KR100957775B1

KR100957775B1 - 신규 ３하이드록시부티레이트ｍｃｌ３하이드록시알카노에이트락테이트 삼중합체 및 그제조방법

Info

Publication number: KR100957775B1
Application number: KR1020060115163A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 이상현; 이은정; 강혜옥; 김태완; 양택호; 박시재
Original assignee: 주식회사 엘지화학; 한국과학기술원
Priority date: 2006-11-21
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2026-11-21
Also published as: KR20080045909A; CN101616954B; CN101616954A

Abstract

본 발명은 신규한 3-하이드록시부티레이트- 중간사슬길이(medium chain length, MCL) 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)] 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 이용하여 제조된 락테이트, 3-하이드록시부티레이트 및 MCL 3-하이드록시알카노에이트의 단량체로 이루어진 신규 삼중합체(3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체)를 제조하는 방법 및 신규 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신규 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트는 생분해성 고분자로서 종래 합성 플라스틱의 용도를 대체할 수 있으며, 의료용으로도 사용이 가능하다.

락테이트, MCL 3-하이드록시알카노에이트

Description

신규 ３하이드록시부티레이트ＭＣＬ３하이드록시알카노에이트락테이트 삼중합체 및 그 제조방법{Novel Copolymer of [poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)] and Method for Preparing the Same }

도 1은 PHA 합성효소와 CP-PCT가 함께 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 나타낸 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 PHA 합성효소 유전자와 CP-PCT 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pPs619C1300-CPPCT의 계열지도를 나타낸 것이다.

도 3은 Ralstonia eutropha의 phaA와 phaB 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pMCS104ReAB의 계열지도를 나타낸 것이다

도 4는 pPs619C1300-CPPCT 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균에 의해 생합성된 삼중합체의 성분을 분석한 가스크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.

발명의 분야

본 발명은 신규한 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)] 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 이용하여 제조된 락테이트, 3-하이드록시부티레이트 및 MCL 3-하이드록시알카노에이트의 단량체로 이루어진 신규 삼중합체(3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체)를 제조하는 방법 및 신규 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체에 관한 것이다.

발명의 배경

락테이트를 단량체로하는 중합체인 폴리락테이트(PLA)는 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 사슬 커플링제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 사슬 커플링제를 이용하기 때문에 고분자 량의 PLA를 제조하는 방법은 유기용제나 커플링제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되어있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드(lactide)로 전환한 다음, 락타이드 링의 개환축합반응을 통해 PLA를 합성하는 화학합성 방법이 사용되고 있다.

한편, PHA는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.

기존에 알려진 PHA는 대표적으로 짧은 탄소수를 가진 SCL-PHA (short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가진 MCL-PHA (medium-chain-length PHA)로 나눌 수 있다. PHA를 합성하는 효소의 유전자는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas 등으로부터 분리되었으며, 상기 PHA를 합성하는 효소 유전자가 형질전환된 재조합 미생물을 통해 다양한 종류의 단량체로 구성된 PHA가 합성되었다 (Qi et al., FEMS Microbiol . Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol . Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol . Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624).

미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(synthase)가 필수적이다. PHA 합성효소는 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA) 를 기질로 사용하여 PHA를 합성하며, PHA의 기질인 하이드록시아실-CoA를 제공할 수 있는 효소로는 Ralstonia eutropha 등으로부터 유래된 α-케토티올레이즈(PhaA), 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈(acetoacetyl-CoA reductase: PhaB), Pseudomonas로부터 유래된 3-하이드록시데카노일-ACP:CoA 트랜스퍼레이즈(3-hydroxydecanoyl-ACP:CoA transferase: PhaG), Aeromonas caviae와 Pseudomonas aeruginosa로부터 유래된 (R)특이적 에놀-CoA 하이드라테이즈[(R)-specific enoyl-CoA hydratase: PhaJ] (Fukui et al., J. Bacteriol., 180:667, 1998; Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000), 대장균과 Pseudomonas aeruginosa 등으로부터 유래된 3-케토아실-ACP 리덕테이즈(3-ketoacyl-ACP reductase: FabG) 등이 알려져 있다 (Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol., 182:2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 2002).　이러한 효소들을 이용하여 다양한 탄소위치(주로 3, 4, 5, 6번 위치)에 하이드록실레이션된 하이드록시알카노에이트를 이용하여 다양한 종류의 PHA를 합성해 왔다.

하지만 2번 위치가 하이드록실레이션된 하이드록시알카노에이트에 대한 PHA 합성효소의 반응성은 거의 없는 것으로 보고되어 있다 (Zhang et al., Appl . Microbiol . Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994). 현재까지 락틸-CoA에 대한 PHA 중합효소의 in vitro 활성측정을 통해 PHA 합성효소의 락틸-CoA에 대한 반응성을 분석한 보고가 있었으나, 락틸-CoA에 대한 PHA 합성효소의 반응성은 매우 미약하다 (Zhang et al., Appl . Microbiol . Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl . Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994). 즉, 2번-탄소위치가 하이드록실레이션된 락테이트와 같은 하이드록시알카노에이트는 PHA 합성효소의 기질특이성에 적합하지 않아, 자연적으로 혹은 재조합 세포나 식물을 이용하여 PHA 및 그 삼중합체를 제조한 예는 없다.

이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 고분자량의 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체를 제조하고자 예의 노력한 결과, 락테이트를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로, 3-하이드록시알카노에이트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자인 Clostridium propionicum 유래 프로피놀-CoA 트랜스퍼라아제(propionyl-CoA transferase) 유전자(pct) 및 PHA 합성효소의 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 배양하는 것에 의하여, 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체가 생성되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.　

본 발명의 목적은 신규 중합체인 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카 노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]의 제조방법을 제공하데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락테이트, 3-하이드록시부티레이트 및 MCL 3-하이드록시알카노에이트를 반복단위로 함유하는 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체 [poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 MCL 3-하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시헥사노에이트(3-hydroxyhexanoate, 3HHx), 3-하이드록시헵타노에이트(3-hydroxyheptanoate, 3HHp), 3-하이드록시옥타노에이트(3-hydroxyoctanoate, 3HO), 3-하이드로노나노에이트(3-hydrononanoate, 3HN); 3-하이드록시데카노에이트(3-hydroxydecanoate, 3HD), 3-하이드록시운데칸노에이트( 3-hydroxyundecanoate, 3HUD) 및 3-하이드록시도데카노에이트(3-hydroxydodecanoate, 3HDD)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시 알카노에이트-락테이트 삼중합체 [poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 세포 또는 식물은 PHA 합성효소 유전자를 가지지 않는 세포 또는 식물을 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자 및 PHA 합성효소 유전자로 형질전환하여 수득되는 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자는 Pseudomonas sp. 6-19 유래의 phaC1_ps6 _-19인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열에서 E130D, S325T 및 Q481M가 변이된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 또는 식물은 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하 는 효소의 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소는 α-케토티올레이즈(PhaA) 또는 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈(acetoacetyl-CoA reductase: PhaB)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 미생물인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배양 또는 재배는 3-하이드록시알카노에이트 를 함유하는 환경에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)] 생성능을 가지는 세포 또는 식물은 (i) 상기 두 유전자를 모두 가지지 않는 세포 또는 식물을 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자와 lactyl-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자로 형질전환하여 수득되거나, (ii) lactyl-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 세포 또는 식물을 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자로 형질전환하여 수득되거나, 또는 (iii) 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록 시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자를 가지는 세포 또는 식물을 lactyl-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자로 형질전환하여 수득되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 MCL 3-하이드록시알카노에이트는 탄소의 개수가 6~12개의 하이드록시알카노에이트를 사용하는 것이 바람직하며, 보다 구체적으로는 3-하이드록시헥사노에이트(3-hydroxyhexanoate, 3HHx), 3-하이드록시헵타노에이트(3-hydroxyheptanoate, 3HHp), 3-하이드록시옥타노에이트(3-hydroxyoctanoate, 3HO), 3-하이드로노나노에이트(3-hydrononanoate, 3HN); 3-하이드록시데카노에이트(3-hydroxydecanoate, 3HD), 3-하이드록시운데칸노에이트( 3-hydroxyundecanoate, 3HUD) 및 3-하이드록시도데카노에이트(3-hydroxydodecanoate, 3HDD) 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 세포 또는 식물은 pct 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환되고, 동시에 phaC를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 phaC가 염색체 상에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, lactyl-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는 phaC인 것을 특징으로 할 수 있고, pct 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환되고, 동시에 phaC를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 phaC가 염색체 상에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 세포로는 다양한 미생물이 알려져 있다 (KR 10-250830 B1). 예를 들면, Achromobacter sp., Achromobacter xylosoxidans 등을 포함하는 Achromobacter 속 미생물들, Acidovorax delafieldii, Acidovax facilis, Acinetobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii 등을 포함하는 Acinetobacter 속 미생물들, Actinomyces sp., Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida 등을 포함하는 Aeromonas 속 미생물들, Alcaligenes aestus, Alcaligenes denitrificans, Alcaligenes eutrophus (Ralstonia eutropha로 재명명된 후 다시 Wautersia eutropha로 재명명됨), Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Alcaligenes pacificus Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes venestus 등을 포함하는 Alcaligenes 속 미생물들, Alteromonas macleodii, Amoebobacter roseu, Amoebobacter pendens 등을 포함하는 Amoebobacter 속 미생물들, Aphanocapa sp., Aphanothece sp. Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium caulinodans, Azospirillum sp., Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum 등을 포함하는 Azospirillum 속 미생물들, Azotobacter sp., Azotobacter agilis, Azotobacter chroococcum, Azotobacter macrocytogenes, Azotobacter vinelandii 등을 포함하는 Azotobacter 속 미생물들, Bacillus anthracis , Bacillus cereus , Bacillus megaterium , Bacillus subtillus, Bacillus thuringiensis 등을 포함하는 Bacillus 속 미생물들, Beggiatoa sp., Beggiatoa alba 등을 포함하는 Beggiatoa 속 미생물들, Beijerinckia indicus , Beijerinckia mobilis 등을 포함하는 Beijerinckia 속 미생물들, Beneckia natrigens , Beneckea pelagia 등을 포함하는 Beneckea 속 미생물들, Bordetella pertussis , Bradyrhizobium japonicum , Caryophamon latum , Caulobacter bacteroides, Caulobacter crescentus 등을 포함하는 Caulobacter 속 미생물들, Chloroflexus aurantiacus, Chlorogloea fritschii 등을 포함하는 Chlorogloea 속 미생물들, Chromatium minutissimum, Chromatium okenii , Chromatium tepidum 등을 포함하는 Chromatium 속 미생물들, Chromobacterium violaceum 등을 포함하는 Chromobacterium 속 미생물들, Clostridium botulinum, Clostridium sphenoides 등을 포함하는 Clostridium 속 미생물들, Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni 등을 포함하는 Comamonas 속 미생물들, Corynebacterium autotrophicum, Corynebacterium hydrocarboxydans 등을 포함하는 Corynebacterium 속 미생물들, Cyanobacteria, Derxia gummosa를 포함하는 Derxia 속 미생물들, Desulfococcus multivorans , Desulfonema limicola , Desulfonema magnum 등을 포함하는 Desulfonema 속 미생물들, Desulfosacina variabilis , Desulfovibrio sapovorans , Ectothiorhodospira halochloris , Ectothiorhodospira mobilis , Ectothiorhodospira vacuolata 등을 포함하는 Ectothiorhodospira 속 미생물들, Ferrobacillus ferroxidans , Flavobacterium sp., Haemophilus influenzae , Halobacterium gibbonsii, Halobacterium volcanii 등을 포함하는 Halobacterium 속 미생물들, Haloferax mediterranei, Hydroclathratus clathratus , Hydrogenomonas facilis , Hydrogenophaga flava , Hydrogenophaga pseudoflava , Hydrogenophaga taeniospiralis 등을 포함하는 Hydrogenophaga 속 미생물들, Hyphomicrobium vulgare를 포함하는 Hyphomicrobium 속 미생물들, Ilyobacter delafieldii, Labrys monachus , Lamprocystis reseopersicina , Lampropedia hyalina , Legionella sp., Leptothrix discophorus , Methylobacterium AM1, Methylobacterium extorquens 등을 포함하는 Methylobacterium 속 미생물들, Methylococcus thermophilus , Methlocystis parvus , Methylomonas methanica, Methylosinus sporium , Methylosinus trichosporium 등을 포함하는 Methylosinus 속 미생물들, Methylovibrio soehngenii , Micrococcus denitrificans , Micrococcus halodenitrificans 등을 포함하는 Micrococcus 속 미생물들, Mycobacterium album , Mycobacterium vacae 등을 포함하는 Mycobacterium 속 미생물들, Nitrobacter agilis , Nitrobacter winogradskyi 등을 포함하는 Nitrobacter 속 미생물들, Nocardia alba , Nocardia asteroides , Nocardia lucida , Nocardia rubra 등을 포함하는 Nocardia 속 미생물들, Paracoccus dentrificans , Oscillatoria limosa , Penicillium cyclopium, Photobacterium mandapamensis , Photobacterium phosphoreum 등을 포함하는 Photobacterium 속 미생물들, Physarum ploycephalum와 Pseudomonas glathei , Pseudomonas indigofera, Pseudomonas lemonieri , Pseudomonas mallei , Pseudomonas marina , Pseudomonas mixta, Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas oxalaticus , Pseudomonas pseudoalcaligenes , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas alcaligenes , Pseudomonas asplenii , Pseudomonas butanovora, Pseudomonas cepacia , Pseudomonas coronafaciens , Pseudomonas dacunhae , Pseudomonas denitrificans , Pseudomonas diminuta , Pseudomonas echinoides , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida , Pseudomonas rubrilineas , Pseudomonas saccharophila , Pseudomonas stutzeri , Pseudomonas syringae , Pseudomonas thermophilus , Pseudomonas viridiflava 등을 포함하는 Pseudomonas 속 미생물들, Ralstonia 속 미생물들, Rhizobium hedysarum , Rhizobium lupini , Rhizobium meliloti , Rhizobium phaseoli , Rhizobium trifoli 등을 포함하는 Rhizobium 속 미생물들, Rhodobacillus 속 미생물들, Rhodobacter capsulatus , Rhodobacter sphaeroides 등을 포함하는 Rhodobacter 속 미생물들, Rhodococcus rhodochrous를 포함하는 Rhodococcus 속 미생물들, Rhodocyclus gelatinosus , Rhodocyclus tenuis 등을 포함하는 Rhodocyclus 속 미생물들, Rhodomicrobium vannielii 와 Rhodopseudomonas acidophila , Rhodopseudomonas capsulata 등을 포함하는 Rhodopseudomonas 속 미생물들, Rhodospirillum molischianum, Rhodospirillum rubrum 등을 포함하는 Rhodospirillum 속 미생물들, Sphingomonas paucimobilis, Spirillum itersomii , Spirillum serpens 등을 포함하는 Spirillum 속 미생물들, Spirulina jenneri, Spirulina maxima , Spirulina subsaksa 등을 포함하는 Spirulina 속 미생물들, Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus xylosus 등을 포함하는 Staphylococcus 속 미생물들, Stella humosa , Stella vacuolata 등을 포함하는 Stella 속 미생물들, Streptomyces antibioticus , Streptomyces coelicolor 등을 포함하는 Streptomyces 속 미생물들, Syntrophomonas wolfei , Thermophilic cyanobacteria , Thermus thermophilus, Thiobacillus A2, Thiobacillus acidophilus , Thiobacillus versutus 등을 포함하는 Thiobacillus 속 미생물들, Thiocapsa pfennigii 등을 포함하는 Thiocapsa 속 미생물들, Thiocystis violacea, Vibrio parahaemolyticus, Xanthobacter autotrophicus , Xanthomonas maltophilia, Zoogloea ramigera 등을 포함하는 Zoogloea 속 미생물 등이 있다.

본 발명에서 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물은 3-하이드록시알카노에이트를 포함하는 환경에서 배양 또는 재배하여 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체 [poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]를 제조할 수 있으며, 글루코오스나 시트릭산 등의 다른 탄소원으로부터 락테이트, 3-하이드록시부티레이트 및 MCL 3-하이드록시알카노에이트를 생합성 할 수 있는 세포 또는 식물이라면 별도로 첨가하지 않아도 상기 삼중합체를 제조할 수 있다.

본 발명의 전환효소의 유전자 및 합성효소의 유전자를 함유하는 식물체를 제조하기 위한, 식물체의 형질감염은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질감염된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(pre-culture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동배양하여 형질감염시키는 단계; (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러 스를 수득하는 단계; 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.　

본 발명에서 이용가능한 형질감염 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: pct 유전자 및 PHA 유전자를 함유한 재조합 플라스미드의 제작

3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-4-hydroxybutyrate-co-lactate)]를 제조하기 위하여 pct 유전자와 PHA 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pPs619C1300-CPPCT를 제작하였다.

(1) pPs619C1300-CPPCT 플라스미드의 제작

pct 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제(pronpionyl-CoA transferase: CP-PCT) 유전자를 사용하였으며, PHA 합성효소 유전자는 슈도모나스 6-10( Pseudomonas sp. 6-19)의 PHA 합성효소 유전자를 사용하였다.

도 1과 같이 PHA 합성효소(synthase)와 CP-PCT가 함께 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 구축하였다. CP-PCT의 경우 발현 시에 숙주 미생물에 대하여 강한 독성을 나타낸다고 알려져 있으며, 일반적으로 재조합 단백질 발현에 널리 사용되는 tac이나 T7 프로모터를 사용한 IPTG 발현유도 시스템에서는 발현유도 물질 첨가와 동시에 재조합 미생물이 모두 사멸한다. 이 때문에 약하게 발현되지만 미생물 성장에 따라 지속적으로 발현되는 항시적 발현되는 시스템을 사용하였다. CP-PCT 유전자는 Chostridium propionicum(DSMZ1682) 의 염색체 DNA를 주형으로 하고, pct 유전자 시퀀스(Selmer et al., Eur J Biochem ., 269:372, 2002)에 기반하여 제작된 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 획득하였다.

서열번호 1: 5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA

서열번호 2: 5-gctctagattaggacttcatttccttcagacccattaagccttctg

이 때, 원래 야생형의 CP-PCT에 존재하는 NdeI 제한효소 부위를 클로닝의 용이성을 위하여 SDM방법을 이용하여 제거하였다. 또, SbfI/NdeI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 3과 4의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.

서열번호 3: 5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3

서열번호 4: 5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3

Pseudomonas sp. 6-19(KCTC11027BP) 유래 PHA 합성효소(phaC1_Ps6 _-19) 유전자를 분리하기 위해 Pseudomonas sp. 6-19의 전체 DNA를 추출하고, phaC1_Ps6 _-19 유전자 시퀀스 (송애진, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)에 기반한 서열번호 5과 6의 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하고, PCR을 수행하여 phaC1_Ps6 _-19유전자를 수득하였으며, phaC1_Ps6 _-19유전자의 염기서열을 서열번호 7에 나타내었고, 이로부터 계산된 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타내었다.

서열번호 5: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3

서열번호 6: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3

상기 수득한 phaC1_Ps6 _-19유전자를 pBluescript II(Stratagene Co., USA)의 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1 재조합 벡터를 제조하였다. BstBI/SbfI 인식부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함된 phaC1_Ps6 _-19합성효소 유전자 절편을 만들기 위해 우선 내재하고 있는 BstBI 위치를 SDM(site directed mutagenesis) 방법으로 아미노산의 변환 없이 제거하였고, BstBI/SbfI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 9과 10, 서열번호 11와 12, 서열번호 13과 14의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.

서열번호 9: 5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3

서열번호 10: 5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3

서열번호 11: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3

서열번호 12: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3

서열번호 13: 5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3

서열번호 14: 5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3

아미노산 서열 배열분석을 통해 phaC1_Ps6 _-19합성효소의 SCL(short-chain-length PHA) 합성활성에 영향을 미치는 아미노산 위치 3 곳(130, 325, 481)을 찾은 다음, 서열번호 15/16, 서열번호 17/18 및 서열번호 19/20의 프라이머를 이용하여, SDM 방법으로 phaC1_Ps6 _-19합성효소의 아미노산 서열 중 E130D, S325T 및 Q481M가 변이된 변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 pPs619C1300를 제작하였다 (표 1).

phaC1_Ps6 _-19합성효소 변이체

재조합 벡터	핵산 치환	아미노산 치환	프라이머
pPs619C1300	GAA →GAT	E130D	서열번호 15/16
	AGC →ACC	S325T	서열번호 17/18
	CAG →ATG	Q481M	서열번호 19/20

서열번호 15: 5- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3

서열번호 16: 5- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3

서열번호 17: 5- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3

서열번호 18: 5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3

서열번호 19: 5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3

서열번호 20: 5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3

상기 제작된 pPs619C1300벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여, 상기 클로닝한 CP-PCT 유전자를 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 제작하였다 (도 2).

(2) pMCS104ReAB의 제작

R. eutropha 유래의 α-케토티올레이즈(PhaA), 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈(acetoacetyl-CoA reductase: PhaB)를 제공하는 플라스미드 pMCS104ReAB를 제작하였다(박시재, PhD thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2003). pSYL105(Lee et al. Biotechnol . Bioeng . 44: 1337, 1994) 를 PstI 으로 절단해 수득한 phaAB 유전자를 PstI으로 절단한 p10499A (Park et al., FEMS Microbiol . Lett., 214:217, 2002)에 삽입하여, p10499PhaAB를 제작하였다. 상기 p10499PhaAB 플라스미드를 SspI으로 절단해 104 프로모터와 phaAB 유전자를 함유한 유전자 조각을 수득한 다음 EcoRV로 절단한 pBBR1MCS 플라스미드에 삽입해 pMCS104ReAB 플라스미드를 제작하였다(도 3).

실시예 2: 3- 하이드록시부티레이트 - MCL 3- 하이드록시알카노에이트 - 락테이트 삼중합체의 제조

실시예 1에서 제작한 pct 유전자와 PHA 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pPs619C1300-CPPCT를 E. coli WB101 [W3110(fadB :: Km), Park and Lee, J. Bacteriol . 185:5391, 2003]에 형질전환시켜, E. coli WB101/pPs619C1300-CPPCT를 수득하였다. WB101은 fadB 변이체 대중균으로서 MCL-PHA의 생산에 효과적은 것으로 밝혀진 균주이다(KR-10-0447531B1).

상기 형질전환체를 하기와 같이 2단계 배양하여, 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체를 수득하였다. 먼저 상기 형질전환 재조합 대장균 E. coli WB101/pPs619C1300-CPPCT을 100 mg/L의 앰피실린(ampicillin)이 함유되어 있는 100 mL의 LB 배지(Bacto^TM Triptone(BD) 10 g/L, Bacto^TM yeast extract(BD) 5 g/L; NaCl(amresco) 10 g/L)에서 24 시간 배양한 후 4℃, 1000g에서 15분간 원심분리 하여 균체를 회수하였다.

회수한 균체를 2 g/L의 소듐 데카노에이트(sodium decanoate), 1g/L의 3-하이드록시부티레이트 및 100 mg/L의 앰피실린이 추가로 함유된 LB 배지(Bacto^TM Triptone(BD) 10 g/L, Bacto^TM yeast extract(BD) 5 g/L; NaCl(amresco) 10 g/L)에서 3일 동안 혐기배양하였다.

또한, 상기 pPs619C1300-CPPCT 및 pMCS104ReAB를 E. coli WB101에 형질전환시켜, E.coli WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB를 수득하였다.

상기 E. coli WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB를 하기와 같이 2단계 배양하여, 3-하이드록시부티레이트-3-하이드록시발러레이트-락테이트 삼중합체를 수득하였다. 먼저 상기 형질전환 재조합 대장균 E. coli WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB을 100 mg/L의 앰피실린과 30 mg/L의 클로람페니콜이 함유되어 있는 100 mL의 LB 배지[Bacto^TM Triptone(BD) 10 g/L, Bacto^TM yeast extract(BD) 5 g/L; NaCl(amresco) 10 g/L)]에서 24 시간 배양한 후 4℃, 1000g에서 15분간 원심분리 하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 2 g/L의 소듐 데카노에이트(sodium decanoate), 1g/L의 3-하이드록시부티레이트 및 100 mg/L의 앰피실린과 30 mg/L의 클로람페니콜이 추가로 함유된 LB 배지에서 3일 동안 혐기배양하였다.

상기 E. coli WB101/pPs619C1300-CPPCT 및 E. coli WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB의 배양액을 각각 4℃, 1000g에서 15분간 원심분리하여 균체를 회수하고 충분한 양의 증류수로 4회 씻어준 후 80℃에서 12시간 건조 하였다. 습기가 완전히 제거된 균체를 정량한 후 100℃에서 클로로포름을 용매로 사용하여 황산 촉매 하에서 메탄올과 반응시켜 주었다. 이를 상온에서 클로로포름의 절반에 해당하는 부피의 증류수를 첨가하여 혼합한 후 두개의 층으로 분리될 때까지 정치시켰다. 두 개의 층 중에서 메틸화된 고분자의 단량체들이 녹아 있는 클로로포름층을 채취하여 가스크로마토그래피로 고분자의 성분을 분석하였다. 내부 표준물질로는 벤조에이트(benzoate)를 사용하였다.

분석 결과, 도 4 에 나타난 바와 같이, E. coli WB101/pPs619C1300-CPPCT 균체 및 E.coli WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB 균체에서, 메틸-3-하이드록시부티레이트(methyl-3-hydroxybutyrate), 메틸-3-하이드록시데카노에이트(methyl-3-hydroxydecanoate) 및 메틸-락테이트(methyl-lactate)가 검출되어 재조합 대장균에 의해 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]가 생성되었음을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 신규 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]를 제공하는 효과가 있으며, 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하 는 효소의 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 신규 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체[poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)]는 생분해성 고분자로서 종래 합성 플라스틱의 용도를 대체할 수 있으며, 의료용으로도 사용이 가능하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.　 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

<110> LG CHEM, LTD Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel Copolymer of [poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)] and Method for Preparing the Same <130> P06-B256 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggaattcatg agaaaggttc ccattattac cgcagatga 39 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctctagatt aggacttcat ttccttcaga cccattaagc cttctg 46 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aggcctgcag gcggataaca atttcacaca gg 32 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcccatatgt ctagattagg acttcatttc c 31 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 7 <211> 1677 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. 6-19(KCTC11027BP) <400> 7 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc 900 acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677 <210> 8 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp.6-19(KCTC11027BP) <400> 8 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg 33 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aacgggaggg aacctgcagg 20 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag 33 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cgagcagcgg gcatatcatg agcatcctga acccgc 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg 36

Claims

락테이트, 3-하이드록시부티레이트 및 중간사슬길이(MCL)의 3-하이드록시알카노에이트를 반복단위로 함유하는 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체 [poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)].
제1항에 있어서, 상기 MCL의 3-하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시헥사노에이트 (3-hydroxyhexanoate, 3HHx), 3-하이드록시헵타노에이트 (3-hydroxyheptanoate, 3HHp), 3-하이드록시옥타노에이트 (3-hydroxyoctanoate, 3HO), 3-하이드로노나노에이트 (3-hydrononanoate, 3HN), 3-하이드록시데카노에이트 (3-hydroxydecanoate, 3HD), 3-하이드록시운데칸노에이트 (3-hydroxyundecanoate, 3HUD) 및 3-하이드록시도데카노에이트 (3-hydroxydodecanoate, 3HDD)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공중합체.
락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시부티레이트-MCL 3-하이드록시알카노에이트-락테이트 삼중합체 [poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL 3-hydroxyalkanoate-co-lactate)] 의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 MCL의 3-하이드록시헥사노에이트 (3-hydroxyhexanoate, 3HHx), 3-하이드록시헵타노에이트 (3-hydroxyheptanoate, 3HHp), 3-하이드록시옥타노에이트 (3-hydroxyoctanoate, 3HO), 3-하이드로노나노에이트 (3-hydrononanoate, 3HN), 3-하이드록시데카노에이트 (3-hydroxydecanoate, 3HD), 3-하이드록시운데칸노에이트 (3-hydroxyundecanoate, 3HUD) 및 3-하이드록시도데카노에이트 (3-hydroxydodecanoate, 3HDD)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 세포 또는 식물은 상기 두 유전자를 모두 가지지 않는 세포 또는 식물을 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자와 lactyl-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자로 형질전환하여 수득되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 세포 또는 식물은 락틸-CoA(lactyl-CoA)를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 세포 또는 식물을 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자로 형질전환하여 수득되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 세포 또는 식물은 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자를 가지는 세포 또는 식물을 lactyl-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자로 형질전환하여 수득되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 락테이트(lactate)를 락틸-CoA(lactyl-CoA)로 전환하고 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 6-19 유래의 phaC1_ps6 _-19인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에트polyhydroxyalkanoate:PHA) 합성효소 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열에서 E130D, S325T 및 Q481M가 변이된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 세포 또는 식물은 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 3-하이드록시알카노에트(3-hydroxyalkanoate)를 3-하이드록시알카노일-CoA(3-hydroxyalkanoyl-CoA)로 전환하는 효소는 α-케토티올레 이즈(PhaA) 또는 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈(acetoacetyl-CoA reductase: PhaB)인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 세포는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 배양 또는 재배는 3-하이드록시부티레이트(3-HB) 및MCL 3-하이드록시알카노에이트(MCL 3-HA)를 함유하는 환경에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.