KR100932945B1

KR100932945B1 - 골 분말과 피브린 글루로 이루어진 고형의 스캐폴드

Info

Publication number: KR100932945B1
Application number: KR1020090003884A
Authority: KR
Inventors: 이준; 윤동현
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2009-12-21
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CN102264401A; EP2388020A1; EP2388020A4; RU2011118071A; JP2012515041A; WO2010082702A1; BRPI0924168A2; CA2746582A1; AU2009337223A1; US20110270408A1; MX2011007193A

Abstract

본 발명은 뼈 재생용 스캐폴드에 관한 것으로, 보다 자세하게는 피브린 글루에 골 분말이 혼합되고, 내부에 뼈 성장촉진을 위한 인자를 수용하기 위한 복수의 세공(pore)이 형성되며 굳은(concrete) 소정의 형상을 가진, 뼈 재생용 스캐폴드 및 상기 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 고형의 스캐폴드는 생체 내 안전하고, 뼈 재생 과정에서 지속적으로 세포, 사이토카인 등의 뼈 성장을 촉진하는 인자의 흡수도 및 유지도를 증가시키고, 또한 뼈 소실 부위에 적합한 형상을 가짐으로 인해 적합한 형태로의 재생을 유도하며, 뼈 재생을 위한 다양한 물질들이 위치할 수 있는 공간을 유지하고, 생체 내 환경에서도 적절한 형태와 강도를 유지하여 신속한 뼈 형성을 유도할 수 있다.

스캐폴드, 골 분말, 피브린 글루

Description

골 분말과 피브린 글루로 이루어진 고형의 스캐폴드{Solid Scaffold Formed with Bone Powder and Fibrin Glue}

골조직 공학의 목적은 골이 필요한 부위에 공학적으로 배양된 골형성세포를 이식하여 골형성을 유도하고 실제 골조직을 개발하는데 있다. 이러한 조직공학을 위해서는 골형성 세포와 이 세포가 부착하여 생존할 수 있는 스캐폴드, 뼈 재생을 위한 유도분화를 촉진하는 성장인자가 필요하다. 각각의 성분은 동시에 영향을 주고 적절한 시간과 환경을 유지해 주면 골조직을 형성할 수 있게 된다. 그래서 각각에 대한 이상적인 인자를 찾는 데에 많은 연구를 하고 있다.

특히, 골형성 세포들이 살아가면서 골을 형성하기 위한 스캐폴드와 같은 골전도 물질이 중요한데 골절도 물질은 골의 무기화 단계와 유사하고 생체 적합성이 있어야 하며 주위 골과 밀접하게 연계되는 표면 활성도와 물리적 지지를 제공하게 된다. 이러한 골전도 물질로는 세라믹, 콜라겐, 생분해성 고분자 등이 다양하게 연구되고 있다.

Takahashi 등은 다공성의 HA(hydroxyapatite)와 BMP(bone morphogenic protein)의 사용을 통한 골유합(Takahashi K et al. J Biomed Master Res A 12:117-123, 2007)을, Asahina 등은 HA, 콜라겐, bovine BMP 등(Asahina I et al. J Med dent Sci. 44:63-69, 1997)을, Ohgushi 등은 세라믹 스캐폴드(Ohgushi H et al. J Biomed Mat Res 26: 885-95, 1992; Ohgushi H et al. J Biomed Mat Res 32: 341-8, 1996), Caplan 등은 다공성 인산칼슘 등(Caplan AI. J Cell Physiol 213(2): 341-347, 2007)의 유용성 등을 보고하였다.

또한, 유럽특허 제1231947호는 (a) 피브린이나 피브리노겐으로 구성된 소프트 매트릭스, (b) 살아있는 세포 및 (c) non-ceramic hydroxyapatite cement로 구성된 고정된 매트릭스를 포함하는 뼈 대체용 재료를 개시하고 있다.

또한, 일본공개특허 제1999-513590호는 무기물화 콜라겐으로부터 형성되고, 매트릭스에 고정화된 5미크론 이하의 입자 사이즈를 갖는 인산칼슘 미립자를 포함하는 생분해성의 다공성 3차원 골 이식용 매트릭스를 밝히고 있다.

아울러, 미국공개특허 제2008-0213229호는 동물의 골조직으로부터 뼈세포를 분리하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 세포 현탁액을 제조하고, 이 뼈세포 현탁액에 반고형성 뼈세포 응고인자를 혼합하여 피브린 혼합형 골절 유합용 반고형성 뼈세포 조성물을 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 종래의 스캐폴드는 살아있는 골세포가 내부에서 성장할 수 있는 배지로서의 역할과, 골 결손 부위에 이식되었을 때 치유 과정 동안 안정적으로 그 공간 내에 유지되면서, 형태와 강도를 유지할 수 없어, 뼈 재생 효과가 저조하다는 문제점이 있다.

본 발명자는 상기와 같은 문제점을 극복할 수 있는 스캐폴드를 개발하기 위하여 예의 노력하던 중 피브린 글루와 골 분말을 혼합한 후 동결건조하여 수득한 고형의 스캐폴드가 생체내 안전하고, 골 재건 과정에서 지속적으로 세포가 위치할 수 있는 공간을 유지하며, 생체내 환경에서도 적절한 형태와 강도를 유지하여 신속한 골형성을 유도할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 피브린 글루와 골 분말의 혼합 후 수행하는 동결건조 과정은 이 혼합체 내의 다수의 기공을 형성시킴으로 인해 뼈 재생 촉진인자의 흡수도와 유지도가 향상되었다.

또한, 동결건조되어 형성되는 본 발명의 스캐폴드는 소정의 원하는 모양의 형틀 내에서 동결건조되어 원하는 모양의 스캐폴드를 제조할 수 있으며 이러한 장점은 뼈 결손부위에 적합한 스캐폴드를 제공할 수 있다. 최근의 3차원 스캐닝 기술과의 접목으로 환자의 결손부위를 정확하게 판단하고 그 모양을 재생할 수 있음으로 인해 본 발명의 활용도가 향상될 수 있다.

따라서, 본 발명은 피브린노겐과 트롬빈을 주요 성분으로 하는 피브린 글루에 골 분말이 혼합된 것을 특징으로 하는 고형의, 뼈 재생용 스캐폴드를 제공하고자 한다.

더 구체적으로, 본 발명은 피브린노겐과 트롬빈을 주요 성분으로 하는 피브린 글루에 골 분말이 혼합되고, 동결건조과정을 거침으로써 내부에 뼈 성장촉진을 위한 인자를 수용하기 위한 복수의 세공(pore)이 형성되며 굳은(concrete) 상태의 물리적 특성을 가진 뼈 재생용 스캐폴드를 제공한다.
더 구체적으로, 상기의 굳은 상태의 물리적 특성은 생체 내 환경에서도 적절한 형태와 강도를 강도를 유지하면서 신속한 골 형성을 유도할 수 있는 정도의 물리적 강도를 말하며, 바람직하게는 100~12,500 kPa, 더 바람직하게는 100~3,000 kPa의 강도를 가지는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 동결건조 과정에 앞서 상기 피브린 글루와 골 분말 혼합물을 소정의 모양 형틀에 넣어 동결 건조함으로써 원하는 모양의 스캐폴드를 제공한다.

또한, 본 발명은 3차원 디지털 스캐닝 기술을 통하여 환자의 결손부위에 대한 형틀을 제조한 후 이 형틀 내에 상기 피브린 글루와 골 분말 혼합물을 넣어 동결 건조함으로써 환자 맞춤형 스캐폴드를 제공한다.

본 발명은 피브리노겐과 트롬빈을 주요 성분으로 하는 피브린 글루에 골 분말이 혼합된 것을 특징으로 하는 굳은(concrete), 뼈 재생용 스캐폴드에 관한 것이다. 즉, 피브린 글루에 골 분말이 첨가되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 스캐폴드는 고형의, 그리고 굳은(concrete) 상태임을 특징으로 한다. 이를 위해 피브린 글루와 골 분말을 혼합한 후 동결건조된 것이 바람 직하다. 또한, 본 발명의 스캐폴드는 동결건조되기 전 소정의 형상을 가지도록 처리되거나, 소정의 형틀 내에서 동결건조된 것이 바람직하다. 한 양태로서, 상기 형상과 형틀은 환자의 턱뼈 또는 치아 결손부위에 대응하는 형상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 형틀은 (a) 3차원 CT를 이용한 3차원 모형 제작 과정, (b) 상기 3차원 모형에서 치과용 레진 등을 이용하여 결손부위에 적합한 스캐폴드 제작용 형틀을 만드는 과정으로 제조된 것일 수 있다.

본 발명에서 '골 분말(bone powder)'는 뼈의 분쇄물, 바람직하게는 뼈 세포가 제거된 뼈(무기물)의 분쇄물을 의미한다. 상기 골 분말은 자가골, 동종골, 이종골 및 합성골(예, hydroxyapatite)로 이루어진 그룹으로부터 1종 이상 선택된 뼈로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명에서 골 분말은 상업적으로도 입수 가능하며, 예를 들면, Dynagraft (오스템), Biocera (오스코텍), Bio-Oss (정산 Biomed), ICB (푸르고), MBCP (푸르고) 등이 있다.

본 발명에서 '피브린 글루(fibrin glue)'는 피브리노겐과 트롬빈을 주요성분으로 포함하는 생체적합성 및 생분해성을 갖는 생산물을 의미한다. 피브린 글루는 현재 다양한 용도로 사용되고 있는데, 유럽 등에서는 피브린의 조직 교착작용을 이용하여 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘, 및 선용 효소의 저해제를 조직접착제로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 등에 적용하여 봉합의 대용 또는 보강을 위한 임상응용이 실시되고 있다. 또한, 일본에서는 수술용 접착제로서 혈관 외과 영역을 비롯해 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착 등 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈 등에 이용되고 있다. 예를 들면, 상표명 Greenplast (녹십자), Beriplast-P (아벤티스), Tisseel (박스터) 등이 상업적으로 입수 가능하다.

본 발명의 피브린 글루는 피브리노겐과 트롬빈을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 피브리노겐은 10 내지 1000mg/ml, 바람직하게는 10 내지 100mg/ml의 농도로 이용될 수 있다. 상기 트롬빈은 0.1 내지 1000IU/ml, 바람직하게는 1 내지 100IU/ml의 농도로 이용될 수 있다.

본 발명의 피브린 글루는 아프로티닌(aprotinin) 또는 염화칼슘을 추가로 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 피브린 글루는 수용성 바인더를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 수용성 바인더는 세포배양배지, 증류수 또는 혈액일 수 있다.

본 발명에서 골 분말과 피브린 글루를 혼합함에 있어서, 피브린 글루의 양이 많을수록 독성을 유발할 가능성이 높기 때문에 그 함량을 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 스캐폴드의 크기가 클수록 강도 및 형태 유지를 위해 골 분말의 함량을 높이는 것이 바람직하다. 이러한 점을 고려할 때, 본 발명에서 피브린 글루와 골 분말은 1 대 1~10, 바람직하게는 1 대 1~5, 보다 바람직하게는 1 대 1~3의 비율로 혼합할 수 있다.

본 발명의 뼈 성장촉진을 위한 인자는 뼈 성장을 촉진하는 다양한 인자를 포함한다. 예를 들어, 호르몬, 사이토카인, 줄기세포 등을 포함한다.

본 발명의 스캐폴드는 동결건조 과정을 거치면서, 피브린글루와 뼈 분말 혼합체 내에 다수의 세공이 생성되므로 뼈 성장촉진인자의 흡수와 유지가 향상된다. 동결건조 상태의 스캐폴드는 뼈 성장촉진인자를 포함하는 배지를 용이하게 흡수하 여 세공 내에 들어가게 된다.

본 발명의 다른 관점은, 골 분말과 피브린 글루를 혼합한 후, 소정 형상의 형틀에서 동결건조하는 것을 특징으로 하는 소정 형상을 가진 고형의 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다.

상기 동결건조 방법은 통상의 방법으로 수행될 수 있으며, 건조시 잔여 수분이 2% w/w 또는 그 이하로 유지되는 것으로 말한다. 또한, 본 발명의 동결건조 방법은 상업적으로 입수가능한 동결건조기를 이용함으로써 가능하다.

본 발명의 또 다른 관점은, 환자의 뼈 소실부위에 처치하여 뼈 재생을 촉진할 수 있도록 뼈 소실부위에 맞는 환자 맞춤형 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 환자 맞춤형 스캐폴드 제작 방법은 (a) 3차원 CT를 이용한 3차원 모형 제작 과정, (b) 상기 3차원 모형에서 치과용 레진 등을 이용하여 결손부위에 적합한 스캐폴드 제작용 형틀을 만드는 과정, 및 (c) 상기 형틀에 피브린 글루와 골 분말 혼합재를 넣어 동결건조하는 과정을 포함한다.

본 발명에 따른 고형의 스캐폴드는 생체 내 안전하고, 뼈 재생 과정에서 지속적으로 세포, 사이토카인 등의 뼈 성장을 촉진하는 인자의 흡수도 및 유지도를 증가시키고, 또한 뼈 소실 부위에 적합한 형상을 가짐으로 인해 적합한 형태로의 재생을 유도하며, 뼈 재생을 위한 다양한 물질들이 위치할 수 있는 공간을 유지하 고, 생체 내 환경에서도 적절한 형태와 강도를 유지하여 신속한 골 형성을 유도할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명의 스캐폴드 제조

1-1. 피브린 글루의 준비

그린플라스트 키트^®(Greenplast kit, 대한민국, 녹십자)를 사용하여 피브린 글루를 제조하였다(도 1). 이하의 과정으로 수행하였다.

가) 바이알 1 용액의 조제, 5ml

먼저, 바이알 1의 단백질 농도는 97.6mg/ml로 확인되었다. 단백질 농도를 40mg/ml로 조정하기 위해 희석배율을 2.5배로 하였다. 1개의 바이알 1에 바이알 2의 2.5ml로 용해하였고, 또 다른 1개의 바이알 1에 생리식염수 2.5ml를 넣어 용해하였다. 완전히 용해된 2개의 바이알 1을 하나의 시험관에 수집하였다.

나) 바이알 3 용액의 조제

바이알 3의 트롬빈 역가는 557IU/ml로 확인되었다. 트롬빈 역가를 20IU/ml로 조정하기 희석배율을 28배로 하였다. 1개의 바이알 3에 바이알 4의 2.5ml로 용해하였고, 이 중에서 1ml를 취하여 10ml의 생리식염수 용액에 첨가하고 잘 섞어주었다.

1-2. 피브린 글루와 골 분말의 혼합

가) 디스크형 뼈 블록

24구판의 각 구에 골 분말(Biocera)를 0.25g 칭량하여 올려놓는다. 각 구에 0.2ml의 바이알 1 용액을 넣어 골 분말에 충분히 적셔지도록 혼합하였다. 그리고, 각 구에 0.1ml의 바이알 3 용액을 넣어주고 신속하게 약스푼을 이용하여 섞어준 후 정치하였다.

나) 반원막대형 뼈 블록

10ml 피펫을 이용하여 제작된 틀을 사용한다. 각 레인에 골 분말(Biocera)1.25g 칭량하여 올려놓는다. 각 구에 2ml의 바이알 1 용액을 넣어 골 분말에 충분히 적셔지도록 혼합하였다. 각 구에 0.5ml의 바이알 3 용액을 넣어주고 신속하게 약 스푼을 이용하여 섞어준 후 1시간 동안 상온에 정치하였다.

1-3. 동결건조

동결건조기의 선반의 온도를 -45℃로 설정하고 가동하였다. 동결건조된 반원막대형 뼈 블록을 수득하였다(도 2).

실시예 2: 실험 재료 및 방법

2-1. 실험동물 및 재료

체중 30kg의 수컷 미니피그(PWG, Korea) 4마리를 실험동물로 사용하였으며, 실온에서 인증된 사육시설에서 동물형 연질 사료와 물을 이용하여 일정기간 사육하였다.

가) 발치

미니피그의 좌우 하악에서 소구치에서 제1 대구치까지 발거를 시행하였다. 발거 후 창상 봉합을 연속 봉합으로 시행하였다. 1주일 후 발사를 시행하였고, 1달 동안 치유를 지켜보았으며, 치유과정에 추가적인 매복치의 발거는 수술시 시행하였다.

나) MBCP/피브린 블록의 제조

(1) 피브린 글루의 준비

그린플라스트 키트^®(Greenplst kit, 대한민국, 녹십자)를 사용하여 피브린 글루를 제조하였다. 그린플라스트 키트 1ml는 ① 농축된 사람의 피브리노겐, ② 아프로티닌, ③ 사람의 혈장 트롬빈, ④ αMEM (배지용액)으로 구성되어 있다. ②를 ①에 섞어 피브리노겐 용액을 제조하고, ④를 ③에 섞음으로써 트롬빈 용액을 제조하였다.

(2) MBCP/피브린 복합체('MBCP+피브린 글루'로 약칭함)의 제조

앞서 제조한 피브린 글루(피브리노겐 용액 및 트롬빈 용액)와 MBCP를 1:1로 혼주합하여 미리 준비한 형에 채워넣었다. 그 후 이를 동결건조 과정을 거쳐 MBCP/피브린 블록(본 발명의 스캐폴드)를 제작하였다(도 3 및 4).

2-2. 실험 방법

가) 마취 유도

미니피그 골이식술을 위해 동물용 진정 마취제(럼푼^® 3mg/kg, 한국 바이엘화학)와 케타민을 각각 정맥 주사하여 전신마취를 유도하였다. 구강내 삽관술을 수행하여 N₂O + O₂를 통한 전신마취를 시행하였다.

수술시 시야 확보를 위하여 상악과 하악의 견치에 bandage를 묶어 최대한의 개구를 유도하였다. 구강내를 포타딘 용액으로 소득한 후 국소마취 유도와 지혈을 위해 1:100,000 에피네프린을 함유한 2% 리도카인(유한양행, 한국)을 하악의 잔존 치조골에 주사하였다(도 5).

나) 치조골 노출

미니피그의 잔존 치조골에 수평 절개와 수직 절개를 가한 후 골막을 박리하여 하악의 협측 및 설측 면을 최대한 노출시켰다.

다) 대조군, 실험군 형성

반경 3 mm의 micro saw를 이용하여 깊이 4-5mm, 길이 8 mm, 기저부 폭 6-7mm 정도의 saddle type 2 wall-bony defect를 형성하였다. 거친 부위는 수술용 round bur 혹은 chisel, mallet을 이용하여 주수하면서 모양을 형성하였다.

먼저 우측의 결손부에는 대조군으로 MBCP를 피브린 글루로 섞어 응고시켜 결손부를 채웠으며, 좌측의 결손부의 전방에는 실험군으로 MBCP/피브린 블록을 채워넣었다(도 6).

창상을 releasing incision을 시행하여 장력을 완화시키고 4-0 nylon을 이용하여 연속 잠금 봉합하였다. 모든 실험동물은 수술 후 감염예방을 위하여 3 일간 아목사실린( 티라목스^®, 삼진제약, 한국)과 디클로페낙 나트륨( 킨포인^®, 삼진제약, 한국)을 근육주사하였고, 1주일 동안 고단백 우유를 동반한 연식을 섭취시켰 다. 소독을 1주일 동안 클로르 헥시딘( 헥사메딘^®, 부광약품, 한국)을 이용하여 시행하였다(도 7).

2-3. 육안적 검사

수술 후 미니 피그의 사료 섭식상태 소독을 지속적으로 시행하였고, 미니피그의 상태를 건전한 상태로 유지하였다. 수술 후 2, 4, 8주에 희생하여 포르말린에 고정하기 전에 골 이식 부위의 치유양상과 염증 상태 및 창상 이개 정도를 육안적으로 관찰하였다.

2-4. 컴퓨터 단층 촬영 검사

이어 각 골 이식 부위를 디지털 표준 방사선 사진을 이용하여 확인하고, 각각을 분류하여 치과용 컴퓨터 단층촬영을 시행 하였다. 추후 이식부를 중심으로 이식부 사이에서 수직 및 수평 골절단을 시행하였다.

가) 3차원 컴퓨터 단층 촬영

각각의 이식재가 포함된 미니피그의 하악골에 대해 Conebeam CT(Alphad vega, asahi roentgen IND. CO., Japan)로 촬영하였다. 촬영조건은 80 KVp 관전압과 8 mA 관전류였고 촬영시간은 15초였다. 모든 시편의 해상도(spatial resolution)는 0.2 mm X O.2 mm 로 설정하여 시편당 약 512장의 영상을 획득하였 다. 획득된 영상은 .dcm 형식(format)으로 촬영된 정보를 담고 있으며, 이 파일은 dicom viewer 프로그램(Ondemand 3 application, cybermed, Korea)을 사용하였고 모든 영상은 판독용 모니터(WIDE, Korea)상에서 확인하고 분석하였다.

나) 골 밀도 분석

Dicom viewer 프로그램상에서 골결손부의 중심을 기준으로 관상면, 시상면, 횡단면의 축을 조정하였다. 횡단면상에서 골결손부 중앙, 상, 하, 좌, 우의 5부위를 10 pixel × 10 pixel의 ROI로 방사선불투과도(opacity)를 측정하였다. 결손부당 전방, 중간, 후방 3부위씩 측절하였고 각각의 미니피그당 2주, 4주, 8주 동안 동일한 분석을 시행하였다. 그리고 기간에 따라 방사선불투과도를 통계 분석하였다. 또한 이를 토대로 실험군간의 기간에 따른 방사선불투과도 변화를 통계 분석하였다. 이때 본 프로그램상의 수치는 상대적인 값으로 -1023~3071 까지 불투과성을 상대적으로 나타낸 것이며 미니피그의 피질골의 방사선 불투과도는 대략 500~1300, 해면골은 -100~600으로 하였다(도 8).

2-5. 조직학적 검사

수술 후 2, 4, 8주에 희생시켜, 각각의 조직 표본을 형성한 후 2 일간 10 % 중성 포르말린용액에 고정하고, 10 % EDTA로 탈회한 후, 통상적인 방법에 의하여 탈수 및 레진 포매를 하였으며, 4~6㎛의 박절 표본을 Poly-L-Lysine을 도포한 슬라이드에 부착하여 표본을 제작하였다. 조직 절편에는 골이식 부위 및 정상부위가 모두 포함되도록 제작하였으며 신생골과 섬유조직의 형태 관찰과 변화를 알아보기 위해 Hematoxylin & Eosin, Masson's trichrome 염색을 시행하여 검경하였다.

실시예 3: 연구결과

3-1. 임상적 소견

3 마리의 미니 피그 중 각 군당 1 증례씩 2 주, 4 주, 8 주로 나누어 분석하였다. 임상적으로 평가해 보면, 염증의 소견은 대조군의 2주에서 중등도의 염증을 동반하여 창상이개가 발생하였으나, 그 외 실험군에서는 실험 4주나 8주에서 모두 염증이나 창상이개는 없었으며 우수한 골 형성을 보였다(표 1).

MBCP+피브린 글루 및 MBCP/피브린 블록에 따른 염증

그룹	골 이식재	2주	4주	8주
대조군	MBCP+피브린 글루	±	-	-
실험군	MBCP/피브린 블록	-	-	-

( - : negative ± : rare + : mild ++ : moderate +++ : intense )

3-2. 방사선학적 소견

가) 3차원 컴퓨터 단층 촬영 평가

4주군에서 MBCP+피브린 글루의 대조군은 전체적인 모양이 높이가 약간 감소하면서 협측과 설측이 약간 흡수된 모양이며 치조제 정상폭이 2-3mm 정도 였으나, 실험군 (MBCP/피브린 블록)에서는 다소 협측의 골소실은 보이나 치조제는 보다 높고 넓은 형태를 유지하고 있었다(도 9).

나) 골 밀도 평가

방사선학적 소견에서 대조군, 실험군 모두에서 정상적인 골화 과정에 따라 골 밀도가 증가 하는 소견을 보였고, 대조군에 비해 실험군에서 현저한 골밀도 증가를 보였다. 대조군에 비해 freeze dried MBCP/fibrin block 군은 특히 2주, 8주군에서 높은 골 밀도를 보였다. 2 주군에서는 인공뼈와 fibrin을 block 처리함으로서 초기 이식 입자들의 안정화에 의미가 있고, 8 주에는 조기 성숙골화에 의한 골성숙을 보임을 나타낸다.(표 2)

치과 CT에 의한 골밀도에서의 변화(± 표준 편차)

그룹	골 이식재	2 주(*)	4 주(*)	8 주(*)
대조군	MBCP+피브린 글루	120.67 (± 5.62)	183.30 (± 4.4)	187.90 (± 4.67)
실험군	MBCP/피브린 블록(*)	*161.17 (± 5.31)	190.90 (± 2.00)	*234.07 (± 7.18)

* p < 0.05

3-3. 조직학적 소견

그 결과 대조군인 MBCP를 피브린 글루에 혼합하여 응고시킨 군에서는 이식 2주 군에서 이식골 주변으로 파골세포의 활성과 주변 혈관신생의 소견을 보였으며 이에 따라 부분적으로 신생골 형성을 나타내었다. 또한 4주에서는 골개조가 더욱 진행되는 모습이었으며 새로운 골의 형성이 더욱 더 많아졌다. MBCP/피브린 블록을 이식한 실험군에서는 이식 2주 후 피브린 구조체 내에 MBCP가 산재되어 있으나 부분적으로 피브린 구조가 해체되면서 신생혈관이 나타났으며 산재된 MBCP의 흡수소견과 주변에 신생골이 보였으며 4 주 후에는 조골세포의 활성이 더욱 뚜렷하여 결손부 외곽은 성숙골로 대체되는 양상이었다(도 10).

결론적으로 미니피그의 하악골에 saddle type의 2벽성 골결손부를 형성하고 각각에 MBCP/피브린 혼합물 또는 동결건조 MBCP/피브린 블록을 이식하여 술후 2주, 4주, 8주에 따른 골형성 효과를 육안적, 방사선학적, 조직학적으로 비교하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 육안적 검사 및 3차원 단층촬영 검사에서 MBCP/피브린 글루 이식군에 비하여 MBCP/피브린 블록 이식군이 보다 골형성이 뛰어났으며 골이식 형태를 잘 유지하였다.

2. 방사선학적 골밀도 검사에서 MBCP/피브린 글루 이식군에 비하여 MBCP/피브린 블록군 이식군이 보다 높은 골밀도를 보여 골형성이 양호함을 보였다.

3. 조직학적 검사에서 MBCP/피브린 글루 이식군에 비하여 MBCP/피브린 블록군이 보다 신생골 형성이 뛰어났으며 골개조가 빨랐다.

이상과 같은 결과로서 동결건조시킨 MBCP/피브린 블록을 이식하였을 때 종래 스캐폴드(MBCP/피브린 글루)에 그 형태 유지가 뛰어나고 골형성이 매우 우수함을 알 수 있었다.

도 1은 본 발명에서 이용된 피브린 글루의 키트 구성을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 동결건조된 Biocera/피브린 블록을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 동결건조된 MBCP/피브린 블록의 제조과정을 나타낸 것이다(a: MBCP와 피브린 글루의 혼합, b: 동결건조 전 젤 상태, c: 동결건조 과정, d: 동결건조 후 고형 상태).

도 4는 MBCP와 피브린 글루의 혼합물(a) 및 이를 동결건조하여 수득한 MBCP/피브린 블록의 상태(b)를 나타낸 것이다.

도 5는 실험동물인 미니피그의 마취 유도 과정, 발치 과정 및 발치된 치아를 각각 나타낸 것이다.

도 6은 미니피그 치조 결손부내에 본 발명에 따른 골 이식재를 이식할 위치를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 골 이식재를 이식하는 과정을 나타낸 것이다(A. 하악의 잔존치조제의 판막을 거상하여 이식부위 노출, B. Saddle 형태의 only 골결손부를 형성, C. MBCP와 피브린 글루의 혼합물 또는 MBCP/피브린 블록의 이식).

도 8은 Dicom viewer program에 의한 골 밀도 분석 과정을 나타낸 것이다[a: 라인 조정, b: 두께 조정, c: 밀도 측정, d: 3 조각(10x10 pixel size, 3mm 두께)에 의해 분할된 밀도 측정]

도 9는 본 발명의 골 이식재가 이식된 부위에 대한 3차원 컴퓨터 단층 촬영 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 골 이식재가 이식된 부위에 대한 조직면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.

Claims

피브린 글루에 사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말 및 합성된 골 분말 중에서 선택된 적어도 1종의 골 분말이 혼합되고 동결건조되어, 뼈 성장촉진을 위한 인자를 수용하기 위한 복수의 세공이 형성되며 100~3,000 kPa의 강도를 가진 굳은 상태로, 뼈 재생이 필요한 결손부에 적합한 형상을 가진 뼈 재생용 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 스캐폴드는 동결건조되기 전 형상을 가지도록 처리된 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 스캐폴드는 형틀 내에서 동결건조된 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제3항에 있어서, 상기 형틀은 (a) 3차원 CT를 이용한 3차원 두개골 모형 제작 과정, (b) 상기 3차원 모형에서 치과용 레진을 이용하여 결손부위에 적합한 스캐폴드 제작용 형틀을 만드는 과정으로 제조되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 골 분말은 뼈 세포가 제거된 뼈의 분쇄물인 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
삭제
제1항에 있어서, 상기 피브린 글루는 피브리노겐과 트롬빈을 포함하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제7항에 있어서, 상기 피브리노겐은 10 내지 1000mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제7항에 있어서, 상기 트롬빈은 0.1 내지 1000IU/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 피브린 글루는 아프로티닌(aprotinin) 또는 염화칼슘을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 피브린 글루는 수용성 바인더를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제11항에 있어서, 상기 수용성 바인더는 세포배양배지, 증류수 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제1항에 있어서, 골 분말과 피브린 글루는 1~10 대 1의 비율로 이루어지는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 뼈 성장촉진을 위한 인자는 호르몬, 사이토카인 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말 및 합성된 골 분말 중에서 선택된 적어도 1 종의 골 분말과 피브린 글루를 혼합한 후, 뼈 재생이 필요한 결손부에 대응하는 형틀 내에서 동결건조하여, 뼈 성장촉진을 위한 인자를 수용하기 위한 복수의 세공이 형성되며 100~3,000 kPa의 강도를 가진 굳은 상태로, 뼈 재생이 필요한 결손부에 적합한 형상을 가진 뼈 재생용 스캐폴드의 제조방법.
삭제
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제15항에 있어서, 상기 형틀은 (a) 3차원 CT를 이용한 3차원 두개골 모형 제작 과정, (b) 상기 3차원 모형에서 치과용 레진을 이용하여 결손부위에 적합한 스캐폴드 제작용 형틀을 만드는 과정으로 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 골 분말은 뼈 세포가 제거된 뼈의 분쇄물인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제15항에 있어서, 상기 피브린 글루는 피브리노겐과 트롬빈을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 피브리노겐은 10 내지 1000mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 트롬빈은 0.1 내지 1000IU/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 피브린 글루는 아프로티닌(aprotinin) 또는 염화칼슘을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 피브린 글루는 수용성 바인더를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 수용성 바인더는 배양배지, 증류수 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 골 분말과 피브린 글루는 1~10 대 1의 비율로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 뼈 성장촉진을 위한 인자는 호르몬, 사이토카인 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.