KR100920994B1

KR100920994B1 - 마이크로그루브를 구비한 임플란트 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100920994B1
Application number: KR1020070130608A
Authority: KR
Inventors: 이석원; 오남식
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2009-10-09
Also published as: US20090155742A1; KR20090063313A

Abstract

본 발명은 임플란트(implant)시에 주위 연조직과 임플란트의 부착을 높게 함으로써 침윤상피 하방이동을 방지하고 세균감염을 막을 뿐 아니라, 임플란트의 수명을 연장시키는 임플란트 지대주 표면처리 방법 및 이와 같은 방법으로 표면처리된 임플란트에 관한 것이다. 본 발명의 표면 처리방법은 임플란트 표면의 조직 부착부위에 인간 치은 섬유아세포의 단면직경보다 큰 간격 및 바닥폭을 가지는 마이크로 그루브를 형성하고 그루브 이외에 연마된 채로 남아있는 능선의 표면에도 부가적인 산-에칭 처리를 함으로써 활발한 사상족(filopodia)의 생성이 유도되도록 함으로써 임플란트 주위 연조직 부착력을 강화하였다.

포토리소그래피, 마이크로그루브, 임플란트, 산-에칭, 표면처리, 연조직 부착, 치은섬유아세포

Description

마이크로그루브를 구비한 임플란트 및 그 제조방법{Implant Having Microgrooves and a Method for Preparing the Same}

본 발명은 치과용 임플란트 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 임플란트 표면의 치아 연조직 부착부위에 인간치은섬유아세포의 단면직경보다 큰 간격 및 바닥폭을 가지는 다수의 마이크로그루브가 존재하는 임플란트 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 치과용 내지 인공 치아용 임플란트(implant)란 구강 내에서 부분적이나 전체적으로 치아가 상실된 부위에 치아의 뿌리 형태를 갖는 금속을 턱뼈에 심어 뼈와 유착되게 한 다음 치아를 형성하는 것을 말한다. 이러한 임플란트는 크게 치아뿌리 모양의 금속을 턱뼈 내에 심는 과정인 1차 수술로 끝나는 임플란트와 1차 및 2차 수술을 시행한 후 보철 치료를 하게 되는 임플란트로 분류할 수 있다.

임플란트는 그 식립 위치에 따라 골막하 임플란트, 골내 임플란트, 골 관통 형 임플란트 등으로 구분할 수 있으며, 임플란트의 외형에 따르면 나사형 임플란트 , 실린더형 임플란트 등으로 나눌 수 있다. 상기 임플란트는 인접 치아를 깎을 필요가 없고, 잇몸 뼈가 흡수되는 것을 막아 기능적 및 심미적으로 우수하기 때문에 근래 그 보급이 확산되고 있다.

그러나, 종래의 임플란트는 시술 후 임플란트와 연조직간의 부착이 불완전할 뿐만 아니라, 필연적으로 접합상피의 하방이동이 발생하고, 부착부분에 틈이 생겨 세균의 침투가 용이할 수 있으므로, 임플란트 주위의 치은염증 발생과 함께 임플란트 수명의 감소까지도 초래할 수 있다.

이런 단점을 극복하기 위해 충분한 안정성과 임플란트의 식립이 가능하도록 임플란트와 골 및 연조직 사이에서 높은 부착력을 갖는 임플란트를 개발하는 것이 요구된다. 임플란트에서 사용되는 티타늄, 지르코늄, 하프늄, 탄탈륨, 니오븀 혹은 이것의 합금 등의 금속 혹은 합금의 몇몇은 골조직과 상대적으로 강한 부착, 골조직 자체만큼 강하거나 그보다 더 강할 수 있는 부착을 형성할 수 있다. 이러한 종류의 금속 임플란트 재료의 가장 주목할 만한 예로는 티타늄과 티타늄의 합금을 들 수 있으며, 실제로 금속과 골조직 사이의 부착 기전이 1950년부터 연구되어 "골유착(osseointegration)" 이란 개념으로 확립되었다.

임플란트와 골조직 간의 부착이 강할 수 있고, 특히 티타늄의 부착은 비교적 강할 수 있으나 이러한 부착력을 더욱 향상시키는 것이 바람직하며 이를 위한 여러 연구들이 다각도로 진행되어 왔다.

현재까지 임플란트-골 유착을 더욱 향상시키기 위하여 임플란트 표면상에 상 대적으로 큰 불규칙한 부분을 생성하는 표면 거칠기를 증가시키는 방법이 존재하며, 증가된 표면 거칠기는 임플란트와 골조직 사이에 더 큰 접촉 및 고착영역을 부여함으로써 더 양호한 기계적 구속력과 강도를 얻을 수 있다.

골유착에 대한 개념이 확립된 이래로 연구자들의 관심이 최근 임플란트와 주위 연조직간의 관계 개선, 즉 임플란트 주위 연조직 반응(peri-implant soft tissue reaction)의 증진으로 모아지고 있다.

브루넷 등(Brunette et al., J. Biomech. Eng. 121:49-57, 1999)과 얀센 등(Jansen et al., Adv. Dent. Res. 13:57-66, 1999)은 오래 전부터 치과용 임플란트 주위 연조직을 구성하는 대표적인 세포인 치은섬유아세포가 미세구조(microtopography) 상에서 세포형태(cell morphology)와 세포-기질 접착(cell-matrix adhesion)을 스스로 변화시킨다는 주제로 연구를 진행하여 왔다. 특히, 임플란트-세포 간 세포-기질 접착의 강화는 임상적으로 치과용 임플란트의 고질적인 후유증으로까지 표현되고 있는 침윤상피 하방 이동(epithelial down-growth)를 방지하거나 최소화하는데 그 목적을 두고 있다. 따라서, 이들 그룹은 미세제작 그루브(microfabricated groove)의 표면이 시험관내 조건(in vitro)에서 상피세포의 배열(orientation)과 방향성 운동(directed locomotion)을 유도하여 궁극적으로 생체 내 조건(in vivo)에서 치과용 티타늄 임플란트 주위의 침윤상피 하방 이동을 방지할 수 있다는 점을 강조하였다. 이들 그룹은 또한, 치과용 티타늄 임플란트의 표면 지형(surface topography)이 결합조직의 구성에 중요함을 근거로 섬유아세포의 세포형태 및 배열을 다각도로 분석하였다. 그 결과로, 마이크로그루브가 부여된 티타 늄 기판(Ti substrata)의 표면 지형(surface topography)이 시험관내 조건 및 생체 내 조건에서의 세포행동(cell behavior)에 미치는 영향의 정도는 마이크로그루브의 크기(dimension)에 의하여 좌우된다는 점이 밝혀졌다.

브루넷 등과 얀센 등의 연구들에서 주로 사용된 마이크로그루브는 마이크로머시닝 기법(micromachiming technique)으로 제작된 V-형태 마이크로그루브로서 이러한 형태는 세포로 하여금 명확한 모서리(edge)에 접착(adhesion)을 형성하도록 유도하였다(도 1 및 도 2). 따라서, 기판과 접착을 이루는 세포들은 두 가지 방향으로만 세포 퍼짐(cell spreading)이 허용되었으며 다음과 같다. 먼저, 그루브(groove)/능선(ridge)에 평행한 방향으로의 신장(elongation)이나 극화(polarization)가 있으며 이는 '컨택트 가이던스(contact guidance)'라는 현상에 기인하는 것으로 여겨진다(Weiss, P. J. Exp. Zool. 100: 353-86, 1945). 또 다른 방향은 능선들 간의 연결(bridging)을 통해 세포 퍼짐을 유도한다. 이러한 외형(geometry)을 감지하여 세포는 포컬 컨택트(focal contact)를 강화시키고(den Braber, E. T. et al., Biomater. 17: 2037-44, 1996), 포컬 컨택트로 전달되는 세포 견인력(cellular traction force)을 증가시키며(Wang, N. et al., Cell Motil. Cytoskeleton 52: 97-106, 2002.), 그 결과로 포컬 컨택트의 수를 증가시킨다(Chen, C. S. et al.,, Biochem. Biophys. Res. Commun. 307: 355-61, 2003, 도 3). 이러한 방법으로 증가된 접착력(adhesion strength)은 외부로부터 가해진 물리력(local mechanical force)보다도 큰 것으로 보고되었다(Loesberg, W. A. et al., J. Biomed. Mater. Res. A 75: 723-32, 2005; Loesberg, W. A. et al., Cell Motil. Cytoskeleton 63: 384-94, 2006.). 원 세포골격 장력(Cytoskeletal tension per se) 또는 세포골격 전스트레스(cytoskeletal prestress)로 불리우기도하는 '세포에 의해 가해지는 수축 견인력(contractile traction force exerted by a cell)'은 focal contact를 앵커(anchorage)로 사용하여, 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 및 세포골격 구조(cytoskeletal structure)와 더불어 세포의 유전자 발현과 성장(growth) 등 다양한 생물학적 활성(biological activity)의 조절에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Ingber, D. E. et al., J. Cell Sci. 116: 1397-1408, 2003.). 표면 구조는 또한, 직접적인 세포 기계적 신호전달(cell mechanotransduction)을 야기하여 유전자 발현 빈도의 확률을 변화시키는 것으로도 알려져 있다(Dalby, M. J. et al., Med. Eng. Phys. 27: 730-41, 2005.). 이러한 생역학적 실험모델(biomechanical model)들에서는 세포형태(cell shape)과 세포 퍼짐의 변화를 유도할 목적으로 마이크로패턴(micropattern)이나 나노구조 표면(nanostructured surface) 등의 환경을 인위적으로 세포에 제공하였다. 대표적인 예가 마이크로구조(microstructure)의 날카로운 모서리(edge) 상에서 세포접착(cell adhesion)이 강화되어 '세포에 의해 가해지는 수축 견인력'이 특정한 방향으로 증가하는 경우이다.(Thery, M. et al., Cell Motil. Cytoskeleton 63: 341-55, 2006.).

종래의 마이크로그루브가 임플란트 표면에 적용되는 두번째 경우는 레이저(laser)를 이용하여 치과용 임플란트 지대주 표면에 마이크로그루브를 부여하는 것이다. 또한, 골조직과 연조직의 접촉 부위에 각각 모두 마이크로그루브를 부여 하고 그 간격 및 폭의 크기에 차등을 부여한 점이 대단히 특징적이나, 현재까지 사용된 마이크로그루브의 가장 바람직한 간격 및 폭이 규명되지 않아 연구가 계속되고 있는 상태이다. 특히, 이 제품의 지대주 표면에 적용된 수 마이크로 수준의 폭을 가지는 그루브는 치은결합조직을 구성하는 치은섬유아세포의 자연적인 단면 지름에 비하여 현저히 작은 크기로 고안된 것이다.

많은 연구들에서 마이크로그루브에 의한 세포형태 변화가 보고되었고, 이는 접착성 세포(adherent cell)에서 DNA 생성과 세포성장에 밀접하게 관련되어 있다는 것이 밝혀졌다(Folkman, J. et al., Nature 273: 345-49, 1978). 실제로, 마이크로그루브 기판(microgrooved substrata) 상에서 배양된 인간치은섬유아세포는 평활한 기판(smooth substrata) 상에서 배양된 경우에 비하여 그루브를 따라 신장 및 배열 등 접촉 안내가 비약적으로 증가하였고, 결과적으로 세포 당 파이브로넥틴(fibronectin) mRNA의 양이 증가하였으며(Chou, L. et al., J. Cell Sci. 108: 1563-73, 1995.), 다양한 생물학적 작용을 관장하는 유전자들의 발현을 변화시켰다(Dalby, M. J. et al., Exp. Cell Res. 284: 274-82, 2003.). 그러나, 이러한 연구들 역시 단일세포의 직경보다 작은 폭, 즉 수 마이크론 폭의 간격(spacing)으로 제작된 마이크로그루브 기판(microgrooved substrata)을 사용하였다. 현재까지 극소수의 연구들에서만 다양한 크기의 마이크로그루브 상에서의 섬유아세포 증식 비교가 보고되었다. 이러한 시험관내 조건에서의(in vitro) 연구들의 대부분은 1-10㎛의 비교적 작은 폭의 그루브가 부여된 기판을 사용하여 세포배열(cell orientation)의 효과적인 변화를 결과로 얻었으나, 접착 섬유아세포(adhered fibroblast)의 증식활성(proliferating activity) 증가는 증명하지 못하였다(den Braber, E. T. et al., Biomater. 17: 1093-99, 1996.; Walboomers, X. F. et al., J. Biomed. Mater. Res. 47: 204-12, 1999.; Walboomers, X. F. et al., J. Biomed. Mater. Res. 46: 212-20, 1999.). 표면 마이크로그루브가 부여된 임플란트(microgrooved implant)를 이용하여 침윤상피 하방이동의 정도를 효과적으로 예방하거나 감소시키려는 생체 내 조건에서의 연구들에서는, 브루넷 등과 얀센 등이 상반된 결과를 보고하였다. 이들 연구들의 실험 디자인에 있어 두 가지 주목할만한 차이점은 식립된 임플란트 재료의 유연성(flexibility)과 부여된 마이크로그루브의 구조적 크기(structural dimension)이며 이는 마이크로그루브를 이용한 생체내 조건에서의 연구에서의 결과에도 마이크로그루브의 크기가 결정적인 변수로 작용할 수 있음을 시사한다.

이상을 종합해 볼 때, 접착 섬유아세포의 직경보다 작은 폭의 마이크로그루브는 세포형태의 변화를 유발하여 초점 접착 생성의 증가와 유전자 발현의 변화를 유도하나, 세포증식의 증가 등의 시험관내 효과나 침윤상피 하방이동 감소 등의 생체 내 효과는 아직 밝혀지지 않은 것을 알 수 있다.

본 발명의 목적은 주위 연조직의 부착력이 강화되고, 침윤상피 하방 이동 및 세균감염을 방지하며, 수명이 증가된 치과용 임플란트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 치과용 임플란트의 제조방법을 제공하는 것이다.

용어의 정의

포토리소그래피 ( photolithography ): 통상적으로 반도체 기판의 표면위에 마스크의 모양대로 기하학적인 문양을 전사하기 위한 공정을 의미하며, 광식각법 또는 노광공정이라고도 한다.

광- 레지스트 ( photoresist ): 감광성 수지를 말하며, 폴리머(polymer), 용제(solvent) 및/또는 감작제(sensitizer) 등으로 구성된다. 대표되는 현상되는 형태에 따라 양성(positive)과 음성(negative)으로 나뉜다. 즉, 양성은 빛을 조사한 부분이 제거되는 형태이며, 음성의 경우에는 빛을 조사한 부분만 남는 형태이다. 양성 광레지스트에는 폴리메틸메탄아크릴레이트{poly(metylmethaneacrylate), PMMA}, DQN(diazoquinone Novolak matrix resin) 레지스트 등이 존재하는데, PMMA는 단일성분으로 수지 자체만으로 광-레지스트 기능을 하고, DQN의 경우 디아조퀴논은 감작제이고, 노볼락 매트릭스 레진(Novolak matrix resin)은 폴리머이다. 음성 광레지스트에는 비스(아릴)아자이드 고무 수지{bis(aryl)azide rubber resin} 등이 존재한다.

산-에칭( acid etching ): 유리, 반도체, 금속 등의 고체 기판의 표면의 보호되지 않은 부분을 산을 이용하여 부식시키는 공정을 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 인공치아가 고정되는 상부의 지대치 영역; 악골에 식립 되는 하부의 인공치근 영역으로 구성되는 치과용 임플란트에 있어서, 임플란트 표면의 치아조직 접착부위에 우물모양의 마이크로그루브가 형성된 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트를 제공한다.

상기 우물모양의 마이크로그루브는 단면이 직사각형 또는 사다리꼴의 모양인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, 인간치은 섬유아세포의 단면 직경보다 큰 간격 및 바닥 폭을 가지는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 마이크로그루브의 간격 및 바닥 폭은 각각 10 내지 90 ㎛인 것이 바람직하고, 15 내지 70 ㎛인 것이 더욱 바람직하고, 상기 마이크로그루브의 깊이는 3 내지 15 ㎛인 것이 바람직하고, 3.5 내지 10 ㎛인 것이 더욱 바람직하다. 나아가, 상기 마이크로그루브는 치과용 임플란트의 지대주 표면에 적용되는 것이 바람직하며, 상기 지대주 표면에 부가적인 산-에칭을 적용할 수 있다. 이때, 상기 임플란트는 티타늄, 티나늄 합금 또는 세라믹인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 산-에칭에 사용되는 산은 불산(HF), 초산(acetic acid), 발연황산(fuming sulfuric acid), 발연질산(fuming nitric acid), 염산(HCl) 또는 이들의 혼합산인 것이 바람직하나, 상기 임플란트를 부식시킬 수 있는 산은 어느 것이라도 사용이 가능하다.

더 나아가, 본 발명은 포토리소그래피(photolithograpy)를 이용한 상기 치과 용 임플란트의 제조방법을 제공한다.

상기 치과용 임플란트 제조방법은

ⅰ) 치과용 임플란트의 지대주 표면에 그루브 형성 예정 부위를 제외하고 광-레지스트(photo-resist)를 처리하는 단계;

ⅱ) 상기 광-레지스트를 처리한 임플란트에 산-에칭을 적용하는 단계; 및

ⅲ) 상기 산-에칭이 적용된 임플란트로부터 광-레지스트를 제거하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 그루브는 단면이 직사각형 또는 사다리꼴의 모양인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, 인간치은 섬유아세포의 단면 직경보다 큰 간격 및 바닥 폭을 가지는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 광-레지스트는 양성 광-레지스트 또는 음성 광-레지스트 모두 사용이 가능하나, 산에 대한 저항성이 높은 양성 광-레지스트를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 양성 광-레지스트는 폴리메틸메탄아크릴레이트(PMMA) 또는 비스아릴아자이드 노볼락(BQN) 포토-레지스트 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 것이라면 어느 것이라도 사용이 가능하다. 상기 음성 광-레지스트는 비스(아릴)아자이드 고무 수지{bis(aryl)azide rubber resin}를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 것이라면 어느 것이라도 사용이 가능하다. 상기 임플란트는 티타늄, 티타늄 합금 또는 세라믹인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 산-에칭에 사용되는 산은 불산(HF), 초산(acetic acid), 발연황산(fuming sulfuric acid), 발연질산(fuming nitric acid), 염산(HCl) 또는 이들의 혼합산인 것이 바람직하나, 상기 임플란트를 부식시킬 수 있는 산은 어느 것이라도 사용이 가능하다.

본 발명인 임플란트의 제조방법은 추가적으로 광-레지스트가 제거된 임플란트 표면에 산-에칭을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 이렇게, 임플란트 표면 전체에 대하여 산-에칭이 적용될 경우, 임플란트의 표면면적이 더욱 증가하여, 세포의 접착, 퍼짐, 증식 및 기질생성유전자의 발현이 더욱 증진될 수 있다.

본 발명은 첫째로, 임플란트 표면에 단일 인간 치은 섬유아세포의 단면직경보다 큰 간격 및 깊이를 가지는 마이크로그루브를 부여함으로써 상기에 기재된 효과를 나타낸다. 본 발명의 마이크로그루브는 기존의 임플란트 표면의 V-형태의 그루브와 달리 우물(well)모양을 가지고 세포가 접촉하여 안착할 수 있는 별도의 그루브/능선의 바닥면이 존재한다. 인간치은섬유아세포의 단면직경보다 크고 평평한 그루브 바닥과 능선을 통하여 임플란트 표면으로 연결되는 마이크로그루브는 모서리 뿐만 아니라 그루브 바닥 및 능선부위를 중심으로 인간치은섬유아세포의 증식이 가능하며 그루브와 능선을 넘나들며 증식할 수 있으므로, 종래의 마이크로그루브보다 세포증식능력이 증가한다.

본 발명자들은 본 발명의 우물모양의 그루브를 형성하기 위해서 임플란트 표면에 반도체의 제조에 사용되는 포토리소그래피(photolithography)법을 사용하였다.

본 발명자들은 임플란트 표면에 그루브 형성 예정 부위를 제외하고 광-레지스트(photo-resist) 처리를 한 후, 불산을 이용하여 산-에칭을 처리함으로써, 그루 브를 형성시켰다. 이어, 본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 그루브 형성 후 광-레지스트를 제거하여 마이크로그루브가 티타늄 임플란트 표면에 적용된 형태를 완성하였다.

본 발명자들은 먼저, 상기와 같이 제조된 본 발명의 우물모양의 마이크로그루브를 가진 임플란트가 주위 연조직 부착을 강화함을 증명하기 위하여 포토리소그래피를 이용하여 다양한 간격, 깊이 및 폭의 마이크로그루브를 부여하여 제조한 티타늄 기판을 실험군으로 사용하고, 평활한 티타늄 기판을 대조군(smooth Ti)으로 사용하여 각 기판(substrata) 표면에서 인간치은섬유아세포를 다양한 시간대로 배양하였다. 마이크로그루브의 유무와 크기에 따라 분류된 실험군들에 속해 있는 인간치은섬유아세포들에 대하여 세포-기질 접착, 세포형태, 세포 생존력 및 증식, 유전자 발현 등 전반적인 세포행동의 차이를 분석하였다.

우선, 인간치은섬유아세포의 세포증식능력을 측정하기 위하여 XTT(2,3-bis [2-methyloxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) 분석을 시행한 결과, 인간치은섬유아세포보다 큰 간격 및 직경을 갖는 마이크로그루브를 가진 티타늄 기판에서 배양된 인간치은섬유아세포의 세포 생존력 및 증식이 증진됨을 확인하였다(도 4).

또한, 본 발명에서 임플란트 표면에서 형성시킨 우물모양의 마이크로그루브가 기질-생성 유전자의 발현을 증진시키는지 확인하기 위해, 마이크로그루브 처리된 티타늄 기판 상에서 배양된 인간치은섬유아세포로부터 파이브로넥틴 및 α5 인 테그린의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과, 평활기판에 비하여, 본 발명의 마이크로그루브가 형성된 티타늄기판 상에서 배양된 세포에서의 양 유전자의 발현 수준이 높음을 알 수 있었으며, 특히 마이크로그루브의 간격이 인간치은섬유아세포의 직경보다 큰 경우가 그 발현 증진 정도가 더 높음을 알 수 있었다(도 5).

본 발명자들은 상기 연구 결과들에 대한 원인으로, 마이크로그루브의 바닥면까지 인간치은섬유아세포가 안착하여 증식할 때(도 6) 세포는 주위 환경, 즉 15 또는 30㎛ 간격의 마이크로그루브로 인한 환경을 3차원으로 인식하여 그에 상응하는 유전자 발현을 보임으로써 전반적인 세포행동(cell behavior)이 변화된다고 결론지었다. 이때, 세포행동에는 세포-기질 접착, 세포 생존력 및 증식, 세포형태 및 배열, 유전자 발현 등 세포의 특징과 운명을 결정하는 대부분의 세포활동들이 포함된다.

상기 연구를 위한 실험의 진행 도중, 본 발명자들은 포토리소그래피로 부여된 마이크로그루브의 옆 벽과 바닥 등 내면에 필연적으로 형성된 산-에칭 표면 위로 세포들이 왕성하게 사상족(filopodia)을 뻗어낸다는 사실을 발견하였다. 사상족은 세포의 생존성, 접착, 이동 등을 담당하는 세포소기관으로서, 상기의 발견에 착안하여 본 발명자들은 마이크로그루브를 형성하기 위한 산-에칭(포토리소그래피) 후, 전체 티타늄 표면에 부가적으로 산-에칭을 처리하면 세포행동이 더욱 바람직하게 변화될 수 있을 것이라는 가설 하에 후속 연구를 진행하였다.

본 발명자들은 우선, 산-에칭에 의하여 형성된 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭을 이전 연구에 비하여 다양화 하고, 그루브 내면뿐 아니라 능선 표면 등 전 체 표면에 산-에칭을 부가적으로 처리함으로써 미세표면적이 현저히 증가된 임플란트의 세포-기질 접착 능력과 더불어 세포 생존력 및 증식 능력을 조사하였다. 그 결과, 마이크로그루브 부여 후 전체 표면에 산-에칭을 추가적으로 적용한 임플란트는 단순 연마 표면의 대조군보다 세포-기질 접착과 세포증식능력이 괄목할 만하게 증가함을 입증하였다.

아울러, 본 발명자들은 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭을 더욱 세분화 하고, 산-에칭 처리의 유무에 따른 다양한 실험군들을 포함하여 세포증식 및 이에 관련된 유전자 발현을 비교하였다. 그 결과, 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭이 상대적으로 크고 부가적으로 산-에칭 처리된 티타늄 기판에서 세포증식 및 이에 관련된 다수 유전자들의 발현이 현저히 증진됨을 입증하였다.

본 발명자들은 상기에 소개된 3가지 연구들의 결과를 종합하여 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭이 상대적으로 크고 부가적으로 산-에칭 처리된 티타늄 임플란트 표면이 기존의 단순 연마 표면에 비하여 인간치은섬유아세포의 세포행동을 바람직하게 변화시킨다는 사실을 입증하였다.

본 발명의 우물(well)모양의 인간치은섬유아세포의 단면 직경보다 큰 간격 및 바닥 폭을 가지는 마이크로그루브는 일반적으로 세포가 접촉하여 안착할 수 있는 별도의 그루브/능선의 바닥 면이 존재하지 않는 V-형태의 그루브를 임플란트 표면에 제공하는 기존의 방법(도 1)을 개선시킨 것이다. V-형태는 날카로운 모서리에 만 세포-기질 접착을 유도하는 디자인으로, 극단적인 세포퍼짐(spreading)이 유도되어(도 2) 3차원 세포배양 모델에서와 매우 유사한 세포형태를 유도하는 본 발명과 확연한 차이를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 효과는 실제 생체 내 섬유아세포의 형태에 가능한 근접하도록 세포형태의 변화를 유도하는 것으로써, V-형태의 그루브와 달리 본 디자인은 마이크로그루브 부여 후 전반적인 티타늄 표면에 부가적인 산-에칭 처리를 통하여 기존 연구들에서 입증하지 못한 세포-기질 접착과 세포증식의 동반 증가를 그 주요한 효과로 입증하였다.

현재까지, 산-에칭 및 블라스팅(blasting) 등으로 치과용 티타늄 임플란트 표면 거칠기를 인위적으로 증가시켜 골아세포의 세포증식을 증가시킨 경우가 보고되었을 뿐, 마이크로그루브 단독 혹은 마이크로그루브와 산-에칭이 동시에 부여된 세포배양 티타늄 기판 및 치과용 임플란트 모델은 존재하지 않았으나, 본 발명의 발명자들이 이를 실험적으로 입증하였다.

즉, 마이크로 수준의 그루브 및 능선과 나노 수준의 산-에칭 표면 거칠기가 혼합된 본 발명이 섬유아세포의 증식에 효과적이라는 과학적 입증을 통하여 임플란트의 연조직 부착력을 강화함으로써 임플란트-연조직 간 부작용을 해결하고, 궁극적으로 임플란트의 수명을 연장시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한 다. 그러나, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 내지 3> 우물모양의 마이크로그루브가 형성된 티타늄기판의 제조

본 발명의 우물모양의 그루브를 형성하기 위해서 포토리소그래피(photolithography)법을 사용하였다.

도 3에 나타난 바처럼, 순수 티타늄 표면에 그루브 형성 예정 부위를 제외하고 광-레지스트(photo-resist)를 처리한 후, 불산 에칭을 통하여 그루브를 형성하였다. 그루브 형성 후 광-레지스트를 제거하여 마이크로그루브가 티타늄 임플란트 표면에 부여된 형태를 완성하였다.

이 때, 제조된 티타늄기판은 간격(spacing)과 깊이(depth)가 각각 15/3.5㎛, 30/3.5㎛, 60/3.5㎛인 마이크로그루브를 부여하여 제조하였다{각각 TiD15(실시예 1), TiD30(실시예 2), 및 TiD60(실시예 3)}.

<실시예 4 내지 10> 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭을 다양화하고, 부가적으로 산-에칭을 처리한 티타늄 기판의 제조

본 발명자들은 티타늄 기판 상에 형성된 마이크로그루브의 간격과 더불어 깊이가 세포-기질 접착과 세포증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 티타늄 기판 군에서 마이크로그루브들의 깊이(depth)를 달리한 티타늄 기판을 제조하였다. 이때, 포토리소그래 피의 등분산성 원리에 의하여 그루브 바닥의 폭(width)은 자동적으로, 깊이(depth)의 2배수를 간격(spacing)에서 제한 값이 된다. 여기에 능선과 그루브를 포함한 전체 표면에 부가적으로 산-에칭을 처리함으로써 결과적으로 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭을 다양화하고, 부가적으로 산-에칭을 처리한 티타늄 기판들을 제조하였다.

<실시예 11 내지 19> 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭을 다양화하고, 부가적인 산-에칭 여부를 달리한 티타늄 기판의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 티타늄 기판 군에 5 및 90㎛ 간격의 마이크로그루브가 부여된 실험군들을 추가하고, 간격이 커질수록 깊이를 증가시키는 방법으로 실험군들을 분류하였으며, 부가적인 산-에칭을 여부를 달리한 군으로 그 범위를 넓혀 티타늄 기판을 제조하였다. 이때, 부가적인 산-에칭을 처리하지 않은 군에는 상기 실시예 1 내지 3을 사용한 실험에서 평활한 티타늄 표면에 비하여 유의한 차이를 보인 군들과 평활한 티타늄 표면 군만을 포함하였다.

< 실험예 1> 임플란트 표면 마이크로그루브의 유무 및 크기에 따른 세포 생존력 및 증식과 기질생성유전자의 발현의 변화

<1-1> 세포 생존력 및 증식의 분석

본 발명자들은 우선, 실시예 1 내지 3에서 포토리소그래피를 이용하여 제조한 마이크로그루브가 형성된 티타늄 기판을 실험군(TiD15, TiD30 및 TiD60)으로 사용하고, 평활한 티타늄 기판을 대조군(smooth Ti)으로 각각 사용하여, 각 기판(substrata) 표면상에서 인간치은섬유아세포를 각각 24, 48, 72 및 96시간 동안 배양하고 그루브의 유무와 크기(간격)에 따른 세포 생존력 및 증식능력을 분석하였다. 구체적으로 각 실험군에 대한 인간치은섬유아세포의 세포생존력과 증식능력을 XTT 어세이를 사용하여 실험하였다. 상기 XTT 어세이는 XTT 분석 키트(Cell Proliferation Kit II, Roche Applied Science, Germany)를 이용하여 Scudiero 등이 개시한 방법을 이용하여 수행하였다(Scudiero et al., Cancer Res., 48(17): 4827-4833, 1988). 그 결과는 도 4에 도시된 바처럼, 티타늄 기판 표면에 15/3.5㎛(TiD15) 폭/깊이의 마이크로그루브가 형성될 경우, 배양된 인간치은섬유아세포의 세포 생존력 및 증식이 특정 배양 시간대에서 폭발적으로 증진됨을 확인할 수 있었다.

또한 30/3.5㎛(TiD30) 폭/깊이의 마이크로그루브가 형성될 경우 모든 배양 시간대에 걸쳐 세포 생존력 및 증식이 점진적으로 증가함을 알 수 있었다.

<1-2> 유전자 발현 분석

이에, 본 발명자들은 세포-기질 접착 및 세포증식에 필수적인 기질단백질들(matrix proteins)을 부호화(encoding)하는 기질생성유전자들(matrix assembly genes)의 발현을 분석하였다. 대표적인 기질생성유전자인 파이브로넥틴(FN)과 α5 인테그린(integrin) mRNA의 발현을 평활한 티타늄 기판 및 본 발명에 따른 마이크로그루브 처리된 티타늄 기판(실시예 1 내지 3) 상에서 각각 배양된 인간치은섬유아세포에 대하여 RT-PCR(reverse transcriptase - polymerase chain reaction)로 분석하였다. 구체적으로, 배양된 세포를 트립신 처리하여, 수득하였으며, 전 RNA 추출 키트(Trizol, Gibco BRL, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라, 전 RNA를 추출하였다. 양성 대조군으로는 24-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트의 바닥에서 배양된 세포를 사용하였다. 추출된 각 시료의 전 RNA의 농도는 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 계산하였다. 각 시료의 전 RNA 1 mg을 역전사효소(Promega, USA)를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 중합효소 연쇄반응은 Taq DNA 중합효소(Roche Diagnostics, Germany), 10 X 완충액, 25 mM MgCl₂ 및 25 mM dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 이용하여 수행하였다. 증폭은 PCR 가열 사이클러(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)를 이용하여 하기 조건으로 수행하였다: 94℃에서 30초, 58℃에서 45초 및 72℃에서 30초로 35 사이클. 증폭 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였고, 에티디움 브로마이드를 이용하여 시각화하였다(도 5). 이 때, 파이브로넥틴 유전자의 증폭을 위한 프라이머로는 서열번호 1(5'-CGAACATCCACACGGTAG-3')로 기재되는 FN 포워드 프라이머 및 서열번호 2(5'-ATCACATCCACACGGTAG-3')로 기재되는 FN 리버스 프라이머를 사용하였고, 알파5 인테그린의 증폭을 위한 프라이머로는 서열번호 3(5'-ACCAAGGCCCCAGCTCCATTAG-3')으로 기재되는 α5 인테그린 포워드 프라이머 및 서열번호 4(5'-GCCTCACACTGCAGGCTAAATG-3')로 기재되는 α5 인테그린 리버스 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 표면에 포토리소그래피를 이용하여 15/3.5㎛(TiD15) 및 30/3.5㎛(TiD30) 폭/깊이의 마이크로그루브를 부여한 티타늄 기판, 즉 본 발명의 우물 모양의 마이크로그루브가 부여된 임플란트는 단순 연마 표면의 임플란트에 비하여 인간치은섬유아세포의 기질생성유전자들의 발현을 괄목할 만하게 증진시키는 것이 확인되었다. 본 발명자들은 상기 두 가지 실험 결과의 원인을 도 6으로 대표되는 세포형태 분석을 통하여 설명하였는데, 이는 ⅰ) 비교적 배양 초기부터 15/3.5㎛(TiD15) 및 30/3.5㎛(TiD30) 폭/깊이의 마이크로그루브의 바닥면 및 능선 위의 면 모두에서 안착하여 증식할 수 있었던 인간치은섬유아세포는 그렇지 않은 경우에 비하여 더욱 오랜 기간 동안 증식할 수 있었던 점; ⅱ) 파이브로넥틴(FN)과 α5 인테그린(integrin) 유전자 발현의 동반 증가와 관련하여 이러한 마이크로그루브들이 인간치은섬유아세포에게 3차원 세포배양의 환경을 제공하여 상응하는 세포형태 및 배열과 유전자 발현을 유도한 점 등이었다. 본 실험예를 진행하는 동안 본 발명자들이 발견한 매우 흥미로운 사실은 도 7에서 도시된 바와 같이, 포토리소그래피로 부여된 마이크로그루브의 옆 벽과 바닥 등 내면에 필연적으로 형성된 산-에칭(acid-etching) 표면 위로 섬유아세포들이 사상족을 왕성하게 돌출시키는 현상을 확인할 수 있었다는 것이다.

이에, 본 발명자들은 마이크로그루브를 형성하기 위한 산-에칭(포토리소그래피) 후, 전체 티타늄 표면에 부가적으로 산-에칭을 처리하면 실험예 1의 세포증식 분석 결과(도 4)와 다른 결과를 도출해낼 수 있고, 나머지 실험예 1의 결과들을 보다 정확히 검증될 수 있다고 예측하였다. 아울러, 기존 연구들에서 입증되지 못한 마이크로그루브의 세포증식 증진 능력이 실험예 1에서 다소 미흡하게 입증된 것과 관련하여, 후속 연구 모델은 이러한 부분을 보다 명확히 밝혀줄 것이라는 점도 기대 효과로 예측되었다.

< 실험예 2> 임플란트 표면에 마이크로그루브를 부여하고 부가적인 산-에칭을 처리한 경우의 세포-기질 접착 및 세포증식 분석

본 발명자들은 임플란트의 표면에 산-에칭(포토리소그래피)의 방법으로 형성된 마이크로그루브 바닥에 인간치은섬유아세포가 사상족을 광범위하게 돌출시킨 점과 사상족은 접착, 이동 및 증식에 깊이 관여하는 세포소기관이라는 점에 착안하여, 임플란트 표면에 우물모양의 마이크로그루브를 부여한 후 부가적으로 산-에칭을 표면 전체에 처리하고 이에 접착된 세포들의 세포행동 변화를 분석하였다.

구체적으로 실험군의 마이크로그루브 깊이를 3.5㎛ 외에 5㎛ 및 10㎛로 설정하여 다양화하였고, 부가적인 산-에칭을 적용하였으며(도 8), 폴리스티렌(polystyrene) 재질의 세포배양 플라스틱(tissue culture plastic) 표면과 평활한 표면을 대조군으로, 마이크로그루브를 부여하지 않고 표면 산-에칭 처리된 표면을 실험군의 일부로 포함시켜 다양한 마이크로그루브-산-에칭 복합 표면들과의 비교를 연구 모델로 디자인하였다(표 1, 실시예 4 내지 10).

크리스탈 바이올렛 염색을 통한 접착 분석을 이용한 세포 접종 초반 2시간 및 4시간에서의 세포-기질 접착 분석 결과, 마이크로그루브의 간격과 깊이가 상대적으로 크고 부가적으로 산-에칭 처리된 실험군(실시예 10)에서 평활한 티타늄 기판(실시예 4) 및 마이크로그루브를 부여하지 않고 표면 산-에칭 처리된 티타늄 기판(실시예 5)에 비하여 세포-기질 접착이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 9).

또한 O'Connell 등의 방법으로 설포로다민 B(sulforhodamine b, SRB) 분석을 수행한 결과, 설포로다민 B(sulforohdamine B, SRB) 염색을 통한 증식 분석을 이용한 24, 48, 72, 96시간 배양에서의 세포증식 분석 결과(O'Connell et al., Clin . Chem. 31(9):1424-1426, 1985), 마이크로그루브의 간격에 비하여 깊이가 상대적으로 얕은 실험군들(실시예 7 및 9)을 제외한 모든 실험군들(실시예 6, 8 및 10)에서 평활한 티타늄 기판(실시예 4) 및 마이크로그루브를 부여하지 않고 표면 산-에칭 처리된 티타늄 기판(실시예 5)에 비하여 세포증식이 유의차 있게 증가함을 확인하였다(도 10).

본 발명자들은 상기 두 가지 분석의 결과에 따라 표면 마이크로그루브의 간격과 깊이가 상대적으로 크고 부가적인 산-에칭을 처리한 티타늄 임플란트가 인간치은섬유아세포의 세포-기질 접착 및 세포증식을 괄목할 만하게 증진시킴을 입증하였다. 특이한 점은 마이크로그루브의 부여 없이 산-에칭만 처리된 실험군(실시예 5)에서는 대조군으로 쓰인 평활한 기판(실시예 4)보다도 세포생존력 및 증식이 감소한 점으로, 이는 산-에칭 단독으로는 세포-기질 접착 및 세포증식을 바람직하게 변화시킬 수 없고 반드시 마이크로그루브가 동반되어야 함을 증명한다.

< 실험예 3> 임플란트 표면에 마이크로그루브를 부여하고 부가적인 산-에칭 여부를 달리한 경우들의 세포증식 및 유전자 발현 분석

<3-1> 세포 증식 분석

본 발명자들은 실험예 1과 실험예 2에서 사용된 실험군들을 종합함과 동시에 마이크로그루브의 간격을 보다 더 다양하게 분류하고 깊이는 간격에 비례하여 증감하는 실험 모델을 디자인하였다. 이에 따라, 임플란트 표면에 마이크로그루브를 부여하고 부가적인 산-에칭 처리 여부를 달리한 경우들(실시예 11 내지 19, 표 2)에 대한 세포증식 및 유전자 발현 분석을 시행하고, 실제로 인간치은섬유아세포의 세포행동을 가장 바람직하게 변화시키는 나노-마이크로 복합 표면 성상을 규명하고자 하였다.

본 발명자들은 먼저 선행 실험으로서, 가장 효과가 클 것이라 예측되는 실험군(실시예 15)과 대조군들(폴리스테린 및 실시예 11) 간의 세포증식을 BrdU 어세이를 이용하여 비교 분석하였다(도 11). 구체적으로, 상기 BrdU 어세이는 BrdU 인코포레이션 키트(cell proliferation ELISA system, Roche, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다. BrdU 어세이는 세포들의 DNA 생산량과 관련하여 세포증식을 측정하는 방법으로서, 이는 실험예 1과 실험예 2에서 사용되지 않은 새로운 방법을 사용하여 실험예 1과 실험예 2의 세포증식 분석 결과를 검증하기 위한 목적도 포함하고 있었다. 그 결과는 간격과 깊이가 큰 표면 마이크로그루브가 부여되고 부가적으로 산-에칭이 처리된 티타늄 임플란트가 평활한 표면의 임플란트에 비하여 세포증식을 효과적으로 증진시킨다는 것이었다.

본 발명자들은 상기의 결과를 토대로 표 2의 실시예 11 내지 19에 적시된 바와 같이 마이크로그루브가 부여되고 부가적인 산-에칭 처리 여부를 달리한 경우의 티타늄 기판들을 제작하고 BrdU 어세이를 이용한 세포증식분석을 다시 시행하였다(도 12). 그 결과는, 간격과 깊이가 상대적으로 큰 표면 마이크로그루브가 부여되고 부가적으로 산-에칭이 처리된 티타늄 임플란트(실시예 15)가 세포증식을 독보적으로 증진시킨다는 것이었다. 특이한 점은, 표면 마이크로그루브의 간격과 깊이가 극단적으로 큰 임플란트(실시예 16)는 세포증식 증진 능력을 가지지 못한다는 것이었다.

<3-2> 유전자 발현 분석

본 발명자들은 다시, 상기 실험에서 쓰인 실험군들(실시예 11 내지 19)을 사용하여 48시간동안 배양된 세포들을 대상으로 세포-기질 접착과 세포증식에 관여한다고 알려진 유전자들 중 23개에 대한 발현 분석을 시행하였다(표 3 및 도 13). 구체적인 실험방법은 상기 실험예 1-2와 동일하며, 표준발현 유전자로 베타-액틴을 사용하였다. 그 결과는, 상기 세포증식 분석 결과와 마찬가지로, 간격과 깊이가 상대적으로 큰 표면 마이크로그루브가 부여되고 부가적으로 산-에칭이 처리된 티타늄 임플란트(실시예 15)가 세포-기질 접착과 세포증식에 관여한다고 알려진 유전자들의 발현을 독보적으로 증진시킨다는 것이었다.

본 발명자들은 실험예 1, 2 및 3의 결과들을 통하여, 간격, 깊이 및 폭이 상대적으로 큰 표면 마이크로그루브가 부여되고 부가적으로 산-에칭이 처리된 티타늄 임플란트는 인간치은섬유아세포의 세포-기질 접착, 세포증식 및 이들에 관련된 유전자 발현을 현저히 증진시킨다는 사실을 입증하였다.

분석 대상 표적 유전자 및 프라이머

표적 유전자*	포워드 프라이머(서열번호)	리버스 프라이머(서열번호)	크기
FN	CGAACATCCACACGGTAG(1)	ATCACATCCACACGGTAG(2)	639bp
α5 integrin	ACCAAGGCCCCAGCTCCATTAG(3)	GCCTCACACTGCAGGCTAAATG(4)	376bp
EGFR	AGTGGTCCTTGGAAACTTGG(5)	GTTGACATCCATCTGGTACG(6)	664bp
TGF-βR-I	ATTGCTGGACCAGTGTGCTTCGTCGTC(7)	TAAGTCTGCAATACAGCAAGTTCCATTCTT(8)	668bp
TGF-βR-II	CGCTTTGCTGAGGTCTATAAGGCC(9)	GATATTGGAGCTCTTGAGGTCCCT(10)	395bp
FGFR	ATCATCTATTGCACAGGGGCC(11)	CATACTCAGAGACCCCTGCTAGC(12)	259bp
RhoA	CTGGTGATTGTTGGTGATGG(13)	GCGATCATAATCTTCCTGCC(14)	183bp
Rac1	ATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTG(15)	TTACAACAGCAGGCATTTTCTCTTCC(16)	636bp
Cdc42	TTCTTGCTTGTTGGGACTCA(17)	CAGCCAATATTGCTTCGTCA(18)	199bp
Rho kinase-1	GAAGAAAGAGAAGCTCGAGAGAAGG(19)	ATCTTGTAGCTCCCGCATCTGT(20)	369bp
Akt-1	ATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAG(21)	GAGGCCGTCAGCCACAGTCTGGATG(22)	330bp
PKC	ATGGCTGACGTTTTCCCGG(23)	GCAGAGGCTGGGGACATTG(24)	453bp
KGF1	CTGACATGGTCCTGCCAAC(25)	GAGAAGCTTCCAACTGCCACTGTCCTG(26)	304bp
MEK1	GGAGGCCTTGCAGAAGAAG(27)	CTTTCTTCAGGACTTGATCC(28)	383bp
Erk2	TCTGTAGGCTGCATTCTGGC(29)	GGCTGGAATCTAGCAGTC(30)	431bp
cMyc	GAACAAGAAGATGAGGAAGAAATCGATG(31)	CCCAAAGTCCAATTTGAGGCAG(32)	718bp
Cyclin D1	ATTAGTTTACCTGGACCCAG(33)	GATGGAGCCGTCGGTGTAGATGCA(34)	399bp
Cyclin E	CAGCCTTGGGACAATAATGC(35)	TGCAGAAGAGGGTGTTGCTC(36)	254bp
CDK2	ACGTACGGAGTTGTGTACAAAGCC(37)	GCTAGTCCAAAGTCTGCTAGCTTG(38)	405bp
CDK4	CCAAAGTCAGCCAGCTTGACTGTT(39)	CATGTAGACCAGGACCTAAGGACA(40)	193bp
CDK6	TGATGTGTGCACAGTGTCACGAAC(41)	CTGTATTCAGCTCCGAGGTGTTCT(42)	737bp
p21cip1	AGTGGACAGCGAGCAGCTGA(43)	TAGAAATCTGTCATGCTGGTCTG(44)	380bp
p27kip1	AAACGTGCGAGTGTCTAACGGGA(45)	CGCTTCCTTATTCCTGCGCATTG(46)	454bp
β-actin	ATCGTGGGCCGCCCTAGGCA(47)	TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGG(48)	345bp
*FN: 파이브로넥틴, α5 integrin: 알파5 인테그린, EGFR: 상피성장인자 수용체, TGF-βR-I: 제1형 형질전환성장인자 수용체, TGF-βR-II: 제2형 형질전환성장인자 수용체, FGFR: 섬유아세포성장인자 수용체, RhoA: 라스 상동체 유전자군, 멤버 A, Rac1: 라스-관련 씨3 보투리눔 톡신 기질 1, Cdc42: 세포분열주기42, Rho kinase-1: 로 키나제-1, Akt-1: 브이-akt 뮤린 티모마 ㅂ바이러스성 발암유전자 상동체 1, PKC: 단백질 인산화효소 C, KGF1: 각질세포 성장인자 1, MEK1: 분열원 활성화 키나제 키나제 1, Erk2: 세포외 신호-조절 키나제 2, cMyc: 브이-myc 미엘로사토마토시스 바이러스성 발암유전자 상동체, Cyclin D1: 사이클린 D1, Cyclin E: 사이클린 E, CDK2: 사이클린-의존적 키나제 2, CDK4: 사이클린-의존적 키나제 4, CDK6: 사이클린-의존적 키나제 6, β-actin: 베타-액틴

본 발명에 따른 임플란트의 표면처리는 첫째로 임플란트 표면의 치은 연조직 부착부위에 우물모양의 단일 인간 치은 섬유아세포의 단면직경보다 큰 간격, 깊이 및 폭을 가지는 마이크로그루브를 부여하고 인간치은섬유아세포의 세포-기질 접착, 세포증식 및 이들에 관련된 유전자 발현 등 각종 세포행동을 증진시킴을 실험적으로 입증하였다. 이는 종래의 임플란트의 시술에서 수명에 관련한 문제점을 해소시킬 수 있으므로 본 발명에 따른 임플란트는 산업적 이용 가능성이 높다.

둘째, 본 발명은 마이크로그루브와 능선 등 임플란트 표면에 부가적으로 산-에칭 처리를 함으로써 더욱 활발한 사상족의 생성을 유도하여 임플란트와 연조직간의 부착력을 향상시킨다. 마이크로그루브와 산-에칭이 동시에 부여된 세포배양 티타늄 기판 및 치과용 임플란트 모델은 종래에는 존재하지 않았으며 본 발명에서는 임플란트의 조직부착 향상을 실험적으로 입증함으로써 임플란트의 안정성이 강화되고 임플란트의 수명이 연장됨에 따라 임플란트의 후유증이 해소될 뿐만 아니라 임플란트주위조직을 건강하게 유지할 수 있게 한다.

도 1은 Brunette 그룹과 Jansen 그룹 등의 V-형태 마이크로그루브를 도시한 그림이다.

도 2는 Jansen 그룹의 방법에 따라 제조된 V-형태 마이크로그루브로 배양된 섬유아세포를 주사전자현미경(SEM)을 통해 촬영한 사진이다.

도 3은 포토리소그래피를 이용한 마이크로그루브 티타늄 기판의 제작과정을 나타내내는 개요도이다:

photo-resist: 광레지스트 Ti disc: 티타늄 원판

HF etching: 불산 에칭 photo-resist removing: 광레지스트 제거

ridge width: 능선의 폭 groove spacing: 그루브 간 간격

groove depth: 그루브 깊이, groove width: 그루브 바닥의 폭.

도 4는 XTT 어세이를 이용하여 분석한 인간치은섬유아세포의 세포증식 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 마이크로그루브 처리에 따른 기질생성유전자들의 mRNA 발현양상을 나타내는 사진이다.

도 6은 본 발명의 30/3.5㎛ 폭/깊이의 마이크로그루브 처리에 따른 인간치은섬유아세포를 주사전자현미경(SEM)을 통해 촬영한 사진이다.

도 7은 포토리소그래피를 이용한 마이크로그루브 형성 시 그루브 옆 벽 및 바닥 등 내면의 산-에칭(acid-etching) 표면을 주사전자현미경(SEM)을 통해 촬영한 사진이다.

도 8은 티타늄 기판의 표면에 마이크로그루브를 부여한 후 그루브와 능선을 포함한 전체 표면에 부가적인 산-에칭을 처리하고 주사전자현미경을 통해 촬영한 사진이다.

도 9 및 도 10은 티타늄 기판의 표면에 마이크로그루브를 부여한 후 그루브와 능선을 포함한 전체 표면에 부가적인 산-에칭을 처리한 실험군들을 대상으로 실시한 접착 분석 및 증식 분석의 실험결과를 나타내는 그래프이다.

도 11 및 도 12는 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭을 다양화하고 산-에칭 처리의 유무에 따른 다양한 실험군들을 포함하여 세포증식을 BrdU 어세이로 비교 분석한 실험결과를 나타내는 그래프이다.

도 13은 마이크로그루브의 간격, 깊이 및 폭을 다양화하고 산-에칭 처리의 유무에 따른 다양한 실험군들을 포함하여 세포-기질 접착과 세포증식에 관련된 유전자들의 발현양상을 나타내는 사진이다.

<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Implant Having Microgrooves and a Method for Preparing the Same <130> 7p-10-08 <160> 48 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN-forward <400> 1 cgaacatcca cacggtag 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN-reverse <400> 2 atcacatcca cacggtag 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha5 integrin forward <400> 3 accaaggccc cagctccatt ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha5 integrin reverse <400> 4 gcctcacact gcaggctaaa tg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR forward <400> 5 agtggtcctt ggaaacttgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR reverse <400> 6 gttgacatcc atctggtacg 20 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF beta R-I forward <400> 7 attgctggac cagtgtgctt cgtcgtc 27 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF beta R-I reverse <400> 8 taagtctgca atacagcaag ttccattctt 30 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF beta R-II forward <400> 9 cgctttgctg aggtctataa ggcc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF beta R-II reverse <400> 10 gatattggag ctcttgaggt ccct 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGFR forward <400> 11 atcatctatt gcacaggggc c 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGFR reverse <400> 12 catactcaga gacccctgct agc 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RhoA forward <400> 13 ctggtgattg ttggtgatgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RhoA reverse <400> 14 gcgatcataa tcttcctgcc 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rac1 forward <400> 15 atgcaggcca tcaagtgtgt ggtg 24 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rac1 reverse <400> 16 ttacaacagc aggcattttc tcttcc 26 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cdc42 forward <400> 17 ttcttgcttg ttgggactca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cdc42 reverse <400> 18 cagccaatat tgcttcgtca 20 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rho kinase-1 forward <400> 19 gaagaaagag aagctcgaga gaagg 25 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rho kinase-1 reverse <400> 20 atcttgtagc tcccgcatct gt 22 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Akt-1 forward <400> 21 atgagcgacg tggctattgt gaag 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Akt-1 reverse <400> 22 gaggccgtca gccacagtct ggatg 25 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKC forward <400> 23 atggctgacg ttttcccgg 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKC reverse <400> 24 gcagaggctg gggacattg 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF1 forward <400> 25 ctgacatggt cctgccaac 19 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF1 reverse <400> 26 gagaagcttc caactgccac tgtcctg 27 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEK1 forward <400> 27 ggaggccttg cagaagaag 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEK1 reverse <400> 28 ctttcttcag gacttgatcc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erk2 forward <400> 29 tctgtaggct gcattctggc 20 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erk2 reverse <400> 30 ggctggaatc tagcagtc 18 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cMyc forward <400> 31 gaacaagaag atgaggaaga aatcgatg 28 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cMyc reverse <400> 32 cccaaagtcc aatttgaggc ag 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin D1 forward <400> 33 attagtttac ctggacccag 20 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin D2 reverse <400> 34 gatggagccg tcggtgtaga tgca 24 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin E forward <400> 35 cagccttggg acaataatgc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin E reverse <400> 36 tgcagaagag ggtgttgctc 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK2 forward <400> 37 acgtacggag ttgtgtacaa agcc 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK2 reverse <400> 38 gctagtccaa agtctgctag cttg 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK4 forward <400> 39 ccaaagtcag ccagcttgac tgtt 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK4 reverse <400> 40 catgtagacc aggacctaag gaca 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK6 forward <400> 41 tgatgtgtgc acagtgtcac gaac 24 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK6 reverse <400> 42 ctgtattcag ctccgaggtg ttct 24 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 forward <400> 43 agtggacagc gagcagctga 20 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 reverse <400> 44 tagaaatctg tcatgctggt ctg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p27 forward <400> 45 aaacgtgcga gtgtctaacg gga 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p27 reverse <400> 46 cgcttcctta ttcctgcgca ttg 23 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward <400> 47 atcgtgggcc gccctaggca 20 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse <400> 48 tggccttagg gttcagaggg g 21

Claims

인공치아가 고정되는 상부의 지대치 영역; 악골에 식립되는 하부의 인공치근 영역으로 구성되는 치과용 임플란트에 있어서, 임플란트 표면의 치은연조직 부착부위에 직사각형 또는 사다리꼴 형상의 마이크로그루브가 형성된 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트.
제1항에 있어서, 상기 마이크로그루브의 깊이는 3 내지 15 ㎛이고, 간격 및 바닥 폭은 각각 10 내지 90 ㎛인 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트.
삭제
제 1항 또는 제2항에 있어서, 마이크로그루브와 능선의 표면에 산-에칭 처리된 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트.
ⅰ) 치과용 임플란트의 지대주 표면에 직사각형 또는 사다리꼴 형상의 마이크로그루브 형성 예정 부위를 제외하고 광-레지스트(photo-resist)를 처리하는 단계;

ⅱ) 상기 광-레지스트를 처리한 임플란트에 산-에칭을 적용하는 단계; 및

ⅲ) 상기 산-에칭이 적용된 임플란트로부터 광-레지스트를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포토리소그래피를 이용한 치과용 임플란트 표면처리방법.
삭제
제5항에 있어서, 상기 마이크로그루브의 깊이는 3 내지 15 ㎛이고, 간격 및 바닥 폭은 각각 10 내지 90 ㎛인 것을 특징으로 하는 포토리소그래피를 이용한 치과용 임플란트 표면처리방법.
제 5항 또는 제7항에 있어서, 광-레지스트가 제거된 임플란트 표면에 산-에칭을 적용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 포토리소그래피를 이용한 치과용 임플란트 표면처리방법.