투여하는 단계; 2) 상기 피검대상을 스캐닝하여 표지물질를 영상화하는 단계; 및, 3) 상기 영상화 결과, 정상의 대조군에 비해 유의적으로 표지물질이 축적된 부위를 육아종인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 생체내(In vivo)에서 육아종을 진단하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of 1) administering an anti-adiponectin antibody conjugated with a label in the intestine of the subject; 2) imaging the label by scanning the subject; And, 3) provides a method of diagnosing granulomas in vivo ( in vivo ) comprising the step of determining that the site of the labeling material significantly accumulate compared with the normal control group as granulomas.
또한, 본 발명은 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell, iDC)에 아디포넥틴을 처리함으로써 시험관내(In vitro)에서 미성숙 수지상세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for activating immature dendritic cells in vitro by treating adiponectin to immature dendritic cells (iDC).
또한, 본 발명은 미성숙 수지상세포에 아디포넥틴을 처리함으로써 시험관내(In vitro)에서 미성숙 수지상세포에서 성숙 수지상세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for promoting differentiation from immature dendritic cells to mature dendritic cells in vitro by treating adiponectin to immature dendritic cells.
아울러, 본 발명은 1) 아디포넥틴 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 세포주의 아디포넥틴 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및, 3) 상기 아디포넥틴 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 염증성 대장 질환 예방 및 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
In addition, the present invention comprises the steps of: 1) treating the test substance to the cell line expressing adiponectin protein; 2) measuring the expression level of the adiponectin protein of the cell line; And 3) selecting a test substance whose expression level of the adiponectin protein is reduced compared to a control group not treated with the test substance, thereby providing a method for screening for preventing and treating inflammatory bowel disease.
본 발명은 기존에 알고 있었던 아디포넥틴이 항염증 단백질이라는 발상과 반대로, 아디포넥틴이 수지상세포의 활성화를 매개하여 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD)를 유발하는 병리적 단백질이며, 항아디포넥틴 항체를 이용한 아디포넥틴의 중화가 IBD를 개선시킬 수 있음을 확인함으로써, 아디포넥틴 억제제를 염증성 대장 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있음을 보여준다.
In contrast to the conventional idea that adiponectin is an anti-inflammatory protein, adiponectin is a pathological protein that mediates activation of dendritic cells to cause inflammatory bowel disease (IBD), and adiponectin using an adiponectin antibody. By confirming that the neutralization of can improve the IBD, it shows that the adiponectin inhibitor can be usefully used as an active ingredient for the composition for preventing and treating inflammatory bowel disease.
도 1은 아디포넥틴의 발현 수준을 확인한 결과를 보여주는 그림이다:
(A) 대조군 마우스, TNBS, DSS 및 Rebamipide를 각각 처리한 아디포넥틴 및 β-액틴의 발현 수준을 면역블랏팅을 이용하여 분석한 결과이다;
(B) 대조군 마우스, TNBS 또는 DSS를 처리한 마우스 유래 조직에서 아디포넥틴의 발현 수준을 면역조직화학적 염색을 이용하여 분석한 결과이다; 및
(C) 정상인, 크론병 환자 및 TB 환자 유래 조직에서 아디포넥틴의 발현 수준을 면역조직화학적 염색을 이용하여 분석한 결과이다.
도 2는 아디포넥틴의 중화가 마우스에서 TNBS에 의한 장 손상을 보호하는 것을 확인한 결과를 보여주는 그림이다:
(A) TNBS로 처리된 마우스의 결장내로 마우스 아디포넥틴의 다클론 항체를 투여한 후 육안으로 관찰한 결과이다; 및
(B) TNBS로 처리된 마우스의 결장내로 마우스 아디포넥틴의 다클론 항체를 투여한 후 면역조직학적 분석한 결과이다.
도 3은 대조군, 및 TNBS 처리, TNBS+아디포넥틴 처리 및 TNBS+항아디포넥틴 처리 마우스군에서 아디포넥틴 중화 항체가 TNBS에 의한 대장염을 억제하는 것을 보여주는 그림이다:
(A) 각 군에서 매일 측정한 체중이다;
(B) 각 군에서 측정한 생존률이다; 및
(C) 각 군의 마우스에서 직장으로부터 5cm 떨어진 대장 부위의 조직 용해물의 MPO 활성이다.
도 4는 아디포넥틴 항체 처리가 염증성 사이토카인 및 세포부착분자의 유도를 억제하는 것을 보여주는 그림이다.
도 5는 대조군으로서 LPS, 시험군으로서 전장 또는 구형 도메인의 아디포넥틴의 존재 하에서, 각각 배양된 미성숙 수지상세포(iDC)가 상동 세포 클로스터링을 효율적으로 유도하는 것을 보여주는 그림이다.
도 6은 아디포넥틴 처리군(10 mg/ml), LPS 처리군(500 ng/ml), 무처리군에서 배양된 수지상세포에서 성숙 마커 단백질을 유세포분석을 통하여 분서한 결과를 보여주는 그림이다.
도 7은 아디포넥틴이 수지상세포에서 IDO 발현을 유도하는 것을 보여주는 그림이다:
(A) 대조군으로 무처리, 실험군으로 LPS, CpG 올리고뉴클레오티드, CD40L, TNF-α, 4-1BB 및 GITR로 48시간 처리된 단핵구 유래 수지상세포에서 IDO 발현을 웨스턴블랏분석으로 분석한 결과이다; 및
(B) 대조군으로 무처리 및 LPS 처리, 실험군으로 전장 또는 구형 도메인의 아디포넥틴으로 처리된 단핵구 유래 수지상세포에서 IDO 발현을 웨스턴블랏분석으로 분석한 결과이다.
도 8은 아디포넥틴이 T 세포 증식을 유도하는 것을 보여주는 그림이다. Figure 1 shows the results of confirming the expression level of adiponectin:
(A) Expression levels of adiponectin and β-actin treated with control mice, TNBS, DSS and Rebamipide, respectively, were analyzed using immunoblotting;
(B) the expression level of adiponectin was analyzed by immunohistochemical staining in control mice, TNBS or DSS-treated mice; And
(C) The expression level of adiponectin in normal Crohn's disease patients and TB patient-derived tissues was analyzed using immunohistochemical staining.
Figure 2 shows the results confirming that neutralization of adiponectin protects intestinal damage caused by TNBS in mice:
(A) the result of visual observation after administration of the polyclonal antibody of mouse adiponectin into the colon of the mouse treated with TNBS; And
(B) Immunohistochemical analysis after administration of mouse adiponectin polyclonal antibody into the colon of TNBS-treated mice.
Figure 3 shows adiponectin neutralizing antibodies inhibiting colitis caused by TNBS in the control group and in the TNBS treated, TNBS + adiponectin treated and TNBS + antiadiponectin treated mice groups:
(A) body weight measured daily in each group;
(B) survival rate measured in each group; And
(C) MPO activity of tissue lysates at the
4 shows that adiponectin antibody treatment inhibits the induction of inflammatory cytokines and cell adhesion molecules.
FIG. 5 is a diagram showing that immature dendritic cells (iDCs) cultured efficiently induce homologous cell clotting, respectively, in the presence of LPS as a control and adiponectin of a full-length or spherical domain as a test group.
FIG. 6 is a diagram showing the results obtained by flow cytometry analysis of mature marker proteins in dendritic cells cultured in adiponectin treated group (10 mg / ml), LPS treated group (500 ng / ml), untreated group.
7 is a diagram showing that adiponectin induces IDO expression in dendritic cells:
(A) Western blot analysis of IDO expression in monocyte-derived dendritic cells treated for 48 hours with no treatment as control, LPS, CpG oligonucleotide, CD40L, TNF-α, 4-1BB and GITR as experimental group; And
(B) Western blot analysis of IDO expression in monocyte-derived dendritic cells treated with adiponectin of the full-length or spherical domain, without treatment and LPS treatment as a control group.
8 shows that adiponectin induces T cell proliferation.
이하, 본 발명에서 사용되는 용어들을 정의한다.
Hereinafter, terms used in the present invention are defined.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 대장 질환의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. As used herein, the term "prevention" means any action that delays the onset of inflammatory bowel disease by administration of a composition of the present invention.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 대장 질환의 증세가 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the terms "treatment" and "improvement" refer to any action in which the symptoms of inflammatory bowel disease improve or benefit from administration of a composition of the present invention.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.As used herein, the term "administration" means providing a subject with any of the compositions of the present invention in any suitable manner.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 염증성 대장 질환의 증상이 호전될 수 있는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다. The term "individual" as used in the present invention means any animal, such as human, monkey, dog, goat, pig or rat, which can improve the symptoms of inflammatory bowel disease by administering the composition of the present invention.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 염증성 대장 질환의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit or risk ratio applicable to medical treatment, which means the severity of the inflammatory bowel disease of the individual, the activity of the drug, the drug. Sensitivity to, time of administration, route of administration and rate of administration, duration of treatment, factors including drug used concurrently, and other factors well known in the medical arts.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 아디포넥틴(adiponectin) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating Inflammatory bowel disease (IBD) containing an inhibitor of the expression or activity of adiponectin protein.
상기 아디포넥틴 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The adiponectin protein preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
상기 아디포넥틴 단백질의 발현 억제제는 아디포넥틴 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The adiponectin protein expression inhibitor is preferably any one selected from the group consisting of antisense nucleotides, small interfering RNA (short interfering RNA) and short hairpin RNA (combination) complementary to the mRNA of the adiponectin gene, but is not limited thereto. It doesn't work.
상기 아디포넥틴 단백질의 활성 억제제는 아디포넥틴 단백질에 상보적으로 결합하는 기질 유사체, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The activity inhibitor of the adiponectin protein is preferably any one selected from the group consisting of substrate analogs, compounds, peptides, peptide mimetics and antibodies that bind to adiponectin protein, but is not limited thereto.
안티센스 뉴클레오티드Antisense nucleotides
안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 안티센스 뉴클레오티드의 유용성은 Rothenberg 등(J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999)이 보고한 바 있다. 당업자에 알려진 아디포넥틴의 mRNA 서열을 이용하여 안티센스 뉴클레오티드를 제작할 수 있으며, 특이적으로 아디포넥틴의 mRNA에 결합하여 아디포넥틴의 발현을 억제할 수 있다.Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. The utility of antisense nucleotides has been reported by Rothenberg et al . ( J. Natl. Cancer Inst., 81: 1539-1544, 1999). Antisense nucleotides can be prepared using the mRNA sequences of adiponectin known to those skilled in the art, and can specifically bind to the mRNA of adiponectin to inhibit the expression of adiponectin.
siRNA 분자siRNA molecules
센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 아디포넥틴 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는 아디포넥틴 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, 아디포넥틴 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.The sense RNA and the antisense RNA form a double stranded RNA molecule, wherein the sense RNA is preferably an siRNA molecule comprising a nucleic acid sequence identical to the target sequence of a continuous nucleotide of some of the adiponectin mRNA. The siRNA molecule is preferably composed of a sense sequence consisting of 10 to 30 bases selected from the base sequence of the adiponectin gene and an antisense sequence complementarily binding to the sense sequence, but is not limited thereto. Any double-stranded RNA molecule having a sense sequence capable of complementarily binding to a nucleotide sequence can be used. Most preferably, the antisense sequence has a sequence complementary to the sense sequence.
항체Antibodies
아디포넥틴에 대한 항체는 아디포넥틴에 특이적이고 직접적으로 결합하여 아디포넥틴의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 아디포넥틴에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 아디포넥틴에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 아디포넥틴 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 아디포넥틴 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다. Antibodies to adiponectin can specifically and directly bind to adiponectin to effectively inhibit the activity of adiponectin. As the antibody specifically binding to adiponectin, it is preferable to use a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Antibodies that specifically bind to adiponectin may be prepared by known methods known to those skilled in the art, and commercially known adiponectin antibodies may be purchased and used. The antibody can be prepared by injecting an adiponectin protein, an immunogen, into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, rabbits. Immunogens are injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection and can generally be administered with an adjuvant to increase antigenicity. Antibodies can be isolated by collecting blood periodically from an external host and collecting serum showing shaped titers and specificity for the antigen.
기질 유사체Substrate analog
아디포넥틴의 결합 도메인을 억제하는 유사체(예: 펩티드 또는 비펩티드성 약제)를 제작하여 아디포넥틴의 활성을 억제할 수 있다. 특히 상기 펩티드 유사체 또는 TMPRSS4의 기질인 작은 펩티드 기질(short peptide substrate: 미합중국 특허 제 7,650,034호)의 단편의 비가수분해형 펩티드 유사체가 사용될 수 있다. 상기 비가수분해성 펩티드 유사체는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al., Tetrahedron. Lett. 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al., J. Med. Chem. 29:295, 1986; Ewenson et al., in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al., in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988) 을 사용하여 생성할 수 있다.
Analogs that inhibit the binding domain of adiponectin (eg, peptides or nonpeptidic agents) can be made to inhibit the activity of adiponectin. In particular, non-hydrolyzable peptide analogues of such peptide analogues or fragments of short peptide substrates (US Pat. No. 7,650,034) that are substrates of TMPRSS4 can be used. The non-hydrolyzable peptide analogues are β-turn dipeptide cores (Nagai et al., Tetrahedron. Lett. 26: 647, 1985), keto-methylene pseudopeptides (Ewenson et al., J. Med. Chem. 29: 295, 1986; Ewenson et al., In Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), Huffman et al., In Peptides: Chemistry and Biology, GR Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), benzodiazepines (Freidinger et al., In Peptides; Chemistry and Biology, GR Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-aminoalcohol (Gordon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 419 1985) and substituted gamma lactam ring (Garvey et al., in Peptides: Chemistry and Biology, GR Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988) Can be generated using
본 발명에서는 아디포넥틴이 염증 상태인 장(intestine)에서의 발현여부 및 위치를 알아보기 위해, TNBS 또는 DSS를 처리한 마우스레서 아디포넥틴의 발현 수준을 웨스턴 블랏 및 면역조직염색을 수행하였다. 그 결과, 대조군 마우스와 달리 TNBS 또는 DSS로 처리된 마우스에서 유의적인 염색이 관찰되었으며, 육아종에서 유의적으로 관찰되었다(도 1A 내지 도 1C 참조). 따라서 아디포넥틴의 유도가 장 염증에 대한 지표 마커임을 알 수 있었다.In the present invention, Western blot and immunohistostaining were performed on the expression level of adiponectin treated with TNBS or DSS to determine whether adiponectin is inflamed intestine. As a result, significant staining was observed in mice treated with TNBS or DSS, unlike control mice, and significantly in granulomas (see FIGS. 1A-1C). Therefore, it was found that induction of adiponectin is an indicator of intestinal inflammation.
또한, 본 발명에서는 장 염증 조건하에서 아디포넥틴의 유도 효과를 알아보기 위해, TNBS에 의해 유도된 IBD 마우스에서 항-마우스 아디포넥틴 다클론 항체를 투여하여 아디포넥틴을 중화시킨 후, IBD의 증세를 관찰하였다. 그 결과, 항-마우스 아디포넥틴은 IBD를 현저하게 개선시켰으며, 특히 점막 및 점막하층의 충혈, 괴사 및 염증의 증상을 개선시켰다(도 2A 및 도 2B 참조). 또한, 아디포넥틴 항체는 체중을 상당히 회복시켰으며, 장 손상을 악화시키는 미엘로퍼옥시다제(MPO)의 활성을 유의적으로 감소시켰다(도 3A 내지 도 3C 참조). In addition, in the present invention, in order to examine the induction effect of adiponectin under intestinal inflammatory conditions, the anti-mouse adiponectin polyclonal antibody was administered in IBD mice induced by TNBS to neutralize adiponectin, and then the symptoms of IBD were observed. As a result, anti-mouse adiponectin markedly improved IBD, especially the symptoms of hyperemia, necrosis and inflammation of the mucosa and submucosa (see Figures 2A and 2B). In addition, adiponectin antibodies significantly recovered body weight and significantly reduced the activity of myeloperoxidase (MPO), which exacerbates intestinal damage (see FIGS. 3A-3C).
또한, 본 발명에서는 항아디포넥틴 항체에 의해 매개되는 IBD의 제거가 염증 감소에 의해 수반되는지 알아보기 위해, 다양한 염증 마커의 발현을 조사하였다. 그 결과, TNBS로 처리된 마우스의 장에서는 TNF-α, IL-1β 및 ICAM-1이 현저하게 발현되었으며, 항-아디포넥틴이 이들 발현을 현저하게 억제하였다(도 4 참조). 따라서 아디포넥틴은 IBD를 유발하는 병원성 단백질이며, 항아디포넥틴 항체를 통한 아디포넥틴의 억제가 염증성 대장 질환을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있다.In addition, in the present invention, the expression of various inflammatory markers was examined to determine whether the removal of IBD mediated by anti-adiponectin antibodies is accompanied by inflammation reduction. As a result, TNF-α, IL-1β and ICAM-1 were remarkably expressed in the intestine of mice treated with TNBS, and anti-adiponectin remarkably suppressed these expressions (see FIG. 4). Therefore, adiponectin is a pathogenic protein that induces IBD, and it can be seen that inhibition of adiponectin through anti-adiponectin antibody can prevent and treat inflammatory bowel disease.
또한, 본 발명에서는 아디포넥틴이 IBD을 유발하는 작용 기전을 알아보기 위해, 아디포넥틴을 수지상세포에 처리하여 수지상세포의 생리학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 아디포넥틴의 처리는 미성숙 수지상세포로부터 유의적인 상동 세포 클로스터링을 형성시킬 수 있었으며(도 5 참조), 전장 아디포넥틴은 인간 iDC로부터 성숙을 유도하는 CD83, CD86 및 HLA-DR의 유도를 상당히 증가시켰으며, 아디포넥틴에 의해 LPS와 유사한 미성숙 수지상세포의 성숙을 유도하였다(도 6 참조). In addition, in the present invention, to examine the mechanism of action of adiponectin-induced IBD, adiponectin was treated to dendritic cells to analyze the physiological characteristics of dendritic cells. As a result, treatment with adiponectin could result in significant homologous cell cloning from immature dendritic cells (see FIG. 5), and full length adiponectin significantly increased the induction of CD83, CD86 and HLA-DR leading to maturation from human iDCs. Adiponectin induced the maturation of immature dendritic cells similar to LPS (see FIG. 6).
또한, 본 발명에서는 아디포넥틴이 미성숙 수지상세포의 활성화를 매개하여 T 세포를 증식시킬 수 있는지 알아보기 위해, 아디포넥틴이 처리된 미성숙 수지상세포 및 동종의 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR)을 이용하여 T 세포 증식 정도를 분석하였다. 그 결과, 아디포넥틴으로 처리된 미성숙 수지상세포는 MLR에서 T 세포를 현저하게 증식시켰으며, LPS, CD40L, CpG 및 TNF-α와 같은 공동 자극 분자의 발현을 증가시켰다(도 8 참조). 따라서, 아디포넥틴은 미성숙 수지상세포를 성숙 수지상세포로 분화하여 T 세포 증식을 유발하는 것을 알 수 있다.In addition, in the present invention, to determine whether adiponectin can proliferate T cells through the activation of immature dendritic cells, immature dendritic cells treated with adiponectin and homologous mixed lymphocyte reaction (MLR) are used. The extent of cell proliferation was analyzed. As a result, immature dendritic cells treated with adiponectin significantly proliferated T cells in MLR and increased expression of co-stimulatory molecules such as LPS, CD40L, CpG and TNF-α (see FIG. 8). Therefore, it can be seen that adiponectin causes T cell proliferation by differentiating immature dendritic cells into mature dendritic cells.
상기 결과를 종합하면, 아디포넥틴은 수지상세포의 활성화를 매개하여 IBD를 유발하는 병리적 단백질이며, 항아디포넥틴 항체를 이용한 아디포넥틴의 중화는 IBD를 치료할 수 있음을 알 수 있다. 이는 기존에 아디포넥틴이 항염증 작용을 하는 것으로 알려져 있는 문헌(Krenning, G., et al., Circ Res 104, 1029-1031, 2009; Kruidenier, L., et al., J Pathol 201, 17-27, 2003)과 다른 발상으로서 진보한 것임을 알 수 있다.
Taken together, it can be seen that adiponectin is a pathological protein that induces IBD by mediating dendritic cell activation, and neutralization of adiponectin using anti-adiponectin antibodies can treat IBD. This has been described previously in Krenning, G., et al., Circ Res 104, 1029-1031, 2009; Kruidenier, L. , et al., J Pathol 201, 17-27. , 2003) and other ideas.
본 발명의 아디포넥틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.1 내지 99 중량% 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The composition containing the adiponectin protein expression or activity inhibitor of the present invention, preferably containing 0.1 to 99% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
본 발명의 조성물은 상기 아디포넥틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. The composition of the present invention may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the expression or activity inhibitor of the adiponectin protein.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The composition of the present invention can be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration. Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and one or more of these components, as needed. And other conventional additives such as buffers and bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules, or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like, and may act specifically on target organs. Target organ specific antibodies or other ligands may be used in combination with the carriers so as to be used. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition, Mack Publishing Company, Easton PA). have.
본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. Nucleotides or nucleic acids used in the present invention can be prepared for the purpose of topical, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, transdermal administration. Preferably, the nucleic acid or vector is used in injectable form. Thus, in particular, the area to be treated may be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for injectable compositions for direct infusion. The composition of the present invention may comprise in particular a lyophilized composition which allows for the composition of an injectable solution according to the addition of isotonic sterile solution or sterile water or a suitable saline solution.
본 발명의 조성물에 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 1000 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
The dosage of nucleic acid used in the compositions of the present invention can be adjusted by various parameters, in particular genes, vectors, mode of administration used, disease in question or alternatively desired duration of treatment. In addition, the range varies depending on the weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of the patient. The daily dosage is about 0.0001 to 1000 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 염증성 대장 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 대장 질환 치료 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of treating inflammatory bowel disease, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the composition to an individual suffering from inflammatory bowel disease.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 대장 질환 예방 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for preventing inflammatory bowel disease, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the composition.
또한, 본 발명은 항아디포넥틴 항체를 이용하여 생체내외에서 내장 육아종을 모니터링 또는 진단할 수 있는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for monitoring or diagnosing visceral granulomas in vitro and in vivo using anti-adiponectin antibodies.
본 발명에서는 아디포넥틴이 염증 상태인 장의 육아종에서 현저히 존재하는 것을 확인(도 1A 내지 도 1C 참조)함으로써, 면역염색 등의 방법으로 육아종을 모니터링 또는 진단할 수 있음을 알 수 있었다.In the present invention, by confirming that adiponectin is remarkably present in the inflammatory intestinal granuloma (see FIGS. 1A to 1C), it was found that granulomas can be monitored or diagnosed by immunostaining or the like.
구체적으로, 생체외에서 육아종을 진단하는 방법으로Specifically, as a method for diagnosing granulomas in vitro
1) 피검대상으로부터 유래한 내장 조직 또는 이의 절편에 표지물질을 결합시킨 항아디포넥틴 항체를 처리하는 단계; 1) treating an anti-adiponectin antibody conjugated with a label to a visceral tissue or a fragment thereof derived from a subject;
2) 상기 조직 또는 이의 절편에서 표지를 검출하는 단계; 및2) detecting the label in the tissue or fragment thereof; And
3) 상기 표지가 정상인 대조군에 비해 유의적으로 검출되는 부위를 육아종(granuloma)인 것으로 판정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.3) providing a method comprising determining the site where the label is significantly detected as compared to the control group is normal granuloma.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 표지물질은 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사선 동위원소로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하며, 형광물질을 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the labeling material of step 1) is preferably any one selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, luminescent materials, and radioisotopes, and more preferably, but not limited thereto. Do not.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 검출은 형광면역분석(Floresence immunoassay, FIA), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay, RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay, EIA) 및 발광면역분석(luminescence immunoassay, LIA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 사용하는 것이 바람직하며, 형광면역분석을 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the detection of step 2) may be performed by fluorescence immunoassay (FIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (enzyme immunoassay). , EIA) and luminescence immunoassay (LIA), it is preferable to use any one method selected from the group consisting of, it is more preferred to use fluorescence immunoassay, but is not limited thereto.
구체적으로, 생체내에서 육아종을 진단하는 방법으로Specifically, as a method for diagnosing granulomas in vivo
1) 표지물질을 결합시킨 항-아디포넥틴 항체를 피검대상의 장내에 투여하는 단계;1) administering an anti-adiponectin antibody conjugated with a label to the intestine of the subject;
2) 상기 피검대상을 스캐닝하여 표지물질를 영상화하는 단계; 및2) imaging the label by scanning the subject; And
3) 상기 영상화 결과, 정상의 대조군에 비해 유의적으로 표지물질이 축적된 부위를 육아종인 것으로 판정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.3) it provides a method comprising the step of determining that the site of the labeling material granules significantly compared to the normal control results.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 표지물질은 방사성 동위원소 또는 조영제인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. In the above method, the labeling material of step 1) is preferably a radioisotope or a contrast agent, but is not limited thereto.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 영상화는 표지물질로서 방사성 동위원소를 사용하는 경우에는 양성자방출단층촬영(Positron Emission Tomography, PET)을 사용하는 것이 바람직하며, 표지물질로서 조영제를 사용하는 경우에는 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI), X-ray 영상진 또는 컴퓨터 단층촬영(Computed Tomography, CT)을 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
In the above method, imaging of step 2) is preferably performed using proton emission emission tomography (PET) when radioisotopes are used as the labeling material, and when contrast medium is used as the labeling material. More preferably, magnetic resonance imaging (MRI), X-ray imaging or computed tomography (CT) is used.
또한, 본 발명은 아디포넥틴을 유효성분으로 함유하는 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell, iDC)의 활성화제 또는 분화 촉진제를 제공한다.The present invention also provides an activator or differentiation promoter of immature dendritic cells (iDC) containing adiponectin as an active ingredient.
또한, 본 발명은 시험관내(In vitro)에서 미성숙 수지상세포에 아디포넥틴을 처리하는 단계를 포함하는, 미성숙 수지상세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of activating immature dendritic cells, comprising the step of treating adiponectin to immature dendritic cells in vitro .
또한, 본 발명은 시험관내에서 미성숙 수지상세포에 아디포넥틴을 처리하는 단계를 포함하는, 미성숙 수지상세포에서 성숙 수지상세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for promoting differentiation from immature dendritic cells to mature dendritic cells, comprising the step of treating adiponectin to immature dendritic cells in vitro.
본 발명에서는 아디포넥틴의 미성숙 수지상세포에 미치는 영향을 분석한 결과, 전장 아디포넥틴이 인간 미성숙 수지상세포로부터 성숙을 유도하는 CD83, CD86 및 HLA-DR의 발현을 현저히 증가시켰으며, 미성숙 수지상세포의 성숙을 유도(도 7 및 도 8 참조)함으로써, 상기 아디포넥틴을 이용하여 시험관내에서 미성숙 수지상세포를 활성화시키고 성숙 수지상세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 알 수 있다.
In the present invention, as a result of analyzing the effect of adiponectin on immature dendritic cells, full-length adiponectin significantly increased the expression of CD83, CD86 and HLA-DR that induces maturation from human immature dendritic cells, and induced the maturation of immature dendritic cells. 7 and 8, it can be seen that the adiponectin can be used to activate immature dendritic cells in vitro and to promote differentiation into mature dendritic cells.
아울러, 본 발명은 In addition,
1) 아디포넥틴 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 1) treating the test substance to the cell line expressing adiponectin protein;
2) 상기 세포주의 아디포넥틴 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및2) measuring the expression level of the adiponectin protein of the cell line; And
3) 상기 아디포넥틴 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 염증성 대장 질환 예방 및 치료물질 스크리닝 방법을 제공한다.3) It provides a method for screening and preventing inflammatory bowel disease, comprising the step of selecting the test substance is reduced in the expression level of the adiponectin protein compared to the control group not treated with the test substance.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the method, the expression level of the protein of step 2) is preferably measured by any one selected from the group consisting of immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA), Western blotting and RT-PCR, but is not limited thereto. .
본 발명에서는 아디포넥틴이 IBD를 유발하며, 아디포넥틴의 중화가 IBD를 개선시키는 것을 확인함으로써, 아디포넥틴의 발현을 감소시키는 물질을 선별하여 IBD 치료제로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
In the present invention, by confirming that adiponectin induces IBD, and neutralization of adiponectin improves IBD, it can be seen that a substance that reduces the expression of adiponectin can be used as an IBD therapeutic agent.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples and production examples.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Preparation Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Examples and Preparation Examples.
<실시예 1> 실험 동물의 준비 및 조건Example 1 Preparation and Conditions of Experimental Animal
본 발명의 모든 실험은 원광대학교의 동물연구윤리위원회(the Animal Studies Ethics Committee, ASEC)의 승인을 받았다. 20-25g 무게의 마우스들(Dae-Han Bio Animal Center Company, Daejun, Korea)을 무균 조건 하에서 살균한 사료 및 물을 제공하면서 사육하였다. 실험은 7주령 수컷 BALB/c 마우스로 수행하였다. 마우스의 항문으로부터 5cm 떨어진 곳에서 비닐 카테터(vinyl catheter)를 이용하여 5% 트리니트로벤젠 설폰산(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)이 포함된 40% 에탄올을 2번(7일 간격으로 분리하여) 직장 투여하여 대장염(Colitis)을 유발시켰다(각 군당 10마리씩). 점적주사 동안 디에틸에테르(diethyl ether)를 이용하여 마우스를 마취시켰으며, 마취 후 60초 동안 수직으로 유지시킨 다음, 우리에 다시 넣었다. 정상적인 대조군의 마우스들은 50% 에탄올(vol/vol)만을 대신 투여한 것을 제외하고 동일하게 수행하였다. 상기 마우스들은 첫번째 TNBS 투여 후 9일째, 즉 두번째 TNBS 투여 후 48시간에 희생시켰다. 마우스에서 아디포넥틴 중화 항체의 효과를 연구하기 위해, 상기 아디포넥틴 중화 항체를 첫번째 TNBS 투여 1일전, 투여 3일 후 및 투여 6일 후에 복강투여하였다. 대조군은 생리학적으로 획득하였다. 상기 마우스들은 첫번째 TNBS 투여 후 9일째, 즉 두번째 TNBS 투여 후 48시간에 희생시켰다.
All experiments of the present invention were approved by the Animal Studies Ethics Committee (ASEC) of Wonkwang University. Mice weighing 20-25 g (Dae-Han Bio Animal Center Company, Daejun, Korea) were bred while providing sterile feed and water under sterile conditions. Experiments were performed with 7 week old male BALB / c mice. Rectally administer 40% ethanol containing 5% trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) twice (separated every 7 days) using a
<실시예 2> TNBS 또는 DSS에 의한 장에서 아디포넥틴 유발 확인Example 2 Confirmation of Adiponectin Induction in the Intestine by TNBS or DSS
지방세포는 호염증성 및 항염증성 사이토카인과 관련된 일련의 단백질들을 분비하는 것으로 알려져 있다. 상기 분비는 TNF-α 및 IL-6가 우선되는 반면에, 아디포넥틴은 나중에 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 아디포넥틴은 내장 지방세포에서 발현되는 것이 알려져 있다.Adipocytes are known to secrete a series of proteins associated with pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. The secretion is known to be prioritized by TNF-α and IL-6, whereas adiponectin is later. It is also known that adiponectin is expressed in visceral adipocytes.
이런 두 가지 사실을 통해, 본 발명자들은 염증 상태인 장(intestine)에서 아디포넥틴 발현이 IBD의 발병을 조절하는지 알아보았다. 이에, 대조군 마우스, TNBS 또는 DSS를 처리한 마우스, 정상인, 인간 크론병(Crohn) 환자 및 결핵(TB) 환자(1999 ~ 2005년에 원광대학교 병원의 환자들로부터 획득)에서 각각 아디포넥틴의 발현 수준을 확인하였다. 5% 또는 10% TNBS 또는 DSS로 처리된 마우스의 경우, 처리 9일째에 조직 용해물을 제조하였으며, 아디포넥틴 및 β-액틴 수준을 조사하였다. 별도의 언급이 없으며, 모든 화합물은 Sigma(St. Louis, MO)에서 구입한 것을 사용하였다. Through these two facts, the present inventors examined whether adiponectin expression regulates the development of IBD in the intestine, which is an inflammatory condition. Therefore, the expression level of adiponectin in control mice, mice treated with TNBS or DSS, normal people, human Crohn's disease (TB) patients, and TB patients (obtained from patients at Wonkwang University Hospital from 1999 to 2005), respectively. Confirmed. For mice treated with 5% or 10% TNBS or DSS, tissue lysates were prepared on day 9 of treatment and the adiponectin and β-actin levels were examined. Unless stated otherwise, all compounds were used as purchased from Sigma (St. Louis, Mo.).
구체적으로, 웨스턴 블랏 분석은 다음과 같이 수행하였다. 동물 모델로부터 유래한 시료로서, 대조군 및 TNBS 처리에 의한 대장염 마우스군으로부터 각각 혈청 및 결장을, 인간으로부터 유래한 시료로서, 건강한 사람 및 만성 염증성 대장질환 환자로부터 각각 혈청을 채취한 후, 용해 완충용액(150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10 mM Tris pH 7.4, 5 mM EDTA pH 8.0, 및 10 mM PMSF)에서 조직 균질기로 균질화시켰다. 2번의 원심분리(10 min, 14,000 ＞g, 4℃) 후, 균질 현탁액을 사용할 때까지 -70℃에 저장하였다. 세포 배양으로부터 유래한 시료로서, 세포 용해물은 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 0.1% deoxycholate, 5 mM sodium fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, 1mM 4-nitrophenyl phosphate, 10 g/ml의 leupeptin, 10 g/ml의 pepstatin A, 및 1 mM 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluride을 포함)에서 제조하였다. 동등한 양의 단백질을 각 웰에 로딩한 후, 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 다음, 니트로셀룰로오즈 막에 이동시켰다. 상기 막을 막 차단 완충액(5% 탈지분유, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl 및 0.1% Tween-20)으로 차단시킨 다음, 1차 항체[항-마우스 아디포넥틴 다클론항체(polyclonal antibody, pAb)(AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), 항-마우스 아디포넥틴 단클론항체(monoclonal antibody, mAb)(AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), 항-인간 아디포넥틴 pAb(AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), 항-인간 아디포넥틴 mAb(AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), 항-마우스 레지스틴(resistin) pAb(AdipoGen, Inc., Seoul, Korea)]로 프로브시켰다. 항원-항체 복합체는 HRP(Horseradish peroxidase) 결합 항체(IgG)(Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, England) 및 ECL 키트를 이용하여 시각화하였다. 일부 실험에 있어서, 추가적으로 Kodak DC290 디지털 카메라를 이용하여 ECL 필름을 기록하였으며, UN-SCAN-IT 소프트웨어 (Silk Scientific, Orem, UT)를 이용하여 디지털화하였다. 원하는 단백질의 밴드 강도는 시료 샘플인 β-액틴의 강도를 통해 표준화시켰다. 또한, 마우스 아디포넥틴 및 인간 아디포넥틴 ELISA 키트는 AdipoGen에서 구입하였으며, 각각의 메뉴얼에 따라 수행하였다. Specifically, Western blot analysis was performed as follows. Serum and colon were collected from animal models, respectively, from the control and TNBS-treated colitis mouse groups, respectively. Serum from humans, serum from the healthy human and chronic inflammatory bowel disease patients, and then lysis buffer solution. (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10 mM Tris pH 7.4, 5 mM EDTA pH 8.0, and 10 mM PMSF) were homogenized with a tissue homogenizer. After two centrifugations (10 min, 14,000> g , 4 ° C), the homogenous suspension was stored at -70 ° C until use. As a sample derived from the cell culture, the cell lysate was dissolved in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 0.1% deoxycholate, 5 mM sodium fluoride, 1 prepared in mM sodium orthovanadate, 1 mM 4-nitrophenyl phosphate, 10 g / ml leupeptin, 10 g / ml pepstatin A, and 1 mM 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluride. Equal amounts of protein were loaded into each well, followed by electrophoresis on a 10% SDS polyacrylamide gel and then transferred to nitrocellulose membranes. The membrane was blocked with membrane blocking buffer (5% skim milk powder, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl and 0.1% Tween-20) and then the primary antibody [anti-mouse adiponectin polyclonal antibody, pAb) (AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), anti-mouse adiponectin monoclonal antibody (mAb) (AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), anti-human adiponectin pAb (AdipoGen, Inc., Seoul, Korea) ), Anti-human adiponectin mAb (AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), anti-mouse resistin pAb (AdipoGen, Inc., Seoul, Korea)]. Antigen-antibody complexes were visualized using Horseradish peroxidase (HRP) binding antibody (IgG) (Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, England) and the ECL kit. In some experiments, ECL films were additionally recorded using a Kodak DC290 digital camera and digitized using UN-SCAN-IT software (Silk Scientific, Orem, UT). The band intensities of the desired proteins were normalized through the intensities of the sample samples β-actin. In addition, mouse adiponectin and human adiponectin ELISA kits were purchased from AdipoGen and performed according to the respective manuals.
상기 분석 결과, 장의 아디포넥틴은 기존에 보고된 위궤양용 약제인 레바미피드(Rebamipid)(Sakurai, K. & Yamasaki, K., Jpn J Pharmacol 64, 229-234, 1994) 또는 담체에 의해 단백질 수준에서 단지 기저 수준으로 유도되는 것과 달리, TNBS 또는 DSS 처리에 의해 현저하게 유도되었다(도 1A). As a result of the above assay, adiponectin in the intestine was previously reported at the protein level by Rebamipid (Sakurai, K. & Yamasaki, K., Jpn J Pharmacol 64, 229-234, 1994) or a carrier for gastric ulceration. Unlike only induced at baseline levels, it was significantly induced by TNBS or DSS treatment (FIG. 1A).
또한, 유도된 아디포넥틴의 발현의 면역조직학적 검사를 수행하였다. In addition, immunohistochemical examination of the expression of induced adiponectin was performed.
구체적으로, 면역조직학적 분석은 다음과 같이 수행하였다. 상기 조직 절편을 1% 과산화수소를 포함하는 PBS에서 20분 동안 처리하여 내생 페록시다아제 활성을 중화시켰다. 마이크로파 항원 복구 공정을 위해, 슬라이드를 풀 전력인 마이크로파 내에서 클린 폴리에틸렌 챔버내 10 mM 구연산 완충용액(pH 6.0)에 10분 동안 담근 후, 10-20분 동안 냉각시켰다. 그런 다음, PBS로 3번 세척한 후, IgG의 비특이적인 결합을 억제하기 위해 상기 조직 절편을 10% 정상 말 또는 염소 혈청에서 30-60분 동안 차단시켰다. 그런 다음, 각 조직 절편을 실온에서 1시간 동안 1차 항체와 함께 배양하였다. 상기 슬라이드를 PBS로 3번 세척한 후, 항-토끼 비오틴화된 2차 항체(Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 배양하였다. 상기 슬라이드를 ABS Reagent (Vectastain)으로 컬러화하였고, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비염색하였다.Specifically, immunohistochemical analysis was performed as follows. The tissue sections were treated for 20 minutes in PBS containing 1% hydrogen peroxide to neutralize endogenous peroxidase activity. For the microwave antigen recovery process, the slides were immersed in 10 mM citric acid buffer (pH 6.0) in a clean polyethylene chamber in full power microwave for 10 minutes and then cooled for 10-20 minutes. After washing three times with PBS, the tissue sections were blocked for 30-60 minutes in 10% normal horse or goat serum to inhibit nonspecific binding of IgG. Each tissue section was then incubated with the primary antibody for 1 hour at room temperature. The slides were washed three times with PBS and then incubated with anti-rabbit biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories, Burlingame, CA). The slides were colored with ABS Reagent (Vectastain) and counterstained with hematoxylin.
그 결과, 대조군 마우스와 달리 TNBS 또는 DSS로 처리된 마우스에서 유의적인 염색이 관찰되었다(도 1B). 아디포넥틴의 유도는 만성 염증 모델인 마우스 콜라겐에 의해 유도된 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 모델에서도 관찰되었다. As a result, significant staining was observed in mice treated with TNBS or DSS, unlike control mice (FIG. 1B). Induction of adiponectin was also observed in a collagen-induced arthritis (CIA) model induced by mouse collagen, a chronic inflammation model.
아울러, 크론병 환자와 정상의 건강한 사람으로부터 유래한 장 조직을 이용하여 면역조직화학적 분석을 수행한 결과, 크론병의 육아종에서 유의적인 염색이 일관되게 관찰되었다(도 1C). In addition, as a result of immunohistochemical analysis using intestinal tissues derived from Crohn's disease patients and normal healthy people, significant staining was consistently observed in Crohn's granulomas (FIG. 1C).
따라서 아디포넥틴의 유도가 장 염증에 대한 지표 마커임을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that induction of adiponectin is an indicator of intestinal inflammation.
<실시예 3> 아디포넥틴의 중화가 TNBS에 의해 유도된 대장염 개선 확인Example 3 Confirmation of Improvement of Colitis Induced by TNBS by Neutralization of Adiponectin
아디포넥틴은 인슐린에 대한 민감성을 증진시키고 항염증 작용을 하는 등의 많은 임상적으로 유용한 기능을 가지고 있음이 알려져 있다(Krenning, G., et al., Circ Res 104, 1029-1031, 2009; Kruidenier, L., et al., J Pathol 201, 17-27, 2003).Adiponectin is known to have many clinically useful functions, such as enhancing insulin sensitivity and anti-inflammatory effects (Krenning, G., et al., Circ Res 104, 1029-1031, 2009; Kruidenier, L. , et al., J Pathol 201, 17-27, 2003).
이에, 본 발명자들은 장염증 조건하에서 아디포넥틴의 유도가 자기방어기전이 될 수 있다고 추정하여, 아디포넥틴 유도의 효과를 알아보았다. 구체적으로, TNBS에 의해 유도된 IBD 마우스 모델(n=10)에서 항-마우스 아디포넥틴 다클론 항체와 대조군 항체로서 항-마우스 레지스틴을 복강투여하여 아디포넥틴을 중화시킨 후, IBD의 증세를 육안 및 조직학적으로 관찰하였다. 조직학적 분석의 경우, 조직을 10% 포르말린에 고정시킨 후, 파라핀 조직 절편을 표준 기술을 이용하여 H&E로 염색하였다. Thus, the present inventors estimated that the induction of adiponectin may be a self-defense mechanism under enteroinflammatory conditions, and examined the effect of adiponectin induction. Specifically, neutralizing adiponectin by intraperitoneal administration of anti-mouse adiponectin polyclonal antibody and anti-mouse resistin as a control antibody in an IBD mouse model induced by TNBS (n = 10), and the symptoms of IBD were visually and histologically Observed by. For histological analysis, tissues were fixed in 10% formalin and paraffin tissue sections were stained with H & E using standard techniques.
그 결과, IBD의 증세를 둔화시키지 않았다. 항-마우스 아디포넥틴은 해부학적 및 생리학적인 관점에서 IBD를 현저하게 개선시키는 반면에, 항-마우스 레지스틴 또는 항-마우스 CD137은 IBD에 대한 유의적인 효과를 내지 않았다(도 2A). 이는 아디포넥틴이 IBD의 원인 물질인 것을 제시하는 것이다. As a result, IBD did not slow down. Anti-mouse adiponectin markedly improved IBD from an anatomical and physiological point of view, whereas anti-mouse resistin or anti-mouse CD137 had no significant effect on IBD (FIG. 2A). This suggests that adiponectin is the causative agent of IBD.
또한, TNBS 투여 9일 후 획득한 결장의 현미경 분석 결과, 에탄올을 처리한 마우스로부터 유래한 대조군 결장이 단지 약간의 염증을 보이는데 비해, 현저한 충혈, 괴사 및 염증을 나타내었다(도 2A). In addition, microscopic analysis of colons obtained 9 days after TNBS administration showed significant congestion, necrosis and inflammation, whereas control colons derived from ethanol treated mice showed only slight inflammation (FIG. 2A).
또한, 면역조직학적 분석 결과, TNBS에 의해 유도된 대장염의 결장 절편에서는 만성 염증의 주요 징후로서 면역세포들이 대량으로 침입하나, 항-마우스 아디포넥틴이 이런 침입을 방해하였다(도 2B). 또한, 아디포넥틴의 중화 항체가 투여된 마우스는 투여되지 않은 마우스에 비해 점막 및 점막하층의 증상을 개선시켰다. 즉, 아디포넥틴의 중화 항체로의 처리는 상기 결장에서의 충혈 및 염증 모두를 거의 완벽하게 억제하였다. In addition, immunohistochemical analysis revealed that colonic sections of colitis induced by TNBS invaded large amounts of immune cells as a major sign of chronic inflammation, but anti-mouse adiponectin prevented this invasion (FIG. 2B). In addition, mice administered with neutralizing antibodies of adiponectin improved symptoms of the mucosa and submucosa compared to mice not administered. That is, treatment of adiponectin with neutralizing antibodies almost completely inhibited both hyperemia and inflammation in the colon.
또한, TNBS의 투여 후, 체중의 급격하고 신속한 증가는 대장염의 결과로서 관찰되었으며, 이는 9일 동안 지속된 반면에, 50% 에탄올로 처리된 대조군 마우스는 대장염이 발달하지 않았으며 건강하게 나타났다(도 3A). 그러나, 아디포넥틴의 중화 항체로 처리된 마우스는 체중이 상당히 회복되었다(도 3B). In addition, after administration of TNBS, a rapid and rapid increase in body weight was observed as a result of colitis, which lasted for 9 days, whereas control mice treated with 50% ethanol did not develop colitis and appeared healthy (FIG. 3A). However, mice treated with adiponectin neutralizing antibodies recovered significantly in body weight (FIG. 3B).
과립구의 침입은 장 손상을 악화시키는 IBD의 증거이다(Rovedatti, L., et al. Differential regulation of interleukin-17 and interferon-{gamma} production in inflammatory bowel disease. Gut,.2009). 이에, 호중구 활성 마커인 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase, MPO)의 활성을 측정하였다. Granulocyte invasion is evidence of IBD exacerbating intestinal damage (Rovedatti, L. , et al. Differential regulation of interleukin-17 and interferon- {gamma} production in inflammatory bowel disease. Gut ,. 2009). Thus, the activity of myeloperoxidase (MPO), a neutrophil activity marker, was measured.
구체적으로, MPO의 활성은 다음과 같이 측정하였다. 우선, 결장 시료는 조직학적 검사를 수행한 후 손상에 의해 염증이 생긴 부위로부터 획득하였다. 상기 시료를 혈액 및 다른 오염물질을 제거하기 위해, 즉시 차가운 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 상기 시료를 화학천칭에서 무게를 잰 후, 결장의 말단 절편(150-300 mg)을 1 ml의 차가운 0.5% 헥사데실트리메틸암모니움 브로마이드(hexadecyltrimethyl ammonium bromide)가 포함된 50 mM 인산완충용액(pH 6.0)에 현탁한 다음, 조직 균질기(OMNI GLH-2017; Yamato Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 각각 30초 동안 3번 균질화시켰다. 3번의 냉해동 주기 (Freeze-Thaw Cycle) 후, 균질물을 12,000 g에서 15분 동안 원심분리한 후, 결과물인 상청액(0.1 ml)을 0.2 mg/ml O-디아니시딘 하이드로클로라이드(O-dianisidine hydrochloride)를 포함하는 인산완충용액(2.4 ml, pH 6.0)으로 희석시켰다. 시료를 25℃에서 10분 동안 전배양한 후, 0.5 ml의 0.003% H2O2를 첨가한 다음, 추가적으로 10분 동안 배양하였다. 0.5 ml의 0.1% 아지드화 나트륨(sodium azide)의 첨가에 의해 반응을 중단시킨 후, 분광광도계(DU-640; Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA)를 이용하여 460 nm에서 흡광도를 측정하였다. MPO 활성의 단위는 25℃에서 1분 동안의 1 ㎛ol의 H2O2를 물로 변환하기 위해 요구되는 활성으로 정의하였다. 상기 MPO 활성은 코드화된 튜브를 이용하여 블라인드 방식으로 수행하였다. Specifically, the activity of MPO was measured as follows. First, colon samples were obtained from sites that were inflamed by injury after performing histological examination. The samples were immediately washed with cold PBS (pH 7.4) to remove blood and other contaminants. After weighing the sample on a chemical balance, the terminal sections (150-300 mg) of the colon were weighed with 50 mM phosphate buffer solution (pH 6.0) containing 1 ml of cold 0.5% hexadecyltrimethyl ammonium bromide. ), And then homogenized three times for 30 seconds each using a tissue homogenizer (OMNI GLH-2017; Yamato Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan). After three Freeze-Thaw Cycles, the homogenate was centrifuged at 12,000 g for 15 minutes, and the resulting supernatant (0.1 ml) was 0.2 mg / ml O-dianisidine hydrochloride (O-dianisidine). dilute with phosphate buffer solution (2.4 ml, pH 6.0). Samples were preincubated at 25 ° C. for 10 minutes, then 0.5 ml of 0.003% H 2 O 2 was added and then incubated for an additional 10 minutes. After stopping the reaction by the addition of 0.5 ml of 0.1% sodium azide, the absorbance was measured at 460 nm using a spectrophotometer (DU-640; Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Calif.). . The unit of MPO activity was defined as the activity required to convert 1 μmol of H 2 O 2 to water for 1 minute at 25 ° C. The MPO activity was performed in a blind manner using coded tubes.
그 결과, TNBS로 처리된 군은 MPO 활성이 증가하였으며, 항-아디포넥틴 투여가 상기 활성을 유의적으로 감소시킨 반면에, 항-마우스 레지스틴은 효과가 없는 것으로 나타났다(도 3C).
As a result, the group treated with TNBS showed increased MPO activity, whereas anti-adiponectin administration significantly decreased the activity, whereas anti-mouse resistin was ineffective (FIG. 3C).
<실시예 4> 항아디포넥틴 항체의 장염증 마커 단백질 억제 효능 확인Example 4 Confirmation of Enteroinflammatory Marker Inhibitory Effect of Anti-Adiponectin Antibody
TNBS에 의해 유도된 IBD 또는 크론병은 Th1 면역반응에 의해 매개된다. 항-아디포넥틴에 의해 매개되는 IBD의 제거가 염증 감소에 의해 수반되는지 알아보기 위해, 다양한 염증 마커의 발현을 조사하였다. 구체적으로, 대조군, TNBS만 처리한 군, TNBS와 항-아디포넥틴을 처리한 군, 및 TNBS와 항-레지스틴(마우스-레지스틴)을 처리한 군의 각각의 결장을 TNF-α(R & D Systems, Minneapolis, MN), IL-1β(R & D Systems, Minneapolis, MN) 및 ICAM-1에 대한 면역조직화학적 염색을 이용하여 발현 수준을 분석하였다. 면역조직분석은 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 수행하였다.IBD or Crohn's disease induced by TNBS is mediated by a Th1 immune response. To determine if the removal of IBD mediated by anti-adiponectin is accompanied by inflammation reduction, the expression of various inflammatory markers was examined. Specifically, each colon of the control group, the TNBS-only group, the TNBS and anti-adiponectin-treated group, and the TNBS and anti-resistin (mouse-resistin) -treated group were treated with TNF-α (R & D Systems, Expression levels were analyzed using immunohistochemical staining for Minneapolis, MN), IL-1β (R & D Systems, Minneapolis, MN) and ICAM-1. Immunohistolysis was performed in the same manner as in <Example 2>.
그 결과, TNBS로 처리된 마우스의 장에서는 TNF-α, IL-1β 및 ICAM-1이 현저하게 발현되었으며, 항-아디포넥틴이 이들 발현을 현저하게 억제하였다. 그러나, 항-레지스틴은 이들 발현을 차단하지 못하였다(도 4). As a result, TNF-α, IL-1β and ICAM-1 were remarkably expressed in the intestine of mice treated with TNBS, and anti-adiponectin remarkably suppressed these expressions. However, anti-resistin did not block these expressions (FIG. 4).
따라서 아디포넥틴이 IBD를 유발하는 병원성 단백질임을 알 수 있었다.
Thus, it was found that adiponectin is a pathogenic protein that causes IBD.
<실시예 5> 아디포넥틴의 미성숙 수지상세포의 공동자극분자의 발현증가 효능 확인Example 5 Confirmation of Increased Expression of Co-stimulatory Molecules of Immature Dendritic Cells of Adiponectin
수지상세포(DC)는 CD4+ T 세포의 운명인 활성, 증식 또는 면역관용의 유도를 결정하는 중요한 면역 작동자임이 알려져 있다(Kanai, T., et al., Curr Opin Gastroenterol 25, 306-313, 2009; Banchereau, et al., Nature 392, 245-252, 1998; Moser, M. & Murphy, et al., Nat Immunol 1, 199-205, 2000).Dendritic cells (DC) are known to be important immune effectors that determine the induction of activity, proliferation, or immune tolerance that is the fate of CD4 + T cells (Kanai, T. , et al., Curr Opin Gastroenterol 25, 306-313, 2009; Banchereau, et al., Nature 392, 245-252, 1998; Moser, M. & Murphy, et al.,
이에, 본 발명자들은 아디포넥틴이 IBD을 유발하는 작용 기전을 알아보기 위해, 내장지방세포에 의해 발현되는 아디포넥틴이 DC의 생리학적 특성을 조절하는 것으로 가정하여, 아디포넥틴의 DC의 생리기능에 미치는 영향을 알아보았다. 상업적으로 구매한 삼량체의 아디포넥틴 뿐만 아니라 제조된 두 종류의 아디포넥틴 단백질(박테리아 또는 포유류 세포에서 발현되는 형태인 전장 단백질, 및 구형 도메인)로 처리된 DC의 다양한 파라미터를 측정하였다. LPS 농도는 Cambrax endotoxin measuring kit를 이용하여 측정하였다. 인간 성숙 수지상세포(mDC)는 단핵구로부터 구별하여 분석하였다. Accordingly, the present inventors assume that adiponectin expressed by visceral adipocytes modulates the physiological characteristics of DC in order to examine the mechanism of action of adiponectin inducing IBD, and thus the effect of adiponectin on the physiological function of DC saw. Various parameters of DCs treated with commercially purchased trimer adiponectin as well as two types of adiponectin proteins produced (full length protein in the form expressed in bacteria or mammalian cells, and spherical domain) were measured. LPS concentrations were measured using a Cambrax endotoxin measuring kit. Human mature dendritic cells (mDCs) were analyzed separately from monocytes.
그 결과, 상업적으로 구매한 아디포넥틴 뿐만 아니라 제조된 아디포넥틴의 LPS의 농도는 0.3EU 이하거나 검출되지 않았다. 모든 아디포넥틴 단백질은 mDC의 식세포 작용 또는 증식에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 미성숙 수지상세포(iDC)는 시험관내에서 발현된 아디포넥틴을 처리된 경우, 유의적인 상동 세포 클로스터링을 관찰할 수 있었으나, 구형 아디포넥틴의 경우 관찰되지 않았다. 또한, 2개의 상업적으로 구매한 아디포넥틴은 잠재적으로 상동 클러스터링을 나타낼 수 있었는데, 전장의 삼량체 아디포넥틴이 상대적으로 보다 약한 클러스터링을 나타내었다. 대조군으로서 LPS는 10 ng/ml 보다 낮은 유의적인 상동 클러스터링을 유도할 수 있었다(도 5). As a result, the concentration of LPS of the adiponectin prepared as well as the commercially purchased adiponectin was less than 0.3EU or not detected. All adiponectin proteins did not affect phagocytosis or proliferation of mDCs. However, immature dendritic cells (iDCs) were able to observe significant homologous cell clotting when treated with in vitro expressed adiponectin, but not with spherical adiponectin. In addition, two commercially available adiponectins could potentially exhibit homologous clustering, with full length trimer adiponectin showing relatively weaker clustering. As a control, LPS was able to induce significant homology clustering lower than 10 ng / ml (FIG. 5).
또한, mDC의 다양한 면역학적 지표가 아디포넥틴 처리에 의해 영향을 받지 않기 때문에, 미성숙 DC(iDC)가 아디포넥틴에 반응하는지 알아보기 위해, 미성숙 DC의 공동자극분자의 발현정도를 유세포분석을 통해 확인하였다.In addition, since various immunological indicators of mDC are not affected by adiponectin treatment, the expression level of co-stimulatory molecules of immature DCs was confirmed by flow cytometry to determine whether immature DCs (iDCs) responded to adiponectin.
그 결과, 전장 아디포넥틴은 인간 iDC로부터 성숙을 유도하는 CD83, CD86 및 HLA-DR의 유도를 상당히 증가시킨 반면에, 구형 아디포넥틴은 상기 단백질을 유도하지 않았다. 아디포넥틴에 의한 성숙 정도는 LPS에 의한 것과 유사하였다. 또한, 상업적으로 구매한 아디포넥틴은 CD83, CD86 및 HLA-DR의 유도를 현저하게 유발시켰다(도 6).
As a result, full length adiponectin significantly increased the induction of CD83, CD86 and HLA-DR leading to maturation from human iDCs, while spherical adiponectin did not induce the protein. The degree of maturation by adiponectin was similar to that by LPS. In addition, commercially available adiponectin significantly induced the induction of CD83, CD86 and HLA-DR (FIG. 6).
<실시예 6> 아디포넥틴의 T 세포 증식 효능 확인Example 6 Confirmation of T Cell Proliferation Efficacy of Adiponectin
IDO(Indoleamine 2, 3-dioxygenase)는 CD4+ T 세포 기능의 조절과 관련된 mDC에 의해 발현된다(Braun, D., et al., Blood 106, 2375-2381, 2005).IDO (
IDO에 대한 아디포넥틴의 영향을 상기 <실시예 5>와 같이 면역 블랏 분석을 이용하여 조사한 결과, 전장 아디포넥틴만이 IDO를 현저하게 증가시켰다(도 7A 및 도 7B). 또한, 대조군으로서, LPS, CD40L, CpG 및 TNF-α와 같은 다양한 활성제 역시 예상한 바와 같이(Hwang, S.L., et al., Cell Res 15, 167-175, 2005; Mellor, A.L., et al., J Immunol 175, 5601-5605, 2005), IDO를 유도하였다. The effect of adiponectin on IDO was investigated using immunoblot analysis as in <Example 5>, and as a result, only full-length adiponectin significantly increased IDO (FIGS. 7A and 7B). In addition, as a control, various active agents such as LPS, CD40L, CpG and TNF-α were also expected (Hwang, SL, et al., Cell Res 15, 167-175, 2005; Mellor, AL , et al., J Immunol 175, 5601-5605, 2005), induced IDO.
이에, 본 발명자들은 아디포넥틴이 처리된 iDC가 동종의 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR)에서 mDC로서 효율적으로 T 세포 증식을 유도할 수 있을 것으로 가정하여 이를 알아보았다. Thus, the present inventors have assumed that adiponectin-treated iDCs can efficiently induce T cell proliferation as mDCs in a homogeneous mixed lymphocyte reaction (MLR).
구체적으로, iDC와 동종의 혼합된 림프구 반응은 다음과 같이 측정하였다. DC의 표현형적 분석을 통해, LPS에 의해 성숙되는 것을 알 수 있다. 새롭게 분리된 CD14+ 단핵구(5 x 105 cells/ml)를 GM-CSF(100 ng/ml) 및 IL-4(500 U/ml)의 존재 하에서 배양하였다. 배양 5일 후, 세포를 추가적으로 전장 재조합 아디포넥틴(20 ㎍/ml)(AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), 구형 도메인(globular domain) 아디포넥틴(10 ㎍/ml) 또는 레지스틴(Resistin)(1 ㎍/ml)의 존재 하에서 48시간 동안 GM-CSF, IL-4 및 LPS와 함께 배양하였다. DC 마커(CD1a, CD86), 공동자극분자(CD86, CD80 및 CD40) 및 기타 분자(HLA-DR)의 발현을 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다. LPS로 처리된 DC에 대한 항원의 발현은 사이토카인이 상대적으로 변하지 않는 것을 나타낸다. LPS로 처리된 DC(빨간색 라인), LPS와 전장 아디포넥틴이 함께 처리된 DC(파란색 라인), LPS와 구형 도메인 아디포넥틴이 함께 처리된 DC(보라색 라인), 레지스틴의 존재 하에 LPS로 처리된 DC(녹색 라인)를 각각 확인하였다. MFI(mean fluorescence intensity)는 평균 형광 강도를 나타내었다. 단핵구 유래 DC는 CD14+ 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF와 배양함으로써 제조하였다. IL-4 및 GM-CSF는 3일마다 공급하였다. 전장 아디포넥틴(10 ug/mml) 및 구형 도메인 아디포넥틴(2.5 ug/ml)은 배양 0일째에 첨가하였다. 배양 6일째에 DC를 48시간 동안 LPS(100 ng//ml)로 자극시켰다. 다양한 비율(1:10 내지 1:640)의 APC/T 세포를 37℃에서 5일 동안 105개의 동종이계 T 세포와 함께 96 웰 플레이트에서 3배로 배양하였다. DNA 합성은 배양기간 동안 마지막 18시간 동안 첨가된 [3H]-티미딘([3H]-TdR 0.5 uCi/well; Amersham, Buckinghamshire, UK)의 결합을 통해 측정하였다. 세포를 자동화된 세포 채취기(LKB Wallac, Turku, Finland)에 의해 유리 섬유 필터매트로 채취하였고, [3H]-TdR의 결합은 액체섬광분광학(liquid scintillation spectroscopy)에 의해 결정하였다. LPS로 자극된 단핵구 유래 DC는 다양한 농도의 아디포넥틴의 존재 하에서 동종이계의 T 세포와 함께 배양하였다. DC는 5일 동안 동종이계 T 세포와 함께 배양하였다. 그런 다음, T 세포 증식은 [3H]-티미딘 결합에 의해 결정하였다. 결과는 평균 [3H]-티미딘 결합 ± SD로 나타내었다. Specifically, the mixed lymphocyte response homogeneous with iDC was measured as follows. Phenotypic analysis of DCs reveals maturation by LPS. Freshly isolated CD14 + monocytes (5 × 10 5 cells / ml) were incubated in the presence of GM-CSF (100 ng / ml) and IL-4 (500 U / ml). After 5 days of culture, cells were additionally added to full length recombinant adiponectin (20 μg / ml) (AdipoGen, Inc., Seoul, Korea), globular domain adiponectin (10 μg / ml) or resistin (1 μg / ml). incubated with GM-CSF, IL-4 and LPS for 48 hours in the presence of ml). Expression of DC markers (CD1a, CD86), costimulatory molecules (CD86, CD80 and CD40) and other molecules (HLA-DR) were confirmed using flow cytometry. Expression of the antigen against DCs treated with LPS indicates that the cytokine is relatively unchanged. DC treated with LPS (red line), DC treated with LPS and full-length adiponectin (blue line), DC treated with LPS and spherical domain adiponectin (purple line), DC treated with LPS in the presence of resistin (green Lines), respectively. Mean fluorescence intensity (MFI) showed the mean fluorescence intensity. Monocyte derived DCs were prepared by incubating CD14 + monocytes with IL-4 and GM-CSF. IL-4 and GM-CSF were fed every 3 days. Full length adiponectin (10 ug / mml) and spherical domain adiponectin (2.5 ug / ml) were added on
통계적 분석은 다음과 같이 수행하였다. 데이타는 일원분산분석(one way analysis of variance)에 의해 분석하였다. p<0.05는 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 분석은 SPSS 통계학적 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago)를 사용하여 수행하였다. Statistical analysis was performed as follows. Data was analyzed by one way analysis of variance. p <0.05 was determined to be significant. The analysis was performed using SPSS statistical software (SPSS Inc., Chicago).
그 결과, LPS 처리된 DC(mDC) 뿐만 아니라 아디포넥틴이 처리된 iDC 역시 MLR에서 T 세포를 현저하게 증식시켰다(도 8). As a result, not only LPS-treated DCs (mDCs) but also adiponectin-treated iDCs proliferated T cells remarkably in MLR (FIG. 8).
따라서, 아디포넥틴은 iDC를 mDC로 분화하여 T 세포 증식을 유발하고, LPS, CD40L, CpG 및 TNF-α와 같은 공동 자극 분자의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있다.
Thus, it can be seen that adiponectin differentiates iDCs into mDCs, induces T cell proliferation and increases the expression of co-stimulatory molecules such as LPS, CD40L, CpG and TNF-α.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 아디포넥틴(adiponectin)을 이용하여 육아종 진단 방법 개발, 및 미성숙 수지상세포의 활성화 또는 분화 촉진제 개발에 사용될 수 있으며, 아디포넥틴 억제제를 이용하여 염증성 대장 질환 예방 및 치료제 및 치료 방법 개발에 사용될 수 있다.As can be seen from the above, the present invention can be used for the development of granulomatous diagnosis method using adiponectin, and the development or activation of differentiation of immature dendritic cells, and a method for preventing and treating inflammatory bowel disease using adiponectin inhibitor. Can be used for development.
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Claims (15)
A pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory bowel disease (IBD) containing an antibody that specifically binds to an adiponectin protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
2) 상기 조직 또는 이의 절편에서 표지를 검출하는 단계; 및
3) 상기 표지가 정상의 대조군에 비해 유의적으로 검출되는 부위를 육아종(granuloma)인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 육아종 진단 방법.
1) treating an anti-adiponectin antibody conjugated with a label to visceral tissues or fragments thereof derived from mammals other than humans;
2) detecting the label in the tissue or fragment thereof; And
3) granuloma diagnosis method comprising the step of determining that the label is detected granuloma significantly compared to the normal control group.
The method of claim 5, wherein the labeling material of step 1) is any one selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, luminescent materials and radioisotopes.
The method according to claim 5, wherein the detection of step 2) is performed by fluorescence immunoassay (FIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (RIA). enzyme immunoassay (EIA) and luminescence immunoassay (LIA).
2) 상기 인간을 제외한 포유류를 스캐닝하여 표지물질를 영상화하는 단계; 및
3) 상기 영상화 결과, 정상의 대조군에 비해 유의적으로 표지물질이 축적된 부위를 육아종인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 육아종 진단 방법.
1) administering an anti-adiponectin antibody conjugated with a label to the intestine of a mammal except human;
2) imaging a label by scanning a mammal other than the human; And
3) granulation species diagnosis method comprising the step of determining that the site of the labeling material is significantly granulated compared to the normal control results.
9. The method of claim 8, wherein the labeling material of step 1) is a radioisotope or contrast agent.
The method of claim 8, wherein the imaging of step 2) comprises radioactive isotope (Positron Emission Tomography, PET), contrast medium magnetic resonance imaging (MRI), X-ray imaging Or Computed Tomography (CT).
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