KR100920141B1

KR100920141B1 - 인간 면역결핍 바이러스의 키메릭 단백질용 재조합폭스바이러스

Info

Publication number: KR100920141B1
Application number: KR1020037009273A
Authority: KR
Inventors: 이글레시아스페레즈엔리끄; 바즈쿠에즈블롬퀴스트다니아엠; 듀아르테카노카를로스에이
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2009-10-08
Also published as: ZA200304387B; DE60232862D1; US20040073008A1; RU2302461C2; ATE435916T1; AU2002237195B2; US20080280354A1; AR032871A1; WO2002068654A3; BRPI0206823B1; KR20030079946A; JP4125128B2; CA2430702C; BR0206823A; CN1526018A; CU23235A1; CA2430702A1; ES2329768T3; US7318927B2; RU2003128991A

Abstract

본 발명은 HIV의 상이한 유전자의 조각들의 조합에 의해 형성된 HIV 키메릭 유전자에 관한 것이며, 상기 조각은 세포독성 T 세포(CTL) 또는 HIV-1 보조 T 세포를 위한 에피토프를 포함하고, 이는 주요 조직적합 복합체(HLA-I)의 광범위한 항원에 의해 제시된다. 상기 유전자로부터 재조합 폭스바이러스가 수득되며, 이는 HIV/AIDS 감염에 대한 예방 및 치료에 유용하고, 백신화된 실험실 동물에서 보호적 면역 세포 반응을 발생시켰으며, HIV/AIDS 환자의 CTL 림프구에 의해 인식된다.

HIV 키메릭 유전자, 재조합 폭스바이러스

Description

인간 면역결핍 바이러스의 키메릭 단백질용 재조합 폭스바이러스 {Recombinant poxvirus for chimeric proteins of the human immunodeficiency virus}

본 발명은 면역학분야에 해당하며, 특히 후천성면역결핍증(AIDS)의 예방 또는 치료용 백신의 개발에 관한 것이다. 이를 발현하는 키메릭 유전자 및 계두 바이러스(fowlpox viruses)도 개시되어 있다.

HIV는 AIDS의 병원체(etiological agent)이다(Popovic M, Sarngadharan M, Read G, and Gallo RC. Science 1984, 224:497-500). 이 바이러스는 CD4+ T 세포를 감염시킬 뿐만 아니라(Klatzman D, Barre Sinoussi F, Nuge-yre MT, Dauguet C, Vilmer E, Griscelli C, Brun-Vezinet F, Rouzioux C, Gluckman, JD, Chermannn JC and Montagni-er L. Science 1984, 225:59-63), 다른 세포 타입, 예를 들어 대식세포(macrophages), 수지상 세포(dentritic cells), 수교세포 (microgilia) 및 에피데리움세포(epithelial cells)로 감염시킨다

모든 감염을 통하여 유지되는(persist through) 높은 수준의 항체에도 불구 하고 HIV는 호스트(host) 면역응답(immune response)로부터 벗어난다. 장기간적으로, HIV는 호스트에 심각한 면역결핍증을 유발하고, 호스트는 기회감염 (opportunistic infections)에 대단히 쉽게 감염된다.

36,000,000 이상의 사람이 HIV/AIDS에 감염되어 살고 있고, 하루 감염 16,000건 중에 94%가 개발도상국에서 발생하고 있다(UNAIDS. Report on the global HIV/AIDS epidemic, June 2000). 이러한 놀라운 특징 및 효과적이고 낮은 비용의 치료방법이 없기 때문에, HIV 백신의 개발이 시급하다. HIV의 여러 특징 중에서, 이러한 개발을 어렵게 만드는 중요한 특징은 아마도 이 항원, 특히 감염과정이 관련되어 있고 중화 항체(neutralizing antibodies)의 목표가 되는 주요 부분(main domains)이 위치하는 외피 당단백질(envelope glycoproteins)의 높은 정도의 유전적 가변성(genetic variability)이다.

중화 항체에 기초한 백신후보(vaccine candidates)은 침팬지에 있어서 HIV로부터 보호할 수 있었다(Berman PW, Gregory TJ, Lavon R, Nakamura GR, Champe MA, Porter JP, Wurm FM, Hershberg RD, Cobb GK and Eichberg JW. Nature 1990, 345: 622-625; Girard M, Kieny MP, Pinter A; Barre-Sinoussi F, Nara P, Kolbe H, Kusumi K, Chaput A, Rainhart T, Muchmore E, Ronco J, Kaczorek M, Gomard E, Gluckman JC and Fultz PN, PNAS 1991, 88: 542-546). 그러나, 이러한 실험들은 바이러스의 공격의 양(dosage), 경로 및 시간(timing)이 자연감염(natural infection)과는 매우 다른 거의 이상적인 조건에서 수행되었다. 또한, 이러한 면역유전자는 다양향 HIV 분리체(isolates)로부터 보호할 수는 없으며, 그 항체는 1차(primary) HIV 분치체를 중화시킬 수 없다.

다른 백신 후보들도 I 단계 및 II 단계 임상시험에서 평가되어 왔다(Johnston MI. AIDS vaccine development: status and future directions. 1999. XII Colloque des Cent Gardes. Ed. Girard M and Dodet B.161-163). 이러한 평가의 대부분은 외피단백질(envelope proteins), 즉 gp160 및 gp120에 기초한 것이다. 재조합 gp120에 기초하여서는 하나의 백신만이 현재 대만과 미국에서 III단계 시험에서 유효성 평가를 수행중이다. 종래의 임상시험을 통해서 이러한 백신으로부터 보호를 받을 수 있더라도 그 보호는 극히 제한적이라는 점을 알수 있다.

상이한 HIV 분리체 및 아형(subtypes)로부터의 보호할 수 있는 체액반응을 일으키는데 있어서 이러한 심각한 제약으로 인해, 연구자들의 노력은 지난 수년간 대부분 주로 면역체계의 세포분야(cellular branch) 및 특히 HIV 항원에 대한 세포독성(cytoxic) T 세포를 자극할 수 있는 백신 후보의 개발로 전환되어 왔다.

실험적 발견들 중에 항 HIV CP1s의 임상적 관련성을 강하게 암시하는 것들은 다음과 같다: 미리 유인원 면역결핍 바이러스(SHIV)를 예방접종한 마카크에게 항 CD8 단일클론성 항체를 투여하였을 때 바이러스혈증의 수준이 월등하게 증가되었다(Matano T, Shibata R, Simeon C, Connors M, Lane C, Martin M, Administration of an Anti-CD8 monoclonal antibody interferes with the clearance of chimeric Simian/Human Immunodeficiency virus during primary infections of rhesus macaques, J Virol, 1998, 72, 1: 164-169); T 세포 인식으 로부터 벗어날 수 있는 바이러스 변종이 HIV-감염 인간 (Borrow, P., H. Lewicki, X. Wei, M. S. Horwitz, N. Peffer, H. Meyers, J. A. Nelson, J. E. Gairin, B. H. Hahn, M. B. A. Oldstone, and G. M. Shaw. 1997. Antiviral pressure exerted by HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) during primary infection demonstrated by rapid selection of CTL escape virus. Nature Med. 3:205-211.) 및 SIV-감염 마카크 (Allen, T. M., O. C. DH, P. Jing, J. L. Dzuris, B. R. Mothe, T. U. Vogel, E. Dunphy, M. E. Liebl, C. Emerson, N. Wilson, K. J. Kunstman, X. Wang, D. B. Allison, A. L. Hughes, R. C. Desrosiers, J. D. Altman, S. M. Wolinsky, A. Sette, and D. I. Watkins. 2000. Tat-specific cytotoxic T lymphocytes select for SIV escape variants during resolution of primary viraemia. Nature. 407:386-90) 모두에게서 선택되었다.; HIV-1 재조합 백시니아 바이러스(Vaccinia Virus; VV)를 주입시킨 자원자로부터 PBMC와 함께 거주시킨 SCID 쥐가 중화 항체가 없는 경우의 면역성 검사에 대해서 보호되었다 (Van Kuyk R, Torbett B, Gulizia R et al, Human CTL specific for the nef protein of HIV protect hu-PBL-SCID mice from HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses, 1993; 9 (suppl 1:S77); 노출된 미감염 인간의 상당한 비율이 HIV 단백질에 대해 특성적인 세포 면역반응을 보였고, 이는 아프리카 매춘부 (Rowland-Jones SL, J Sotton, K Ariyoshi, T Dong, F Gotch, s McAdams, D Whitby, S Sabally, A Gallimore, T Corrah, M Takiguchi, T Schltz, A McMichael, H Whittle. 1995. HIV-specific cytotoxic T cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women. Nature Medicine, 1: 59-64), 혈청양성인 산모가 낳은 태아 (Rowland-Jones SL, DF Nixon, MC Aldhous, F Gotch, K Aroyoshi, N Hallam, JS Kroll, K Froebel, A McMichael. HIV specific cytotoxic T-cell activity in an HIV-exposed but uninfected infant. Lancet, 1993, 341: 860-861)에게도 적용된다. 또한, 장기간 비 프로그래서(progressors)는 강한 CTL 반응을 보였다 (Cao, Y, Qin L, Zhang I, Safrit J and Ho DD, New Engl J Med, 1995, 332:201-208; Riviere Y, McChesney MB, Porrot E, et al. AIDS Res Hum Retroviruses, 11:903-990); HLA 클래스 I 타입은 HIV-1-감염 개체의 질병진행율과 연과되어 있다 (Carrington, M., G. W. Nelson, M. P. Martin, T. Kissner, D. Vlahov, J. J. Goedert, R. Kaslow, S. Buchbinder, K. Hoots, and O. B. SJ. 1999. HLA and HIV-1: heterozygote advantage and B*35-Cw*04 disadvantage. Science. 283:1748-52). CTL 반응은 자연감염에 있어 중화 항체를 선행하며 급성감염에 있어 바이러스혈증의 조절과 연관되어 있고 (Koup RA, Safrit JT, Cao Y, et al, Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency syndrome, J Virol, 1994; 68: 4650-4655), AIDS로의 진행은 CTL 활성의 손상과 밀접히 관련되어 있다 (Harrer T, Harrer E, Kalams S, Elbeik T, Staprans S, Feinberg MB, Cao Y, Ho DD, Yilma T, Caliendo A, Jonson RP, Buchbinder S, and Walker B. HIV-specific CTL- response in healthy long-term asymptomatic HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses, 1996, 12, 7: 585-592). 바이러스-특헝 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 백신이 마침내 HIV 감염의 SIV 모델내의 감염의 결과에 긍정적인 영향을 끼쳤다 (Barouch, D. H., S. Santra, J. E. Schmitz, M. J. Kuroda, T. M. Fu, W. Wagner, M. Bilska, A. Craiu, X. X. Zheng, G. R. Krivulka, K. Beaudry, M. A. Lifton, C. E. Nickerson, W. L. Trigona, K. Punt, D. C. Freed, L. Guan, S. Dubey, D. Casimiro, A. Simon, M. E. Davies, M. Chastain, T. B. Strom, R. S. Gelman, D. C. Montefiori, M. G. Lewis, E. A. Emini, J. W. Shiver, and N. L. Letvin. 2000. Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination. Science. 290:486-92; Gallimore, A., M. Cranage, N. Cook, N. Almond, J. Bootman, E. Rud, P. Silvera, M. Dennis, T. Corcoran, J. Stott, A. McMichael, and F. Gotch. 1995. Early suppression of SIV replication by CD8+ nef-specific cytotoxic T cells in vaccinated macaques. Nature Med. 1:1167-1173.).

이러한 실험적 발견들 모두는 치료 및 예방의 전략은 그 목적의 적어도 하나로서 면역반응의 이 무기의 유도/보전/복원을 포함해야 한다는 점을 강하게 시사하고 있다.

동물 또는 인간에 있어서 CTLs를 생성하려고 다양한 방법론이 개발되어 왔다. 지금까지 가장 효과적인 것은 재조합 생 백터(recombinant live vectors)이다. 이 방법은 병원체로부터 선택된 유전자를 그 선택된 항체를 생산하기 위해 숙주(recipient)의 세포 안으로 전달할 무해한 바이러스 또는 박테리아를 이용하는 것이다. 세포안으로 유전자를 전달하는 이러한 방법은 CTL 에피토프의 과 정 및 MHC-I 분자에 의한 그들의 제시(presentation), 그리로 순차적으로 숙주(host)내의 CTL 클론의 유효한 자극을 최대화한다.

벡터로서 성공적으로 사용되어 온 것은 폭스바이러스(Poxviridae 계열)이다. 이 계열의 가장 널리 알리진 것은 백시니아 바이러스(Vaccinia Virus; VV)이며, 이는 쳔연두 박멸 켐페인 동안에 인간에 광범위하게 사용되었다.

HIV 단백질을 위한 VV 재조합으로 몇몇의 임상시험이 수행되어 왔다(Corey L, McElrath J, Weihold K, Matthewa T, Stablein D, Grahm B, Keefer M, Schwartz D, Gorse G. Cytotoxic T Cell and Neutralizing Antibody Responses to Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope with a combination vaccine regimen. J Infectious Dis, 1998, 177:301-9; Graham BS, Matthews TJ, Belshe R, Clements ML, Dolin R, Wright PF, Gorse GJ, Schwartz DH, Keefer MC, Bolognesi DP, Corey L, Stablein D, Esterlitz JR, Hu SL, Smith GE, Fast P, Koff W, J Infectious Dis, 1993, 167: 533-7). 그러나, VV는 인간에게 사용되기에는 다음 두가지의 주요 제약이 있다: (1) 백신접종을 받은(vaccinated) 사람중 적은 비율이 면역약화 개체에게는 치명적일 수 있는 강한 부작용을 보였고, (2) 종전에 VV 백신화 경력이 있는 환자의 경우 이종(heterologous) 항체에 대해서는 반응성이 떨어진다.

이러한 단점을 해결하기 위해서 VV대신에 아비폭스바이러스(Avipoxvirus)를 사용하는 것이다. 이들은 폭스바이러스 계열에 속하나, 이들의 복제는 조류 세포에 한정되어 인간 세포에 있어서 이들의 복제 사이클은 성공적이지 못하다. 이러한 목적으로 다음의 두가지 아비폭스바이러스가 사용되었다: 카나리폭스바이러 스(CPV) 및 파울폭스바이러스(FPV).

종양 관련 항체의 다양한 인간 병원체의 아비폭스바이러스 재조합은 동물에 있어서 CTL 반응을 유도한다(Limbach KJ, and E Paoletti. 1996. Non-replicating expression vectors: applications in vaccines development and gene therapy. Epidemiol. Infect. 116:241-256). 백신개발을 위해 재조합 아비폭스바이러스를 사용하는 방법은 미국에서 특허되었고(Paoletti E. y cols 1992 US5174993, Paoletti E. et al 1993, US5505941), 특히 렌티바이럴 항체(lentiviral antigens)를 위한 재조합 아비폭스바이러스를 사용하는 것에 대해서 유럽에 특허출원이 되었다(Paoletti E et al, EP0956360).

HIV-1 gag, pol 및 env를 위한 CPV 재조합이 건강한 지원자를 상대로 I단계 및 II단계 임상시험이 수행되었다(Clements-Mann ML, K Weinhold, TJ Matthews, BS Graham, GL Gorse, MC Keefer, MJ McElrath, R-H Hsieh, J Mestecky, S Zolla-Pazner, J Mascola, D Schwartz, R Siliciano, L Corey, PF Wright, R Belshe, R Dolin, S Jackson, S Xu, P Fast, MC Walker, D Stablein, J-L Excler, J Tartaglia, A-M Duliege, F Sinangil, E Paoletti. 1998. Immune responses to Human Immunodeficiency Virus (HIV) Type 1 induced by Canarypox expressing HIV-1MN gp120, HIV-1SF2 recombinant gp120, or both vaccines in seronegative adults. J Infect Dis 177: 1230-1246; Egan MA, WA Pavlat, J Tartaglia, E Paoletti, KJ Weinhold, ML Clements, RF Siliciano. 1995. Induction of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1)-specific cytolytic T lymphocyte responses in seronegative adults by a nonreplicating, host-range-restricted canarypox vector (ALVAC) carrying the HIV-1MN env gene. J Infect Dis 171: 1623-1627). 단계 임상시험에서 백신화된 경우의 50%, II 단계에서의 30% 및 우간다에서 최근 I 단계에서의 10% 미만의 경우에 적어도 하나의 HIV 항체에 대한 CTL이 보고되었다. 이 rCPV (vCP205)는 하나 이상의 HIV 타겟에 대한 CTL 반응을 얻기 위해 HIV 유전자를 게놈의 상이한 3개의 비본질적 부분에 주입함으로써 생성되었다.

다른 한편으로 FPV는 DNA 면역화와 조합하여 HIV 항원에 대한 마카크 내에서 CTL 반응을 유도하기 위해서 또한 사용되어 왔다(Robinson HL, DC Montefiori, RP Johnson, KH Manson, ML Kalish, JD Lifson, TA Rizvi, S Lu, S-L Hu, GP Mazzara, DL Panicali, JG Herndon, R Glickmanm, MA Candido, SL Lydy, MS Wyand and HM McClure. 1999. Nature Medicine, 5: 526-534). 면역원과의 이러한 조합은 HIV-1/마카카 네메스트리나(HIV-1/macaca nemestrina) 감염 모델에 있어 일정 수준의 보호를 제공하였다(Kent SJ, A Zhao, SJ Best, JD Chandler, DB Boyle, IA Ramshaw. Enhanced T-Cell immunogenicity and protective efficacy of a human immunodeficiency virus type 1 vaccine regime consisting of a consecutive priming with DNA and boosting with recombinant fowlpox virus. 1998. J Virol, 72: 10180-10188). 그러나, HIV 감염은 M 네메스트리나에 있어 비효율적이고 복제가 어렵기 때문에 이러한 동물 모델은 중요한 제약을 제공한다.

또한, 몇몇의 병원균체 유래 일련의 정확한 CTL 에피토프로 구성된 소형 유 전자(minigens)로 면역화시킴을 통해서 CTL 반응이 발생되었다는 것이 또한 보고되었다(Whitton, L, Sheng N, Oldstone MB, and McKee T. A "String of beads" vaccine, comprising linked minigenes, confers protection from lethal-dose virus challenge, J Virol, 1993, 67, 1:348-352; A multivalent minigene vaccine, containing B-cell, cytotoxic T-Lymphocyte and Th epitopes from several microbes, induces appropriate responses in vivo and confers protection against more than one pathogen. J Virol, 71, 3: 2292-2302).

전 gag 유전자와 더불어 gag 유래 소형 유전자를 위한 변형 백시니아 안카라(MVA) 재조합이 쥐에 있어 CTL 반응을 유도하기 위해서 사용되어 왔다(Hanke T, RV Samuel, TJ Blanchard, VC Neumann, TM Allen, JE Boyson, SA Sharpe, N Cook, GL Smith, DI Watkins, MP Cranage, AJ McMichael. 1999. Effective induction of simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T lymphocytes in macaques by using a multiepitope gene and DNA prime-Modified Vaccinia Virus Ankara boost vaccination regimen. J Virol, 73, 9: 7524-7532). 그러한 소형 유전자는 gag 유래 분리성(discrete) CTL 에피토프의 스트링으로 구성되어 있다.

소형 유전자 접근법의 주된 제한은 개개의 CTL 에피토프에 대한 조합은 제한된 범위의 HLA 항원만에 적용되므로, 따라서 유도된 CTL 반응이 매우 한정이 된다는 점이다.

본 발명의 본질은 HIV 단백질 유래 CTL 에피토프 풍부 영역(rich regions)으로 이루어진 키메릭 유전자의 구성이며, 이러한 영역은 바이러스 라이프 사이클의 초기 단계에서 발현되는 내부 보전단백질(conserved proteins) 및 조절단백질(regulatory proteins)로부터 선택된다.

이러한 해결책은 많은 HLA 대립형질유전자(alleles)에 의해 제시되는 CTL 에피토프의 동시 중첩과정을 가능하게 하므로 HIV 소형유전자에 비해 유리하다. 몇몇의 HIV-1 단백질을 위한 다른 아미폭스 바이러스 재조합과 비교하였을 때 이 해결책의 또다른 장점은 동일한 유전자 내에서 몇몇의 단백질 유래 면역학적으로 관련있는 영역의 밀집이 재조합 바이러스의 생성을 용이하게 하고, 동일한 재조합 바이러스 내에 몇몇의 항생(antibiotic) 시스템을 사용해야 하는 필요성을 없애준다는 점이다. 또한, 이는 하나의 재조합 바이러스 내에 수개의 HIV 아류(subtype) 유래 에피토프의 조합을 용이하게 한다. 선택된 영역은 가장 잘 보존된 바이러스 단백질 및 초기 발현 조절 생성물에 속한다. 이러한 CTL 에피토프 풍부 영역은 세포 프로테아제에 의한 과정을 용이하게 하기 위해 2 개의 리신(lysines)이 양옆에 있는 보존 T 헬퍼 세포 에피토프와 결합되어 있다. 마지막으로, 단일클론성 항체에 의해 인식되는 B 세포 에피토프가 면역화학적 기술에 의해 폴리펩티드의 확인을 용이하게 하기 위해 첨가된다.

키메릭 유전자는 상이한 DNA 조각을 모음으로써 결합되며, DNA 조각의 일부는 화학적 합성에 의해서 생성되며 다른 부분은 HIV 유전자를 템플레이트로 이용하 여 효소중합연쇄반응(polimerase chain reaction; PCR)로 증폭된다. DNA 조각은 적절한 플라스미드 벡터에 서로 클로닝되고, 시퀀싱되어, 폭스바이러스 재조합 벡터에 해독된다.

특히, 본발명은 유전자 cr3에 관한 것이며, 이는 HIV-1 단백질 gp120, gp31 및 Vpr 유래 Th 세포 에피토프, Mab 2C4에 의해 인식되는 gp120의 V3 루프 상의 에피토프(Duarte CA, Perez L, Vazquez J, Duenas M, Vilarubia OL, Navea L, Valdes R, Reyes O, Montero M, Ayala M, and Gavilondo J. Epitope mapping, V region DNA sequence, and neutralizing Fab fragments of two monoclonal antibodies against the HIV-1 V3 loop. Immunotechnology 1996, 2:11-20), 및 단백질 RT, Gag 및 Nef 상의 CTL 에피토프 풍부 영역을 포함한다.

이러한 키메릭 유전자는 박테리아 또는 바이러스 생 벡터(lived vector) (ej 폭스바이러스, gp르페스바이러스, 알파바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, BCG, 살모넬라)의 게놈에 삽입되며, 바람직한 벡터는 폭스바이러스이며, 구체적으로는 아비폭스바이러스, 더욱 구체적으로는 FPV이다. 이러한 재조합 생 벡터는 동물 또는 인간내 HIV에 대한 TH1 면역 반응 및 세포독성 T 세포를 유도하기 위해 사용된다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 그러한 키메릭 단백질을 위한 FPV 재조합에 관한 것이며, 특히 키메릭 유전자를 포함하는 FPCR3 및 FPSCR3gpt라 명명된 재조합 FPV 균주(strain)에 관한 것이다. 결합되고 나서, cr3은 폭스바이러스 재조합 벡터, 특히 FPV 재조합 벡터에 클로닝된다. 이 경우에, 플라스미드 pEFL29 및 pFP67xgpt는 재조합 벡터로 사용되었다. pEFL29는 FPB 게놈의 6kb BamHI 말단 조각에 동형(homologous) 영역을 제공하는데, 이는 동형 유전자가 VV 7.5K 프로모터의 조절하에 삽입된 전사단위 양옆에 위치하고 또한 FPV의 4b 프로모터의 조절 하에 보고된 유전자 및 lacZ을 포함한다. pFP67xgpt는 동형 재조합 신호로서 11.2 kb BamHI 영역 유래 오픈 리딩 프레임 6 및 7을 이용한다. 이러한 영역은 이형 유전자가 합성 폭스바이러스 E/L 프로모터 하에 위치한 전사 단위 양옆에 위치하며, 또한 재조합 바이러스의 선택을 가능하게 하는 미코페놀산(mycophenolic acid)에 대한 저항성을 제공하는 gpt 유전자를 포함한다.

결과적인 플라스미드는 각각 pFPCR3 및 pFPSCR3gpt로 명명되었다. 그러한 플라스미드는 몇가지 공지의 트랜스펙션(transfection) 기술 중 하나를 이용하여 치킨 엠브리오 피브로블래스트(Chicken Embryo Fibroblasts; CEF)의 1차 배양액에 트랜스팩트된다. 특히 이 경우에, 트랜스펙션은 미리 FPV의 FP29 균주(strain)으로 감염시킨 CEF 내에 리포펙틴(Sigma, USA)을 이용하여 수행되며, 다른 방법들 예를 들어 전기충격법(electroporation) 및 DEAE Dextran 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 및 B 갈락토시다제(B galactosidase)를 발현했던 FPV게놈 재조합 바이러스 상의 이에 상응하는 비본질적(non-essential) 영역과의 이형 재조합의 결과, pFPCR3의 경우 복원가능하거나 pFPSCR3gpt의 경우 미코페놀산에 저항성을 보일 수 있다. 선택 마커(selection marker)의 존재는 재조합 바이러스 플라크의 확인 및 CEF 상의 수개의 패시지(passages)에 의한 정제를 가능하게 한다. 선택된 바이러스 상에 이형 유전자의 존재는 PCR에 의해 확인될 수 있으며 단백질 의 발현은 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 확인될 수 있다.

본 발명은 또한 Balb/c 쥐 내의 CTL 활성으로 TH1 면역 반응을 유도하기 위한 위에서 설명한 재조합 FPV 단독의 용도 또는 종래 기술에서 선택된 약학적으로 수용가능한 제제와 조합하여 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 특히 TH1 면역 반응을 자극하는 면역조절제(면역강화 물질) 또는 보조제, 특히 사이토킨, 예를 들어 IL2, IL12, IFNg, GMSCF, GSCF와 병용하여 위에서 설명한 키메릭 유전자를 위한 재조합 FPV의 치료 또는 예방 조합에 관한 것이며, 특히 FPCR3 및 FPSCR3gpt에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 동물 또는 인간에 하루 10² 내지 10⁷ iu의 사용량의 IL2와 병용하여 바이러스 FPCR3 또는 FPSCR3gpt의 조합에 관한 것이다. FPV의 투여일부터 또는 그 이후에 매일 Balb/c 쥐에 IL2를 투여하는 경우 CR3에 대한 세포면역반응이 증가된다.

비록 본 발명이 특히 CR3에 관한 것이나, CR3 내에 있지 않은 CTL 풍부 조각 또는 CR3 내의 이에 상응하는 조각이기는 하나 다른 HIV-1 분리체 유래의 것도 사용할 수 있다.

비슷하게, 본 발명은 FPV의 FP9 균주(strain)에 관한 것이나, 다른 FPV 근원주(parental strains)도 재조합 바이러스를 형성하기 위해 사용될 수 있으며, 다른 아비폭스바이러스 예를 들어 CPV, 다른 폭스바이러스 예를 들어 VV 또는 MVA, 또는 다른 바이러스들 예를 들어 헤르페스바이러스, 알파바이러스, 아데노바이러스, 폴 리오바이러스 또는 심지어 박테리아 예를 들어 BCG 또는 살모넬라도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서는, 유전자가 포유류 세포 내에 발현되도록 적절한 플라스미드 벡터에 클로닝될 수 있으며, 약학적으로 수용가능한 전달체(carrier)와 함께 TH1 면역 반응 및 CTL 활성을 유발하기 위해 포유동물 내에 주입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 위에서 언급된 면역조절제 또는 보조제 또는 리포솜, 다당, 리포펩티드, 리피드, 프로테오리포솜 또는 그들의 조합과 같은 다른 것들과 병용하는, 위에서 설명한 재조합 플라스미드의 치료 또는 예방 조합이 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 박테리아, 효모, 균류, 곤충 또는 포유류 세포, 식물 또는 형질전환 동물의 우유 내에 재조합 단백질이 발현되기 위해 다른 플라스미드에 클로닝될 수 있다. 또한, 그러한 시스템에서 재생한 단백질은 투여되었을 때 동물 또는 인간 내 TH1 면역 반응 및 CTL 활성을 유도하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 위에서 언급된 면역조절제 또는 보조제 또는 리포솜, 다당, 리피드, 프로테오리포솜과 같은 다른 보조제들 또는 동물 또는 인간 애 TH1 타입 면역반응 및 CTL 활성을 증가할 수 있는 다른 공지되어 있는 보조제와 병용하는, CR3 단백질의 치료 또는 예방 조합이 포함된다.

도 1. 삽입 부위(insertion site)로서 BamH1 6Kb 말단 영역 유래 ORF-1을 이용한 계두(Fowlpox) 내에 이형 재조합을 위한 플라스미드 pEFL-cr3. 유전자 cr3는 VV p7.5K 프로모터의 조절 하에 있으며 보고유전자(reporter gene) LacZ는 FPV 4b 프로모터의 조절 하에 있다.

도 2. 삽입 부위로서 11.2 kb BamHI 조각 유래 ORF-6 및 ORF-7 사이의 DNA 영역을 이용한 FPV 내의 이형 재조합을 위한 플라스미드 pFP67xgpt. 유전자 cr3는 합성 프로모터 E/L의 조절 하에 있으며, 유전자 Ecogpt는 VV 7.5K 프로모터의 조절 하에 있다.

도 3. (A) PCR 및 (B) 3 개의 독립적인 cr3 재조합 FPVs의 웨스턴 블롯(western blot): (1) FPCR3.1; (2) FPCR3.2; (3) FPCR3.3; (4) FPL29; (5) DNA molecular weight marker.

도 4. (A) cr3내부 올리고뉴클레오티드를 이용항 PCR (B) 3 개의 독립적인 cr3 재조합 FPV의 웨스턴 블롯: (1) FPSCR3GPT.1; (2) FPSCR3GPT.2; (3) FPSCR3GPT.3; (4) 모 바이러스(parental virus); (5) 분자량 마커(Molecular weight marker).

도 5. 웨스턴 블롯으로 평가된 CR3 발현의 안정도. 레인은 바이러스 스톡(viral stock) 유래 FPSCR3GPT로 감염된 FPV에 대한 3개의 독립적인 표본(1, 2, 3) 및 수크로스 완충액으로 정제된 FPV에 대한 3개의 독립적인 표본(4, 5, 6)을 나타낸다. 레인 7은 모 바이러스로 감염된 CEF를 나타낸다.

도 6은 펩티드 32가 포함된 EPSCR3gpt 및 P815 세포로 면역화된 쥐 또는 CR3 또는 Nef를 위한 VV 재조합으로 감염된 쥐 유래 비장세포(splenocytes)를 이용한 2개의 독립적인 ELISPOT 실험의 결과. 결과는 10⁶ 비장세포 당 IFN 감마 점액분비세포(IFN gamma secreting cells)의 수로 표현하였다.

해당하는 네거티브 콘트롤(P815 자체 또는 VV WR 감염)의 수치는 제하였다.

도 7은 FPCR3 또는 FPSCR3gpt로 면역화된 주 또는 cr3 유전자로 안정하게 이식된 P815 유래 비장세포를 이용한 IFN 감마 ELISPOT 실험. 결과는 10⁶ 비장세포 당 IFN 감마 점액분비 세포의 수치로 나타내었다. 네거티브 콘트롤(모 P815; parental P815)의 수치는 제하였다.

도 8은 AIDS 환자 유래 T 림프구에 의한 VVCR3 감염 자가 B 세포의 인식. IFNg ELISPOT로부터의 결과는 10⁶ 말초혈관(peripheral blood) 단핵세포 당 IFN 감마 분비세포의 수치로 나타내었다.

하기의 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것이며, 본 발명은 다음의 실시예에 의해 제한적으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1. cr3 의 수득

cr3는 상이한 HIV 유전자의 조각을 결합한 키메릭 유전자이며, pTAB11 플라즈미드 상에 조합되는데, 이는 pTAB9와 본질적으로 동일하지만(Gomez CE, Navea L, Lobaina L, Dubed M, Exposito N, Soto A and Duarte CA. he V3 loop based Multi-Epitope Polypeptide TAB9 Adjuvated with Montanide ISA720 is Highly Immunogenic in Nonhuman Primates and Induces Neutralizing Antibodies Against Five HIV-1 isolates. Vaccine 17:2311-2319, 1999), P64K 단백질의 N-말단 부분을 코딩하는 절편(fragment) 대신에 유전자의 5' 말단의 gp120 유래 T1 및 T2 T 헬퍼 세포 에피토프를 가진다. gp 120 유래 T2 에피토프, MN 균주의 V3 에피토프, 및 gp41 및 vpr 유래 T 헬퍼 세포 에피토프를 코딩하는 186 bp 블런트-BamHI (blunt-BamHI) 합성 DNA 절편은 EcoRV-BamHI 절단 pTAB11 부위로 클로닝되었다. 2개의 연속적인 리신을 코딩하는 DNA 서열이 세포간 프로세싱을 원활히 하기 위해 각각의 에피토프 사이에 삽입되었다. 그 결과의 플라스미드를 pCR1이라고 명명하였다. p66/p51 (RT) 단백질 (HIV-1 SF2 프로바이러스 유래 pos. 2663-3109)을 코딩하는 603 bp 절편은 O.2660 및 O2661 프라이머를 이용하여 PCR 증폭되었다(표 1). PCR 절편을 저용해성(low-melting) 아가로스(agarose) 이후에 소화(digested) Bg1II-EcoRI로부터 추출하고 Bg1II-EcoRI 절단 pCR1 벡터 내에 CR2 단백질을 코딩하는 pCR2 플라즈미드를 수득하기 위해 서브클로닝하였다. 그리고 나서, nef 유전자 서열을 포함하는 324 bp 절편 (HIV-1 LAI 분리체 유래 pos. 8516-8818)을 O.2662 프라이머 및 O.2663 프라이머로 PCR 증폭하였다. 마지막으로, gag 유전자 p24 코딩 부위 내에 267 bp의 다른 세그먼트 (HIV-1 SF2 유래 pos. 14512-1691)를 O.2664 and O.2665 프라이머(표 1)를 이용하여 증폭하였다. 그리고 나서, 20 pmol의 O.2662 및 O.2666프라이머 (표 1)를 이용하여 중첩 PCR (overlapping PCR)을 수행하였다. 동일한 양의 각 밴드(0.47 pmol)를 PCR 버퍼[KCl 50 mM; Tris-HCl 10 mM, (pH 8.3), 25 ℃; 젤라틴 0.001%], MgCl₂2.5 mM, dNTP 0.2 mM 및 4 U의 Taq Polymerase와 50 ㎕에 혼합하였다. O.2663 및 O.2664 올리고뉴클레오티드의 상보성(complementary) 9 bp 말단에 의한 밴드의 복원(annealing)을 촉진하기 위하여, 혼합물을 92 ℃에서 2 분동안 처음 가열하고 나서, 50 ℃에서 냉각시켰다. 마지막으로 복원된 세스먼트를 확장시키기 위하여 온도를 72 ℃로 5 분동안 승온하였다. 그리고 나서, 10 ㎕의 상기 반응액을 2.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 20 pmol of O. 2662 and 20 pmol of O.2666 및 4 U Vent pol을 포함하는 PCR 완충용액에 첨가하여 전체 부피를 50 ㎕로 하였다. 표준 증폭 조건은 92 ℃에서 2 분을 하고, 92 ℃에서 40 초, 50 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 1 분의 사이클을 30회 하고 나서, 72 ℃에서 5분동안 최종 확장하는 것이다. 다음으로, 중첩 nef-p24 증폭 밴드를 저용융성(low-melting) 아가로스에서 전기영동으로 정제하고 Xbal로 다이제스트하였다(digest). 마지막으로 pCR3 플라스미드를 수득하기 위해 전의(former) 블런트-Xbal 밴드를 pCR2 벡터 Nrul-Xbal 절단 부위에 클로닝하였다. cr3는 따라서 T 헬퍼 세포 및 다양한 범위의 GLA 항원(표 2)에 의해 발현되는 gp120, gp41, vpr, RT, nef 및 gag 유래 CTL 에피토프를 포함하는 키메릭 단백질을 코딩한다.

PCR 반응에 사용된 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열

올리고뉴클레오티드	서열 (5'-3')
O.2660	GAAGATCTGTACAGAAATGGAAAAG
O.2661	GGAATTCTCGCGATCCTACATACAAATCATC
O.2662	GACATCACAAGTAGCAATACAGC
O.2663	CCCTGCATGTGGCTCAACTGGTACTAGCTTG
O.2664	GTTGAGCCACATGCAGGGCCTATTGCAC
O.2665	GCTCTAGATTATTCGGCTCTTAGAGTTTTATAG
O.2666	GCTCTAGATTATTCGGCTCTTAGAG

CR3 내의 T 세포 에피토프

수치는 각각의 바이러스 단백질의 HXB2 아미노산 서열에 대한 위치를 나타내는 것이고, 바이서스 분리체는 괄호안에 있으며; ND는 정의되지 않았다(Not defined)는 의미이다.

실시예 2. pFPL29 내에 cr3 의 클로닝

pCR3에서, 5' 상의 Clal 사이트 및 T4 파아지 유전자 32 종결자(terminator) 및 3'의 Hind III 사이트를 가지고, cr3 유전자는 pTryp의 조절하에 클로닝되었다. 이 플라스미드는 Clal 및 HindIII로 다이제스트되었으며, 5' 말단에 ATG 및 3'에 전사 종결 코돈을 갖는 cr3 유전자를 수득하기 위하여 Klenow I으로 처리하였다. 이 DNA 절편은 폭스바이러스 재조합 벡터 pEFL29에 클로닝되었다.

pEFL29는 FPV 게놈 내의 동형(homologous) 재조합을 위한 비필수적 부위로서 BamH1 6Kb 말단 절편을 가지고 있다. 이러한 절편은 3개의 ORF를 가지고 있으며 ORF1은 중단된다. VV p7.5K, 프로포터는 이러한 동형 부위에 의해 양쪽이 둘러싸이고, 그리고 나서 Smal 사이트 및 리포터 유전자 lacZ에 의해 FPV의후기 프로모터 4b의 조절 하에 진행된다. 이 플라스미드는 또한 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자 및 복제의 박테리아 기원을 포함한다.

PEFL29는 알칼린 포스파타제로 다이제스트되고 처리되며 cr3 유전자를 포함하는 Clal/HindIII 다이제스트 밴드로 연결된 Smal이었다. p7.5k 하에서 정배향의(in the right orientation)의 cr3를 갖는 몇몇의 클론이 선택되었다. E.coli 균주 DH5α(φ80dlacZΔM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK- mK+), supE44, relA1, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169)가 카나마이신이 포함된 LB 배양액(25 ㎍/ml) 내에 재조합 플라스미드를 증식하고 선택하기 위해 사용되었다. 모든 유전자 조작은 Sambrook를 따라서 이루어졌다(Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Sec Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

클론 pEFL-cr3의 DNA 서열(도 1)은 자동 서열 프로세서(Pharmacia)를 이용하여 확인하였다. 이 클론은 CsCl 구배를 이용하여 정제되었으며, 치닌 엠브리오 피브로블래스트(CEF)를 트랜스펙트하는데 이용된다.

실시예 3. pFP67xgpt 내에 cr3 의 클로닝

cr3 유전자는 PCR증폭되었고 pMosblue 벡터(Amersham, UK) 내에 클로닝되었다. 그 결과의 플라스미드를 pTCR3라고 명명하였다. pTCR3는 Hpal/BamHI 다이제스트되었고, cr3를 포함하는 짧은 밴드는 폭스바이러스 벡터 pFP67xgpt 내에 클로닝되었다.

pFP67xgpt는 FPV 게놈의 동형 재조합을 위한 비필수적 부위로서 FPV 게놈의 11.2 Kb BamH1의 절편을 가지고 있다 (Tomley F, Binns M, Campwell J, Boursnell M. Sequence Analysis of an 11.2 Kilobase, near-terminal, Bam HI fragment of fowlpox virus, J Gen Virol, 1988, 69, 1025-1040). 이러한 절편은 이 부위의 오픈 리딩 프레임 6 및 7을 포함하며 삽입(insertion)은 유전자간 부위(intergenic region)에서 일어난다. E/L 합성 프로모터(Carroll MW, Moss B. E. coli B-glucoronidase (GUS) as a marker for recombinant vaccinia viruses, Biotechniques, 1995, 19, 3: 352-354) 및 리포터 유전자 Ecogpt가 VV의 7.5K 프로모터의 조절 하에서 이러한 동형 부위에 의해 양옆이 둘러 쌓인다. 이 플라스미드는 또한 카나마이신 저항 유전자 및 복제의 박테리아 기원(bacteria origin of replication)을 포함한다.

플라스미드 pFP67xgp는 Stul/BamHI에 의해 절단되고 pTCR3의 Hpal/BamHI 다이제스쳔(digestion) 유래 DNA 절편을 포함하는 cr3로 연결되었다. E/L 합성 프로모터 하에서 적절한 배향의 cr3를 갖는 몇몇의 클론이 선택되었다 (표 1). E.coli 균주 DH5α(φ880dlacZΔ(M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK- mK+), supE44, relA1, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169)가 암피실린이 포함된 LB 배양액(50 ㎍/ml) 내에 재조합 플라스미드를 증식하고 선택하기 위해 사용되었다. 모든 유전자 조작은 Sambrook를 따라서 이루어졌다. 클론 pFP67xgptct의 DNA 서열은 자동 서열 프로세서(Pharmacia)를 이용하여 확인하였다. 이 클론은 CsCl 구배를 이용하여 정제되었으며, CEF를 트랜스펙트하는데 이용된다.

실시예 4. 재조합 FPVs의 생성

재조합에 사용된 모(parental) FPV는 감쇠(attenuated) HP-438 균주이었으며, 이는 6번의 연속적인 CEF 상에서의 통과(passages), 융모요막(chorioallantoic membranes) 상에서 2번의 추가적인 통과, 마지막으로 CEF를 438번 통과시킴으로써 병원성 균주 HP-1로부터 유래되었다(Mayr A and K Malicki. 1966. Attenuierung von virulentem Huhnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus. Zentralbl. Veterinaermed. Reihe B 13: 1-13). 2회-용균반(plaque)-정제 HP438(FP9) 분리체를 원종(stock)을 구성하기 위해서 6회 통과시켰다. 2% 신생 소 혈청(NBCS)를 포함하는199 배양액에서 CEF 상에서 FPV 원종이 배양되었다.

재조합 FPV는 앞서 언급한 FP9 및 플라즈미드 pEFL29 또는 그 유도체 사이에 동형 재조합으로 생성된다. 25 cm² 플라스크에서 배양된 CEF는 2 용균반 형성 단위(pfu)/세포의 다중감염도(mutiplicity of infection)으로 FP9로 감염되었고, 2시간 후에 세포들은 20 ㎍의 리포펙틴(Gibco BRL, USA)을 이용하여 CsCl 정제 10 ㎍의 플라스미드 DNA(pEFL-cr3 또는 pFP67xgptctl)로 트랜스펙트되었다. 프레시 배양액(fresh medium) (10% 트립토스 포스페이트 브로스 및 2% NBCS를 포함하는 199 배양액 3 ml)을 첨가하고 37 ℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 프레시 배 양액을 24시간 후에 다시 첨가하고 나서, 세포들을 추가적으로 3-4일 동안 배양하였다. 그 후에, 세포들을 냉각-해빙을 3회 실시하였다. 재조합 바이러스를 선택하기 위해 세포 여액(lysate)을 CEF 내에서 적정하였다(titrated). 흡착 2시간 후에 바이러스 접종원(viral inculum)을 제거하고 EMEN을 포함하는 아가로스 층을 첨가하였다. 이 층은 동일한 부피의 2% 저용융성(low melting) 아가로스 및 EMEN 2X(Gibco, Grand Island, NY) 및 4% 우태혈청(fetal calf serum; Gibco, Grand Island, NY). 낮 동안에 4개의 바이러스 용균반이 명확하였다. 0.33% Xgal(Melford Laboratories, UK)를 포함하는 다른 아가로스 층을 배양액에 첨가함으로써 pEFL-cr3로 트랜스펙트된 CEF를 균주화되었다(were strained). 푸른 홍균반을 선택하고 100% 바이러스 홍균반이 B 갈락토시다제 발현에 양성일 때까지 3번 정제하였다. lacZ+ 바이러스의 원종이 그리고 나서 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰 및 2% NBCS를 포함하는 199 배양액의 25cm² 플라스크에서 배양된 CEF 내에서 증폭되었다. 선택된 재조합 FPV는 FPCR3라고 명명하였다. 플라스미드 pFP67xgptctl로 트랜스펙션하기 위한 선택적인 배양액은 미코페놀산(25 ㎍/ml), 잔틴(xantine, 250 ㎍/ml) 및 히포잔틴(1 ㎍/ml)를 포함하였다. 낮 동안에 4개의 바이러스 홍균반은 명백하였다. gpt 및 cr3 유전자가 동일한 부위에 의해 양옆을 둘러싸여 있기 때문에, 선택적 배양액에서 바이러스 홍균반을 분리하는 것은 재조합이 발생하였고 두 유전자 모두 FPV 게놈에 삽임되었을 나타낸다. 홍균반은 CEF 내에서 3회 연속 정제되었다. 재조합 바이러스는 FPSCR3GPT라고 명명하였다.

실시예 5. FPCR3의 PCR 분석

FPCR3 재조합이 cr3 유전자를 포함하고 있다는 것을 확인하기 위해 PCR 분석이 사용되었다. 재조합 FPV를 CEF 내에서 6일 동안 증식하고, 세포는 회수하여 펠렛으로 만들었다. 펠렛은 1.25mg/ml의 프로티나제 K를 포함하는 200 ㎕의 추출 완충용액(10mM Tris HCl, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% SDS, 2% β-머캅토에탄올)에 서스펜션시키고 55 ℃에서 2시간동안 배양되었다. DNA를 페놀-클로로포름을 이용하여 추출하고 에탄올을 이용하여 침전시켰다. 각각의 바이러스 유래 DAN를 아래에서 설명하는 각각 cr3 유전자의 5' 및 3' 내 서열에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 테스트하였다. 사용된 PCR 조건은 94 ℃에서 5분하고 나서, 94 ℃에서 1분, 45 ℃에서 1분 30초 및 72 ℃에서 1분 30초를 25사이클, 및 마지막으로 72 ℃에서 10분 최종 확장하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다:

프라이머 775, 5' TATTAACATTGCCTAGTAG 3'

프라이머 776, 5' GAAGTAGAATCATAAAGAAC 3'

3개의 독립적인 CR3 재조합 바이러스 (FPCR3.1; FPCR3.2; FPCR3.3)는 PCR 반응 후에 예측된 1.3kb 밴드를 보였다. 이 밴드는 모 바이러스 FPL29에는 없다(도 3A).

실시예 6. FPSCR3GPT의 PCR분석

FPSCR3GPT 재조합이 cr3 유전자를 포함하고 있는지 확인하기 위해 PCR 분석을 사용하였다. 재조합 FPV는 CEF 내에서 6일동안 증식되었고 세포는 수획되어 펠렛으로 만들었다. 펠렛은 1.25mg/ml의 프로티나제 K를 포함하는 200 ㎕의 추출 완충용액(10mM Tris HCl, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% SDS, 2% β-머캅토에탄올)에 서스펜션시키고 55 ℃에서 2시간동안 배양되었다. DNA를 페놀-클로로포름을 이용하여 추출하고 에탄올을 이용하여 침전시켰다. 각각의 바이러스 유래 DAN를 아래에서 설명하는 각각 cr3 유전자의 5' 및 3' 내 서열에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 테스트하였다. 사용된 PCR 조건은 94 ℃에서 5분하고 나서, 94 ℃에서 1분, 45 ℃에서 1분 30초 및 72 ℃에서 1분 30초를 25사이클, 및 마지막으로 72 ℃에서 10분 최종 확장하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다:

프라이머 2660, (257-279) 5'GAAGATCTGTACAGAAATGGAAAAG 3'

프라이머 2663, (1029-1059) 5'CCCTGCATGTGGCTCAACTGGTACTAGCTTG 3'

3개의 독립적인 CR3 재조합 바이러스 (FPSCR3gpt.1; FPSCR3gpt.2; FPSCR3gpt.3)는 PCR 반응 후에 예측된 800 pb 밴드를 보였다. 이 밴드는 모 바이러스 FPL29에는 없다(도 4A).

실시예 7. FPCR3로 감염된 CEF에 의한 CR3 발현의 평가

FPCR3에 의한 CR3의 발현은 웨스턴 블롯(Western blotting)으로 확인하였다. 융합성(confluent) CEF는 60 mm Petri 디쉬 내에서 재조합 FPV를 이용하여 0.5 pfu/세포로 감염되었다. 24시간 후에 세포는 수획되었고 펠렛으로 만들어졌으 며, 1X SDS 겔-로딩 완충용액(50mM Tris HCl pH 6.8, 100mM DTT, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤)에 서스펜션시켰다. 단백질은 15% 겔상의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)pd서 분액되었다. 그리고 나서 표준 프로토콜에 따라서 니트로셀룰로오스 막(Hybond-C, Amersham, UK) 상에서 전기이동(electro-transferred)시켰다. 이동 후에 막은 5% 비지방 건조 우유/포스페이트 버퍼 염수(PBS: 2.68mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄, 0.137M NaCl, 8.06mM Na₂HPO₄)에서 밤새 블록킹하였다. 그리고 나서 1% 건조 우유를 포함하는 PBS에 희석된 10 ug/ml의 단일클론성 항원으로 실온에서 2시간동안 배양되엇다. 이 단일클론성 항원은 CR3로 면역화된 쥐에서 생산되었다(Iglesias E, Ruiz M, Carrazana Y, Cruz LJ, Aguilar A, Jimenez V, Carpio E, Martinez M, Perez M. Martinez C, Cruz O, Martin A, Duarte C. Chimeric proteins containing HIV-1 epitopes. Journal Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, 2001, 5: 109-20). 그리고 나서, 막을 세척하고 겨자무 퍼록시다제(HRPO)(Amersham, UK)에 결합된(conjugated) 쉽 항-마우스(anti-mouse antibody) 항체 (1:2000)로 배양하였다. 수회의 세척 후에, ECL 웨스턴 블롯 디텍션 시스템(Amersham, UK)을 이용하여 면역흡입법(immunoblots)를 실시하였다. 분자량이 50 내지 64 kDa를 가지는 특정 밴드를 FPCR3 감염 배양액에서 발견되었다. 모 FP9 바이러스로 감염된 CEF에서는 단백질이 발견되지 않았다(도 3B).

실시예 8. FPSCR3gpt로 감염된 CEF에 의한 CR3 발현의 평가

FPSCR3gpt에 의한 CR3 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 상기 실시예에서 설명한 바와 비슷한 방법으로 확인하였다. 분자량이 50 내지 64 kDa를 가지는 특정 밴드를 FPSCR3 감염 배양액에서 발견되었으며, 반면 모 FP9 바이러스로 감염된 CEF에서는 단백질이 발견되지 않았다(도 4B).

실시예 9. FPCR3 및 FPSCR3gpt의 정제 및 쥐의 면역화

재조합 FPV의 큰 모종(large stocks)이 특정 병원성없는 가축(flock)의 란(eggs)로부터 수득한 CEF 상에서 배양되었다. 25%(w/v) 수크로스 완충액을 통한 세포질추출물을 Beckman SW28 rotor에서 29000 rpm으로 두시간 동안 원심분리함으로써 FPV를 정제하였다. 바이러스 역가를 CEF 단층(monolayer) 상에서 용균반 분석을 통해 결정하였다. 도 5는 배양의 규모를 증가시켜도 CR3 발현이 변하지 않는다는 것을 보여준다.

젊고 성장한(young adult; 5-8 주 성장) 암 Balb/c 마우스(the Institute for Animal Health, Compton, UK, or the Centro Nacional de Produccion de Animales de Laboratorio (CENPALAB), Cuba의 SPF 브리딩 컬러니(bleeding colony)로부터 수득)는 정맥내 (i.v), 복막내(intraperitoneal; i.p), 또는 피하 (s.c) 경로로 2.5-5 x 10⁷pfu의 FPCR3, FPSCR3gpt 또는 200 ㎕ 무균 PBS 내에 네가트브 콘트롤 바이러스에 의해 프라임되었다.

실시예 10. Balb/c 마우스내 CR3에 대한 CTL 반응의 측정

항원 특정 IFN-γ-방출 세포의 확인을 위한 효소-연결-면역 분석법(enzyme-linked-immunospot; ELISPOT)을 앞서 언급한 방법(Tanguay S and JJ Killion. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. 1994. Lymphokine Cytokine Res, 13: 259-263)을 이용하여 수행하였다. 요약하면, 이모빌론-P 멤브레인 96-웰 플레이트(immobilion-P membrane 96-well plates; Millipore, Molsheim, France)를 100 ㎕/웰의 5㎍/ml 쥐의 IFN-γ-특정 단일클론성 항체 R4(Parmingen, San Diego, California)로 4 ℃에서 밤새 코팅을 하고, PBS로 3회 세퍽을 하고, 10% FBS로 37 ℃에서 1시간동안 보충된 RPMI 1640 배양액을 이용하여 블러킹을하였다. 그리고 나서 테스트 세포를 첨가하였다: 이들은 FPCR3 또는 FPSCR3gpt로 프라임되고 추가면역된(boosted) 마우스 유래 (위에서 설명한 바와 같이 제조된) 생체외(ex vivo) 비장 세포 현탁액이었다. 서로 다른 숫자의 테스트 세포 웰당 첨가하였다: 10⁶, 2x10⁵, 및 4x10⁴. 세포들은 합성 펩타이드로 1 μM에서 배양되거나 CR3, Gag 또는 Nef를 위한 VV 재조합 5pfu/세포 m.o.i로 감염된 P815 세포를 첨가하여 활성되었다(stimulated). 펩티드가 없거나 콘트롤 백시니아 바이러스(vSC8 또는 와일드 타입 백시니아 균주 WR)로 감염된 P815세포는 IFN-γ-생산 세포의 바탕수(background numbers)를 나타내기 위하여 포함되었다. 각각 의 웰은 R10 배양액 및 hIL02의 최종 부피가 200㎕를 가졌다. 모든 측정 변수들은 중복해서 테스트하였다. 밤새(적어도 17시간) 배양하고 나서플레이트를 PBS로 3회, PBS 및 0.05% Tween20으로 5회 세척하고 나서, 2차 비오틴-콘주게이티드(a secondary biotin-conjugated) 항체 XMG1.2(Pharmingen, San Die해, California)를 0.5 ㎍/ml로 첨가하고 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 웰은 PBS 및 0.05% Tween 20으로 5회 세척하고 나서, 알칼린 포스파타제(AP)-라벨된 스트렙타비딘(Vector Labs, CA, USA)를 PBS 및 0.05% Tween 20에서 1/1000으로 희석시킨 용액으로 실온에서 한시간동안 첨가하였다. 웰은 다시 PBS 및 0.05% Tween 20으로 3회, PBS로 3회 세척하였고, AP h할성 키트(Biorad, CA, USA)를 이용하여 스팟을 발전시켰다. 15분 후에 웰은 수돗물로 세척하고 건조시켰으며, 스팟을 스트레오스코픽 마이크로스코프(Leica Microscopy System, Heerbrugg, Switzerland) 하에서 검수하였다(counted). 혹은, 몇몇의 분석에서는 HRPO-라벨된 스트렙타비딘(Amersham, UK)랄 사용하고, 1/800으로 희석하였으며; 스팟은 그리고 나서 0.1%의 3,3'-디아미노벤지딘/트리스-HCL 50 mM, pH 7.4 및 0.1%의 과산화수소로 발전시켰다(Sigma, Saint Louis, USA). 결과는 10⁶ 비장세포 또는 분액 세포 당 스팟 형성 세포(SFC)로 나타내었다. 각 그룹에 대해서 두배의 네거티브 콘트롤(펩티드가 없거나 콘트롤 VV로 감염된 P815)보다 큰 값을 포지티브로 간주하였다.

두개의 독립적인 ELISPOT 분석의 결과를 도 6에 나타내었다. Balb/c 마 우스 유래 비장세포의 주(significant) 분액을 FPCR3로 면역화시켰으나, 네거티브 바이러스를 지닌 것중에서 VVCR3 또는 VVgag으로 감염되거나 V3 MN 펩티드(LKKKRIHIGPGRAFYERY)로 프라임된 P815에 대해서 IFN 감마 ELISPOT에서 포지티브인 것은 없었다.

다른 실험에서, Balb/c 마우스는 FPCR3 또는 FPSCR3gpt로 설명한 바와 같이 면역화되었으며 CTL 유도는 cr3로 안정화되게 트랜스펙트된 P815(P815cr3)를 이용하여 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 7에 표시하였다. 두 재조합 FPV는 CR3에 특성인 IFB 감마 분비 세포의 주 분액을 유도하였다.

실시예 11. AIDS 환자 유래 림프구에 의한 CR3 에피토프의 처리(processing) 및 인식

HIV 감염 환자 유래 자가 B 세포는 EBV 형질전환되었고, CR2를 위한 VV재조합(VVCR3)로 감염되었다. 이러한 목표세포들은 HIV환자 유래 말초 혈관 림프구로 배양되었고, IFNγ 분비 비장세포의 수자는 ELISPOT에 의해 계산되었다. 이 실험은 폭스바이러스에 의해 발현된 cr3유전자가 HIV 감염 환자 유래 CTL 림프구에 그 에피토프를 효율적으로 제공할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명은 HIV의 상이한 유전자의 조각들의 조합에 의해 형성된 HIV 키메릭 유전자에 관한 것이며, 상기 조각은 세포독성 T 세포(CTL) 또는 HIV-1 보조 T 세포 를 위한 에피토프를 포함하고, 이는 주요 조직적합 복합체(HLA-I)의 광범위한 항원에 의해 제시된다. 상기 유전자로부터 재조합 폭스바이러스가 수득되며, 이는 HIV/AIDS 감염에 대한 예방 및 치료에 유용하고, 백신화된 실험실 동물에서 보호적 면역 세포 반응을 발생시켰으며, HIV/AIDS 환자의 CTL 림프구에 의해 인식된다.

SEQUENCE LISTING <110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA <120> RECOMBINANT POXVIRUS FOR CHIMERIC PROTEINS OF THE HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS. <130> hiv <140> <141> <150> CU 2001-0057 <151> 2001-02-28 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1333 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> gene <222> (1)..(1333) <223> Gen cr3 sequence <400> 1 atgcgtatca aacagattat caacatgtgg caggaagtgg gcaaagcgat gtatgccccg 60 ccgatttctg gtatggttga gcagatgcat gaagatatca ttagcctgtg ggaccagtct 120 cttaagaaaa agcgtatcca cattggccca ggccgtgcat tctatgaaag atacctaaag 180 gatcaacagc tcctagggaa aaagcaactg ctgtttattc atttcagaat tgggtgtcga 240 catagcagaa agaaagagat ctgtacagaa atggaaaagg aagggaaaat ttcaaaaatt 300 gggcctgaaa atccatacaa tactccagta tttgctataa agaaaaaaga cagtactaaa 360 tggagaaaac tagtagattt cagagaactt aataaaagaa ctcaagactt ctgggaagtt 420 cagttaggaa taccacaccc cgcagggtta aaaaagaaaa aatcagtaac agtattggat 480 gtgggtgatg catacttttc agttccctta gataaagact ttagaaagta tactgcattt 540 accataccta gtataaacaa tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgctgcca 600 cagggatgga aaggatcacc agcaatattc caaagtagca tgacaaaaat cttagagcct 660 tttagaaaac agaatccaga catagttatc tatcaataca tggatgattt gtatgtagga 720 tcggacatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg gctagaagca 780 caagaggagg aggagatggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 840 tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 900 attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 960 ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 1020 tggtgctaca agctagtacc agttgagcca catgcagggc ctattgcacc aggccaaatg 1080 agagaaccaa ggggaagtga catagcagga actactagta cccttcagga acaaatagga 1140 tggatgacaa ataatccacc tatcccagta ggagaaatct ataaaagatg gataatcctg 1200 ggattaaata aaatagtaag aatgtatagc cctaccagct ttctggacat aagacaagga 1260 ccaaaggaac cctttagaga ttatgtagac cggttctata aaactctaag agccgaataa 1320 tctagaacgg atc 1333

Claims

HIV-1에 대한 광범위한 세포성 면역반응을 유도하기 위해, 세포독성 T 세포(Cytotoxic T Lymphocytes; CTL) 에피토프 풍부 영역(rich regions)을 인코드하는 조각, HIV(Human Immunodeficiency Virus; 인간 면역결핍 바이러스) 유래 T 헬퍼(T helper; Th) 세포 에피토프 및 단일클론성 항체의 타겟인 적어도 하나의 B 세포 에피토프로 구성되며, 상기 CTL 에피토프 풍부 영역은 바이러스 라이프 사이클의 초기 단계에서 발현되는 내부 보전단백질(conserved proteins) 및 조절단백질(regulatory proteins)로부터 선택된 것이고, 여기에서 키메릭 폴리단백질(polyprotein)은 HIV-1((Human Immunodeficiency Virus type 1; 인간 면역결핍 바이러스 유형 1) 단백질 역전사효소(Reverse Transcriptase; RT), P24 및 Nef(negative factor; 반작용인자) 유래 조각, gp120, gp41 및 vpr 유래 Th 에피토프 및 gp120 유래 B 세포 에피토프로 구성되는, 상이한 HIV-1 유전자 유래 조각으로 구성된 서열 번호 1의 핵산 서열임을 특징으로 하는 키메릭 CR3 유전자.
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제1항에 있어서, 역전사효소 유래 조각 203-259, P24 유래 219-307, Nef 유래 45-147, gp120 유래 Th 세포 에피토프 T1 및 T2, gp41 유래 580-594, vpr 유래 566-580 및 Mab 2C4에 의해 인식되는 V3 영역 MN 균주(strain) 유래 B 세포 에피토프로 구성되는 키메릭 폴리단백질을 인코드하는 키메릭 CR3 유전자.
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제4항에 있어서, DNA 서열이 CR3 유전자의 서열에 상응하는, 키메릭 CR3 유전자.
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포유류 세포 프로모터의 조절하에 있는 제1항에 따른 키메릭 CR3 유전자로 구성되는 플라스미드 벡터.
AIDS 환자 또는 미감염 인간에게 있어 HIV의 상이한 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 제22항에 따른 재조합 플라스미드 벡터 및 약학적으로 수용가능한 매체로 구성되는 백신 제제.
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AIDS 환자 또는 미감염 인간에게 있어 HIV의 상이한 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 제 제23항에 따른 백신 제제 및 면역강화 물질로 구성됨을 특징으로 하는 HIV의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제25항에 있어서, 면역강화 물질이 사이토킨인 약학적 조성물.
제26항에 있어서, 상기 사이토킨이 IL2인 약학적 조성물.
HIV-1에 대한 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하기 위한, 상이한 HIV 단백질 유래 조각을 포함하는, 서열 번호 1의 핵산 서열에 의해 코드되는 키메릭 단백질.
HIV-1에 대한 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하기 위한, CR3 단백질의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는, 서열 번호 1의 핵산 서열에 의해 코드되는 키메릭 단백질.
HIV-1에 대한 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하기 위한, CR3 단백질의 서열에 필수적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는, 서열 번호 1의 핵산 서열에 의해 코드되는 키메릭 단백질.