KR100941036B1 - 인간 배아줄기세포로부터 척수신경계 희소돌기 아교세포생산을 위한 삼단계 분화기법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 배아줄기세포를 소닉 헷조그(Sonic Hedgehog, Shh), 레티놀 산(Retinoic acid, RA), 노긴(noggin) 및 비트로넥틴(vitronectin)을 포함하는 배지에서 배양하여 복측 척수신경계세포가 증가된 배상체를 유도하는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 인간배아줄기세포를 정상 발생과정과 매우 유사한 후성학적인 세포분화의 최적 환경을 단계별로 조성하여 외부 유전자의 인위적 도입과정 없이 인간배아 줄기세포로부터 희소돌기 아교세포를 효과적으로 분화유도 할 수 있다. 또한 상기 분화 유도된 희소돌기 아교세포 또는 그 전구세포를 이용하여 척수질환 및 척수 손상 치료용 세포치료제 조성물을 개발할 수 있다.

Description

인간 배아줄기세포로부터 척수신경계 희소돌기 아교세포 생산을 위한 삼단계 분화기법{Three-step Differentiation protocol for generation of spinal cord oligodendrocytes from human embryonic stem cells}

본 발명은 인간배아줄기세포로터 척수손상환자의 치료에 이용될 수 있는 척수 희소돌기 아교세포(spinal cord oligodendrocyte)로의 분화유도 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 1) 인간배아줄기세포로부터 배아체의 형성 과정에서 노긴(Noggin), 레티놀 산(retinoic acid, RA) 및 소닉 헷조그(Sonic hedgehog, Shh)을 함께 처리하여 신경외배엽, 보다 특이적으로는 척수신경외배엽이 증가된 배상체(복측 척수신경계세포)를 형성하고, 2) 이를 bFGF와 PDGF로 처리하여 희소돌기 아교세포의 전구세포 증식을 촉진시킨 뒤, 3) 증식된 전구세포에 환상 아데노신 일인산(cAMP), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1), 및 신경영양인자(NT-3)를 처리하여, 최종 희소돌기 아교세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

척추 손상을 치료하기 위한 목적으로 사용될 수 있는 세포들을 얻기 위한 방법은 인간 척수조직에서 얻어낸 세포를 배양하는 방법 및 줄기세포를 분화하여 얻는 방법 등이 있으나, 공여세포의 부족으로 인해 척추 손상을 입은 사람을 치료할 수 있는 조직을 대량 획득하기 위해서는 줄기세포를 이용한 연구가 현재로서는 가장 큰 가능성을 보여주고 있다. 최근 발표된 연구결과들에 의하면 정상 인간배아발달 과정에서 희소돌기 아교세포의 분화에 연관된 여러 가지 요소를 줄기세포에 시간대별로 처리함으로서 유전적 원인 또는 사고에 의한 척추 손상을 치료할 수 있는 세포 치료용조성물을 획득할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

특히, 무한한 자가증식능력을 소유함과 동시에 인체를 구성하는 200여종이 넘는 세포로 분화가 가능한 인간배아줄기세포는 무한대로 자가 증식하면서 여러 분화와 관련된 요소들을 포함한 배양조건하에 놓이면 신체를 구성하고 있는 특정세포로 분화할 수 있는 잠재력을 보유한다. 따라서 이를 통하여 획득한 세포를 신경계 질병 치료를 포함한 다양한 세포치료 위한 목적으로 이용하려는 시도가 전 세계적으로 진행되고 있다.

배아줄기세포를 이용한 희소돌기 아교세포 분화 방법으로는 크게 적절한 성장인자 또는 호르몬의 복합적 처리 및 물리, 화학적 배양 조건의 조절 을 이용하는 방법, 그리고 바이러스 벡터 및 특정 화합물질 등을 이용하여 희소돌기 아교세포의 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 유전자를 세포에 도입하여, 유전자의 과 발현을 유도함으로서 분화를 용이하게 하는 방법을 들 수 있다. 전자의 경우 설치류 유래 마우스 배아줄기세포를 이용하여 순도 높은 희소돌기 아교세포들을 분화시키려는 시도가 시행되어 왔으나, 마우스와 인간의 발달과정에서 나타나는 차이점, 인간 배아줄기세포와 마우스 배아 줄기세포 간에 나타나는 형태학적 차이, 표지인 자의 발현 차이 및 배양조건의 차이에 기인하여 희소돌기 아교세포로의 기술개발은 매우 제한 적으로 이루어지고 있다.

이와 더불어 유전공학적 기법을 이용하는 후자의 연구는 인위적으로 외래 유전자를 세포에 도입시켜 세포의 형질을 변형시키는 과정이 필수적으로 요구된다. 따라서 유전적으로 변화된 세포의 안전성 문제에 기인하여, 질병치료를 위한 세포의 인체 내 주입이 요구되는 임상적용이 어려운 실정이며, 단지 희소돌기 아교세포로의 분화에 중요한 역할을 하는 유전인자를 찾기 위한 실험적 연구방법으로 이용되고 있다.

이와 같은 사실을 고려하여 실질적으로 임상에 사용가능한 분화유도는 세포의 유전학적 형질변화를 초래하지 않는 후성학적 분화(epigenetic differentiation) 과정을 거쳐 이루어져야한다는 이론이 지배적이다. 그러나 인간배아줄기세포로부터 신경단위세포(neuron)로 분화를 유도하는 기법에 관하여 그동안 많은 연구보고가 있었던 반면, 신경계를 구성하는 또 다른 중요한 세포인 척수 희소돌기 아교세포로의 분화기법에 대한 개발 실적은 매우 저조한 상황이다. 더구나 인간배아 줄기세포로부터 희소돌기 아교세포로의 후성학적 분화방법은 대부분이 초기 분화과정부터 단계별 분화가 아닌 희소돌기 아교세포의 최종 분화과정에만 초점이 맞추어져 있는 실정으로, 인간배아 줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 발생단계별 후성적 분화방법의 개발이 정도관리가 필요한 세포공정과정에 필수적으로 요구되어진다.

이에 본 발명에서는 상기 종래기술들의 문제점을 극복하고 보다 효율적으로 정상 배아발달 과정에 유사한 분화 프로토콜을 개발하기 위하여 신경외배엽 형성, 척추신경계 분화, 희소돌기 아교세포의 전구세포분화, 이들 전구세포의 증식 및 희소돌기 아교세포로의 최종분화 단계를 체계적으로 포함하는 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 다능성(pluripotency)을 보유하는 인간배아줄기세포를 원치 않는 세포로의 분화를 억제함과 동시에 척수 신경질환 및 척수손상 등의 세포치료에 사용될 잠재력이 있는 척수 희소돌기 아교세포를 분화시키는 경우, 배아줄기세포의 특성인 무한증식 능력을 고려할 때, 대량의 척수손상 조직의 수급을 용이하게 하여 세포치료의 가장 큰 문제점인 원재료의 확보 할 수 있음과 더불어 본 발명의 분화과정은 정상 척수신경의 발달과정과 매우 유사하게 구성되어 있으므로, 척수발달과정에 관여하는 아직 밝혀지지 않은 다양한 유전자 및 발굴을 가능하게 하는 실험실 모델 시스템(in vitro model system)으로 이용할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

정상적인 초기 배아발생과정 중 척추 희소돌기 아교세포는 신경관 후미(척수가 될 부분, caudal part)의 복측(ventral part)에서 분화가 개시되며, 신경관 형성 및 복측 척수신경세포의 분화에는 여러 종류의 분화인자가 단독 혹은 복합적으로 작용하여 희소돌기 아교세포의 분화를 유도하게 된다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 정상 발생과정과 매우 유사한 세포분화의 최적 환경을 단계별로 조성하여 외부 유전자의 인위적 도입과정 없이, 인간배아줄기세포로부터 희소돌기세포를 효과적으로 분화유도 할 수 있는 최적의 분화기법을 개발함에 있다.

이를 위하여 정상 발생과정 중 척수 희소돌기 아교세포의 발생, 분화, 증식, 성숙 및 생존에 관여하는 각종 인자들을 대상으로 인간배아줄기세포로부터 최종 희소돌기 아교세포가 분화되기까지 각 단계별로 미치는 영향을 조사하여 효과적인 분화기법을 개발하였다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 인간 배아줄기세포에 소닉 헷조그(Sonic Hedgehog, Shh), 레티놀 산 (Retinoic acid, RA), 및 노긴 (noggin) 포함하는 배지에서 배양하여 복측 척수신경 외배엽이 증가된 배상체를 형성하는 제1단계; 상기 형성된 배상체를 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF)를 포함하는 배지에서 배양하여 희소돌기 아교세포의 전구세포의 증식을 유도하는 제2단계; 및 상기 증식된 전구세포를 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1), 및 신경 영양인자 3(neurotrophin 3, NT-3)을 포함하는 배지에서 배양하여 희소돌기 아교세포를 분화 유도하는 제3단계를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법을 제공한다.

본 발명의 복측 척수 신경계 세포는 뇌와 척수를 형성하는 신경단위세포(neurons), 성상세포(astrocytes), 희소돌기 아교세포(oligodendrocytes)로 분화될 수 있으며, 희소돌기 아교세포는 다시 뇌신경 혹은 척수신경계를 구성하는 세포로 구분되어 분화된다. 본 발명의 노긴은 초기 발달과정 중 신경관 복측 세포의 형성을 저해하는 BMPs의 길항제(antagonist) 역할 및 신경세포 분화를 유도하는데 효능이 있고, 이와 더불어 레티놀 산(retinoic acid, RA)은 마우스 배아줄기세포의 신경세포 분화유도에 효과가 있다.

본 발명의 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법에 있어서, 상기 제1단계에서 3 내지 7μm/ml의 비트로넥틴(vitronectin)을 더 처리하는 것이 바람직하며 5μm/ml의 비트로넥틴을 처리하는 것이 가장 바람직하다. 본발명의 비트로넥틴은 정상 발달과정 중 소닉 헷조그(SHH)에 결합 후, SHH의 활성을 증진시키는 것으로 알려진 세포 외 기질(extra cellular matrix ECM)의 구성 단백질이다. 본 발명에서 비트로넥틴을 함께 처리하였을 경우 희소돌기 아교세포로의 분화율이 현저하게 증가됨을 알 수 있었다(도 7C).

본 발명의 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법에 있어서, 상기 제1단 계에서 초기 1내지 3일은 인간배아 줄기세포를 분화용 배양액에 적응시키기 위하여 1.5 내지 2.5ng/ml의 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF)의 존재 하에 분화용 배양액에 적응시킨 후 분화시키는 것이 바람직하고 가장 바람직하게는 초기 2일동안 2ng/ml의 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF)의 존재 하에 분화용 배양액에 적응시킨 후 분화시키는 것이 좋다. 여러 가지 싸이토카인 이나 성장인자들이 인간배아줄기세포의 분화를 촉진하기도 하지만, 때로는 싸이토카인 이나 성장인자들의 세포독성에 의해 세포들이 죽는 현상이 발생할 수 있기 때문에, 상기 방법에 따라 bFGF를 첨가하여 적응기간을 갖는 경우, 이러한 독성을 감소시켜 배상체 형성을 안정하게 하고 원활한 분화가 일어날 수 있도록 하는 장점이 있다.

본 발명의 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법에 있어서, 상기 제1단계에서 450 내지 550ng/ml의 소닉 헷조그 (Sonic Hedgehog, Shh), 8 내지 12μM의 레티놀 산 (Retinoic acid, RA), 및 0.8 내지 1.2μg/ml의 노긴 (noggin)을 포함하는 배양액에서 6 내지 10일 배양하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 500ng/ml의 소닉 헷조그(Sonic Hedgehog, Shh), 10μM의 레티놀 산(Retinoic acid, RA) 및 1μg/ml의 노긴 (noggin)을 포함하는 배지에서 8일 배양하는 것이 좋다. 본 발명에서 상기 조건의 배지에서 배양하는 경우 척수쪽 신경세포로의 성질을 보유하게끔 유도하는 능력이 있음을 알 수 있었다(도 4, 도 5).

본 발명의 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법에 있어서, 상기 제2단계에서 8 내지 12 ng/ml의 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 8 내지 12 ng/ml의 혈소판 유래 성장인자(PDGF)을 포함하는 배양액에서 6 내지 10일 배양하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 10ng/ml의 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 10ng/ml의 혈소판 유래 성장인자(PDGF)을 포함하는 배양액에서 8일 배양하는 것이 좋다. 본 발명에서 상기 조건의 배지에서 배양하는 경우 전구세포의 증식이 빠르게 진행되고 증식율이 가장 높은 것을 알 수 있었다(도 6I).

본 발명의 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법에 있어서, 상기 제3단계에서 0.5 내지 1.5μg/ml의 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 80 내지 120ng/ml의 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1) 및 3 내지 7ng/ml의 신경 영양인자 3 (neurotrophin 3, NT-3)을 포함하는 배양액에서 6 내지 10일 배양하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1μg/ml의 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 100ng/ml의 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1) 및 5ng/ml의 신경 영양인자 3 (neurotrophin 3, NT-3)을 포함하는 배양액에서 8일간 배양하는 것이 좋다. 본 발명에서 상기 조건의 배지에서 배양하는 경우 분화 효율이 통계적으로 유의성 있게 증가됨을 알 수 있었으며 상기 인자들이 희소돌기 아교세포로의 최종 분화 시 분화된 희소돌기 아교세포의 생존에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다(도 7E).

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 신경기초배지(DMEM/F-12 배지)에 23 내지 27 μg/ml의 인슐린, 45 내지 55 μg/ml 아포-트렌스페린 (apo-transferrin), 5 내지 7 ng/ml 프로게스테론, 8 내지 12 μg/ml의 푸트레신 (Putrescine), 45 내지 55 ng/ml의 나트륨 셀레나이트 (Sodium selenite), 36 내지 44 ng/ml의 삼 요오 드 티로이딘(tri-iodo-thyroidin T3), 36 내지 44 ng/ml의 티록신(Thyroxine T4) 및 B27 보강제를 포함하는 신경제한배지(neural restricred media)에 추가적으로 450 내지 550ng/ml의 소닉 헷조그 (Sonic Hedgehog, Shh), 8 내지 12μM의 레티놀 산 (Retinoic acid, RA) 및 0.8 내지 1.2μg/ml의 노긴 (noggin)을 포함하는 복측 척수신경외배엽이 증가된 배상체 형성용 배지조성물을 제공한다. 본 발명의 신경기초배지로 사용된 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)는 세포배양에 사용되는 기본배지로 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 DMEM/F-12 (Gibco사)를 사용하였고, 본 발명의 신경제한배지(neural restricred media)는 신경기초배지(DMEM/F-12 배지)에 인슐린, 아포-트렌스페린 (apo-transferrin), 프로게스테론, 푸트레신(Putrescine), 나트륨 셀레나이트 (Sodium selenite), 삼 요오드 티로이딘, 티록신, 및 B27을 더 포함하여 신경계 세포로 분화를 유도하는 배지이다. 상기 B27은 신경세포 배양에 일반적으로 첨가되는 배지조성물로 혈청과 유사하게 사용되는 성장 보강제이며, 일반적으로 중추 신경계의 신경세포들의 오랜 기간 생존을 위해 사용한다. 본 발명에서는 Gibco사의 50배 stock B27 보강제를 구입하여, 희석(1ml B27 보강제/50ml)하여 사용하였다. 본 발명의 복측 척수신경외배엽이 증가된 배상체 형성용 배지조성물에 있어서, 상기 배지조성물은 3 내지 7μm/ml의 비트로넥틴(vitronectin)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배상체 형성용 배지 조성물인 것이 바람직하다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 기술한 신경제한배지(neural restricred media)에 추가적으로 8 내지 12 ng/ml의 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 8 내지 12 ng/ml의 혈소판 유래 성장인자(PDGF)을 포함하는 희소돌기 아교세포 전구세포 증식 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 기술한 신경제한배지(neural restricred media)에 추가적으로 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1), 및 신경 영양인자 3(neurotrophin 3, NT-3)을 포함하는 희소돌기 아교세포 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도 방법에 의하여 분화된 척수 희소돌기 아교세포 또는 그 전구세포를 유효성분으로 포함하는 척수질환 및 척수 손상 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포치료제 조성물에 있어서, 상기 척수 희소돌기 아교세포 또는 그 전구세포를 유효성분으로 하는 조성물은 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과적 수술로 척추 손상부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 척추손상부위로 이동할 수 있으나 바람직하게는 정맥에 투여된 후 척추 손상 부위로 이동하는 것이 좋다. 본 발명의 조성물 중 분화 유도된 희소돌기 아교세포 전구세포 및 희소돌기 아교세포는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이, 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우 10⁴ 내지 10⁸ cells를 투여한다.

이하, 본 발명의 인간 배아줄기세포로부터 척수신경계 희소돌기 아교세포 생산을 위한 분화기법을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다. 본 발명은 정상 발생과 정과 유사하게 인간배아줄기세포로부터 1) 노긴(Noggin), 레티놀 산(Retinoic acid), 소닉 헷조그(Sonic hedgehog)를 처리하여 신경외배엽(복측 척수신경외배엽)의 분화유도, 2) 혈소판 유래 성장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF) 및 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast growth factor, bFGF)를 처리하여 희소돌기야교세포의 전구세포의 증식유도, 3) 신경영양인자-3(neurotrophin-3, NT-3), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like growth factor, IGF-I) 및 환상 아데노신 일인산(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)를 처리하여 성숙한 희소돌기 아교세포로의 분화를 유도하는 총 세 단계를 포함한다. 또한 1) 단계에서 비트로넥틴(Vitronectin)을 배양액내에 첨가하여 분화유도의 효율을 극대화하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 척수 희소돌기아교세포의 특이적 분화 및 생존인자 사용으로 인하여 분화수율을 현저하게 증가시키는데 특징이 있으며, 또한 노긴(Noggin), 레티놀 산(Retinoic acid), 소닉 헷조그(Sonic hedgehog)를 처리하여 신경외배엽(복측 척수신경외배엽)의 분화과정을 거치는데 그 특징이 있다.

본 발명은 인간 배아줄기세포를 척수 희소돌기 아교세포로 분화하기 위하여 신경계세포 유도 배양액을 사용하였으며, DMEM/F-12(신경기초배지)를 기본 배지로 하여, 25 ug/ml 인슐린, 50 ug/ml 아포-트렌스페린(apo-transferrin), 6.3 ng/ml 프로게스테론, 10 ug/ml 푸트레신(Putrescine), 50 ng/ml 나트륨 셀레나이트(Sodium selenite)을 더 첨가하여 신경제한배지(neural restricted media)로 사용하였고, 40 ng/ml의 삼 요오드 티로이딘, 40 ng/ml의 티록신 및 B27 보강제를 추가적으로 사용하였다. 이 신경계세포 유도 배양액을 기본으로, 척수 희소돌기 아 교세포 분화를 특이적으로 유도하기 위해 싸이토카인, 성장인자, 호르몬을 분화 단계 순서에 적합한 순으로 단독 혹은 복합적으로 처리하여 최종적으로 성숙한 희소돌기 아교세포를 생산하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 인간배아줄기세포의 배상체 형성과정 중 척수신경계세포로의 분화촉진

1). 인간 배아줄기세포 배양

인간 배아줄기세포는 DMEM/F-12에 20% KnockOut SR (Gibco사), 0.1 mM 불필수 아미노산(nonessential amino acids)(Gibco사), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)(Sigma), 100 unit/ml 페니실리/스트렙토마이신(Gibco사) 및 4 ng/ml hbFGF(Peprotech)을 첨가한 배양액을 사용하여 매일 배양액을 바꿔주어 배양하였고, 매 7일마다 한번 씩 계대배양을 하면서 유지된 세포주를 희소돌기 아교세포의 분화에 사용하였다. 줄기세포로의 특성이 유지되고 있는지를 확인하기 위하여 인간 배아줄기세포의 미분화 마커인 Oct4, Nanog, SSEA-4, 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase)로 면역염색을 하거나, Oct4, Nanog, Rex1 유전자의 발현을 중합효소연쇄반응을 통하여 확인하였다. 도 1에서 본 실험의 원재료인 인간배아 줄기세포가 희소돌기 아교세포로 분화 개시 전 미분화 인간배아 줄기세포로서의 특성을 제대로 유지하고 있는지와 관련하여 미분화의 표지인자인 (B) 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase), (C) SSEA-4, (D) Nanog , (E) Oct-4 , (G)Rex-1의 유전자를 모두 발현하고 있음을 알 수 있었다. 도 1A는 전형적인 인간배아 줄기세포 콜로니의 형태이며 도 1F는 도 1D와 E를 합성하여 나타낸 것이다. 도 1G는 중합효소 연쇄반응에 의한 인간배아줄기세포-특이 유전자의 발현을 나타내었는데 분화 표지 인자들에 대하여 발현되지 않음을 알 수 있다. Pax6 내지 HNF3beta는 분화되었을 경우 나타나는 유전자들이다. 인간 배아줄기세포는 Miz-hES4와 Miz-hES6 세포주를 사용하였다.

2). 노긴 ( Noggin ) 처리에 의한 신경계 세포 유도

인간배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포 분화를 위해서는 우선적으로 신경계세포로의 분화를 촉진하여야 하고, 이들 세포들로 하여금 신경관의 후미에 존재하는 척수신경세포, 특이적으로는 복측 척수신경 세포로 분화유도를 증진시키는 것이 선행 조건이다. 마우스의 태아발달에 관련된 문헌상에 보고 B된 바에 의하면, 노긴은 초기 발달과정 중 신경관 복측 세포의 형성을 저해하는 BMPs의 길항제(antagonist) 역할 및 신경세포 분화를 유도하는데 효능이 있음이 알려져 있으며, 이와 더불어 레티놀 산(retinoic acid, RA)은 마우스 배아줄기세포의 신경세포 분화유도에 쓰이고 있다.

이러한 사실에 착안하여 본 발명에서는 인간배아 줄기세포의 분화개시 후 초기 분화형태로 나타나는 배상체의 형성과정 8일 동안, RA 또는 노긴을 처리하여 신 경계 세포로의 분화효율을 비교분석 하였다. 그 결과, 도 2의 A, B, C와 같이, 노긴 (1 μg/ml)을 처리한 배상체들은 대조군 (A)과 RA (10 μM)를 처리한 그룹 (B)에 비하여 크기가 현저하게 크고 건강한 형태를 보임이 나타났다.

신경외배엽으로의 분화효율을 신경외배엽에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현양으로 분석한 결과, 도 2D와 E에 증명된 바와 같이 노긴을 처리할 경우, 대조군과 RA를 처리한 그룹에 비하여, 내배엽 (분화 후 췌장, 간 등의 내장기관을 형성) 분화의 표지 유전자 [HNF3beta, Sox 17, AFP (alpha-fetoprotein) 및 중배엽 (분화 후 근육, 뼈, 혈액 등을 형성하는 세포로 분화) 분화의 표지 유전인자 (Mixl1, GATA4, T)발현이 효과적으로 감소함과 동시에 희소돌기 아교세포로 분화할 수 있는 신경외배엽의 표지인자 (Pax6, Sox1, Nestin)의 발현이 증가함을 보임으로, 신경외배엽으로의 분화인자를 노긴으로 결정하였다. 도 2E는 도 2D의 유전자 발현 결과를 정량적으로 나타낸 것이다. 도 3은 2D 및 E의 유전자 수준에서 보여준 실험결과를 면역형광염색기법을 이용하여 단백질 수준에서 재검증한 실험결과로서, 노긴 처리로 인해 HNFβ, Sox17, AFP, GATA4, Bry 등을 발현하는 내배엽 및 중배엽 세포로의 분화가 효과적으로 차단됨과 동시에 본 기술의 궁극적 목적 세포인 희소돌기 아교세포의 전구세포 [신경외배엽세포 (Pax6와 Nestin을 함께 발현)]로 분화유도가 촉진되었음을 나타낸다.

3). RA 및 소닉 헷조그 ( Sonic hedgehog ) 처리에 의한 복측 척수신경계 세포 분화유도.

인간의 중추신경계는 뇌와 척수로 구성되어 있고, 중추신경계의 초기 형성 과정 중 뇌는 신경관의 앞쪽에 형성되며, 척수는 뒤쪽에서 발생된다. 척수 희소돌기 아교세포는 운동성 신경세포 (motor neuron)과 함께, 발생학적 근원이 척수 신경관의 복측에 존재하는 pMN 도메인에서 유래되므로, 배아줄기세포로부터 형성된 신경계세포가 희소돌기 아교세포가 되기 위해서는 신경계세포의 정체성이 척수신경계, 특히 복측 척수신경계의 성질을 보유하도록 분화가 이루어져야 한다. 초기배아의 머리로부터 꼬리쪽, 즉 전뇌 (forebrain) -중뇌 (midbrain) - 후뇌 (hindbrain) -척수 (spinal cord) 순으로, 그리고 등쪽 (dorsal)으로부터 배쪽 (ventral)을 따라 발현하는 유전자를 표지인자로 하여 신경계 세포의 분화 양상을 관찰하였다.

정상 태아발달과정 중 전뇌로부터 척수까지 구간별로 발현되는 유전자(도 4A의 우측)를 사용하여, 배상체 형성 8일 동안 분화인자의 여러 조합적 처리에 의한 척수 신경계 세포로의 분화효율을 조사하였다. 이 때 배상체 형성과정의 8일 동안 초기 2일은 인간배아 줄기세포를 분화용 배양액에 적응시키기 위하여, 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF)의 존재 하에 분화용 배양액에 적응시킨 후 분화시켰다.

중합효소 연쇄반응 결과, 레티놀 산 및 노긴(R/N), 또는 소닉 헷조그 (500 ng/ml), 레티놀 산 및 노긴 을 함께 처리한 실험군 (S/R/N)이 대조군, 노긴만을 처리한 실험군 (Noggin), 그리고 소닉 헷조그 및 노긴을 처리한 실험군 (S/N) 보다 척수쪽에서 발현하는 유전자들 (Hoxb5, Hoxc5, Hoxb6)의 발현이 증가되었다. 본 발명 결과, 레티놀 산은 신경계 세포자체의 형성에는 큰 효과가 없으나, 형성된 신경계 세포가 척수쪽 신경세포로의 성질을 보유하게끔 유도하는 능력이 있음이 나타났다.

도 4B부터 E는 S/R/N의 처리에 의하여 세포의 운명이 척수신경 세포쪽로 변환되었음을 단백질 수준에서 면역형광염색법으로 재검증한 결과로서, S/R/N 처리에 의하여 뇌쪽에서 발현하는 Otx2의 발현이 감소하고, 척수쪽에서 발현하는 HB9의 발현이 증가함을 보여준다. E의 녹색은 신경단위세포의 표지인자인 Tuj1으로, 일부 세포들이 척수 운동신경세포로도 분화됨을 보여준다.

레티놀 산과 노긴 (R/A)을 함께 처리한 그룹, 그리고 소닉 헷조그, 레티놀 산 및 노긴을 함께 처리 (S/R/N)한 그룹 모두 신경계세포로 하여금 척수 신경계 세포로 분화하는 효과가 있음이 나타남에 따라 척수 희소돌기 아교세포가 분화하는 지역인 복측 척수신경계의 분화에 대한 효과를 두 그룹을 대상으로 비교 분석하였다. 이해를 돕기 위하여 도 5A의 우측에 발달과정 중 신경관의 등쪽 (dorsal)으로부터 배쪽 (ventral)에 이르기까지 지역별로 발현되는 유전자들의 발현 범위를 모식화 하였다. 분석 결과, 도 5A에서 볼 수 있듯이 소닉 헷조그, 레티놀 산, 노긴을 함께 처리한 실험군(S/R/N)에서 정상 발달과정 중 척수 희소돌기 아교세포가 분화되는 지역인 pMN 도메인에서 특이적으로 발현하는 Olig2의 발현이 현저하게 증가하였다.

면역형광 염색법을 사용하여 검증한 결과 도 5B부터 D에서 대조군에 비하여 S/R/N을 처리하였을 경우 척수 내 희소돌기 아교세포의 분화지역인 pMN 도메인에서 발현되는 Olig1과 Olig2를 발현하는 세포가 현저히 증가되었고, 희소돌기 아교세포에서 발현되는 O4의 발현이 검출되었다. 따라서 인간배아 줄기세포로부터 척수신경계 희소돌기 아교세포를 분화를 촉진시키기 위한 전 처리 과정으로서 소닉 헷조그, RA 및 노긴의 복합처리를 최종적으로 결정하였다.

실시예 2. 분화촉진된 척수 복측 신경세포세포로부터 희소돌기 아교세포 전구세포의 증식 및 분화

세포치료를 위한 충족요건 중 하나는 다량의 원재료가 확보되어야 한다는 점을 들 수 있다. 소닉 헷조그, RA 및 노긴 의 복합적인 처리 (S/R/N)에 의해 척수 복측 신경외배엽의 분화가 촉진됨을 밝힘에 따라, 이에 포함되어 있는 희소돌기 아교세포 전구세포의 증식을 유도하기 위하여 여러 증식인자 중 bFGF (10 ng/ml)와 PDGF (10 ng/ml)의 증식효과를 비교분석 하였다. 이를 위하여 배상체 내에 형성된 신경계 세포들을 트립신을 처리한 뒤, 세포 외 기질 (extracellular matrix)로서 폴리-L-오르니틴 (poly-L-ornithine)과 라미닌 (laminin)이 도말되어 있는 배양접시에 낮은 밀도의 세포 (1.25X104 cells/cm2)를 부착시킨 후, 8일간 배양하여 증식인자들의 효과를 조사하였다. 도 6은 S/R/N 처리에 의하여 신경 외배엽을 거쳐 분화된 희소돌기 아교세포의 전구세포를 대상으로 한 증식의 분석결과이다. 전구세포의 증식률 분석을 위하여 BrdU(DNA 구성성분인 티미딘(thymidine)의 유사체)를 배양액에 첨가하여 분열하는 세포를 표지한 뒤, 희소돌기 아교세포의 전구세포에서 특이적으로 발현하는 NG2에 대하여 면역 형광염색을 실시하였으며, 분열하고 있는 희소돌기 아교세포의 전구세포를 계수하여 비교 분석하였다.

도 6A, C, E 및 G는 희소돌기 아교세포의 전구세포에서 특이적으로 발현하는 NG2와 BrdU에 대한 항체를 사용하여 면역형광 염색을 시행한 결과로서 사진에 나타난 바와 같이 bFGF를 처리한 그룹과 bFGF 및 PDGF (혈소판 유래 성장인자, platelet-derived growth factor)를 함께 처리한 그룹에서 전구세포의 증식이 빠르게 진행되었다(도 6B, D, F 및 H는 각각 좌측 형광 염색된 세포들의 형태를 보여주는 위상차현미경사진이다.). 증식하고 있는 희소돌기 아교세포의 전구세포를 계수하여 통계분석한 결과, bFGF 및 PDGF를 처리한 그룹에서 전구세포의 증식율이 가장 높은 것으로 나타났다 (도 6I).

실시예 3. 증폭된 척수 복측 희소돌기 아교세포의 전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 최종 분화

특정조직의 발생과정을 조절하는 분화인자에 더하여 세포의 외부에 존재하는 세포외 기질 (ECM) 역시 세포의 분화과정에 중요한 역할을 담당한다. 따라서 정상 발달과정 중 소닉 헷조그 (SHH)에 결합 후, SHH의 활성을 증진시키는 것으로 알려진 세포외 기질인 1) 비트로넥틴(vitronectin) (5 μg/ml)을 배상체 형성과정 8일 동안 S/R/R의 처리와 함께 추가적으로 처리한 뒤, 2) bFGF 및 PDGF를 처리하여 전구세포를 증폭시킨 후, 3) 생존인자들이 존재하는 배양액내에서 희소돌기 아교세포로 최종 분화시켜 O4를 발현하는 척수 희소돌기 아교세포의 분화율을 측정하였다.

비트로넥틴 만을 첨가한 대조군 (도 7A, VN)에 비하여 S/R/N을 처리한 실험군에서 O4을 발현하는 희소돌기 아교세포가 효율적으로 분화되었고 (도 7B), 특히 비트로넥틴을 S/R/N과 함께 처리하였을 경우 희소돌기 아교세포로의 분화율이 현저하게 증가되었다(도 7C). 도 7D는 각 처리그룹별 희소돌기 아교세포를 계수하여 정량적으로 나타낸 것이다.

종합적으로, 전구세포의 증식인자 그리고 최종 분화과정의 생존인자의 효과 를 분석한 결과, bFGF 및 PDGF로 전구세포증식을 촉진시킬 경우, 도 6의 분석결과로부터 예상한 바와 같이 증식인자를 처리하지 않은 대조군 보다 효율적인 희소돌기 아교세포 분화가 유도됨이 나타났다(도 7E). 이와 더불어 8일간의 최종 분화유도시에 발생하는 세포의 사멸의 억제하기 위하여 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP, 1 μg/ml), 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1, 100 ng/ml), 신경 영양인자 3 (neurotrophin 3, NT-3, 5 ng/ml)로 처리하면 분화효율이 통계적으로 유의성 있게 증가됨이 관찰되어 이들 인자가 희소돌기 아교세포로의 최종 분화 시 분화된 희소돌기 아교세포의 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 분석되었다(도 7E). 도 8은 전체 분화유도 프로토콜의 분화인자별 처리시기 및 과정을 도식화 하여 나타낸 것이다.

실시예 4. RNA 추출과 RT - PCR 와 면역형광염색 방법.

RNA의 총량은 트리졸(Trizol, Invitrogen사)을 사용하여 분리하였고 cDNA는 추출한 RNA의 1μg에 슈퍼스크립트 III(SuperScript III first-strand synthesis system, Invitrogen사)를 사용하여 제작하였다. 이후 하기 표 1에서 나타난 프라이머와 PCR 기계(AccuPower PCR-Premix, Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 수행하였다. PCR결과는 1% 아가로스 겔 전기영동법으로 확인하였다. 상대적인 밴드의 강도는 이미지 분석기(image analyser, AutoChemi Bioimaging system, UVP Inc., CA, USA)로 분석하였다. mRNA의 발현수준은 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA의 발현과 비교하여 표준화 하였다.

[표 1]

실시예 5. 면역형광염색 방법.

세포들을 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline PBS) 용액에 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 설탕 20%로 포화된 배아체를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시키고 O.C.T compound (Tissue Tek, Sakura)에 끼워 넣고 9μm 간격으로 크라이오스탯(Cryostat, LEICA CM 3050S)를 사용하여 절단하였다. 면역형광 염색을 일반적인 방법에 의해 수행하였고 알칼라인 인산화효소 활성 염색을 알칼라인 인산화효소 기질 키트(Alkaline Phosphatase Substrate Kit Ⅲ, Vector Laboratories.)를 사용하여 수행하였다. 항체 목록은 하기 표 2에 나타내었다. 적절한 형광 표지된 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove, PA)를 시각화에 사용하였다. 정량적인 평가를 액시오비젼(Axiovision, version 2.4 software, Zeiss)를 사용하여 수행하였다.

[표 2]

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 다능성(pluripotency)을 보유하는 인간배아 줄기세포를 원치 않는 세포로의 분화를 억제함과 동시에 척수 신경질환 및 척수손상 등의 세포치료에 사용될 잠재력이 있는 척수 희소돌기 아교세포를 분화시킬 수 있다.

따라서 배아줄기세포의 특성인 무한증식능력을 고려할 때, 본 발명은 대량의 척수손상조직의 수급을 용이하게 하여 세포치료의 가장 큰 문제점인 원재료의 확보의 문제를 극복할 수 있다.

이와 더불어 본 발명의 분화과정은 정상 척수신경의 발달과정과 매우 유사하게 구성되어 있으므로, 척수발달과정에 관여하는 아직 밝혀지지 않은 다양한 유전자 및 발굴을 가능하게 하는 실험실 모델 시스템 (in vitro model system)으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 실험의 원재료인 인간배아줄기세포가 희소돌기 아교세포로 분화개시 전 미분화 인간배아줄기세포로서의 특성을 제대로 유지하고 있는지 보여주는 도면이다.

도 2는 싸이토카인의 일종인 노긴 (Noggin)이 인간배아줄기세포의 초기 분화과정에서 희소돌기 아교세포의 전구세포인 외배엽세포로 효과적인 분화유도를 하는 것을 보여주는 도면이다.

도 3은 2D 및 E가 유전자 수준에서 보여준 실험결과를 단백질 수준에서 재검증한 도면이다.

도 4는 도 2와 3의 결과에서 보여준 인간배아줄기세포로부터 분화효율이 증가된 신경외배엽세포에서 희소돌기 아교세포로의 효율적인 세포분화를 나타내는 도면이다.

도 5는 발달과정 중 신경관의 등쪽(dorsal)으로부터 배쪽(ventral)에 이르기까지 발현하는 유전자들의 발현을 나타낸 도면이다.

도 6은 S/R/N 처리에 의하여 신경외배엽을 거쳐 분화된 미분화 희소돌기 아교세포(즉, 희소돌기 아교세포의 전구세포)의 증폭을 나타낸 도면이다.

도 7은 bFGF와 PDGF를 함께 처리하여 증폭시킨 전구세포를 희소돌기 아교세포로 추가 분화시켜 획득한 O4를 발현하는 척수 희소돌기 아교세포의 분화수율을 측정한 도면이다.

도 8는 전체 분화유도 프로토콜의 분화인자별 처리시기 및 과정을 도식화 하 여 나타낸 도면이다.

Claims (11)

1. 인간 배아줄기세포에 소닉 헷조그(Sonic Hedgehog, Shh), 레티놀 산 (Retinoic acid, RA), 및 노긴 (noggin) 포함하는 배지에서 배양하여 복측 척수신경 외배엽이 증가된 배상체를 형성하는 제1단계; 상기 형성된 배상체를 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF)를 포함하는 배지에서 배양하여 희소돌기 아교세포의 전구세포의 증식을 유도하는 제2단계; 및 상기 증식된 전구세포를 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1), 및 신경 영양인자 3(neurotrophin 3, NT-3)을 포함하는 배지에서 배양하여 희소돌기 아교세포를 분화 유도하는 제3단계를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1단계에서 비트로넥틴을 더 포함하는 배지에서 배양하여 복측 척수신경 외배엽이 증가된 배상체로 분화유도하는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 제1단계에서 초기 1 내지 3일은 인간배아 줄기세포를 분화용 배양액에 적응시키기 위하여 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF)의 존재 하에 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포 로의 분화유도방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 제1단계에서 450 내지 550ng/ml의 소닉 헷조그 (Sonic Hedgehog, Shh), 8 내지 12μM의 레티놀 산 (Retinoic acid, RA), 및 0.8 내지 1.2μg/ml의 노긴 (noggin)을 포함하는 배양액에서 6 내지 10일 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 제2단계에서 8 내지 12 ng/ml의 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 8 내지 12 ng/ml의 혈소판 유래 성장인자(PDGF)을 포함하는 배양액에서 6 내지 10일 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 제3단계에서 0.5 내지 1.5μg/ml의 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 80 내지 120ng/ml의 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1) 및 3 내지 7ng/ml의 신경 영양인자 3 (neurotrophin 3, NT-3)을 포함하는 배양액에서 6 내지 10일 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포로부터 척수 희소돌기 아교세포로의 분화유도방법.
7. 신경기초배지(DMEM/F-12 배지)에 23 내지 27 μg/ml의 인슐린, 45 내지 55 μg/ml 아포-트렌스페린 (apo-transferrin), 5 내지 7 ng/ml 프로게스테론, 8 내지 12 μg/ml의 푸트레신 (Putrescine), 45 내지 55 ng/ml의 나트륨 셀레나이트 (Sodium selenite), 36 내지 44 ng/ml의 삼 요오드 티로이딘(tri-iodo-thyroidin T3), 36 내지 44 ng/ml의 티록신(Thyroxine T4) 및 B27 보강제를 포함하는 신경제한배지(neural restricred media)에 추가적으로 450 내지 550ng/ml의 소닉 헷조그 (Sonic Hedgehog, Shh), 8 내지 12μM의 레티놀 산 (Retinoic acid, RA) 및 0.8 내지 1.2μg/ml의 노긴 (noggin)을 포함하는 복측 척수신경 외배엽이 증가된 배상체 형성용 배지 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 배상체 형성용 배지 조성물은 3 내지 7μm/ml의 비트로넥틴(vitronectin)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배상체 형성용 배지 조성물.
9. 신경기초배지(DMEM/F-12 배지)에 23 내지 27 μg/ml의 인슐린, 45 내지 55 μg/ml 아포-트렌스페린 (apo-transferrin), 5 내지 7 ng/ml 프로게스테론, 8 내지 12 μg/ml의 푸트레신 (Putrescine), 45 내지 55 ng/ml의 나트륨 셀레나이트 (Sodium selenite), 36 내지 44 ng/ml의 삼 요오드 티로이딘(tri-iodo-thyroidin T3), 36 내지 44 ng/ml의 티록신(Thyroxine T4) 및 B27 보강제를 포함하는 신경제한배지(neural restricred media)에 추가적으로 8 내지 12 ng/ml의 염기성 섬유모 세포 성장인자(bFGF) 및 8 내지 12 ng/ml의 혈소판 유래 성장인자(PDGF)을 포함하는 희소돌기 아교세포 전구세포 증식 유도용 배지 조성물.
10. 신경기초배지(DMEM/F-12 배지)에 23 내지 27 μg/ml의 인슐린, 45 내지 55 μg/ml 아포-트렌스페린 (apo-transferrin), 5 내지 7 ng/ml 프로게스테론, 8 내지 12 μg/ml의 푸트레신 (Putrescine), 45 내지 55 ng/ml의 나트륨 셀레나이트 (Sodium selenite), 36 내지 44 ng/ml의 삼 요오드 티로이딘(tri-iodo-thyroidin T3), 36 내지 44 ng/ml의 티록신(Thyroxine T4) 및 B27 보강제를 포함하는 신경제한배지(neural restricred media)에 추가적으로 환상 아데노신 일인산 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 인슐린 유사 성장인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1), 및 신경 영양인자 3(neurotrophin 3, NT-3)을 포함하는 희소돌기 아교세포 분화 유도용 배지 조성물.
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