KR100951185B1 - 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물, 그제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는신경세포 보호용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물, 그 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 하기 식 1로 표시되는 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물, 그 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다:

(1)

본 발명에 따르면, 상황버섯으로부터 추출한 DHP 유도체의 신경세포 보호용 화합물로서의 적용가능성을 실험적으로 검증하였으며, 과산화수소에 의해 매개되는 신경세포의 사멸을 효과적으로 억제함으로써 우수한 신경세포 보호 효과를 갖는 신경세포 보호용 화합물을 제공할 수 있다.

Description

상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물, 그 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물 {A compound extracted from Phellinus linteus for protection of neuronal cells, method for preparing the compound and a composition comprising the compound as an effective component}

본 발명은 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물, 그 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 상황버섯으로부터 추출한 DHP 유도체의 신경세포 보호용 화합물로서의 적용가능성을 실험적으로 검증함으로써, 우수한 신경세포 보호 효과를 갖는 신경세포 보호용 화합물, 그 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.

부종 (Edema), 허혈 (ischemia) 등을 포함하는 다양한 신경병리학적 변화들은 세포내 칼슘과 유리 라디칼 (free radicals)의 생산을 증가시키고 2차 손상에 영향을 주며, 신경손상은 중추신경계 뉴런의 재생능력 결함보다는 부적절한 중추신경계환경 때문에 유발된다. 따라서, 중추신경계에서 부적절한 환경을 중화 또는 대체하고, 격렬한 세포반응을 자극함으로써 중추신경계의 재생을 촉진하기 위한 다양한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

일반적으로, 척수손상 (Spinal Cord Injury, SCI)은 급성기 (acute phase), 상당한 양의 허혈성 괴사에 이어 나타나는 2차 조직 손상기, 만성기 (chronic phase)의 3 단계로 진행되는데, 2차 조직 손상기에서는 유리 라디칼의 생산이 증가되고, 흥분성 신경전달물질이 과다 방출되며, 염증반응이 발생된다.

한편, 산화적 스트레스는 SCI의 병리생리학에서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되며, 이러한 산화적 스트레스는 활성 산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)에 의해 매개된다. ROS는 세포의 용해와 면역반응의 일부로 산화적 파열 또는 유리 라디칼들을 발생시키는데, 촉매로 작용할 수 있는 유리 전이금속들이 충분히 존재해야 발생될 수 있고, 주로 미토콘드리아 전자 수송과 관련된 세포 호흡의 생산물로 발생될 수 있다. ROS에 의해 매개되는 산화적 손상은 ROS의 생성과 예방 기작 활성 사이의 불균형에 의해 야기되고, 이로 인해 과다하게 생성된 ROS가 세포의 과도한 노출을 유발할 수 있고, 유리 라디칼에 의해 매개되는 손상이 유도될 수 있다. ROS에 의해 매개되는 손상 효과는 글루타티온, 아스코빅산과 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 글루타티온 퍼옥시다아제 및 카탈라아제 등과 같은 ROS 제거 역할을 하는 효소를 포함하는 항산화 시스템에 의해 억제될 수 있다. 그러나, ROS에 의한 항산화 시스템의 기능적인 결함은 여러 가지 산화적 손상을 야기하고, 결과적으로는 세포 사멸을 야기한다.

특히, 배양된 척수 유래 신경 전구세포 (NPCs)와 신경 줄기세포 (NSCs) 등의 신경세포는 ROS의 증가에 민감하고, 그 결과 세포 사멸이 발생된다. 신경세포들에서 ROS에 의해 매개되는 세포사멸은 신경줄기세포 치료와 뇌의 치료 방사선 요법 동안 종종 관찰된다. 따라서, ROS를 비활성종으로 효소적 방법에 의해서 전환시키거나, 전이금속 촉매들을 킬레이트화 하거나, 항산화제들을 사용하여 ROS를 해독하는 등의 다양한 세포 방어체계들이 보고된 바 있다.

한편, 4-(3,4-디히드록시페닐) (DHP) 유도체는 지용성 유기화합물로서, 상황버섯 (phellinus linteus )으로부터 추출 정제될 수 있다. 특히, DHP 유도체는 다양한 세포에서 ROS에 의해 매개되는 세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있다고 알려져 있으며, 낮은 농도에서도 감소된 ROS 생산을 통해 다양한 생물학적 활성을 발휘하고 항암, 항염증, 항감염 활성을 포함해서 다양한 약리효과를 나타낸다. 이와 관련하여, 대한민국 공개특허공보 제2005-74070호에서는 상황버섯에서 분리한 항산화 활성을 갖는 신규 화합물로서 DHP 유도체, 그 제조방법 및 그 용도를 개시하고 있으며, 상기 화합물의 항산화 활성을 유리 라디칼 제거시험을 통하여 확인하고, 이를 포함하는 다양한 형태의 항산화 제제를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 상기 DHP 유도체의 항산화 활성이 신경전구세포 및 신경줄기세포 등과 같은 신경세포의 보호에 어떠한 영향을 미치는가에 관한 연구는 전혀 보고된 바가 없을 뿐만 아니라, DHP 유도체의 신경세포 보호용 화합물 또는 조성물에의 적용가능성에 대한 실험적 뒷받침 역시 전혀 제시된 바가 없다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는, 상황버섯으로부터 추출한 DHP 유도체의 신경세포 보호용 화합물로서의 적용가능성을 실험적으로 검증함으로써, 우수한 신경세포 보호 효과를 갖는 신경세포 보호용 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는, 상황버섯으로부터 상기 신경세포 보호용 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는, 상기 신경세포 보호용 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위해서,

하기 화학식 1로 표시되는 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물을 제공한다:

본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위해서,

상황버섯을 채취하여 건조시킨 다음, 에탄올로 추출하고 여과한 후, 그 여액을 농축하여 에탄올 추출물을 얻는 단계;

상기 에탄올 추출물을 헥산 및 H₂O의 혼합액에 용해시켜서 헥산 추출물을 얻는 단계;

상기 헥산 추출물에 대해서 헥산-에틸아세테이트 농도구배를 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 얻는 단계; 및

상기 활성분획을 건조시키는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 화학식 1로 표시되는 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물의 제조방법을 제공한다:

또한, 본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위해서,

상기 화학식 1로 표시되는 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다:

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에서는, 하기 식 1로 표시되는 DHP 유도체가 갖는 항산화 활성을 이용하여 이를 신경세포 보호용 화합물로 이용하고자 하였다:

(1)

본 발명에서는, 신경전구세포 및 신경줄기세포 등과 같은 신경세포들에서 상기 식 1의 화합물이 신경 독성을 갖는 물질들에 영향을 미친다는 점을 파악하고, 이러한 효과가 감소된 지질 과산화에 의해서 평가되는 산화환원반응의 조절과 관련성이 있을 것으로 파악하였다. 상기 산화환원반응의 조절은 상기 식 1의 화합물이 티오레독신 환원효소의 발현, 과산화수소의 제거, 카스파아제-3 및 카스파아제-9의 활성화 등을 포함하는 다양한 항산화 활성을 갖는다는 사실과 직접적으로 관련이 있을 것으로 추정되며, 본 발명에서는 다양한 실험적 방법을 통하여 이를 구체적으로 입증하였다.

DHP 유도체로 알려진 상기 식 1에 따른 화합물은 다양한 항산화 활성을 지니며, 활성산소종에 대해서 대항하는 유용한 방어기작으로 기능한다. 또한, 일반적 으로 항산화제들은 세포성장, 생존, 세포독성, 다양한 유전자의 전사 조절뿐만 아니라, 산화환원반응 조절 및 화학적 독성과 관련된 형질전환 조절기능을 수행하지만, 아직까지 DHP 유도체가 생물체 내에서 어떠한 기능을 수행하는지에 대해서는 충분히 규명되어 있지 않다. 따라서, 본 발명에서는 상기 식 1의 화합물이 우수한 신경세포 보호효과를 갖는다는 사실을 발견하고, 이러한 특성을 신경세포 보호용 화합물로서 응용하고자 하였다.

또한, 본 발명에서는 상기 신경세포 보호용 화합물에 대한 제조방법으로서,

상황버섯을 채취하여 건조시킨 다음, 에탄올로 추출하고 여과한 후, 그 여액을 농축하여 에탄올 추출물을 얻는 단계; 상기 에탄올 추출물을 헥산 및 H₂O의 혼합액에 용해시켜서 헥산 추출물을 얻는 단계; 상기 헥산 추출물에 대해서 헥산-에틸아세테이트 농도구배를 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 얻는 단계; 및 상기 활성분획을 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물의 제조방법을 제공하며,

더 나아가 상기 신경세포 보호용 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신경세포 보호용 조성물은 유효성분으로서의 상기 식 1의 화합물 이외에도, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수도 있으며, 이러한 담체로는 부형제, 결합제, 활택제, 붕괴제, 윤활제, 피복제, 유화제, 현탁제, 용제, 안정화제, 흡수조제, 주사용수 및 등장화제로 이루어진 군으로부터 선택된 하 나 이상의 담체를 예로 들 수 있다. 구체적으로, 결합제로는 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등을, 부형제로는 디칼슘 포스페이트 등을, 붕괴제로는 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등을, 윤활제로는 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스 등을 예로 들 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구 또는 비경구 제제로 제형화될 수 있으며, 경구 제제로는, 과립제, 정제, 캅셀제, 액제 등을 예로 들 수 있고, 비경구로 투여되는 경우에는 정맥주사, 피하주사, 근육내주사, 복강주사 또는 흉부주사 등의 형태로 적용될 수 있으며, 그 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

상기 조성물은 건강식품의 형태로 제조될 수도 있으며, 이 경우 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 상황버섯으로부터 추출한 DHP 유도체의 신경세포 보호용 화합물로서의 적용가능성을 실험적으로 검증하였으며, 과산화수소에 의해 매개되는 신경세포의 사멸을 효과적으로 억제함으로써 우수한 신경세포 보호 효과를 갖는 신 경세포 보호용 화합물을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니될 것이다.

실시예 1. 본 발명에 따른 화합물의 제조

상황버섯 300g을 채취하여 60℃에서 3일 동안 건조시킨 다음, 에탄올 500ml로 1주일 동안 추출하였다. 이어서, 상기 추출물을 헥산 및 H₂O의 혼합액 100ml (헥산:H₂O의 부피비 = 4:1)에 용해시켜서 헥산 추출물 5ml을 얻었다. 다음으로, 얻어진 헥산 추출물에 대해서 용리액으로서 헥산-에틸아세테이트 농도구배를 사용하는 실리카겔 (0.063-0.200 mm, Merck) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리함으로써 활성분획 3ml를 정제하였고, 이를 건조시켜서 본 발명에 따른 화합물 0.3g을 제조하였다.

실시예 2. 성체 척수 유래 신경 전구세포와 신경 줄기세포의 배양

성체 척수 유래 신경 전구 세포 (NPCs) 와 신경 줄기세포 (NSCs)의 배양을 위해 생쥐를 마취시켰다. 성체 척수 유래 신경 전구세포를 얻기 위해서, 전 경부 확대 (complete cervical enlargement) (spinal cord level C3 through T1) 부분을 절개하여 적출하였다. 또한, 성체 뇌로부터 유래되는 신경 줄기세포를 얻기 위해, 생쥐 태아 뇌를 적출하였다.

뇌 막을 제거한 후에, 조직을 잘게 절단하였으며, PBS로 세척 후에 0.125% 트립신과 0.01% DNA 분해효소 (DNase)를 처리하여 37℃에서 30분간 배양하였다. 세포는 B27 보충재, bFGF (20 ng/ml), EGF (20 ng/ml)를 넣은 NB 배지에 배양하였고, 페트리디쉬에 신경구로 배양하거나 PDL 처리된 배양 접시에 배양하였다.

실시예 3. NPCs 와 NSCs 에 대한 실시예 1에 따른 화합물의 처리와 H ₂ O ₂ 에의 노출

세포는 NB 배지에 접종시킨 다음, 5% O₂ 농도의 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 80% 농도의 세포를 8시간 동안 실시예 1에 따른 화합물 (1 ng/ml)로 전처리한 다음, 6시간 동안 H₂O₂ (0.3 mM)를 처리하였다. 실시예 1에 따른 화합물와 H₂O₂의 최적 농도는 반응물들의 다양한 농도에서의 세포 독성 (cytotoxicity)과 세포 생존 효과 (survival effect)와 관련된 예비 연구에 의해 결정되었다. H₂O₂ 희석액은 실험 직전에 30% 스톡 용액을 DMEM으로 희석함으로써 제조하였다. 세포는 배양되면서 시간별로 측정되었고, 독성 또는 생화학적 측정을 수행하였다. H₂O₂ 처리는 희석 후 5분 이내에 이루어지지 않으면 H₂O₂의 독성이 감소됨을 확인하였는데, 이는 H₂O₂의 높은 반응력과 희석용액 중에서의 짧은 반감기 때문인 것으로 판단된다.

실시예 4. 세포 생존력 측정

세포 생존력은 트립토판 블루 (Tryphan Blue) 염색을 통해 동일한 조건에서 최소한 3번 측정하였다.

실시예 5. 척수 손상 동물 모델 유도

척수 손상 질환을 유발하기 위한 방법으로 랫트 (성체 암컷 Wistar, 260g, 6 weeks-old)를 사용하였다. 실험 동물에 외상을 유도하기 위해서 하기 방법을 사용하였다.

랫트를 케타민 (ketamine) (75 mg/kg)과 자일라진 (xylazine) (10 mg/kg)으로 마취시킨 다음, T9과 T10 부위에 대해 물리적 손상을 유도하여 척수 파괴를 유도하였다. 급성 단계 척수 손상 (SCI) 병리생리학에 대한 실시예 1에 따른 화합물의 효과를 평가하기 위해, 척수 손상을 유도한 랫트를 3 그룹 (n = 40)으로 나누어 관찰하였다. 실험군은 실시예 1에 따른 화합물 10 ng/ml을 매트리겔 (matrigel)과 혼합하여 손상부위에 직접 투입하였고 (n = 30), 대조군은 DMSO를 매트리겔과 혼합하여 손상부위에 투입하였다 (n = 10).

실시예 6. 척수 손상 모델에 대한 실시예 1에 따른 화합물의 처리

정제된 실시예 1에 따른 화합물 (10 ng/ml)을 DMSO에 녹였고, 매트리겔과 혼합하여 척수 손상 직후에 손상 부위에 직접 주입하였다. 대조군은 동일한 양의 DMSO를 매트리겔과 혼합하여 손상부위에 투입하였다. 실시예 1에 따른 화합물을 처리한 30마리 척수손상 그룹과 대조군으로 10마리 척수손상 그룹의 두 그룹으로 나누어서, 모두 40 마리의 실험동물을 사용하였다. 척수 손상 후, 실험적인 처치 (매트리겔과 혼합한 실시예 1에 따른 화합물) 또는 대조 처치 (매트리겔과 혼합한 DMSO)는 즉시 손상된 척수의 외피간 공간 (intra-thecal space)으로 주입하였으며, 피부 절개부는 봉합하였다.

실시예 7. ATP 측정

단백질 정량은 단백질 정량 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용해서 측정하였다. 세포는 (150 mmol/L KCl, 25 mmol/L Tris-HCl; pH 7.6, 2 mmol/L EDTA pH 7.4, 10 mmol/L KPO4 pH 7.4, 0.1 mmol/L MgCl₂ 및 0.1% (w/v) BSA (완충용액 1 ml 중 1 mg의 단백질 농도)) 완충용액으로 부유시켰다. ATP 합성은 750 ㎕의 기질 완충용액 (10 mmol/L 말레이트, 10 mmol/L 피루베이트, 1 mmol/L ADP, 40 ㎍/ml 디지토닌 및 0.15 mmol/L 아데노신 펜타포스페이트)에 세포 부유액 250 ml를 넣어줌으로써 개시되었다. ATP 정량은 ATP Bioluminescence Assay Kit (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)를 사용하여 루미노미터 (Berthold, Detection Systems, Pforzheim, Germany)로 측정하였다. 실험 데이터는 Fisher 또는 t-test 상에서의 변화 분석을 이용해 분석하였다 (도 6 참조).

실시예 8. 카스파아제 분석 및 정량

카스파아제-3과 카스파아제-9 활성 측정을 위해서, 단백질을 카스파아제-Glo 3 또는 9 시약 (Promega)과 혼합하였다. 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 발광 (luminescence)을 TD 20/20 루미노미터 (Turner Designs, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다.

실시예 9. 세포내 활성산소종의 측정

세포내 ROS는 형광표지 지표인 DCFDA를 사용하여 측정하였다. 형광 현미경에 의한 관찰을 위해, 세포를 평판배양하고, 0.3 mM H₂O₂만을 처리 또는 실시예 1에 따른 화합물을 처리한 후, 0.3 mM H₂O₂를 처리하였다. 다음으로, 세포를 세척한 후 10 μM의 DCFDA를 37℃에서 30분 동안 처리하고, 형광 현미경 (ex/em=495/525 nm)으로 관찰하였다. ROS 발생을 정량하기 위해, 척수로부터 유래된 신경 전구 세포는 HBSS로 세척한 후, 10 μM의 DCFDA를 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 세포를 HBSS로 3번 세척하고 100 μM의 tBHP 또는 SS-31과 함께 노출시켰다. DCF의 산화는 마이크로플레이트 스펙트로플루오로미터 (ex/em=485/530 nm) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에 의해 실시간으로 측정하였다.

실시예 10. 플로우 사이토메트리 ( Flow cytometry )

BD Biosciences FACScan (San Jose, CA)으로 세포에 대한 플로우 사이토메트 리를 수행하였다. 세포 주기의 G0/G1, S, G2/M기의 세포 비율은 DNA histogram fitting program (MODFIT; Verity Software, Topsham, ME)으로 측정하였다.

실시예 11. 조직학적 분석

실험동물은 소듐 펜토바비탈 (sodium pentobarbital)로 마취하고, 척수는 4% 파라포름 알데하이드로 고정시켰다. 고정된 척수는 48시간 동안 30% 수크로오즈에 유지시키고 냉동 미세절단기 (frozen microtome)로 10㎛ 두께로 잘랐다. 손상된 척수에서 단백질의 상승조절을 분석하기 위해, 손상의 중심에서 조직은 ED-1과 GFAP 등의 특이적인 항체를 이용하여 면역화학적 방법으로 표지한 후, 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다.

실시예 12. 통계학적 분석

모든 데이터는 5번 또는 더 많은 독립적인 실험으로부터 ±SEM을 사용하여 표시하였다. 실험군간 차이의 통계학적 유의성은 Student's two tailed t-test을 사용하여 계산되었다.

실험결과 평가

도 1에는 화학식 1에 따른 화합물의 배양된 RAW 264.7 마크로파지 (5×10⁵/ml)에 대한 성장효과를 도시하였다. 도 1을 참조하면, 화합물의 농도에 비례하 여 마크로파지의 성장속도가 둔화 또는 감소되는 결과를 보여주고 있다. 이 결과는 화학식 1에 따른 화합물이 마크로파지를 비롯한 염증반응에 관계하는 면역세포의 성장을 억제함으로써 중추 신경계 질환의 급성기 치료 가능성을 간접적으로 시사 해 주는 결과이다.

한편, 상기 실시예 1 내지 실시예 12에 따른 실험결과로부터 하기 사항들을 판단할 수 있었다.

1) 실시예 1에 따른 화합물은 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸로부터 NPCs와 NSCs를 보호해 주고 세포 성장에 영향을 준다.

도 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸은 NPCs와 NSCs에서 2 번째 날 분명히 확인되었으나, 실시예 1에 따른 화합물 (1 ng/ml)을 전처리한 배양에서는 세포사멸이 관찰되지 않았다. 따라서, 실시예 1에 따른 화합물 1 ng/ml의 전처리는 0.3 mm 또는 0.05 mm 농도의 과산화수소 처리에 의해 유발되는 세포사멸로부터 NPCs와 NSCs를 보호함을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, NPCs와 NSCs가 실시예 1에 따른 화합물 1 ng/ml을 전처리한 경우에, 2일에서 5일까지 잘 자란다는 사실로부터, 실시예 1에 따른 화합물의 전처리에 의해서 NPCs와 NSCs의 세포 성장이 증가함을 알 수 있었으며, 이 경우 실시예 1에 따른 화합물의 최적농도는 1 ng/ml임을 알 수 있었다. 한편, 도 2에서 실시예 1에 따른 화합물의 농도가 10 ng/㎖인 경우에는 시간이 지날수록 훨씬 적은 농도인 1 ng/ml과 대비하여 세포성장의 효과가 떨어지는 것을 알 수 있다. 결국, 실시예 1에 따른 화합물의 최적농도는 1 ng/ml 이며, 10 ng/㎖인 경우에는 오히려 효과가 떨어지는 점을 고려할 때 실시예 1에 따른 화합물의 농도가 0.5 ~ 5 ng/㎖일 때 그 효과가 뛰어난 것을 예상할 수 있다.

2) NPCs, NSCs, 척수 손상 동물모델에서 실시예 1에 따른 화합물은 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸 특징들을 억제한다.

과산화수소는 세포적 산화 스트레스를 증가시키고 세포사멸을 유도한다. 따 라서, 과산화수소 처리 이후에 ROS 발생에 대한 실시예 1에 따른 화합물의 효과가 NPCs에서 평가되었다. 과산화수소는 농도 의존적으로 DCF의 산화를 증가시키고 증가된 DCF 형광 강도는 1 ng/ml의 실시예 1에 따른 화합물에 의해 억제되었다 (도 3 참조). 이는, 실시예 1에 따른 화합물 자체는 ROS 발생에 영향을 주지 않았지만, 과산화수소에 의해 매개되는 ROS 발생을 감소시키며, 미토콘드리아 일체성을 유지함으로써 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸을 억제하는 것으로 판단된다.

또한, 과산화수소는 카스파아제의 활성을 자극하기 때문에, 실시예 1에 따른 화합물이 과산화수소를 처리한 NPCs와 NSCs, 척수 손상 동물모델에서 카스파아제-3와 카스파아제-9 활성을 억제하는지를 관찰하였다 (도 4, 5, 7a 참조).

실험 결과, NPCs와 NSCs에서 24시간과 48시간 동안 과산화수소를 처리한 후에, 카스파아제-3와 카스파아제-9의 활성은 현저히 증가했지만, 실시예 1에 따른 화합물 전처리는 과산화수소에 의해 매개되는 카스파아제 활성화를 유의성 있게 억제시킴을 알 수 있었다 (도 4 및 5 참조). 척수 손상 동물모델에서 1일과 7일 동안 과산화수소 노출 후, 카스파아제-3와 카스파아제-9의 활성은 현저히 증가했지만, 실시예 1에 따른 화합물의 전처리는 과산화수소에 의해 매개되는 카스파아제 활성화를 유의성 있게 억제함을 알 수 있었다 (도 7a),

더 나아가, NPCs와 NSCs에서 과산화수소 처리 후에 ATP 생산에 대한 실시예 1에 따른 화합물의 효과를 평가하였다 (도 6 참조). 평가 결과, 24시간과 48시간 동안 과산화수소를 각각 처리 후에, ATP 생산은 현저히 감소했지만, 실시예 1에 따른 화합물 전처리는 ATP 생산을 유의성 있게 회복시켰다. 이러한 결과는 실시예 1 에 따른 화합물이 NPCs와 NSCs, 척수 손상 동물모델 뿐만 아니라 아마도 뇌 손상 모델에서 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸 특징들을 억제한다는 것을 나타낸다.

3) 실시예 1에 따른 화합물은 NPCs와 NSCs, 척수 손상 동물모델에서 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸로부터 세포를 보호한다.

세포가 생존하기 위해서는 세포사멸의 억제가 요구되며, 척수의 손상은 에피센터 (epicenter) 주위에 많은 마이크로글리아 (microglia) 및 마크로파지 (macrophage) 등의 광범위한 증식을 보여주지만 (도 7b 참조), 실시예 1에 따른 화합물을 처리한 동물군에서는 ED-1 양성 마크로파지와 마이크로글리알 세포들의 침투 및 활성화가 감소됨이 나타났다.

4) 실시예 1에 따른 화합물은 척수 손상 부위에서 세포사멸을 감소시킨다.

척수의 손상은 세포사멸의 결과이며, 손상부위로 매트리겔과 혼합한 실시예 1에 따른 화합물 처리 전후에 손상에 의해 유발되는 세포사멸은 TUNEL staining에 의해서 확인하였다. 실시예 1에 따른 화합물 전처리는 손상에 의해 매개되는 TUNEL 양성 세포들을 효과적으로 억제시켰다.

상기 실시예 1 내지 12의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는 실시예 1에 따른 화합물이 면역조절 기능과 항산화반응, 특히 마크로파지와 마이크로글리알 세포들의 활성화와 급성 척수 손상 같은 염증질환의 병리 생리학에서 결정적인 매개체인 ROS의 발생을 억제하는데 핵심적인 역할을 한다는 것을 실험적으로 입증하였다.

또한, 본 발명에서는 실시예 1에 따른 화합물에 의해 조절되는 경로가 인 비트로 NPCs와 NSCs, 인 비보 척수 손상 동물모델에서 p-P38, p-SAPK/JNK, PARP, p-ERK, Bax, 카스파아제 3, 9 활성화 및 시토크롬 c임을 밝혔다 (도 4, 5 및 7 참조). 실시예 1에 따른 화합물의 단기 효과는 주로 세포사멸 억제이며, ROS에 의해 매개되는 세포손상은 실시예 1에 따른 화합물 전처리에 의해 상당히 감소되었다. 인 비트로 배양에서 (NPCs 및 NSCs) 실시예 1에 따른 화합물의 전처리는 세포내의 ROS 수치를 낮추었을 뿐만 아니라 (도 3 참조), 카스파아제-3와 카스파아제-9의 활성화를 효과적으로 억제하였고 (도 4 및 5 참조), 세포의 ATP 생성 능력이 유의성 있게 회복되었다 (도 6 참조).

카스파아제의 활성화는 척수 손상 이후에 발생되며, 또한 PI3K/p-AKT, p-ERK1/2, Bcl-2 단백질들의 증가는 손상된 척수에서 세포사멸의 실행에 중요한 역할을 하는데, 특히 카스파아제-3와 카스파아제-9은 PARP 절단을 통한 세포사멸에 기여한다 (도 5 및 7a 참조). 뿐만 아니라, 세포사멸 동안에 PARP에 의한 DNA 복구 효소의 절단은 DNA 복구의 억제뿐만 아니라 세포사멸의 진행을 위해 필수적인 ATP의 세포내 풀을 보존한다.

따라서, 척수 손상에서 실시예 1에 따른 화합물의 주요한 보호 효과는 면역조절 기능과 함께 이차적인 세포사멸의 억제인 것이 분명하다 (도 7b 참조). 상기 실시예 1 내지 12의 결과들은 SCI 직후에 실시예 1에 따른 화합물이 세포사멸과 기능적인 결함을 유의성 있게 감소시킨다는 것을 증명한다. 실시예 1에 따른 화합물을 처리한 동물군은 더욱더 빠르게 뒷다리 반사 (hind limb reflexes)를 회복하였 고, 이는 대조군과 비교해서 높은 반응 비율을 보였다.

본 발명에 따른 화합물의 신경세포 보호용 화합물로서의 적용은 척수 손상 이후에 신경 기능 개선과 이차 병리학적 손상을 예방해 주는 용도로서 매우 유용하며, 결과적으로 인간 척수손상 치료를 위한 새로운 약품 개발 목표를 달성하기 위한 시발점이 될 것이다.

도 1은 화학식 1에 따른 화합물의 배양된 RAW 264.7 마크로파지 (5x10⁵/ml)에 대한 성장효과를 도시한 도면이다.

도 2a 및 2b는 화학식 1에 따른 화합물의 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸 감소 효과를 도시한 도면으로서, 도 2a는 배양된 NPCs를 8시간 동안 화학식 1에 따른 화합물 (1 ng/ml)로 전처리하고 0.3 mm 농도의 H₂O₂를 5일 동안 처리한 결과를 도시한 도면이고, 도 2b는 배양된 NSCs를 8시간 동안 화학식 1에 따른 화합물 (1 ng/ml)로 전처리하고 0.05 mm 농도의 H₂O₂를 5일 동안 처리한 결과를 도시한 도면이다.

도 3은 배양된 NPCs에서 과산화수소에 의해 매개되는 ROS 발생에 대한 화학식 1에 따른 화합물의 전처리 효과를 도시한 도면이다.

도 4는 배양된 NPCs에서 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸 억제 특성에 대한 화학식 1에 따른 화합물의 전처리 효과를 도시한 도면이다.

도 5는 배양된 NSCs에서 과산화수소에 의해 매개되는 세포사멸 억제 특성에 대한 화학식 1에 따른 화합물의 전처리 효과를 도시한 도면이다.

도 6은 NPCs와 NSCs에서 과산화수소 처리 후에 ATP 생성에 대한 화학식 1에 따른 화합물의 효과를 도시한 도면이다.

도 7은 화학식 1에 따른 화합물의 척수 손상 실험동물 모델에서 세포 사멸 특성에 대한 억제 효과를 도시한 도면으로서, 도 7a는 척수 손상 실험동물 모델에 서 화학식 1에 따른 화합물의 과산화수소에 의해 매개되는 카스파아제 활성화 억제 효과를 도시한 도면이고, 도 7b는 손상된 척수의 손상부위를 ED-1 및 GFAP 항체로 면역염색 (Immunostaining)한 결과를 관찰한 도면이다.

Claims (3)

1. 삭제
2. 삭제
3. 하기 식 1로 표시되는 상황버섯으로부터 추출한 신경세포 보호용 화합물 0.5 ~ 5 ng/㎖를 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물:

   

   (1)

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