KR100913406B1

KR100913406B1 - Ｔｈ１－매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100913406B1
Application number: KR1020080027563A
Authority: KR
Inventors: 임신혁; 권호근
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2009-08-21
Anticipated expiration: 2028-03-25

Abstract

본 발명은 프로바이오틱스(probiotics) 균주를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 CD4⁺Foxp3⁺ Tregs의 형성을 유도하고, 천연(naturally occurring) Tregs(CD4⁺CD25⁺)의 억제자 활성을 증가시켜 T 세포의 저반응성(hypo-responsiveness)을 유도하여 Th1 면역 반응을 감소시킴으로써, 염증 질환과 같은 Th1 세포-매개 질환을 치료한다. 본 발명의 조성물은 Th1 면역 반응을 감소시키는 데 있어서, T 세포의 아폽토시스를 유도하지 않기 때문에, 인체에 대한 안전성이 우수하다. 본 발명의 조성물은 인체에 무해한 미생물 균주를 이용하기 때문에, 안전한 의약 또는 식품을 제공할 수 있다.

Th1, 면역질환, 프로바이오틱스, 염증, T 세포, Foxp3, 면역조절 T-세포

Description

Ｔｈ１－매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Ｔｈ１－Mediated Immune Diseases}

본 발명은 프로바이오틱스(probiotics)를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

위장관 미생물이 숙주 생리학적 측면에 미치는 이로움은 다수가 있으며, 예컨대, 대사 활성, 증가 효과(trophic effects) 및 위장관에서 병원균 과성장의 억제를 포함한다(Guarner, 2003; Rautava, 2005). 여러 종의 미생물이 위장관에서 다양한 현상을 유발하며 이는 점막 면역시스템에 해롭거나 또는 이로운 효과를 나타낸다. 프로바이오틱스는 숙주의 생리학적 측면 또는 건강에 이로운 효과를 갖는 비병원성 미생물로 정의될 수 있다(Marteau, 2006). Lactobacilli 및 Bifidobacteria 그룹은 항염증 특성을 갖는 가장 대표적인 미생물이다(Braat, 2004). 예를 들어, 프로바이오틱 미생물 균주는 대장염(Marteau, 2000; Hoentjen, 2003), 염증성 장질환(Foligne, 2005; Kennedy, 2001) 및 국소적 알러 지(Viljanen, 2005)에 대하여 보호 효능을 나타낸다. 염증성 장질환(IBD)에 대한 다양한 녹아웃 형질전환 및 적응성 트랜스퍼 동물 모델이 개발되고 이를 대상으로 하여 프로바이오틱스의 치료학적 가능성이 확인되었다. 예를 들어, 락토바실러스 및 비피도박테리움 종들은 염증을 감소시키는 데 효과적이라는 실험 결과가 있었다(McCarthy, 2003). IL-10 및 IL-4의 증가된 발현이 Lactobacillus casei를 섭식한 마우스에서 관찰되었다. 반대로, 프로바이오틱 균주 중 일부 균주는 Th1 타입 사이토카인(IL-2 및 IL-12)의 발현을 크게 유도하였고, 특히 Lactobacillus acidophilus가 이러한 작용을 하였다. 그러나 어떠한 프로마비오틱 균주 단독 또는 조합이 이용되어야 하고, 특정 질환 조건에 바람직한 균주의 특정 종류는 무엇인 지에 대한 문제는 아직까지 해결되어 있지 않다(Shanahan, 2003). 특정 질환의 치료에 이용되는 프로바이오틱 균주의 조합은 잘 선별되어야 한다.

프로바이틱스의 치료학적 효능에 대한 많은 연구가 있었지만, 면역계의 조절에 대한 이들의 기전은 아직 까지 잘 규명되어 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 염증성 질환과 같은 Th1 면역 반응에 의해 유발되는 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있는 프로바이오틱스를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 특정의 비피도박테리움 및/또는 락토바실러스, 특히 프로바이틱스의 혼합물이 면역조절/억제 T-세포인 CD4⁺Foxp3⁺ Tregs의 형성을 유도하고, 천연(naturally occurring) Tregs(CD4⁺CD25⁺)의 억제자 활성을 증가시켜 T 세포의 저반응성(hypo-responsiveness)을 유도하여 Th1 면역 반응을 감소시킴을 규명하고, 염증 동물모델에서도 우수한 치료 효능을 발휘함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium) 또는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 염증성 질환과 같은 Th1 면역 반응에 의해 유발되는 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있는 프로바이오틱스를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 특정의 비피도박테리움 및/또는 락토바실러스, 특히 프로바이틱스의 혼합물이 CD4⁺Foxp3⁺ Tregs의 형성을 유도하고, 천연(naturally occurring) Tregs(CD4⁺CD25⁺)의 억제자 활성을 증가시켜 T 세포의 저반응성(hypo-responsiveness)을 유도하여 Th1 면역 반응을 감소시킴을 규명하고, 염증 동물모델에서도 우수한 치료 효능을 발휘함을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium) 또는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)를 유효성분으로 포함한다. 상기 두 미생물은 염증성 질환의 치료에 효능이 있는 것으로 아직까지 규명되지 않은 것으로서, 많은 미생물 종으로부터 본 발명자들에 의해 선택된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 미생물을 추가적으로 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 비피듐, 락토바실러 스 류테리, 락토바실러스 액시도필러스, 스트렙토코커스 써모필러스 및 락토바실러스 카제이로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 4종의 미생물을 포함한다.

본 발명의 조성물이 총 3종의 미생물을 유효성분으로 하는 경우에는, 본 발명의 조성물은 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 액시도필러스 및 락토바실러스 카제이를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물이 총 4종의 미생물을 유효성분으로 하는 경우에는, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 비피듐, 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 액시도필러스 및 락토바실러스 카제이를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 비피듐, 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 액시도필러스, 스트렙토코커스 써모필러스 및 락토바실러스 카제이 등 총 5종의 미생물을 포함한다.

본 발명의 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 성분들 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-2000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효 성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 염증성 질환과 같은 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.

본 발명의 조성물은 다양한 Th1-매개 면역 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “Th1-매개 면역 질환”은 Th1 세포의 생성 및/또는 활성에 의해 생성되는 사이토카인, 예컨대, IL-1β, IL-2, IL-12, IL-17, IFN-γ 또는 TNF-α 등이 관여하는 질환을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “Th1 세포”는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예를 들어, Th1 세포는 IL-2 및 IFN-γ를 합성하지만 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13는 합성하지 않는 사이토카인 발현 패턴을 나타낸다. Th1 세포는 다양한 세포내 병원균에 대한 세포-매개 면역반응, 기관-특이적 자가면역 질환 및 지연성 과민반응에 관여한다.

본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-매개 면역 질환은 특별하게 제한되지 않으 며, 바람직하게는 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환에 적용된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-매개 면역 질환은 자가면역질환 또는 염증 질환이고, 보다 더 바람직하게는 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병 및 류마티스 관절염이다.

본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-매개 면역 질환은 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 공다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 천식, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병, 다발경화증, 자폐스펙트럼 장애, 주의력결핍 장애 및 주의력 결핍 과잉행동장애를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 CD4⁺Foxp3⁺ Tregs의 형성을 유도하고, 천연(naturally occurring) Tregs(CD4⁺CD25⁺)의 억제자 활성을 증가시켜 T 세포의 저반응성(hypo-responsiveness)을 유도하여 Th1 면역 반응을 감소시킴으로써, Th1 세포-매개 질환을 치료하는 데 유효하다. 또한, 본 발명의 조성물은 Th1 면역 반응을 감소시키는 데 있어서 T 세포의 아폽토시스를 유도하지 않으며, 인체에 무해한 미생물 균주 를 이용하기 때문에, 안전한 의약 또는 식품을 제공할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 조성물은 미생물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스로서, Th-1 매개 면역질환을 치료하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 CD4⁺Foxp3⁺ Tregs의 형성을 유도하고, 천연(naturally occurring) Tregs(CD4⁺CD25⁺)의 억제자 활성을 증가시켜 T 세포의 저반응성(hypo-responsiveness)을 유도하여 Th1 면역 반응을 감소시킴으로써, Th1 세포-매개 질환을 치료한다.

(ⅲ) 본 발명의 조성물은 Th1 면역 반응을 감소시키는 데 있어서, T 세포의 아폽토시스를 유도하지 않기 때문에, 인체에 대한 안전성이 우수하다.

(ⅳ) 본 발명의 조성물은 인체에 무해한 미생물 균주를 이용하기 때문에, 안전한 의약 또는 식품을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통 상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

마우스 및 뮤라인 IBD / AD 질환 모델

Balb/c J 마우스 (6-8 주령)를 SLC 회사 (일본)로부터 구입하였고, 광주과학기술원(GIST)의 동물 사육실에서 무균 조건하에서 유지하였다. 모든 동물 실험은 GIST 동물 사육회에서 승인 받은 것이다.

대장염을 유도하기 위하여, 1mg TNBS in 50% 에탄올을 마취시킨 마우스에 주입하였고, 이 경우 직장에 삽입된 카테터를 이용하였으며; 100 ㎕ TNBS-에탄올 혼합물을 결장에 조심스럽게 주입하였다. 대장염 유발 1일 후, 마우스 그룹에 동일 부피의 대조군 PBS 또는 프로바이오틱스 혼합물을 6-7일 동안 섭식시켰다. 프로바이오틱스 조합의 효과를 분석하기 위하여, 대장염 유도 후 마우스를 7개의 그룹으로 나누고, PBS, 5종 균주 각각 및 5종 균주 혼합물을 6일 동안 투여하였다. 대장염의 증후는 사망률, 체중 감소 및 현미경 관찰 등으로 평가하였다.

아토피 피부염을 유발하기 위하여, 마우스를 3개의 군으로 나누고 귀 표면을 외과용 테이프(Nichiban, Tokyo, Japan)로 3회 스트리핑 하였다. 30분 후, 아세톤/올리브유 용액(아세톤:올리브유 = 1:3)에 용해된 20 ml 1% DNCB (Sigma)을 각각의 귀 표면에 페인팅 하였다. DNCB 페인팅 4일 후, 10 mg/ml 진드기 추출물(연세대학교, 서울, 대한민국) 20 ml로 재-페이틴 하였다. 이들 DNCB 및 진드기 항원 페인팅은 1주일에 1회 실시하였다. 테이프 스트리핑 및 DNCB/진드기 추출물 페인팅은 4주까지 계속 실시하였다. 유도 과정 2주 후, 아토피 피부염의 유발 여부를 확인하기 위하여, 눈 브리딩을 실시하여 IgE 레벨을 체크 하였다. 아토피 피부염 유도가 확인된 후, 프로바이오틱스 및 PBS를 각각의 실험군(Pro 및 Cont 군)에 매일 구강 투여 하여, 4주 유도 과정까지 하였다. 테이프 스트리핑 하기 직전에 귀 두께 및 임상점수를 측정하였고, DNCB 및 진드기를 적용하고 24시간 이후에 귀 두께 및 임상점수를 측정하였다. AD 비유도군에서는 단지 테이프 스트리핑 및 PBS 페인팅만을 실시하였다.

프로바이오틱 균주

실험에서 사용되는 프로바이오틱 혼합물은, 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium, 1 X 10⁹ CFUs), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus, 1 X 10⁹ CFUs), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus, 1 X 10⁹ CFUs), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus leuteri, 1 X 10⁹ CFUs) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, 1 X 10⁹ CFUs)을 포함하는 생 박테리아 5 X 10⁹ cfu/100 ㎕이다. 아토피 모델에서, 각각의 단독 균주의 효과를 확인하기 위하여, 각각의 균주 5 X 10⁹ cfu/100 ㎕를 마우스에 투여하였다.

조직학적 관찰

IBD 케이스에서, 마우스로부터 전체 장을 분리시키고 종래 방법(Ameho et al. 1997)에 따라 평가하였다. 조직학적 스코어링을 하기 위하여, 전체 장을 4% 파라포름알데하이드 in PBS에 고정화 하고, 파라핀에 임베딩 하였다. 파라핀 섹션을 H&E로 염색하고 종전의 방법(Marceau et al. 2004)에 따라 스코어링 하였다.

아토피 피부염 케이스의 경우, 종전의 방법(Matsuoka et al. 2003)에 각각의 마우스에 대한 임상조건 및 증상을 평가하였다. 쥐를 희생시킨 후, 귀를 절단하고, 4% 파라포름알데하이드(Sigma)에 16시간 고정한 후, 파라핀으로 임베딩 하였다. 조직을 3-10 mm로 준비하고, H&E로 염색하였다. 진피에서 H&E에 의해 염색된 총 침윤세포의 개수를 공지된 방법(Matsuoka et al. 2003)에 따라 측정하였다. 조직학적 시료에 기초하여, 총 침윤세포를 결정하였다. 40X 대물렌즈 및 레티클이 있는 10X 대안렌즈(0.22 mm by 0.22 mm 이미지를 얻을 수 있음)로 각각의 군으로부터 3-5 섹션을 카운팅 하였다. 데이터를 제곱 밀리리터에 대한 세포의 개수로 표현하였다. 계산된 세포수는 5번의 독립적인 카운팅의 평균이다.

RNA 분리, cDNA 합성, 정량적 실시간 PCR 및 표준 PCR

각각의 실험군으로부터 비장 및 장막간림프절을 얻고, 이로부터 TRIzol 시약(Molecular Research Center)을 이용하여 총 RNA를 얻었다. 역전사는 역전사효 소(Promega) 및 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 실시하였다. 합성된 cDNA를 실시간 PCR로 증폭하였고, 이 경우 다음의 프라이머를 이용하였다: murine L-32(전방향 5'-GCC CAA GAT CGT CAA AAA GA-3' 및 역방향 5'-ATT GTG GAC CAG GAA CTT GC-3'), IL-2 (전방향 5'-CCT GAG CAG GAT GGA GAA TTA CA -3' 및 역방향 5'-TCC AGA ACA TGC CGC AGA G-3'). IL-4 (전방향 5'-ACA GGA GAA GGG ACG CCA T-3' 및 역방향 5'-GAA GCC CTA CAG ACG AGC TCA-3'), IL-5 (전방향 5'-AGC ACA GTG GTG AAA GAG AC-3' 및 역방향 5'-TCC AAT GCA TAG CTG GTG ATT T3'), IL-10(전방향 5'-ATA ACT GCA CCC ACT TCC CA-3' 및 역방향 5'-TCA TTT CCG ATA AGG CTT GG-3'), IL-12 p40 (전방향 5'-GGA AGC ACG GCA GCA GAA TA-3' 및 역방향 5'- AAC TTG AGG GAG AAG TAG GAA TGG-3'), IL-13 (전방향 5'-GCA ACA TCA CAC AGG ACC AGA-3' 및 역방향 5'-GTC AGG GAA TCC AGG GCT AC-3'), IL-17(전방향 5'-TTC ATC TGT GTC TCT GAT GCT-3' 및 역방향 5'-TTG ACC TTC ACA TTC TGG AG-3') IFN-g (전방향 5'-TCA AGT GGC ATA GAT GTG GAA GAA-3' 및 역방향 5'-TGG CTC TGC AGG ATT TTC ATG-3'), TNF-α (전방향 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3' 및 역방향 5'-TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC-3'), TGF-β (전방향 5'-GAA GGC AGA GTT CAG GGT CTT-3' 및 역방향 5'-GGT TCC TGT CTT TGT GGT GAA-3') 및 Foxp3 (전방향 5'-CCC ATC CCC AGG AGT CTT G-3' 및 역방향 5'-CCA TGA CTA GGG GCA CTG TA-3').

B220 ⁺ B 세포 및 CD4 ⁺ T 세포의 분리

T 세포를 각각의 실험군의 비장 및 장막간림프절로부터 분리하였다. CD4⁺ T 세포 분리 비드 (Miltenyi Biotech Cat No.130-049-201) 및 컬럼(Miltenyi Biotech Cat No. 130-042-401), 또는 마우스 CD4 비드(Dynal Cat No.114.45) 및 DETACHaBEAD (Dynal Cat No.124.06)을 이용하여 CD4⁺ T 세포를 분리하였다. CD4⁺CD25⁺ 및 CD4⁺CD25^- T 세포를 분리하기 위하여, CD4⁺ T 세포를 바이오틴-컨쥬게이트 래트 항-마우스 CD25 (BD Pharmigen; Cat No. 553069)로 표지하고, 표지 완충액(PBS pH 7.2, 2 mM EDTA)에서 스트렙타비딘 마이크로비드(Miltenyi Biotech; Cat No. 130-048-101)와 반응시켰다. 또한, CD4⁺CD25⁺ 조절 T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotech; Cat No. 130-091-041)를 이용하였다. B220⁺ B 세포를 분리하기 위하여, B220⁺ B 세포 분리 비드(Miltenyi Biotech: Cat No. 139-049-501)를 이용하였다.

세포 배양 및 자극

모든 분리된 B 및 T 세포를 10% 우태아혈청(Hyclone), 3 mM L-글루타민(Sigma), 10 mM HEPEs (Sigma), 100 U/ml 페니실린 (Sigma) 및 100 U/ml 스트렙토마이신 (Sigma) 및 0.05 mM 2-β-머캅토에탄올 (Sigma)이 보충된 DMEM (Invitrogen)을 포함하는 T 세포 배지에서 배양하였다. 사이토카인 프로파일 분 석을 위하여, 세포에 PMA (20 nM) 및 이오노마이신 (2 μM)을 4시간 동안 처리하였다. 증식 분석을 위하여, 분리된 T 세포를 항-CD3 (1 ㎍) 또는 항-CD3와 항-CD28 (1 ㎍)으로 72시간 동안 자극하였다.

인 비트로 T 세포 및 B 세포 증식 분석

CD4⁺ T 세포를 T 세포 배지 100 ㎕에 재현탁하고, 1 ㎍/ml 항-CD3(BD Pharmigen; Cat No.553058)와 1 ㎍/ml 용해성 항-CD28(BD Pharmigen; Cat No.553294)로 자극하였다. B 세포의 경우, 자극을 주기 위하여 10 ㎍/ml LPS (Sigma)을 포함하는 T 세포 배지 100 ㎕에 재현탁 하였다. 10% 열-비활성화 FBS (Hyclone)를 포함하는 T 세포 배지에서 세포를 96-웰 플레이트에 56-72시간 동안 배양하였다. 이어, 0.5 μCi [H³]-티미딘(NEN)을 각각의 웰에 첨가하고 추가적으로 16시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 수집하고 액상섬광카운팅으로 [H³]-티미딘 업테이크를 측정하였다.

억제자 T-세포에 의한 이펙터 T-세포 활성 억제 시험

PBS 또는 프로바이오틱스 투여 마우스로부터 MLN CD4⁺CD25⁺ T 세포(억제자 세포)를 분리하고 1 mg/ml 항-CD3 코팅된 플레이트에 플레이팅 한 다음, 야생형 Balb c/J 마우스로부터 분리된 CD4⁺CD25^- T 세포(이펙터 세포)의 다양한 비율과 공동배양 하 였다. 각각의 시료에 대하여 3 세트의 독립적 실험을 실시하였고, 72시간 동안 배양하였다. 56-72시간 배양한 다음, 0.5 μCi [H³]-티미딘(NEN)을 각각의 웰에 첨가하고 추가적으로 6시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 수집하고 액상섬광카운팅으로 [H³]-티미딘 업테이크를 측정하였다.

유세포기 분석

아폽토시스 파퓰레이션을 측정하기 위하여, 1 X 10⁶ CD4⁺ T 세포를 1 X Annexin V 결합 완충액 (BD bioscience, Cat No. 556454) 1 ml에 재현탁 하였다. 현탁된 세포(1 X 10⁵ 세포) 100 ㎕를 5 ml 배양튜브에 옮기고 Annexin V-PE 및 7-ADD 5 ㎕을 첨가한 다음 암 조건에서 15분 동안 25℃에서 반응시켰다. 이어, 1 X 결합 완충액 400 ㎕을 각각의 튜브에 첨가한 다음 즉시 FACS로 분석하였다. CD4⁺CD25⁺ T 세포 파퓰레이션을 측정하기 위하여 CD4⁺ T 세포를 항-CD4-FITC (BD Bioscience Cat No.553047) 및 항-CD25-PE (BD Bioscience Cat No. 553866)로 염색하였다. Foxp3 검출을 위하여, 세포를 Foxp3 고정/투과화 완충액(eBioscience Cat No; 00-5523-00)으로 투과화 하고, anti-Foxp3-PE (eBioscience; Cat No; 12-5773)로 염색하였다. 모든 FACS 실험에서, 정제된 래트 IgG2b 이소타입(eBioscience; Cat No; 14-4031-81)을 대조군으로 이용하였고, IgG2b 포지티브 파퓰레이션은 0.2% 이하였다.

고유판 ( lamina propria : LP ) 및 귀 CD4 ⁺ T 세포의 분리

마우스의 귀 및 장을 절단하고, RPMI 배지를 포함하는 디쉬에 바로 옮겼다. 귀 및 장을 1-2 cm 절편으로 절단하고, PRMI 배지로 세척한 다음, 5% FBS 및 1.0 mM EDTA을 포함하는 PBS 25 ml을 포함하는 플라스크에서 실온에서 20분 동안 부드럽게 교반해 주었다. 절편을 파쇄한 다음, 혈청이 없는 RPMI 배지 15 ml을 포함하는 50-ml 원심분리 튜브에 옮겨 주고 15초 동안 2회 격렬하게 교반하였다. 그런 다음, 0.5 mg/ml 콜라게나아제 타입 V (Sigma) 10 ml을 포함하는 5개의 T 플라스크에 조직을 옮기고, 37℃에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후, 세포 현탁액을 PBS로 세척하고, LP 총세포 또는 귀 총세포로 이용하였다. 종래의 CD4⁺ T 세포 분리 방법에 따라 LP CD4⁺ T 세포를 추가적으로 분리하였다.

혈청 내 총 IgE 및 진드기 특이 IgE 의 측정

AD 유도 2주-4주 후, 혈액을 꼬리 정맥 또는 심장으로부터 얻었다. 총 혈청 IgE 레벨은 ELISA 키트(BD Biosciences)로 얻었다. 간단하게, IgE를 측정하기 위하여 혈청을 200배 희석하였고, 일차항체로 이용하기 위하여 0.1 M 소듐 카보네이트(pH 9.5)로 혈청을 250배 희석하였다. 검출 항체는 희석제(PBS containing 10% of FBS)에 초기에 500배 희석 하였고, 스트렙타비딘-컨쥬게이트 HRP(horseradish peroxidase)를 검출항체로 250:1의 비율로 검출항체 희석제에 첨가하였다. 진드 기 특이 IgE의 검출을 위하여, 10 ㎍/ml 진드기 추출물 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 코딩하고, 4℃에서 하룻밤 동안 보고???하였다. 항원 용액을 버린 다음, 각각의 웰을 블록킹 용액으로 실온에서 1시간 동안 블록킹 하였고, 10배 희석된 시료 100 ml을 첨가하였으며, 나머지 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 각각의 항원 및 혈청에 대하여 3개의 웰을 준비하였다. 농도 및 OD 값은 각각의 웰 및 혈청의 평균이다. 항원 웰의 흡광도 값을 비항원 웰의 흡광도 값을 차감한 것을 항원의 OD 값으로 이용하였다.

혈청 내 총 IgG 및 진드기 특이 IgG 의 측정

혈청 IgG 레벨을 측정하기 위하여, 혈청을 마우스 IgG ELISA 정량 키트(BETHYL)로 분석하였다. 간단하게, 수득한 혈청을 2000배 희석하고 캡처링 항체로 이용하기 위하여 0.05 M 카보네이트-바이카보네이트(pH 9.5)로 100배 희석하였다. HRP-컨쥬게이트 검출항체를 희석제(50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, 1% BSA at pH 8.0)로 20000배 희석하였다. 진드기 특이 IgG의 평가를 위한 방법은 특이 IgE의 검출 방법과 유사하며, 혈청은 200배 희석하였다. 3개의 웰을 각각의 항원 및 혈청에 대하여 준비하였다. 농도 및 OD 값은 각각의 웰 및 혈청의 평균이다. 항원 웰의 흡광도 값을 비항원 웰의 흡광도 값을 차감한 것을 항원의 OD 값으로 이용하였다.

조직 내 Foxp3 의 검출을 위한 면역조직화학염색

마우스 결장 및 귀의 파라핀 절편(3 mm)를 면역조직화학염색에 이용하였다. 면역조직화학염색은 항-래트 Foxp3 (eBioscience; Cat No: 14-5773) 및 항-토끼 Foxp3 (Santa Cruz; Cat No: sc-28705)를 이용하여 실시하였다. 카운터염색을 위하여, 프로피듐 요오다이드(Molecular Probes; Cat No: P21493) 및 Hoeschst34580 (Molecular Probes; Cat No: H21486)를 이용하였다. 염색 후, Fluoview 현미경(Olympus)으로 조직 절편에 대한 이미지을 얻었다.

적응성 트랜스퍼 실험

PBS 또는 프로바이오틱스의 구강투여 30일 이후에, 마우스를 희생시키고 MLN CD4⁺ T 세포를 각각의 그룹으로부터 분리하였다. 세포를 트랜스퍼링 하기 전에, 5 x 10⁶ CD4⁺ T 세포를 5 mM CFSE로 37℃에서 15분 동안 레이블링 하고, 복강주입 방식으로 AD 유도 마우스에 트랜스퍼 하였다. 트랜스퍼링을 동일한 과정에 따라 5회 실시하였다. 마지막 적응성 프랜스퍼링 과정 24시간 후에, 마우스를 희생시키고 귀를 제거하여 면역조직화학염색 방법에 따라 조절성 T 세포의 이동을 분석하였다.

임상 점수의 평가

AD의 경우, 각각의 마우스의 임상 조건 및 증상은 공지된 방법(Matsuoka et al. 2003a)을 조금 변형하여 평가하였다. 간단하게, 0점(보이지 않음), 1점(마일 드), 2점(보통) 및 3점(심각) 스코어링을 3명의 독립적 관찰자에 의해 실시하여, 귀 표면 상의 드라이에스(dryess), 미란/찰상(excoriation/erosion), 부종 및 홍반을 스코어링 하였다. 각각의 군에 대한 평균 값을 취하였다.

류마티스 관절염( RA ) 치료 효능 실험

1. 콜라겐 유도 관절염 동물 모델의 제조

콜라겐 유도 관절염(collagen induced arthritis, CIA) 동물 모델은 류마티스 관절염의 원인으로 여겨지는 콜라겐을 주입하여 하기와 같이 제조하였다. 닭의 Ⅱ 형 콜라겐(Sigma) 4 mg을 100 mM 아세트산 1 ml에 혼합하여 4℃에서 하루 동안 용해시켰다. 이를 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 4 mg/ml이 들어있는 프로인트 완전 아쥬번트(Freund's complete adjuvant, DIFCO) 1 ml에 혼합하여 에멀젼화한 후, 6 내지 8주령의 Lewis 래트의 꼬리 부위에 150 ㎕(300 ㎍)을 피내 주사하여 면역시켰다. 1차 면역 후 7일째에 닭의 II형 콜라겐 4 mg을 100 mM 아세트산 1 ml에 혼합하여 4℃에서 하루 동안 용해한 후 이를 프로인트 불완전 아쥬번트(Freund's incomplete adjuvant, DIFCO) 1 ml에 혼합하여 에멀젼화시켰다. 상기 에멀젼의 150 ㎕(300 ㎍)를 꼬리 부위에 피내 주사하여 2차 면역(boosting) 반응을 유도하였고, 2차 면역 후 1-2주가 경과하자 관절염 증상인 홍반이나 부풀어 오름이 점차적으로 나타나기 시작하였다.

2. 관절염 동물 모델에서의 치료 효능 분석

관절염 유도된 래트를 3개의 그룹으로 나누고, 대조군에서는 PBS, MTX군에는 종래에 RA 치료제로 사용되고 있는 메토트렉세이트, 그리고 Probiotics 군에는 본 발명의 5종의 균주 혼합물을 일주일에 3회씩 구강 투여 한 뒤 나타나는 변화를 관찰하였다. 관절염 임상점수는 다음 표 1과 같이 계산을 하였다.

점수체계

점수	병의 경과 상태
0	홍반과 부풀어 오름이 나타나지 않음
1	발 중간부분 또는 발목관절에 한해 홍반과 약간의 부풀어 오름이 나타남
2	발목관절로부터 발 중간부분에 걸쳐 홍반과 약간의 부풀어 오름이 나타남
3	발목관절에서 중족골관절에 걸쳐 홍반과 중간정도의 부풀어 오름이 나타남
4	발목, 발 및 발가락을 포함하여 홍반과 심한 부풀어 오름이 나타남

또한, H&E 염색 관찰 및 정량적 실시간 PCR은 상술한 실험 방법에 따라 실시하였다.

통계 분석

통계 분석을 위하여, 투-테일드 스튜던트 t-테스트를 실시하였고, P <0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다(^*<0.05, ^**<0.005, ^***<0.001).

실험 결과

프로바이오틱스의 구강 투여는 장막간림프절에서 CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ 조절 T 세포 파퓰레이션을 증가시킨다

본 발명자들은 항-염증 효능이 있는 것으로 알려져 있거나 또는 알려져 있지 않은 5종의 프로바이오틱 균주를 선별하였다: 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium, BB), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus, LA), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus, ST), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri, LR) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, LC). 프로바이오틱스의 항-염증 기능에 대한 기전을 규명하기 위하여, 본 발명자들은 T 세포 및 프로바이오틱스 사이의 관련성을 분석하였다. PBS 또는 프로바이오틱스 투여 30일 후, 장막간림프절(MLN) CD4⁺ T 세포를 분리하고 유세포분석기(FACS)로 Foxp3⁺ 파퓰레이션을 조사하였다(도 1a-1b). PBS (8.5%) 처리된 마우스 (Cont)와 비교하여, Foxp3⁺ 파퓰레이션이 LA (11.54%), LC (10.4%), LR (11.36%) 및 BB (10.82%) 군에서 증가하였고, ST 군(7.48%)에서는 조금 감소하였다.

이어, 본 발명자들은 여러 균주로 이루어진 프로바이오틱 혼합물의 투여가 Foxp3⁺ 파퓰레이션의 상승적(synergic) 증가를 유도할 수 있는 지 여부를 조사하였다: 3 균주, LA/LC/LR; 4 균주, LA/LC/LR/BB 및 5 균주, LA/LC/LR/BB/ST. 3개의 상이한 프로바이오틱 혼합물의 30일 투여 후, MLN CD4⁺Foxp3⁺ 파퓰레이션을 각각의 군에서 분석하였다(도 1c). 3종의 균주로 이루어진 프로바이오틱 혼합물의 경우, Foxp3⁺ 파퓰레이션이 상당히 증가하였으며, 4종 또는 5종의 균주로 이루어진 프로바이오틱 혼합물의 경우에도 Foxp3⁺ 파퓰레이션이 상당히 증가하였다(4종 균주 14.57% 및 5종 균주 15.97%).

상기 실험 결과는, 프로바이오틱스의 투여는 MLN에서 Foxp3⁺ 조절 T 세포 파퓰레이션을 증가시키며, 이러한 증가는 균주의 종류에 특이적이고, 적합한 균주의 조합은 프로바이오틱에 의한 면역조절능을 상승적으로 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다.

프로바이오틱의 투여는 CD4 ⁺ T 세포 및 B220 ⁺ B 세포 저반응성(hyporesponsiveness)을 유도한다

상기한 Foxp3⁺ 조절 T 세포 파퓰레이션에 대한 실험 결과에 기초하여 가장 우수한 효능을 발휘한 5종 프로바이오틱 혼합물(Pro)을 이용하여, 이의 항-염증 효능 및 기전을 분석하였다. 비장(SP) 및 장막간림프절(MLN)에서 사이토카인 발현 및 증식속도를 측정하여 이펙터 T 세포의 기능을 조사하였다(도 2a-2b). 프로바이오틱스 혼합물(Pro) 또는 대조군으로서의 PBS(Cont)를 30일 동안 정상 Balb/c 마우스에 투여한 후, 비장(SP) 및 장막간림프절(MLN)의 CD4⁺ T 세포를 분리하고, PMA/이오노마이신(P+I)으로 자극하였다.

Th1-타입 이펙터 사이토카인(IL-2, IFN-γ, TNF-α) 및 Th2 타입 사이토카인(IL-4, IL-10)의 전사체 레벨을 실시간 PCR (RT-PCR)로 측정하였다. 놀랍게도, 프로바이오틱스는 모든 사이토카인의 레벨을 감소시켰다((p<0.005, 도 2a). 이 실험 결과는 본 발명의 프로바이오틱스가 CD4⁺ T 세포 저반응성을 유도할 수 있음을 나타내는 것이기 때문에, 본 발명자들은 프로바이오틱스가 T 세포 증식을 억제하는 지 여부를 조사하였다. 프로바이오틱-투여 및 PBS-투여 마우스로부터 분리한 CD4⁺ T 세포를 항-CD3/CD28로 자극하거나 또는 자극하지 않은 다음, 비자극 CD4⁺ T 세포에서의 [H³]-티미딘 결합(cpm)의 레벨과 비교함으로써 자극 지수를 계산 하였다. 도 2b에서 볼 수 있듯이, 프로바이오틱스군(Pro)은 SP 및 MLN 모두에서 대조군(Cont) 보다 덜 분할되었다.

이어, 본 발명자들은 비장(SP) 및 장막간림프절(MLN)에서 사이토카인 발현 및 증식속도를 측정하여 이펙터 B 세포의 기능을 조사하였다(도 2c-2d). 간단하게, 정상 Balb/c 마우스에 PBS 또는 프로바이오틱스를 30일 동안 투여한 다음, B220⁺B 세포를 SP 또는 MLN로부터 분리하고, P+I로 자극하여 사이토카인을 발현시키고 증식속도를 자극하기 위하여 LPS로 자극하였다. 프로바이오틱스 투여는, PBS-투여 군과 비교하여 비장(SP) 및 장막간림프절(MLN)의 B220⁺ B 세포에서 모든 사이토카인(Th1 및 Th2 사이토카인)을 크게 감소시켰다. 또한, 프로바이오틱스는 외래의 LPS 자극에 대한 B 세포 증식을 억제하였으며, 이는 SP(자극 지수: 14.4 vs 62.45) 및 MLN (자극 지수: 29.92 vs 62.98) 둘 모두에서 관찰되었다.

상기 실험 결과에 따르면, 본 발명의 프로바이오틱스는 점막 및 전신성 부위에서 CD4⁺ T 세포 및 B220⁺ B 세포 저반응성을 유도한다는 것을 알 수 있다.

프로바이오틱스는 CD4 ⁺ CD25 ^- T 세포로부터 Foxp3 ⁺ CD4 ⁺ T 세포의 형성을 유도한다

말초 T 세포 관용성의 기전은 T 세포 아폽토시스를 포함한다(Wells et al. 1999). 프로바이오틱스에 의해 유도된 저반응성이 T/B 세포 아폽토시스와 관련이 있는 지 여부를 Annexxin V 및 7-ADD를 이용하여 분석하였다(도 3). Pro 및 Cont 그룹의 MLN 및 SP로부터 얻은 세포의 CD4⁺ T 세포 및 B220⁺ B 세포를, Annexxin V 및 7-ADD로 염색하고 아폽토시스 파퓰레이션(Annexin V⁺/ 7-ADD⁺)을 유세포 분석기로 분석하였다. 아폽토시스는 증가되지 않았고(도 3a 및 3b); Annexin V⁺/ 7-ADD⁺) 이중 양성 MLN T 및 B 세포의 동일한 비율이 Pro 및 Cont 그룹에서 확인되었다. 흥미롭게는, 이는 Pro 그룹에서 이중 양성 세포의 비율이 Cont 그룹보다 낮은 것으로 관찰도었는 바, 이는 프로바이오틱스의 처리는 비장 T 및 B 세포에 대하여 항-아폽토시스 작용을 함을 나타낸다(도 3a 및 3b). 이러한 실험적 발견은, 프로바이오틱스에 의한 T 및 B 세포 저반응성이 아폽토시스에 의해 유도되지 않음을 증명한다. 면역 저반응성은 IL-10 and TGF-β과 같은 면역-조절 사이토카인(Zeller et al. 1999; Li et al. 2006) 또는 Tregs (Sakaguchi et al. 2001)에 의해 중재된다. 그러나, 본 발명자들은 프로바이오틱스가 TGF-β 레벨을 증가시키지 않는다는 것을 발견하였고, IL-10 레벨을 감소시킨다는 것을 확인하였다. Foxp3는 Treg 세포의 표지(Sakaguchi 2005)이며, T 세포, B 세포 및 다른 면역 세포와 같은 이펙터 세포 기능을 직접적으로 억제하기(Grossman et al. 2004; Lim et al. 2005; Sakaguchi 2005) 때문에, 본 발명자들은 조절 T 세포(Tregs)에 의해 중재되는 면역 저반응성에 실험의 초점을 맞추었다. 앞선 실험 결과(도 1)에서, 본 발명자들은 T 및 B 세포 면역-저반응성이 MLN뿐만 아니라 비장에서도 나타냄을 발견하였으며, 이에 프로바이오틱스의 처리 두 조직에서 Foxp3 mRNA 발현 정도를 분석하였다(도 4a). 흥미롭게도, 프로바이오틱스는 mRNA 및 단백질 레벨(p< 0.005)에서 MLN T 세포의 Foxp3 발현을 증가 시켰으나 비장의 CD4⁺ T 세포에는 확연한 효과를 갖지 못하였다(도 4). 본 발명자들은 또한 프로바이오틱스에 의하여 생성된 Tregs (CD4⁺Foxp3⁺)가 CD4⁺CD25⁺ 또는 CD4⁺CD25^-세포로부터 유도 되는지 여부를 실험하였다. CD4⁺CD25⁺는 Foxp3 고발현의 자연발생적 Tregs(nTregs)에 대한 마커이기 때문에(Stephens and Mason 2000; Jordan et al. 2001; Bluestone and Abbas 2003), 본 발명자들은 Pro 및 Cont 그룹의 MLN CD4⁺ T 세포에서 CD4⁺CD25⁺ 이중 양성 파퓰레이션을 측정하였으나, 두 그룹의 CD4⁺CD25⁺ Treg 파퓰레이션 사이에서는 확연한 차이를 발견하지 못하였다(Pro: 5.29% vs Cont: 5.59%)(도 5). CD4⁺CD25^- Foxp3⁺ T 세포는 또한 Treg 기능을 갖기 때문에(Bluestone and Abbas 2003), 프로바이오틱스가 CD4⁺CD25^- Foxp3⁺ Treg의 수를 증가시키는지 여부를 실험하였다. 흥미롭게도, 프로바이오틱스는 CD4⁺CD25⁺T 세포에서는 그렇지 않았으나 CD4⁺CD25^- T 세포에서는 Foxp3⁺ 세포의 파퓰레이션을 최대 5배까지 증가시켰다(도 4c). 비록 그룹간 CD4⁺CD25⁺T 세포에서 관찰된 Foxp3 파퓰레이션 간에는 차이가 없었으나, 본 발명자들은 두 파퓰레이션간 Treg 이펙터 기능을 비교하였다. Treg는 cell-to-cell 접촉을 통하여 타겟 T 세포에서 저-반응성(hypo-responsiveness)을 유도하기 때문에, 억제시험을 통하여 Pro 및 Cont 그룹으로부터 CD4⁺CD25⁺Treg의 억제능을 비교하였다. 정상 마우스의 CD4⁺CD25^- 타겟 T 세포를 Pro 또는 Cont 그룹 MLN의 억제자 CD4⁺CD25⁺T 세포와 혼합배양하고 항-CD3로 자극하였다. CD4⁺CD25⁺T 세포에 의한 억제는, Treg:타겟 세포의 비율을 다양하게 하여 T 세포 증식을 평가함으로써 분석하였다. 타겟 세포 단독(CD4⁺CD25^-)의 증식 레벨은 100%로 간주하였따. 도 4d에서 볼 수 있듯이, Pro 그룹의 CD4⁺CD25⁺ Tregs는 Cont 그룹의 Tregs보다 높은 억제 활성을 나타내었다(p*< 0.05). 이러한 실험 결과는, 본 발명의 프로바이오틱스가 CD4+CD25^- 세포의 풀로부터 Foxp3⁺ Tregs의 생성을 자극할 뿐만 아니라 CD4⁺CD25⁺ Tregs의 억제자로서의 기능을 강화시킨다는 것을 보여주는 것이다.

프로바이오틱스는 TNBS -유도 염증성 장질환의 발전을 완화시킨다

정상 마우스에 프로바이오틱스를 투여하면 CD4⁺Foxp3⁺ Treg 파퓰레이션이 증가하고 이펙터 사이토카인 및 증식을 하향조절 되어 CD4⁺ T 세포 저반응성을 유도하기 때문에, 염증성 장 질환(IBD)의 동물 모델에서 본 발명의 프로바이오틱스가 대장염을 치료 또는 경감시킬 수 있는 지 여부를 조사하였다. 또한, 본 발명자들은 프로바이오틱스 혼합물에 포함된 각각 개별적인 균주들의 동일 투여량이 치료학적 효능을 나타내는 지 여부도 조사하였다. TNBS-유도 대장염은 Th1-매개 IBD에 대한 잘 규정된 동물 모델로서 인간 크론씨병과 유사하다(Jurjus et al. 2004). IBD를 유도하기 전에, 5종, 4종 또는 3종 균주 혼합물 및 단일 균주(LA, LC, LR, BB and ST)를 포함하는 다양한 프로바이오틱스의 동일 CFU(colony forming unit), 또는 PBS를 마우스에 매일 20일 동안 투여하였고, 이어 각각의 그룹의 Balb/c 마우스에 TNBS를 직장내 주입하여 대장염을 유도하였다(도 6).

대장염의 발전에 대한 효능을 생존도(도 7b, 8a), 체중(도 7a, 8b), 결장의 전체 모양(도 7c)과 조직관찰(도 7d)로 평가하였다. 흥미롭게도, 3종, 4종 및 5종 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물만이 사망률을 유의성 있게 감소시켰고, 단일 균주는 이러한 효능을 나타내지 않았으며, 예방 효능은 사망률 결과와 일치 하였다(도 7a 및 8b). 또한, 본 발명자들은 5종 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물이 가장 우수한 대장염 예방 효능을 나타냄을 발견하였다. 5종 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물은 결장의 염증을 매우 크게 감소시켰다(도 7c 및 7d). 체중 감소와 사망률은 장의 전체적인 모양 평가(도 7c) 및 결장 조직 단편 평가(도 7d)와 잘 일치되었다.

IBD에 대한 본 발명의 프로바이오틱스 혼합물의 예방 효능을 보다 상세하게 규명하기 위하여, IBD 유도 후, 프로바이오틱스 또는 PBS 처리된 MLN에서 CD4⁺ T 세포 및 B220⁺ B 세포의 친염증성 사이토카인의 발현 수준을 조사하였다. IL-17, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 친염증성 사이토카인의 발현은 프로바이오틱스 처리에 의해 MLN CD4⁺ T 세포에서 크게 감소하였다(도 7e). 또한, B220⁺ B 세포에서 IL-10, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 친염증성 사이토카인의 발현이 프로바이오틱스 처리에 의해 크게 감소하였다(도 7f). 이러한 실험 결과는, 5종의 균주를 포함하는 본 발명의 프로바이오틱스 혼합물이 IBD 동물 모델에서, 친염증성 사이토카인을 크게 감소시킴으로써 가장 우수한 예방 효능을 나타낸다는 것을 입증한다.

프로바이오틱스는 류마티스 관절염( RA )에 대한 치료 효능을 나타낸다

도 15a에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 프로바이오틱스의 구강투여는 기존의 치료제인 MTX 보다 더 우수한 RA 치료효능을 나타낸다. 또한, 관절부위의 조직학적 관찰(H&E staining)에서도(도 15b), 대조군인 CIA 동물 모델에서 많은 수의 림프구가 조직내에 침투(infiltration)된 것을 확인할 수 있다. 림프구들은 헤마토자일린으로 염색되어 청색의 점으로 관찰되고, 주변의 관절 조직들은 에오신으로 염색되어 적색으로 관찰된다. 한편, 본 발명의 조성물을 투여한 군과 MTX 투여군에서는 림프구의 침투 현상을 거의 볼 수 없다. 따라서 본 발명의 조성물은 림프구에 의해 유도되는 면역염증반응을 매우 효율적으로 억제하고 있음을 알 수 있다.

최종적으로, 분자수준에서의 기전 규명을 위해 세 그룹의 관절부위에서 CD4⁺ T 세포를 분리 한 뒤 그것이 발현하는 사이토카인의 양을 정량적 실시간 PCR 을 통해 확인하였다(도 15c). 프로바이오틱스의 구강투여는 MTX보다 조금 더 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, IBD와 AD와 같은 기전으로 조절성 T 세포 마커인 Foxp3 역시 큰폭으로 증가함을 확인할 수 있었다.

프로바이오틱스는 아토피 피부염의 발전을 완화시킨다

전형적인 T 세포 매개 면역질환인 IBD에 대하여, 본 발명의 프로바이오틱스가 매우 우수한 예방 효능을 갖는다는 것이 입증되었기 때문에, 본 발명자들은 추가적으로 본 발명의 프로바이오틱스가 B 세포 매개 면역질환인 아토피 피부염(AD)에 대하여도 치료 효능을 나타내는 지 여부를 조사하였다. 투여하기 2주 전에 집먼지 진드기 추출물 및 DNCB를 이용하여 뮤라인 AD 모델을 구축하였고, 이어 프로바이오틱스 (5종 균주 혼합물; 1 X 10⁹ CFU) 또는 PBS를 AD 마우스 모델에 2주 동안 구강 투여하였으며, 투여 중에도 AD 유도를 계속적으로 실시하였다. 유도 과정 동안, AD 유도 24시간 이후에 한 주에 2번씩 귀 두께 및 임상 점수를 측정하였다(도 9c 및 9d).

AD 구축 동안, 귀 두께는 Pro 및 Cont 그룹에서 거의 동일하였으나, 2주 동안 프로바이오틱스를 투여한 경우에는 상당한 차이가 관찰되었다(도 9c). Pro 그룹은 처리 7일 후부터 귀 두께의 증가정도가 크게 감소 하였고(p<0.02), 4주 동안의 계속적인 프로바이오틱스의 투여에 의해 귀 두께가 조금씩 감소하는 경향을 나타내었다. Cont 그룹은 귀 두께가 계속적으로 증가하였다(도 9c). 귀 두께에 대한 실험 결과에 일치되게, 임상 점수도 Pro 그룹에서 크게 감소하였다(도 9d). 본 발명자들은, 프로바이오틱스 혼합물에 포함되어 있는 각각의 단일 균주, 또는 3종 및 4종 균주 혼합물에 대하여 치료학적 효능을 조사하였다(도 10). IBD 실험 결과와는 다르게, 몇몇의 프로바이오틱 균주(LA, LC 및 LR)는 귀 두께의 증가를 감소키시고 임상점수를 감소시켜 어느 정도 치료효능을 나타내었으며, BB 및 ST는 치료 효능이 미약 하였다(도 10a, 10b). 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물이 가장 우수한 치료 효능을 나타내었다.

프로바이오틱스의 치료 기전을 보다 자세하게 규명하기 위하여, AD를 최종적으로 유도한 후, 마우스를 희생시키고, Cont 및 Pro 그룹으로부터 귀를 제거하고 조직학적 분석을 실시하였다(도 9e). w/o 유도군의 조직과 비교하여, 귀 부종, 조직 파괴는 Cont 그룹에서 쉽게 관찰되었으나, 이러한 현상은 프로바이오틱스 처리군에서는 상당히 감소되었다(도 9e). 침습된 세포수의 경우에도 동일한 양상을 나타내었다(도 9f). w/o 유도 귀와 비교하여, Cont 귀는 10배 정도의 침습된 세포수를 나타내었고(w/o 유도; 238± 37 cells/mm² vs Cont; 2630± 139 cells/mm², p<0.001), 이러한 심각한 침습은 Pro 귀에서 상당히 감소되었다(1423± 115 cells/mm², p<0.005) (도 9f). 또한, 현미경 관찰을 통하여, Cont 귀 섹션에서 크게 증가된 침습 과립구 특히 호산구를 관찰하였고 Pro 귀 섹션에서는 크게 감소된 호산구 수를 관찰하였다.

IgE 과생산이 AD의 특성 중 하나이기 때문에(Gao et al. 2004), 프로바이오틱스 처리가 IgE 레벨을 조절할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 혈액 시료에 있는 총 혈청 IgG 및 IgE 레벨을 분석하기 위하여 양쪽 그룹으로부터 14일째 및 31일째에 혈청을 수집하였다(도 9g). 시간의 경과에 따라 양쪽 그룹에서 총 IgG가 조금 증가하였으나, Pro의 31일째 혈청에서의 IgE 농도(41± 29 ng/ml)는, Cont (149± 51 ng/ml)와 비교하여 거의 3배 정도 감소된 값을 나타내었다.

이어, IgG 및 IgE 농도의 알러젠 특이적 증가 여부를 조사하였으며, 이는 알러지 질환의 치료에 있어서 의약 또는 치료방법의 효능을 판단하기 위하여 알러젠 특이적 IgE 반응의 하향 조절이 중요하기 때문이다(Till et al. 2004; Larche et al. 2006). 알러젠으로서의 진드기 추출물을 플레이트에 코딩한 다음, ELISA를 실시하였다(도 9h). Pro 그룹에서 진드기 특이적 혈청 IgE 농도는 Cont 그룹과 비교하여 최대 2배까지 감소하였다(P<0.05) (도 9h). 또한, 단독 균주, 3종, 4종 및 5종 균주 처리군에서 혈청 IgE 농도를 비교하였다(도 10c). 혈청 IgE 농도는 LA 및 LC 처리군에서 조금 감소하였고 3종, 4종 및 5종 균주 처리군에서는 크게 감소하였다. 가장 큰 폭의 감소는 5종 균주 처리군에서 관찰되었다.

최종적으로, Cont 및 Pro 그룹의 림프절(DLN; 천경림프절, 보조림프절 및 상완림프절) CD4⁺ T 세포를 분리하고, AD에서 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 및 IFN-γ와 같은 병원성 사이토카인의 발현 양상을 분석하였다(도 9i). 프로바이오틱스 투여는 DLN CD4⁺ T 세포에서 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13과 같은 병원성 사이토카인 발현을 상당히 하향-조절 하였다(도 9i). 결론적으로, 상기 실험 데이터는, 5종-프로바이오틱 혼합물은 혈청 총 IgE 농도와 진드기 특이적 IgE 농도를 감소시키고 병원성 사이토카인의 발현을 감소시켜 가장 강력한 치료 효능을 발휘한다는 것을 보여주는 것이다.

프로바이오틱스 투여는 질병 상태에서 MLN Foxp3 ⁺ CD4 ⁺ 조절성 T 세포를 특이적으로 증가시킨다

Foxp3⁺CD4⁺ 조절성 T 세포 파퓰레이션의 증가가 프로바이오틱스 투여된 w/o 질병 마우스의 MLN에서 관찰되었기 때문에, 본 발명자들은 프로바이오틱스의 치료 효능이 염증 질병 상태에서의 Foxp3⁺CD4⁺ 조절성 T 세포 파퓰레이션의 증가와 관련이 있는 지 여부를 조사하였다(도 6). 이를 입증하기 위하여, IBD 상태에서 PBS 또는 프로바이오틱스를 투여한 후, DLN 및 MLN CD4⁺ T 세포를 분리하고 FACS으로 Foxp3⁺ 파퓰레이션을 조사하였다(도 11a). DLN CD4⁺ T 세포의 경우 Cont 및 Pro 그룹 사이에 Foxp3⁺ 파퓰레이션의 차이가 거의 없었으나(Cont; 6.1% vs Pro; 5.9%), MLN CD4⁺ T의 경우에는 상당한 차이가 있었다(Cont; 6.4% vs Pro; 10.2%) (도 11a). 또한, AD 상태에서 MLN CD4⁺ T 세포의 경우 Pro 그룹은 증가된 Foxp3⁺ 파퓰레이션을 나타내었으나, DLN CD4⁺ T 세포에서는 관찰되지 않았다(도 11b).

프로바이오틱스의 투여가 어떤 작용을 통하여 CD4⁺Foxp3⁺ Tregs의 생성을 유발하는 지 여부를 분석하였다. 최근 연구 결과에 따르면, APC 서브세트는 조절성 T 세포의 생성과 관련이 있다(Kuwana 2002; Mellor and Munn 2004; Yamazaki et al. 2006; Mahnke et al. 2007). 따라서, 본 발명자들은 관용성에 대한 APCs의 스큐잉(skewing)이 Tregs의 생성에 관여하는 지 여부를 조사하였다. Pro 및 Cont 질병 마우스의 결장 및 귀에서 APCs(non-CD4⁺/CD8⁺)를 준비하고, 공동-자극 분자 및 인돌 아민 2,3-디옥시게나아제(IDO)의 발현을 측정하였다. IDO를 고발현하는 APCs는 T 세포 활성을 조절하고 T 세포 관용성을 유도한다(Mellor and Munn 2004). B7.1, B7.2, B7DC, 또는 ICOSL의 레벨에서 차이가 거의 없었다. 흥미롭게도, Pro 그룹 APCs에서 엑스 비보 IDO 발현이 증가(p < 0.0003) 하였다(도 12). 결론적으로, 상기 데이터를 통하여, 프로바이오틱스의 투여가 질병 상태에서도 MLN Foxp3⁺ 조절성 T 세포를 생성시키며 IDO-발현 수지상세포가 Tregs에 의해 생성된다는 것을 알 수 있다.

염증 위치에서 상향조절된 CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ T 세포는 염증 질환의 억제를 초래한다

Tregs는 림프절 조직을 통하여 재순환되고 염증위치로 들어갈 수 있기 때문에(Iellem et al. 2001; Szanya et al. 2002; Huehn and Hamann 2005a; Maul et al. 2005), 본 발명자들은 프로바이오틱스의 치료 효능이 염증 위치(결장 및 귀)에서의 CD4⁺Foxp3⁺ Treg 세포의 인리치먼트와 관련이 있는 지 여부를 조사하였다. IBD 시스템에서, 고유판(lamina propria: LP) CD4⁺ T 세포를 결장에서 분리하고 Foxp3 단백질 농도를 FACS로 측정하였다. 건강한 마우스, 대조군(Cont) 마우스 및 프로바이오틱-처리(Pro) 대장염 마우스에서 CD4⁺Foxp3⁺ T 세포를 비교하였다. LP CD4⁺Foxp3⁺ T 세포는 대장염 마우스(14%)에서 건강한 마우스(22%)보다 낮은 레벨을 나타내었다(도 13a). 놀랍게도, Pro 그룹(31%)은 Cont 그룹(14%)과 비교하여 2배 이상의 CD4⁺Foxp3⁺ T 세포 레벨을 나타내었다. 또한, Pro 그룹의 염증 결장에서 Foxp3⁺CD4⁺ 조절성 T 세포의 인리치먼트는 면역조직화학(IHC)에서도 확인되었다(도 13b). IHC 실험에 따르면, IBD 유도는 w/o 유도 조건과 비교하여 대장염 부위에서 Foxp3⁺ 세포수를 조금 감소시켰으나, 프로바이오틱스의 투여는 대장염 부위에서 Foxp3⁺ 세포수를 크게 증가시켰다(도 13b).

IBD 모델의 결과와 일치되게, AD 시스템의 경우에도 w/o 유도, Cont 및 Pro 그룹에서 귀 CD4⁺ T 세포를 분리한 다음, FACs를 통하여 Foxp3⁺ 파퓰레이션을 분석하였으며, 그 결과 보다 큰 차이가 관찰되었다(도 13c 및 13d). IBD와 유사하게, AD 유도는 귀 조직에서 Foxp3⁺CD4⁺ 조절성 T 세포의 소폭 감소를 야기하였다(w/o 유도; 7.4% vs Cont; 4.6%) (도 13c). 흥미롭게도, Pro 그룹의 귀 CD4⁺ T 세포(33%)는 Cont group (4.6%)과 비교하여 8배, w/o 유도 group (7.4%)과 비교하여 5배 증가된 레벨을 나타내었다. 이 실험 결과는 IHC로도 확인되었다(도 13d). 결론적으로, 상기 실험 데이터는 염증 위치(결장 및 귀)에서 Foxp3⁺CD4⁺ 조절성 T 세포의 인리치먼트가 프로바이오틱스에 의한 염증 억제의 주요 기전임을 증명한다.

프로바이오틱스 투여에 의한 조절성 T 세포의 트래픽킹(trafficking)에 대한 화학유도자( chemoattractants )의 증가 및 염증 위치에서 Treg 의 인 비보 이동

다양한 조절성 세포가 염증 위치에 자리를 잡으며 면역-항상성의 불균형을 튜닝한다는 것은 잘 알려져 있다(Brandtzaeg and Johansen 2005; Huehn and Hamann 2005b; Kim 2006). 호밍 및 억제의 개념(Huehn and Hamann 2005b)은 조절성 T 세포의 분야에서 잘 연구되어 있다(Brandtzaeg and Johansen 2005; Huehn and Hamann 2005b; Kim 2006). 또한, 본 발명자들의 앞선 실험들은 정상 및 질병 상태에서 MLN 조절성 T 세포의 인 비보 생성을 명확하게 보여주고 있으며, 염증 결장 및 귀 부위에서 크게 인리치된 Foxp3⁺ 조절성 T 세포를 검출하였다. 이에, 본 발명자들은 인 비보 생성된 조절성 T 세포가 염증 부위로 이동하여 면역항상성을 유지한다는 가설을 정립하였다. 상기 가설을 입증하기 위하여, AD 모델을 이용하여 염증 위치에서 케모카인 발현의 변화를 조사하였는 바, 이는 AD 모델이 IBD 모델과 비교하여 프로바이오틱스의 처리에 의해 염증 위치에서 조절성 T 세포의 증가가 뚜렷하였기 때문이다.

정상, Cont 및 Pro 그룹에서 귀 총 세포를 분리한 다음, 조절성 T 세포의 트래피킹에 대한 화학유도자로 알려진 케모카인(Jonuleit et al. 2000; Mantovani et al. 2000; Bystry et al. 2001; Lanzavecchia and Sallusto 2001; Mellman and Steinman 2001; Columba-Cabezas et al. 2002; Penna et al. 2002; Szanya et al. 2002)의 발현을 조사하였다. 흥미롭게도, Pro 그룹의 혼합 귀 세포에서 CCL1 and CCL22의 발현이 크게 증가한다는 것을 발견하였다(도 14a). 또한, Pro 그룹의 귀 CD4⁺ T 세포에서 수용체인 CCR4 및 CCR8의 발현이 증가하는 것을 발견하였다(도 14b). 상기 실험 데이터에 따르면, 조절성 T 세포는 MLN에서 생성되어 귀 부위로 이동하고 면역항상성을 유지한다는 것을 알 수 있다. 그러나, 상기 실험 결과만으로는 MLN CD4⁺Foxp3⁺ T 세포의 염증 부위로으 이동에 대한 우리의 가설을 충분히 입증할 수 없으며, 그 이유는 CCL1, CCL22, CCR4 및 CCR8은 피부-homing, 피부 류코사이트 항원⁺ T 세포 및 Th2 세포에서 종종 발현되기 때문이다(Bonecchi et al. 1998; Campbell et al. 1999; Margherita Mariani 2004).

따라서, 상기한 문제점을 해결하기 위하여, 프로바이오틱스의 처리에 의한 염증성 위치로의 조절성 T 세포의 인 비보 이동을 조사하였다. PBS 또는 프로바이오틱스의 구강 투여 30일 이후에, MLN CD4⁺ T 세포를 분리하고, CFSE로 표지한 다음, 복강 주입 방식으로 AD 유도 마우스에 상기 세포를 전이시켰다(도 14c). 5번의 적응성 전이 후, 귀 부위에서의 CFSE⁺Foxp3⁺ 파퓰레이션을 IHC로 조사하였다. 음성 대조군의 경우, 동일 부피의 PBS를 전이시켰다. 흥미롭게도, 몇 개의 CFSE⁺Foxp3⁺ 세포가 Cont MLN CD4⁺ T 세포 전이 귀에서 검출되었고, 이중 양성 세포의 수는 Pro MLN CD4⁺ T 세포 전이 귀에서 크게 증가하였다(도 14c). 결론적으로, 상기 실험 결과에 따르면, 프로바이오틱스의 구강 투여는 MLN에서 조절성 T 세포를 생성시키고 인 비보 생성된 조절 T 세포는 염증 부위로 이동하여 면역항상성을 유지하는 데 기여한다는 것을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1a-1c는 프로바이오틱스의 구강 투여에 의한 장막간림프절에서 CD4⁺Foxp3⁺ 조절 T 세포 파퓰레이션의 증가를 보여준다. LA, LC, LR, BB 및 ST는 각각 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)를 나타낸다.

도 2a-2d는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱 혼합물에 의한 사이토카인 발현의 억제 및 T/B 세포 저반응성의 유도를 보여주는 실험 데이터이다. 도 2a-2b는 비장(SP) 및 장막간림프절(MLN)에서 사이토카인 발현 및 증식속도를 측정하여 이펙터 T 세포의 기능을 조사한 결과이다. 도 2c-2d는 비장(SP) 및 장막간림프절(MLN)에서 사이토카인 발현 및 증식속도를 측정하여 이펙터 B 세포의 기능을 조사한 결과이다. 그룹 당 10마리의 마우스로부터 데이터를 수집하였다. 오차막대는 SD를 나타낸다. (**)는 p < 0.005, (***)는 p < 0.001를 나타낸다. 데이터는 3번의 단독 실험의 대표적인 값이다.

도 3a-3b는 프로바이오틱스가 아폽토시스를 유도하지 않음을 보여준다. 비장 또는 장막간림프절 CD4⁺ T 세포를, 프로바이오틱스(Pro) 또는 PBS (Cont)로 20일 동안 투여한 건강한 Balb/c 마우스로부터 분리하였다. 아폽토시스 파퓰레이션(Annexin V⁺ 및 7-ADD⁺)를 FACS로 측정하였다. 데이터는 3번의 단독 실험의 대 표적인 값이다.

도 4a-4d는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스가 CD4⁺CD25^- T 세포로부터 Foxp3⁺CD4⁺ T 세포의 형성을 유도한다는 것을 보여준다.

도 5는 대조군 및 프로바이오틱스-처리군에서 MLN CD4⁺ T 세포의 CD4⁺CD25⁺ 이중 양성 파퓰레이션 분석 결과이다.

도 6은 TNBS-유도 대장염 동물모델 실험의 개략적인 실험 방법을 보여주는 모식도이다.

도 7a-7f는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물에 의한 TNBS-유도 대장염의 예방/치료 효능을 보여주는 실험 결과이다.

도 8a-8b는 프로바이오틱스 혼합물에 포함되어 있는 각각의 균주 및 프로바이오틱스 혼합물에 의한 TNBS-유도 대장염의 예방/치료 효능을 보여주는 실험 결과이다.

도 9a-9i는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물에 의한 아토피 피부염의 치료 효능을 보여주는 실험 결과이다. w/o induction, Cont 및 Pro는 각각, 아토피 피부염 유도되지 않은 군, PBS 처리된 아토피 피부염 동물 및 프로바이오틱스 혼합물 처리된 아토피 피부염 동물을 나타낸다.

도 10a-10c는 균주의 수 및 종류가 변화된 프로바이오틱스에 의한 아토피 피부염의 치료 효능을 보여주는 실험 결과이다.

도 11a-11b는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물의 투여가 질병 상태에서 MLN Foxp3⁺CD4⁺ 조절성 T 세포를 특이적으로 증가시킨다는 것을 보여주는 실험 결과이다. 도 11a는 IBD 케이스이고, 도 11b는 AD 케이스이다.

도 12는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물이 투여된 AD 유도 마우스에서 인돌 아민 2,3-디옥시게나아제(IDO)의 발현이 증가됨을 보여준다. C는 대조군이고, P는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물 투여군이다. HPRT: Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase; IDO: indole amine 2,3-dioxygenase; B7.1: CD80; B7.2: CD86; ICOSL: inducible costimulator ligand; PD1L: programmed death 1.

도 13a-13d는 프로바이오틱스 혼합물에 의하여 염증 위치에서 상향조절된 CD4⁺Foxp3⁺ T 세포가 염증 질환의 억제를 초래함을 보여주는 실험 결과이다.

도 14a-14c는 프로바이오틱스 혼합물 투여에 의한 조절성 T 세포의 트래픽킹(trafficking)에 대한 화학유도자(chemoattractants)의 증가 및 염증 위치에서 Treg의 인 비보 이동에 대한 실험 결과이다.

도 15a-15c는 프로바이오틱스 혼합물 투여에 의한 류마티스관절염-유도 래트에서 관절염 치료 효능을 보여주는 실험 데이터이다. MTX는 메타트렉세이트, Probiotics는 5종의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 혼합물을 각각 나타낸다.

Claims

락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococus thermophilus)를 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 염증질환을 개선하기 위한 식품 조성물.
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락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococus thermophilus)를 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 염증질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococus thermophilus)를 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 이식 거부 또는 자가면역질환을 개선하기 위한 식품 조성물.
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락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococus thermophilus)를 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 이식거부 또는 자가면역질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.