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KR100924990B1 - 불순물 함량을 감소시킨 블록 공중합체, 고분자 담체 및고분자 의약제제 및 그 제조 방법 - Google Patents

불순물 함량을 감소시킨 블록 공중합체, 고분자 담체 및고분자 의약제제 및 그 제조 방법 Download PDF

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KR100924990B1
KR100924990B1 KR1020037016687A KR20037016687A KR100924990B1 KR 100924990 B1 KR100924990 B1 KR 100924990B1 KR 1020037016687 A KR1020037016687 A KR 1020037016687A KR 20037016687 A KR20037016687 A KR 20037016687A KR 100924990 B1 KR100924990 B1 KR 100924990B1
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KR
South Korea
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poly
polyethylene glycol
amino acid
acid
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KR1020037016687A
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타케시 나카니시
카즈히사 시미즈
류지 우에하라
마사노부 스즈키
메구미 마치다
토모코 아쿠츠
시게토 후쿠시마
Original Assignee
니폰 가야꾸 가부시끼가이샤
사쿠라이 야스히사
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Abstract

본 발명은 필수적으로 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)을 포함하는 블록 공중합체로 부터 불순물을 충분히 제거할 수 있고, 의약 제제 등에 사용될 수 있는 순도의 고분자 담체를 제조하는데 유용한 정제 방법; 고분자 담체의 제조 방법; 불순물 함량을 감소시킨 블록 공중합체; 고분자 담체; 이러한 고분자 담체를 사용한 고분자 의약 제제; 블록 공중합체에 포함된 불순물인 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(산성 아미노산)을 이온 교환수지 또는 분배/흡착 수지에서 처리한 후, 겔 여과 컬럼을 사용해 그 량을 결정하는 정량방법을 제공한다.

Description

불순물 함량을 감소시킨 블록 공중합체, 고분자 담체 및 고분자 의약제제 및 그 제조 방법{BLOCK COPOLYMER REDUCED IN IMPURITY CONTENT, POLYMERIC CARRIER, PHARMACEUTICAL PREPARATIONS IN POLYMERIC FORM AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF THE SAME}
본 발명은, 약물 등을 운반할 때 담체로 사용될 수 있는 고순도 블록 공중합체, 블록 공중합체를 안트라시클린계 항암제와 축합반응시켜 형성되며 의약제 담체로 사용될 수 있는 고분자 담체, 그 고분자 담체에 의해 형성되는 고분자 의약 제제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그 블록공중합체내의 불순물을 정량하는 방법에 관한 것이다.
미셀을 형성하는 고분자 담체를 사용하여, 약물, 유전자 등을 생체 내 목적장소로 운반하려는 시도가 알려져 왔으나, 이제까지 이러한 용도로 사용되는 블록 공중합체에 있어서 불순물이 충분히 제거될 수 있었다고는 할 수 없다.
종래에, 블록 공중합체 등의 합성 고분자 화합물의 정제에는, 투석법, 한외여과법, 침전법 등의 방법이 사용되어 왔다.
투석, 한외여과에 의한 정제법은, 분자량의 차에 착안하여 분리 및 정제하는 방법이다. 일반적으로 투석막, 한외여과 필름은, 투과할 수 있는 최대 분자량에 의해 분류되고 있는데, 그 분자량 분획의 정밀도에는 큰 편차가 있다. 따라서, 투석, 한외여과에 의해 블록 공중합체 등의 합성 고분자를 정제하는 방법에 있어서, 대상으로 하는 합성 고분자의 분자량과 불순물의 분자량 사이에 큰 차가 없는 경우는, 충분한 정제를 할 수 없었다. 또한, 이 방법은 산업적 용도로는 적합하지 않고, 오로지 실험실에서의 정제법으로 사용되었다.
한편, 침전법에 의한 정제법은, 공업적으로도 적용 가능한 방법으로서 널리 실시되어 왔다. 이 방법은 용매에 대한 용해도의 차를 이용하여 불순물을 제거함으로써 정제하는 방법이고, 블록 공중합체 등의 합성 고분자 화합물에 포함되는 저분자량 성분을 제거하는 데 좋은 방법이다. 그러나, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(산성 아미노산) 등의 분자량이 큰 불순물의 경우, 블록 공중합체 등의 합성 고분자 화합물과 불순물의 용매에의 용해도의 차가 적어, 침전에 의해 블록 공중합체와 같은 고분자 화합물을 충분히 정제될 수 없다.
이와 같이, 블록 공중합체에 포함된 분자량이 큰 불순물은 충분히 제거되지 않았고, 의약 제제 등으로도 사용할 수 있는 블록 공중합체를 얻는 데 적합하게 사용될 수 있는 정제법은 아직 알려져 있지 않았다.
또한, 친양성(amphipathic property)을 가지는 미셀-형성 블록 공중합체에 대하여, 블록 공중합체 중의 불순물을 정량하기 위한 종래의 방법도 만족스런 분석 결과를 주는 것은 아니었다.
종래의 방법에 있어서, 블록 공중합체 등의 합성 고분자는, 용매에 용해되어, 겔 여과 컬럼이 연결된 고속 액체 크로마토그래피(gel permeation chromatography: GPC)에 의해 분석되었다.
그러나, 블록 공중합체와 이에 포함되는 불순물 사이의 분자량의 차가 적은 경우, 양자를 명료한 피이크로 분리하는 것이 곤란하여, 불순물 정량법으로서 그 성능은 불충분하였다.
또한, 양자 분자량의 차가 충분한 경우에도, 불순물량이 소량인 경우에는 명료한 피이크가 얻어지지 않는다. 이것은 겔 여과분리 기구가 분자 확산을 이용하고 있기 때문에, 크로마토그래피상 피이크가 퍼지기 쉽고, 양적으로 적은 성분에 관해서는 피이크의 높이가 충분히 얻어지지 않게 된다. 따라서, 종래의 방법들은 충분한 성능을 갖는 정량방법을 제공하는 데 성공하지 못하였다.
또한, 분자량의 차에만 기초하여 주성분과 불순물을 분리 정량하기 때문에, 불순물의 구조, 유래 등의 정성적인 정보는 일절 얻어질 수 없었다.
본 발명자들은, 상기의 문제점들을 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은,
(1) 불순물의 함량이 10중량% 이하인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염,
(2)(1)에 있어서, 불순물이 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(산성아미노산)인 블록 공중합체 또는 그의 염,
(3)(1) 또는 (2)에 있어서, 폴리 산성 아미노산이 폴리아스팔트산인 블록 공중합체 또는 그의 염,
(4)(1) 또는 (2)에 있어서, 블록 공중합체가 일반식(1)의 공중합체인 블록 공중합체 또는 그의 염;
Figure 112003048688720-pct00001
(상기 식에서, Rl은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내고, R2는 결합 작용기를 나타내며, R3은 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R4는 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타내며, n은 5-1000의 정수, m은 2-300의 정수, x는 0-300의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않음),
(5)(4)에 있어서, 일반식(1)의 Rl이 탄소수 1∼5의 알킬기, R2가 탄소수 1∼5의 알킬렌기, R3이 메틸렌기 또는 에틸렌기, R4가 수소원자 또는 탄소수 1∼5의 아실기이고, n은 5-1000, m은 2-300, x는 0-300의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않은 블록 공중합체 또는 그의 염,
(6)(4)에 있어서, 일반식(1)의 Rl이 메틸기, R2가 트리메틸렌기, R3이 메틸렌 기, R4가 아세틸기이고, n은 20-500, m은 10-100, x는 0-100의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않은 블록 공중합체 또는 그의 염,
(7) 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 이온 교환 수지에 의해 정제하여 블록 공중합체를 제조하고, 보호기를 제거한 후, 필요에 따라 분배/흡착 수지를 사용하여 정제하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 블록 공중합체 또는 그의 염의 제조방법,
(8)(1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 블록 공중합체의 폴리(산성 아미노산)이 안트라시클린계 항암제 잔기와 축합되어 있는 고분자 담체,
(9)(8)에 있어서, 폴리(산성 아미노산)과 안트라시클린계 항암제 잔기의 축합반응이, 폴리(산성 아미노산)의 측쇄 카르복실산과 안트라시클린계 항암제 잔기 사이의 축합반응인 고분자 담체,
(10) (8) 또는 (9)에 있어서, 안트라시클린계 항암제 잔기가 독소루비신 잔기인 고분자 담체,
(11) (8) 또는 (9)에 있어서, 폴리(산성 아미노산)에서의 안트라시클린계 항암제 잔기의 결합 비율이 30∼55%인 고분자 담체,
(12) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 블록 공중합체와 반응조제 사이의 축합 화합물을 분리한 후, 이 축합 화합물에 안트라시클린계 항암제를 반응시키는 것을 특징으로 하는 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 고분자 담체의 제조방법,
(13)(12)에 있어서, 안트라시클린계 항암제가 독소루비신 또는 그의 염인 고분자 담체의 제조방법,
(14) 안트라시클린계 항암제가 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 고분자 담체에 의해 형성되는 미셀의 내핵에 포함되는 블록 공중합체-약제 복합체를 함유하는 고분자 의약제제,
(15) (14)에 있어서, 안트라시클린계 항암제가 독소루비신 또는 그의 염인 고분자 의약제제,
(16) (14) 또는 15)에 있어서, 상기 블록 공중합체-약제 복합체가 동결 건조 형태로 포함되는 것을 특징으로 하는 고분자 의약 제제,
(17) (1)에 따른 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체에 포함된 불순물을 정량하는 방법으로서, 블록 공중합체를 용매에 용해시키는 단계, 이 용액을 수지 처리하는 단계, 및 그 처리액을 겔 여과 컬럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법,
(18)(17)에 있어서, 용매가 물과 혼합된 유기 용매를 포함할 수도 있는 물이고, 수지가 이온 교환 수지이며, 불순물이 폴리에틸렌 글리콜인 정량 방법, 및
(19) (17)에 있어서, 용매가 물과 혼합된 유기 용매를 포함할 수도 있는 물이고, 수지가 에테르 결합을 가지는 화합물을 흡착하는 분배/흡착 수지이며, 불순물이 폴리(산성 아미노산)인 정량 방법을 제공한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 실시 형태
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명 제1의 태양은, 불순물의 함량이 10중량% 이하인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염에 관한 것이다. 그 블록 공중합체에 포함되는 불순물을 분석한 결과, 불순물은, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(산성 아미노산), 즉 카르복실산을 측쇄에 가지는 폴리아미노산인 것으로 밝혀졌다. 폴리에틸렌 글리콜의 예로는, 폴리에틸렌 글리콜, 일측-말단 알콕시 폴리에틸렌 글리콜 등을 들 수 있다. 폴리(산성아미노산)의 예로는, 폴리글루탐산, 폴리아스팔트산을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체에 있어서의 폴리(산성 아미노산)으로는, 측쇄에 카르복실기를 가지는 α- 및/또는 β-아미노산 중합체를 들 수 있고, 바람직하게는 폴리글루탐산 또는 폴리아스팔트산이고, 블록 공중합체로서는, 예컨대, 상기 일반식(1) 또는 (2)의 블록 공중합체 또는 그의 염을 들 수 있다.

(상기 식에서, Rl은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내고, R2는 결합 작용기를 나타내며, R3은 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R4는 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타내며, n은 5-1000의 정수, m은 2-300의 정수, x는 0-300의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않음).
또한, Rl로는 수소 원자 또는 저급알킬기를 들 수 있으며, 저급알킬기가 바람직하고, 구체적인 예로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기 등을 들 수 있으며, 특히 메틸기가 바람직하다. R2의 결합기로는, 분지쇄를 가지는 탄화수소 작용기를 들 수 있으나, 바람직하게는 알킬렌기이고, 구체적인 예로는 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기 등을 들 수 있으며, 특히 에틸렌기, 트리메틸렌기가 바람직하다. R3로는 메틸렌기 또는 에틸렌기를 들 수 있으며, 메틸렌기가 바람직하다.
R4로는 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 들 수 있고, 아미노기의 보호기로서는 통상 사용되는 아미노기의 보호기이면 특별히 한정되지는 않으며, 바람직하게는 저급 아실기가 사용되고, 구체적인 예로서는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티로일기 등을 들 수 있고, 아세틸기가 특히 바람직하다. 이때, n은 5-1000, 바람직하게는 20-500, 특히 바람직하게는 80-300의 정수, m은 2-300, 바람직하게는 10-100, 특히 바람직하게는 20-50의 정수, x는 0-300, 바람직하게는 0-100, 특히 바람직하게는 0-50의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않다.
본 발명에서의 블록 공중합체 염으로서는, 알칼리 금속염, 알칼리토 과금속염, 암모늄염, 유기 암모늄염 등을 들 수 있고, 예를 들면 나트륨염,칼륨염, 칼슘염, 암모늄염, 및 트리에틸 암모늄염 등이 바람직하다.
블록 공중합체에 포함되는 불순물은, 미셀을 형성하지 않으며, 약물, 유전자 등의 고분자 담체로서의 성능을 가지지 않는 것으로 생각되며, 따라서, 의약적 용도로 사용되기 위하여, 불순물의 함량이 10%이하인 것이 바람직하고, 5% 이하인 것이 보다 더 바람직하다.
본 발명의 제2의 태양은, 폴리에틸렌 글리콜을 이온 교환 수지에 의해 정제하고, 폴리(산성 아미노산)과 블록 공중합체를 형성하며, 필요에 따라 보호기를 제거한 후에 분배/흡착 수지를 사용하여 정제하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염의 제조방법에 관한 것이다. 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체로는, 상술한 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중체와 같은 블록 공중합체가 바람직하게 사용된다. 블록 공중합체가 보호기에 의해 보호되어 있는 경우, 보호기로는, 통상 산성 아미노산의 측쇄에서 카르복실기를 보호하는 것이면 특히 한정적이지는 않으며, 예컨대, 저급 알코올과의 에스테르, 치환체를 가질 수 있는 아실기 치환 저급 알코올과의 에스테르 등을 들 수 있다. 구체적으로, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 프로필 에스테르, 부틸 에스테르, 벤질 에스테르, 페네틸 에스테르, p-메톡시벤질 에스테르, p-니트로벤질 에스테르 등이 있다. 보호기의 제거 방법으로는, 보호기에 따라 통상 사용되는 적당한 방법을 사용할 수 있지만, 예컨대, 산 또는 알칼리에 의한 가수분해법, 촉매 등을 사용한 가수소분해법 등을 들 수 있다.
이하에서, 본 발명에 따라 불순물 함량의 감소시킨 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체로서 예컨대, 일반식(1)로 표현되는 화합물에 대한 정제 방법을 구체적으로 설명한다.
블록 공중합체 합성 방법에 관하여는, 여러가지 방법이 있을 수 있으며, 예컨대, 일본 특허출원 공개공보 제6-206832호에는 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜의 수산기 말단을 변성시킴으로써 얻어지는 물질을 아스파라긴산 유도체와 중 합반응시킨 후, 아미노기를 보호하고, 에스테르 결합을 가수분해시켜 블록 공중합체를 제조하는 방법이 기재되고 있으나, 고순도 블록 공중합체를 얻기 위한 정제법은 아직 알려져 있지 않다.
일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜의 수산기 말단의 변성은, 당업계에 있어서 공지의 반응을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대, 에틸렌 이민 등을 반응시키는 방법, 아실로니트릴, 메타아크릴로니트릴 등으로 마이클 부가(Michel addition)를 행한 후, 니트릴기를 환원하여 아미노기로 변환하는 방법, 수산기를 할로겐으로 치환한 후, 에탄올 아민 등의 알코올 아민과 반응시키는 방법, 수산기를 직접 니트릴기로 변환시킨 후, 환원하여 아미노기로 변환시키는 방법 등에 의해 행해질 수 있다.
일측-말단을 아미노기로 변성한 폴리에틸렌 글리콜에는 변성이 불완전한 일측-말단 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대, 수산기 말단을 가지는 일측-말단 폴리에틸렌 글리콜 및 말단에 아크릴로니트릴이 부가된 일측-말단 폴리에틸렌 글리콜 등이 포함된다.
이러한 변성이 불완전한 폴리에틸렌 글리콜은 산성 작용기를 가진 이온 교환체를 사용하여 분별 제거할 수 있다. 이용가능한 이온 교환체로는 산성 작용기를 가지는 것이라면 특별히 제한적이지는 않으며, 예컨대, 상업적으로 이용가능한 것들이 있다[이온교환수지로서, Diaion SKIB (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Diaion PK-216 (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Diaion WK-10 (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Diaion WK20 (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Amber lite 120B (Rohm and Haas Japan Co. 제조), Amber lite 200C (Rohm and Haas Japan Co. 제조), Amber lite IRC-50 (Rohm and Haas Japan Co. 제조), Amber lite IRC-76 (Rohm and Haas Japan Co. 제조) 및 Dowex50W(Dow Chemical Corp. 제조)이 포함되며; 이온교환 겔로서, SP-Sephadex C-25 (Pharmacia Biotech 제조), SP-Sephadex C-50 (Pharmacia Biotech 제조), CM-Sephadex C-25 (Pharmacia Biotech 제조), CM-Sephadex C-50 (Pharmacia Biotech 제조), SP-Toyopearl 550 (Toso K.K. 제조), SP-Toyopearl 650 (Toso K.K. 제조), CM-Sephadex 550 (Pharmacia 제조) 및 CM-Sephadex 650 (Pharmacia 제조)이 포함되고; 특히, SP-Toyopearl 650 및 CM-Sephadex 650가 바람직하게 사용됨].
얻어진 폴리에틸렌 글리콜을 정제하는 방법으로는 배치법 또는 컬럼법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컬럼법이 사용된다. 즉, 변성 말단을 가지는 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜이 용매에 용해된다. 사용하는 용매는 이온 교환으로 사용할 수 있는 것이면 특별한 제한은 없으나, 물 또는 물/유기 용매의 혼합 용매, 예컨대, 물-메탄올, 물-아세토니트릴 등이 바람직하다. 계속하여, 생성 용액을 H+ 형태로 재생되는 상기 이온 교환체가 충전된 컬럼을 통과시키고, 컴럼을 물 또는 물/유기 용매의 혼합 용매로 세정하여, 변성이 불완전한 폴리에틸렌 글리콜을 제거한다. 그 후, 염기성 물질을 첨가한 용매, 바람직하게는 암모니아수 또는 암모니아수-유기 용매의 혼합 용매에, 흡착된 말단이 아미노기로 변성한 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜을 용출시킨다. 용출액을 농축, 동결 건조 등과 같이 적당하게 처리함으로써, 말단을 아미노기로 변성시킨 고순도 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜을 얻는다.
다음으로, 말단 아미노기로 변성된 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜과, 예컨대, 측쇄의 카르복실기를 보호한 아미노산의 N-카르복실산 무수물을 반응시키고, 블록 공중합체를 합성한 후, 필요에 따라 무수초산 등으로 말단의 아미노기를 아세틸화한다. 그 후, 필요에 따라 측쇄의 보호기를 탈보호하고, 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체를 얻는다.
이렇게 얻어진 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체에는 불순물로서 폴리(산성 아미노산)이 포함되는데, 이는 분배/흡착 수지에 의해 정제할 수 있다. 분배/흡착 수지로는, 실리카겔, 규산염 분말, 탄화수소에 의해 변성된 실리카겔, 스티렌/디비닐벤젠 수지 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 스티렌/디비닐벤젠 수지, 보다 더 바람직하게는 HP-20SS(Mitsubishi Chemical Corporation 제조)가 사용된다.
얻어진 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체의 정제방법은 배치법 또는 컬럼법이 있으며, 바람직하게는 컬럼법이 사용된다. 즉, 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체를 용매에 용해시킨다. 사용하는 용매는 폴리(산성 아미노산)을 해리시키는 염기성을 가지며, 분배/흡착 수지에 사용할 수 있는 것이라면 특별히 제한적이지는 않으며, 알칼리금속수산화물 수용액 또는 알칼리금속수산화물 수용액/유기 용매의 혼합 용매, 예컨대, 수산화나트륨 수용액-메탄올, 수산화나트륨 수용액-아세토니트릴 등이 바람직하다. 용매에 용해시킨 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체 용액을, 분배/흡착 수지가 충전된 컬럼에 통과시킨 다음, 수산화나트륨 수용액 또는 수산화나트륨 수용액/유기 용매의 혼합 용매를 컬럼에 통과시킴으로써 폴리(산성 아미노산)을 제거한다. 그 후, 저극성 용매 예컨대, 유기용기의 비율을 높인 물/유기용매의 혼합 용매와 같은 용매를 사용하여, 흡착한 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체를 용출시킨다. 이렇게 용출된 용액을 농축, 동결건조, 또는 침전 등의 적당한 방법으로 후처리하여, 고순도 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체를 얻는다.
본 발명의 제3의 태양은, 정제된 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체와 안트라시클린계 항암제를 축합반응시킴으로써 얻을 수 있는 고분자 담체에 관한 것이다. 고분자 담체로는, 아래 일반식(3) 또는(4)로 표현되는 고분자 화합물을 들 수 있다. 본 발명에는 그의 염도 포함된다:
Figure 112003048688720-pct00002
Figure 112003048688720-pct00003
(상기 식에서, R은 수산기 또는 안트라시클린계 항암제 잔기를 나타내며, Rl은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내고, R2는 결합 작용기를 나타내며, R3은 메 틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R4는 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타내며, n은 5-1000의 정수, m은 2-300의 정수, x+y는 0-300의 정수를 나타내며, x+y는 m 보다 크지 않음).
본 발명에서의 일반식 (3) 또는 (4)의 화합물에 있어서, R로는, 수산기 또는 안트라시클린계 항암제 잔기를 들 수 있다. 블록 공중합체의 폴리(산성 아미노산) 부분에 있어서, 그 구성 각 부분의 결합 순서는 한정적이지 않으며, 랜덤하게 또는 규칙적일 수 있다. 블록 공중합체의 폴리(산성 아미노산)부분의 측쇄 카르복실산 잔기와 안트라시클린계 항암제 잔기의 결합 양식은 특별히 제한적이지는 않으며, 안트라시클린계 항암제의 아미노기와의 아미드 결합이 바람직하다. 특히 안트라시클린계 항암제의 아미노 부분의 1급 아미노기에 의한 아미드 결합이 바람직하다. 폴리(산성 아미노산) 부분의 측쇄 카르복실산 잔기에 대하여 안트라시클린계 항암제가 결합하고 있는 비율은 1∼100%이며, 미셀을 형성하는 능력을 고려하면, 10∼60%가 바람직하고, 30∼55%가 특히 바람직하다. 안트라시클린계 항암제 잔기로는, 다우노루비신, 독소루비신, 아크라루비신, 에피루비신 및 피라루비신이 있으며, 독소루비신 잔기가 바람직하게 사용된다.
Rl, R2, R3, R4 및 n은 상기한 바와 같은 범위가 바람직하다.
또한, x+y는 0-300, 바람직하게는 0-100, 특히 바람직하게는 0-50의 정수를 나타내고, x 및 y는 상기 조건을 포함하는 정수이면 0을 포함하는 어떠한 값도 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 제4의 태양은, 정제한 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체와 반응조제를 축합반응하게 하고, 이 축합화합물을 분리한 후, 안트라시클린계 항암제를 반응시킴으로써 고분자 담체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 고분자 담체는, 국제특허출원공개공보 제WO97/ 12895호에 개시된 방법, 즉 블록 공중합체와 안트라시클린계 항암제를 카르보이미드형의 탈수축합제로 축합반응시키는 방법에 의해서도 얻어지나, 이 때 활성중간체인 아실이소우레아가 분자내 전이하여 부산물로서 아실우레아를 생성하여, 아실우레아가 부가된 고분자 담체를 생성한다. 블록 공중합체와 반응조제와의 축합화합물을 분리함으로써 부산물 아실우레아를 억제하고, 아실우레아의 부가가 적은 고분자 담체를 제공할 수 있게 된다. 부산물 아실우레아의 량은, 가스 크로마토그래피 주입구의 온도를 충분히 높게 설정해 놓고, 아실우레아로부터 열분해된 이소시아네이트 유도체를 측정함으로써 결정된다.
이하에서, 상기 제조방법을 보다 구체적으로 설명한다. 정제한 블록 공중합체를 유기용매에 용해하고, 탈수 축합제와 반응조제를 첨가하여 반응시키며, 반응에 의해 생긴 알킬우레아 유도체를 여과하여, 여과액으로부터 활성 에스테르체를 분리한다. 계속하여, 얻어진 활성 에스테르체에 유기 용매중에서 안트라시클린계 항암제 또는 그 염을 첨가한 다음, 필요한 경우, 염기를 가해 반응시키고, 반응용액으로부터 고분자 담체를 분리한다. 유기 용매로서는, 반응물이 용해될 수 있으면 특별히 제한적이지는 않으나, 비수성 극성용매가 바람직하며, 예컨대, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 등을 들 수 있고, 디메 틸포름아미드가 바람직하다. 블록 공중합체와 반응조제와의 축합반응에 사용되는 탈수축합제로서는, 통상 펩티드 합성에 사용되는 축합반응제가 사용되며, 시클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)등이 바람직하다. 반응조제로는 통상 펩티드 합성에 사용되는 반응조제가 사용된다. 예컨대, N-히드록시 화합물을 들 수 있고, N-히드록시 숙신이미드나 N-히드록시 벤조트리아졸 등이 바람직하다. 사용하는 염기는 특별히 제한적이지는 않으며, 트리에틸아민 등의 유기 염기가 바람직하다. 안트라시클린계 항암제로는, 상기 안트라시클린계 항암제 잔기를 제공하는 안트라시클린-기재 화합물을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 제5의 태양은, 제조한 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체로부터 제조되는 고분자 담체가 만드는 미셀 내핵에 안트라시클린계 항암제가 내포되어 있는 블록 공중합체-약제 복합체를 포함하는 고분자 의약제제에 관한 것이다. 안트라시클린계 항암제로서는, 다우노루비신, 아크라루비신, 에피루비신 및 피라루비신 또는 그 염이 있으며, 독소루비신 또는 그 염이 바람직하게 사용된다. 블록 공중합체-약제 복합체가 동결 건조물의 형태로 포함되는 고분자 의약 제제도 본 발명 하나의 태양이다. 상기한 고분자의약 제제의 제조 방법은 특별히 제한적이지는 않으며, 일본특허출원 공개공보 제7-69900호에 기재되어 있는 방법, 즉 블록 공중합체와 안트라시클린계 항암제를 용해한 디메틸포름아미드와 물의 혼합 용매를 투석막을 사용한 투석 조작 및 한외여과막을 사용한 다른 여과 조작을 이용하며, 필요에 따라 동결 건조하는 방법을 적용할 수도 있다. 또 에탄올 등의 물과 혼화가능한 저비점 유기 용매와 물과의 혼합 용매에 블록 공중합체와 안 트라시클린계 항암제를 용해하고, 얻어지는 용액을 농축함으로써 저비점 유기 용매를 증류 제거하고, 필요에 따라 동결 건조하는 방법에 의할 수도 있다.
본 발명의 제6의 태양은, 상기한 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체 중에 포함된 불순물의 량을 정량함에 있어서, 당해 블록 공중합체를 용매에 용해하고, 이 용해액을 수지처리하며, 그 처리액을 겔 여과 컬럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피 처리하는 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서의 폴리에틸렌 글리콜-폴리(산성 아미노산) 블록 공중합체 및 그 블록 공중합체내의 불순물에 관해서는, 상기한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 불순물로서 폴리에틸렌 글리콜을 정량 분석할 때, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체 용해하는 용매로는, 블록 공중합체를 용해할 수 있는 임의의 용매가 이용될 수 있으나, 바람직하게는 적당한 염에 의해 pH가 조정된 수용액, 또는 이들과 유기용매, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란 등과의 혼합 용매가 사용된다. pH를 조정하기 위하여 사용하는 염으로는, 통상 사용되는완충작용을 하는 염이 사용할 수 있으며, 인산염, 포름산염, 탄산수소나트륨염, 프탈산염, 트리스염산염 등이 바람직하다.
또한, 불순물로서 폴리아미노산을 정량 할 때의 용매로서는, 폴리에틸렌글리콜을 측정할 때 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체를 용해하고, 측쇄의 카르복실산을 해리할 수 있는 임의의 용매가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 적당한 염에 의해 pH가 조정된 수용액, 또는 이들과 유기 용매, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란 등과의 혼합 용매가 사용된다. 측쇄의 카르복실산을 해리하기 위한용매의 pH는 5∼13이 바람직하고, 이를 위해 사용하는 염으로서는, 상기한 인산염, 포름산염, 탄산수소나트륨염, 프탈산염, 트리스염산염 등이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 블록 공중합체에 불순물로서 포함되는 폴리에틸렌 글리콜을 정량 할 때, 그 블록 공중합체 용액을 처리하기 위한 수지는, 블록 공중합체의 이온 해리기와 대응하는 이온을 형성할 수 있는 이온 교환 수지, 즉 음이온교환수지가 바람직하고, 디알킬아민, 트리알킬아민, 디알킬에탄올아민류 등의 염기성 작용기를 가지는 것이면 특별히 제한없이 사용될 수 있다. 분석법으로서는 컬럼법 또는 배치법 어느 것이나 이용가능하나, 바람직하게는 컬럼법이 사용된다.
컬럼법에는 오픈 컬럼에 이온 교환 수지[예컨대, Diaion SA10A(Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Diaion PA318 (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Diaion SA20A (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Diaion WA30 (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Diaion WA10 (Mitsubishi Chemical Corporation 제조), Amber lite IRA402 (Rohm and Haas Japan Co. 제조), Amber lite MR904 (Rohm and Haas Japan Co. 제조), Amber lite IRA410 (Rohm and Haas Japan Co. 제조), Amber lite IRA93 (Rohm and Haas Japan Co. 제조), Amber lite IRA68 (Rohm and Haas Japan Co. 제조), 및 Dowex66 (Dow Chemical Japan Corp. 제조)]; 셀룰로스 이온 교환 수지체[예컨대, Cellex QAE (Bio-Rad Co., Ltd. 제조), Cellex PEI (Bio-Rad Co., Ltd. 제조), Cellex D (Bio-Rad Co., Ltd. 제조) 및 Cellex DE52 (Bio-Rad Co., Ltd. 제조)]; 또는 겔 이온 교환수지체[예컨대, QAE- Sephadex A25 (Pharmacia Biotech 제조), QAE-Sephadex A50 (Pharmacia Biotech 제조), DEAE-Sephadex A25 (Pharmacia Biotech 제조), DEAE-Sephadex A50 (Pharmacia Biotech 제조), DEAE-Separose CL-6B (Pharmacia Biotech 제조) 및 DEAE-Bio Gel A (Pharmacia Biotech 제조)]을 충전하여 행하는 방법; 또는 사전에 이온 교환 수지가 충전된, 고속 액체 크로마토그래피에 의한 전처리법에 사용되는 시판 카트리지[예컨대, Sep-Pak QMA (Waters Co., Ltd. 제조), Sep-Pak NH2 (Waters Co., Ltd. 제조), Bond Elut PSA (Barian Co., Ltd. 제조), Bond Elut DMA (Barian Co., Ltd. 제조) 및 Bond Elut SAX (Barian Co., Ltd. 제조)]를 사용하는 방법이 있으나, 분석의 용이성으로 인하여 카트리지를 사용하는 편이 바람직하다. 특히 바람직하게는 Sep-Pak QMA이 사용된다.
당해 블록 공중합체에 불순물로서 포함되는 폴리에틸렌글리콜의 정량 분석으로는, 상기 수지 처리를 거쳐 수지에 흡착되지 않고 용출된 폴리에틸렌 글리콜를, 겔 여과 컬럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분석결과를 얻을 수 있다. 이 방법에서는, 용출된 용액을 고농도로 농축할 수 있기 때문에, 폴리에틸렌 글리콜을 고감도로 정량 분석할 수 있다.
본 발명에 불순물의 정량에 사용하는 겔 여과 컬럼의 담체로는, 고속 액체 크로마토그래피로 사용되는 것이면 제한적이지 않으며, 블록 공중합체중의 불순물의 대략적인 분자량에 따라 적당한 배제 한계 분자량을 가지는 것이 사용된다. 폴리에틸렌 글리콜의 정량용으로는, 특정 담체[예컨대, Shodex OHpak SB-803 HQ (Showa Denko K.K. 제조), Shodex OHpak SB-802.5 HQ (Showa Denko K.K. 제조), Shodex OHpak SB-804 HQ (Showa Denko K.K. 제조)], 폴리(산성 아미노산)의 정량 분석에 대하여는 특정 담체[예컨대, Asahipak GF-310 HQ (Asahi Kasei Corporation 제조) 및 Asahipak GF-510 HQ (Asahi Kasei Corporation 제조)]가 사용될 수 있다. 부가적으로, Asahipak GS-320 HQ (Asahi Kasei Corporation 제조) 및 Shodex OHpak Q-802 (Showa Denko K.K. 제조)도 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 이용되는 고속액체크로마토그래피는, 시판하는 고속 액체 크로마토그래피 장치에 의해 행해질 수 있다.
또한, 본 발명에서의 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체에 불순물로서 포함되는 폴리(산성아미노산)의 정량분석에 사용하는 해당 블록 공중합체 용액을 처리하는 수지는, 에테르 결합을 가지는 블록 공중합체를 흡착하는 수지, 즉 분배/흡착 수지가 바람직하고, 실리카겔, 규산염 분말, 탄화수소에 의해 변성된 실리카겔, 스티렌/디비닐벤젠 수지 등을 들 수 있다. 탄화수소에 의해 변성된 실리카겔로서는, 탄소수 1 내지 30의 탄화수소에 의해 변성된 실리카겔이 바람직하고, 탄소수 4 내지 18의 탄화수소에 의해 변성된 실리카겔이 특히 바람직하다.
분석법으로는 컬럼법 또는 배치법이 모두 사용될 수 있으나, 바람직하게는 컬럼법에 의해 행해진다. 또한 시판되는 분배/흡착 수지를 충전한 컬럼도 사용할 수 있으며, 임의의 크기인 것이 사용될 수 있다. 또한, 시판되는 분석용 고상추출 컬럼, 예컨대, Sep-Pak C18( Waters Co., Ltd. 제조), Sep-Pak tC18 ( Waters Co., Ltd. 제조), Sep-Pak C8 ( Waters Co., Ltd. 제조), Bond Elut C18 ( Barian Co., Ltd. 제조) 및 Bond Elut C8 ( Barian Co., Ltd. 제조)가 사용될 수 있으며, Sep-Pak C18이 특히 바람직하게 사용된다.
당해 블록 공중합체에 불순물로서 포함되는 폴리(산성 아미노산)의 정량분석은, 카르복실산을 해리하는 용매에 용해시킨 용액를 상기 수지로 처리하고, 수지에 흡착되지 않고 용출되는 폴리(산성아미노산)을, 겔 여과 컬럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피에서 정량함으로써 가능하다. 이 방법은, 용출한 용액을 고농도로 농축 할 수 있기 때문에, 폴리(산성 아미노산)을 고감도로 정량 분석할 수 있다. 또한, 이러한 분석법에 따라, 실제 상기 정제 공정을 경과하여 얻어진 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체와 종래의 폴리에틸렌 글리콜과 폴리아스팔트산의 블록 공중합체 각각에 포함된 폴리에틸렌글리콜 및 폴리아스팔트산의 분량을 측정한 결과는 다음과 같다:
블록 공중합체에 포함된 불순물량
불순물 미정제 정제
폴리에틸렌 글리콜 6.0중량% 1.3중량%
폴리아스팔트산 7.5중량% 2.4중량%
이하, 실시예를 참고로, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명을 이하의 실시예로 한정하는 것은 아니다.
제조예 1
H+ 형태로 재생된 Toyopearl 650M(900mL)을 글래스 컬럼에 충전하였다. 일측-말단 메톡시/일측-말단 3-아미노프로폭시 폴리에틸렌 글리콜(중량 평균 분자량 5287) 29.97g을 1.98L의 10% 아세토니트릴 수용액에 용해시키고, 이 용액을 컬럼에 침투시켰다. 1.6L의 10% 아세토니트릴 수용액으로 컬럼을 세정한 다음, 10% 아세토니트릴 함유-0.4M 암모니아수를 사용하여 전개하였다. 목적 화합물을 포함하는 분획을 수집하여, 감압하에서 농축시킨 다음, 동결 건조하여, 정제된 일측-말단 메톡시/일측-말단 3-아미노 프로폭시 폴리에틸렌 글리콜 25.71g를 얻었다.
제조예 2
제조예 1에서 얻어진 정제된 일측-말단 메톡시/일측-말단 3-아미노 프로폭시 폴리에틸렌 글리콜(23.32g)을 디메틸 술폭시드(DMSO) 466mL에 용해시키고, 35℃로 가열하였다. β-벤질 L-아스팔테이트-N-카르복실산 무수물(BLA-NCA) 42.87g을 가하여, 22시간동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 디이소프로필 에테르(IPE) 3.73L와 에탄올(EtOH) 0.93L의 혼합용매 중에 적하하고, 석출 침전물을 여과한 후, IPE 및 EtOH의 혼합 용액(4:1)로 세정하고, 이어서 IPE로 세정한 다음, 진공 건조하여, 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리(β-벤질 L-아스팔테이트) 공중합체 54.29g(아스팔트산 유니트 : 29.0)을 얻었다.
제조예 3
제조예 2에서 얻어진 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리(β-벤질 L-아스팔테이트) 공중합체(52.85g)을 디메틸 포름아미드 529mL에 용해시키고, 35℃로 가열하였다. 아세트산 무수물 2.50mL을 가하여, 3시간동안 반응시켰다. 반응 혼합 물을 디이소프로필 에테르(IPE) 4.76L와 에탄올(EtOH) 0.53L의 혼합용매 중에 적하하고, 석출 침전물을 여과한 후, IPE 및 EtOH의 혼합 용액(9:1)로 세정하고, 이어서 IPE로 세정한 다음, 진공 건조하여, 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리(β-벤질 L-아스팔테이트) 공중합체 N-아세틸화물 51.67g을 얻었다.
제조예 4
제조예 3에서 얻어진 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리(β-벤질 L-아스팔테이트) 공중합체 N-아세틸화물(50.19g)을 아세토니트릴 753mL 및 0.2N 수산화나트륨 용액 2.16L와 5시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 2N 염산으로 중화시킨 후, 감압 농축하에서, 아세토니트릴을 제거한 다음, 에틸 아세테이트 1.2L를 사용하여 3회 추출하였다. 수성층을 농축한 다음, 용액의 량을 1.3L로 설정하고, 이에 6N 수산화나트륨 11mL를 가하여 염기성 용액을 형성하고, 이 용액을, 충분히 세정한 HP-20SS컬럼(2L)에 침투시켰다. 0.01N 수산화나트륨수용액(8L) 및 물(3L)로 세정 후, 50% 아세토니트릴-물(6L)로 용출시켰다. 목적 화합물을 포함하는 분획을 수집하여, 감압 농축하였으며, H+ 형태로 제생된 Dowex 50W8(520mL)를 통해 침투시키고, 50% 아세토니트릴-물(1L)로 세정하였다. 용출액을 감압하에서 농축한 다음, 동결 건조시켰다. 얻어진 동결건조 생성물을 디메틸포름아미드(DMF) 320mL에 용해시키고, 헥산 2.56L 및 에틸 아세테이트 0.64L의 혼합용매 중에 적하하였다. 석출된 침전을 여과하고, 헥산과 에틸 아세테이트의 혼합용액(4:1) 및 헥산으로 세정한 다음, 진공 건조시켜 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물 33.20g를 얻었다.
제조예 5
제조예 4에서 얻어진 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물 28.85g를 디메틸포름아미드 577mL에 용해하고, 35℃로 가열하였다. 디시클로헥실카르보아미드(DCC) 19.75g, N-히드록시숙신 숙신이미드(HOSu) 11.01g를 가하고, 1시간 동안 반응시켰다. 생성된 디시클로헥실우레아를 코튼 플러그 여과하였다. 얻어진 여과액을 에틸 아세테이트 2.3L로 희석한 다음, 헥산 3.5L를 가하였다. 석출된 침전을 여과하고, 헥산:에틸 아세테이트(3:1)용액으로 세정한 다음, 진공 건조시킴으로써, 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물-HOSu 활성 에스테르체 33.82g를 얻었다.
제조예 6
제조예 5에서 얻어진 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물-HOSu 활성 에스테르체 33.73g를 디메틸포름아미드 1.35L에 용해시키고, 35℃로 가열하였다. 염산 독소루비신 26.13g을 분말 형태로 첨가하고, 반응액에 현탁시킨 다음, 트리에틸아민 8.16mL을 첨가하고, 1시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 4.0L, 헥산 16.0L의 혼합용매 중에 적하하고, 석출된 침전을 여과한 후, 헥산:에틸 아세테이트(3:1)용액으로 세정 후, 진공 건조시켰다. 다음으로 얻어진 침전을 아세토니트릴 590mL에 현탁시킨 후, 물 1780mL을 가한 후, 35℃로 가열 및 교반하였다. 침전이 용해된 것을 확인하고 나서 1시간 동안 교반을 계속한 후, 반응용액을 감압하에서 농축하여 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조시켰다. 얻어진 동결 건조 생성물을 디메틸포름아미드 1.074L에 다시 용 해시키고, 용액을 에틸 아세테이트 2.15L, 헥산 8.60L의 혼합 용매 중에 적하하였다. 석출된 침전을 여과하고, 헥산:에틸 아세테이트(3:1) 용액으로 세정한 후, 진공 건조시켰다. 마지막으로, 얻어진 침전을 무수에탄올 1074mL에 현탁시키고, 35℃에서 2시간 동안 교반시킨 다음, 현탁액을 여과하고, 무수 에탄올로 세정한 후, 진공 건조시킴으로써 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물-독소루비신 축합체45.39g를 얻었다. 이 블록 공중합체의 폴리아스팔트산 부분의 측쇄 카르복실산 잔기에 대한 독소루비신의 결합 비율은 약 47%이었다.
제조예 7
제조예 6에서 얻어진 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물-독소루비신 축합체 20.00g에 주사용수 100mL을 가하고, 35℃로 가열한 후, 현탁시켰다. 0.5N 수산화나트륨 용액을 6.0mL 가하여 교반시킨 후, 무수에탄올 100mL을 가하였다. 블록 공중합체가 용해한 것을 확인한 후, 염산 독소루비신 3.906g을 첨가하여 용해시켰다. 0.5N 수산화나트륨 5.9mL을 가하여 pH를 6으로 조정하고, 주사용수 188mL을 가한 1시간 후, 용액을 멤브레인 필터(Millipore; GV type 0.22㎛)에서 여과한 후, 감압하에서 용매를 증류 제거하여 블록 공중합체-약제 복합체 용액을 얻고, 더 동결 건조를 시켜, 블록 공중합체-약제 복합체 동결 건조 생성물 22.96g을 얻었다.
실시예 1
제조예 4에서 얻어진 블록 공중합체 10.3mg을 10mM 아세트산 완충액(pH 7.0, 1mL)에 용해시켜, 1.0043g의 블록 공중합체 용액을 얻었다. 이 중 일부(0.7491g)를 메탄올, 물, 10mM 아세트산 완충액(각 5mL)을 침투시킨 Sep-Pak QMA 컬럼(Waters Co., Ltd. 제조)으로 통과시키고, 10mM 아세트산 완충액(3mL)으로 세정하였다. 통과한 분획과 세정 분획을 포함하여 4.1171g의 용액을 얻었다. 이 용액을 이하의 조건으로, 겔 여과 컬럼을 장착한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정량하였다. 포함된 폴리에틸렌 글리콜은 0.1005mg(1.3중량%)이었다.
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컬럼: Shodex OHpak SB803 + SB-G(Showa Denko K.K. 제조)
컬럼 온도: 40℃
이동상: 100mM 염화나트륨 수용액
유속: 0.5mL/분
검출기: 시차 굴절율 검출기
주입량: 50㎕
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실시예 2
제조예 4에서 얻어진 블록 공중합체 10.3mg을 10mM 인산 완충액(pH 7.0, 1mL)에 용해시켜, 블록 공중합체 용액을 얻었다. 이 중 일부(0.7491g)를 메탄올, 물, 10mM 인산 완충액(각 5mL)을 침투시킨 Sep-Pak QMA 컬럼(Waters Co., Ltd. 제 조)으로 통과시키고, 10mM 인산 완충액(3mL)으로 더 세정하였다. 통과 분획과 세정 분획을 포함하여 4.1735g의 용액이 얻어 졌다. 이 용액을 이하의 조건으로, 겔 여과 컬럼을 장착한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정량하였다. 포함된 폴리에틸렌 글리콜은 0.250mg(2.4중량%)이었다.
--------------------------------------------------------------
컬럼: Asahipack GF310 HQ + Asahipak GF1B ( Asahi Kasei Corporation 제조)
컬럼 온도: 40℃
이동상: 100mM 인산 완충액
유속: 0.5mL/분
검출기: 시차 굴절율 검출기(또는 UV 검출기)
주입량: 50㎕
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실시예 3
제조례6에 얻어진 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물-독소루비신 축합체 50mg을 정확히 평량하여, 4% SDS:아세토니트릴(1:1) 용액 25mL에 용해시켰다. 이 용액을 이하의 조건으로 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분석하여, 유리 염산 독소루비신 함량이 1.29중량%, 독소루비신 유래 불순물 함량이 0.15중량%(흡광도에 기초하는 염산 독소루비신 환산)인 것을 발 견하였다.
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컬럼: Capsule pack C18UG80 5m ( Shiseido Co., Ltd. 제조) i.d. 4.6 mm 150 mm
컬럼 온도: 40℃
이동상:(A)0.2% 인산, 0.15% SDS/H20:CH3CN=7:3
(B)0.2%인산, 0.15%SDS/H20:CH3CN=3:7
그라디언트: B%(분); 25(0), 25(13), 100(30), 100(40)
유속: 1.0mL/분
검출기: UV (254nm)
주입량: 20㎕
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실시예 4
제조례6에 얻어진 일측-말단 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-폴리아스팔트산 공중합체 N-아세틸화물-독소루비신 축합체 30mg을 정확히 평량하여, 디메틸포름아미드 1mL에 용해시켰다. 이 용액을 이하의 조건으로 고속 액체 크로마토그래피에서 분석하였다. 전이하여 결합하고 있는 디시클로헥실 유레아 유도체는 0.08% 이하(검출 한계 이하)였다.
--------------------------------------------------------------
컬럼: TC-1 ( GL Science Co., Ltd. 제조), 30 mm 0.25 mm i.d., 막 두께 0.25㎛
이동상: 헬륨 0.8mL/분
컬럼 온도: 70℃, 3℃/분, 88℃, 15℃/분, 180℃(5분)
주입구: 290℃
검출기: FID(290℃)
주입량: 분할(20:1),1㎛
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본 발명에 따라, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성 아미노산)의 블록 공중합체에 불순물로서 포함되는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(산성 아미노산)을 제거한 고순도의 블록 공중합체를 제공할 수 있으며, 이와 안트라시클린계 항암제를 축합반응시킨, 약제나 유전자의 담체로서 의약적 용도로도 사용할 수 있는 고분자 담체를 제조할 수 있고, 또한 그 고분자 담체가 형성하는 미셀 내핵에 안트라시클린계 항암제를 내포하는 고분자 의약 제제를 제공할 수 있다.
본 발명에 의해 제거되는 블록 공중합체에 포함되는 불순물은, 미셀형성 등의 기능을 하지 않는 것이 명백하며, 이들을 제거한 고분자 담체는 우수한 성능을 가진다고 간주될 수 있다. 또힌 이러한 고순도의 고분자 담체를 사용하여 얻어지는 고분자 제제는 임상으로도 사용가능한 고순도의 의약 제제가 될 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 그 블록 공중합체내의 불순물인 폴리에틸렌 글리콜 및 측쇄에 카르복실산을 가지는 폴리(산성 아미노산)을 정량할 수 있으며, 블록 공중합체 제조방법의 개량, 제조 규격의 책정이나 공정 관리에 유용한 정보를 얻을 수 있다.

Claims (19)

  1. 불순물의 함량이 10중량% 이하인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염에서 상기 폴리(산성 아미노산)이 안트라시클린계 항암제 잔기와 축합되어 있는 고분자 담체로서,
    상기 불순물이 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(산성아미노산)이고, 상기 블록 공중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 이온 교환 수지에 의해 정제하고, 정제된 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체를 형성하며, 분배/흡착 수지를 사용하여 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되며,
    상기 폴리(산성 아미노산)과 안트라시클린계 항암제 잔기의 축합반응이, 폴리(산성 아미노산)의 측쇄 카르복실산과 안트라시클린계 항암제 잔기 사이의 축합반응인 고분자 담체.
  2. 불순물의 함량이 10중량% 이하인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염에서 상기 폴리(산성 아미노산)이 안트라시클린계 항암제 잔기와 축합되어 있는 고분자 담체로서,
    상기 불순물이 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(산성아미노산)이고, 상기 블록 공중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 이온 교환 수지에 의해 정제하고, 정제된 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체를 형성하며, 분배/흡착 수지를 사용하여 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되며,
    상기 안트라시클린계 항암제 잔기가 독소루비신 잔기인 고분자 담체.
  3. 불순물의 함량이 10중량% 이하인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염에서 상기 폴리(산성 아미노산)이 안트라시클린계 항암제 잔기와 축합되어 있는 고분자 담체로서,
    상기 불순물이 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(산성아미노산)이고, 상기 블록 공중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 이온 교환 수지에 의해 정제하고, 정제된 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체를 형성하며, 분배/흡착 수지를 사용하여 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되며,
    상기 폴리(산성 아미노산)에서의 안트라시클린계 항암제 잔기의 결합 비율이 30∼55%인 고분자 담체.
  4. 불순물의 함량이 10중량% 이하인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염에서 상기 폴리(산성 아미노산)이 안트라시클린계 항암제 잔기와 축합되어 있는 고분자 담체의 제조방법으로서,
    상기 불순물이 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(산성아미노산)이고, 상기 블록 공중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 이온 교환 수지에 의해 정제하고, 정제된 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체를 형성하며, 분배/흡착 수지를 사용하여 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되며,
    상기 블록 공중합체와 반응조제 사이의 축합 화합물을 분리한 후, 이 축합 화합물에 안트라시클린계 항암제를 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 안트라시클린계 항암제가 독소루비신 또는 그의 염인 고분자 담체의 제조방법.
  6. 안트라시클린계 항암제가, 불순물의 함량이 10중량% 이하인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체 또는 그의 염에서 상기 폴리(산성 아미노산)이 안트라시클린계 항암제 잔기와 축합되어 있는 고분자 담체에 의해 형성되는 미셀의 내핵에 포함되는 블록 공중합체-약제 복합체를 함유하는 고분자 의약제제로서,
    상기 불순물이 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(산성아미노산)이고, 상기 블록 공중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 이온 교환 수지에 의해 정제하고, 정제된 폴리에틸렌 글리콜과 폴리(산성아미노산)의 블록 공중합체를 형성하며, 분배/흡착 수지를 사용하여 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 고분자 의약 제제.
  7. 제6항에 있어서, 안트라시클린계 항암제가 독소루비신 또는 그의 염인 고분자 의약제제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 블록 공중합체-약제 복합체가 동결 건조 형태로 포함되는 것을 특징으로 하는 고분자 의약 제제.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 블록 공중합체가 일반식(1)의 공중합체인 고분자 담체.
    Figure 112009028340651-pct00004
    (상기 식에서, Rl은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내고, R2는 결합 작용기를 나타내며, R3은 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R4는 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타내며, n은 5-1000의 정수, m은 2-300의 정수, x는 0-300의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않음)
  10. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 블록 공중합체가 일반식(1)의 공중합체인 고분자 담체의 제조방법.
    Figure 112009028340651-pct00005
    (상기 식에서, Rl은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내고, R2는 결합 작용기를 나타내며, R3은 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R4는 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타내며, n은 5-1000의 정수, m은 2-300의 정수, x는 0-300의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않음)
  11. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 블록 공중합체가 일반식(1)의 공중합체인 고분자 의약 제제.
    Figure 112009028340651-pct00006
    (상기 식에서, Rl은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내고, R2는 결합 작용기를 나타내며, R3은 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R4는 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타내며, n은 5-1000의 정수, m은 2-300의 정수, x는 0-300의 정수를 나타내며, x는 m 보다 크지 않음)
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