KR100910131B1 - 자외선에 의한 세포 변이 억제 효과를 갖는 인동 추출물,그 추출 방법 및 인동 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 인동을 이용하여 자외선에 의한 세포 손상 또는 세포 변이에 따른 질환을 방지, 억제할 수 있는 추출물 및 그 추출 방법을 제안한다. 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물은 예를 들어 자외선 노출로 인한 세포계획사(apoptosis), 세포막 변이, 세포분열 정지, DNA 변이와 같은 핵 성분의 파괴 등을 억제할 수 있음을 확인하였다.
인동(Lonicera japonica), 자외선(Ultraviolet lay), 세포계획사(Apoptosis), 세포주기(Cell Cycle), 수지상세포(dendritic cell, DC)
Description
도 1은 본 발명에 따라 인동으로부터 자외선 차단 효과를 갖는 추출물을 얻는 과정을 개략적으로 도시한 플로 차트이다.
도 2는 마우스 피부를 자외선에 노출시켰을 경우, 자외선 강도에 따른 접촉성 과민 반응이 억제되는 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프.
도 3은 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물로 처리한 마우스 피부와 인동 추출물로 처리하지 않은 마우스 피부를 자외선에 노출시킨 뒤, 접촉성 과민 반응을 측정한 결과를 도시한 그래프.
도 4는 마우스의 수지상세포를 자외선에 노출시켰을 경우 자외선 강도에 따른 수지상세포 주기의 변화를 측정한 결과를 도시한 그래프.
도 5는 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물로 처리한 마우스의 수지상 세포와, 인동 추출물로 처리하지 않은 마우스의 수지상 세포를 각각 자외선에 노출시킨 뒤, 세포 주기의 변화를 측정한 결과를 도시한 그래프.
도 6은 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물로 처리한 마우스의 수지상 세포와, 인동 추출물로 처리하지 않은 마우스의 수지상 세포를 각각 자외선에 노출시킨 뒤, 각 세포의 세포막 변화 또는 파괴 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프.
도 7은 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물로 처리한 마우스의 수지상 세포와, 인동 추출물로 처리하지 않은 마우스의 수지상 세포를 각각 자외선에 노출시킨 뒤, 각 세포의 미토콘드리아막의 변이 또는 파괴 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프.
도 8은 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물이 일정량 함유되어 있는 크림으로 처리한 마우스의 수지상 세포와, 인동 추출물로 처리하지 않은 마우스의 수지상 세포를 각각 자외선에 노출시킨 뒤, 자외선에 노출된 마우스의 수지상세포 내의 DNA 응축 정도를 측정한 사진.
도 9a 내지 도 9e는 각각 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물을 농도를 달리하여 처리한 마우스의 수지상 세포와 LPS로 처리한 마우스의 수지상 세포의 보조자극인자들의 발현 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프.
본 발명은 인동으로부터 활성 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인동으로부터 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분을 추출하는 방법, 이 방법에 따라 자외선 차단 효과를 갖는 인동 추출물 및 이 인동 추출물을 유효 성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
인동(Lonicera japonica)은 쌍떡잎식물 꼭두서니목 인동과의 덩굴식물로서, 겨울에도 곳에 따라 잎이 떨어지지 않기 때문에 인동(忍冬)이라고 한다. 한방에서는 인동의 잎과 줄기를 인동등(忍冬藤), 꽃은 흰꽃과 노랑꽃이 동시에 보이기 때문에 인동의 꽃봉오리를 금은화라고 하여 종기, 치질은 물론이고 천식, 기관지염 등에 이용하고 있다.
인동등의 성분은 황동류 화합물인 루테올린(luteolin), 로니세린(lonicerin)과 같은 플라보노이드, 클로로겐산(chlorogenic acid), 이소-클로로겐산(isochlorogenic acid)이 대부분을 차지하고 있으며, 휘발유인 리날로올(linalool), 시스-2,6,6-트리메틸-2-에테닐-5-하이드록시-테트라하이드로파이란(cis-2,6,6-trimethyl-2-ethenyl-5-hydroxy-tetrahydropyrane) 등이 대략 0.6%를 차지하며, 그 외에 미량의 로가닌(loganin), 이노시톨(inositol), 알코올, 탄닌, 사포닌 등을 함유하고 있다. 특히 최근의 연구 결과에 따르면 인동덩굴꽃에는 이소시드, 사포닌 성분이 함유되어 있어, 폐렴쌍구균을 비롯한 여러 가지 세균들에 대한 억제 작용은 물론이고, 각종 화농성 감염증, 간독성 보호 등에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
이와 같은 기능을 갖는 인동에 대해서 최근 많은 연구 및 특허가 진행되고 있는데, 일례로 한국등록특허 제163813호에서는 분말화한 인동 줄기와 인동 잎을 소정 비율로 혼합하고, 물로 환류 추출하여 얻어지는 소염진통 활성이 우수한 유효성분을 추출하는 방법을 제안하고 있으며, 한국등록특허 제672036호에서는 상기 한국등록특허 제163813호의 방법을 이용하여 로니세로사이드 A 0.5~ 3.0 중량%, 로니세로사이드 B 0.5~3.0 중량%, 로니세린 0.5~2.0 중량%, 로가닌 2.0~5.0 중량% 포함되어 있는 인동 물 추출물의 부탄올 분획물인 천식 치료제를 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2005-0005633호에서는 인동초 추출물을 유효성분으로 포함하는 성장호르몬 분비 유도/촉진 조성물을 제안하고 있다.
그렇지만 상술한 것과 같이 인동을 활용하기 위한 다양한 연구가 시도되었으나 여전히 인동에 포함된 성분의 효능에 대해서는 지속적인 연구가 필요한 실정이다. 특히, 현재까지 폭넓게 사용되지 못하고 있는 인동초 등의 기능을 이용하여 각종 기능성 식품, 화장품은 물론이고 의약학적 제재로서의 응용에 대한 연구가 보다 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 자외선 조사 등에 의한 세포계획사 또는 세포 내 물질의 변환 등으로 야기될 수 있는 각종 질환 가능성을 억제함으로서, 의학적 또는 약학적으로 이용될 수 있음은 물론이고 예를 들어 기능성 화장품 성분 또는 건강식품 등으로 이용될 수 있는 인동 추출물, 그 제조 방법 및 이와 같이 얻어진 인동 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 효과를 갖는 활성 성분의 수율이 크게 향상되도록 하고, 그 결과 생산성 내지는 경제성이 있는 공정을 통하여 산업적인 면에서도 응용될 수 있는 인동 추출물, 그 추출 방법 및 인동 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 구성 및 첨부한 도면을 통하여 보다 분명해질 것이다.
상기와 같은 목적을 갖는 본 발명의 일 관점에 따르면, 인동을 절단하는 단계와; 상기 절단된 인동에 물을 배합하여 열탕 추출하는 단계와; 상기 열탕 추출에 의하여 얻어진 현탁액을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계를 포함하는 인동으로부터 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 활성 성분을 추출하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 침전 추출물을 얻는 단계는 상기 현탁액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 회수하는 단계와, 상기 상층액을 유기용매로 처리하여 침전시키는 단계와, 침전물을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 얻어진 침전 추출물을 정제하는 단계를 더욱 포함한다.
이때, 침전 추출물을 정제하는 단계는 상기 얻어진 침전물을 투석하여 추출물을 회수하는 단계와, 회수된 추출물을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계와, 회수된 상층액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 관점에 따르면 절단된 인동을 물로 열탕 처리하여 얻어진 현탁액을 원심분리하고, 원심분리에 의하여 얻어진 상층액을 유기용매로 처리하여 얻어진 침전물을 원심분리함으로 추출되는 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 인동 추출물을 제공한다. 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물은 상기 인동 추출물은 자외선에 의한 세포계획사를 억제하는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 다른 관점에서는 상술한 방법에 따라 얻어진 인동 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 조성물을 제공한다. 이때, 상기 인동 추출물은 전체 조성물 총량을 기준으로 0.05 ~ 1.0 중량%의 비율, 또는 전체 조성물 총량을 기준으로 1 ~ 1000㎍/㎖의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 인동 추출물이 함유되는 위 조성물은 크림, 로션, 겔, 파우더, 졸, 고형체, 나노스피어 또는 마이크로스피어 형태의 중합체의 형태를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 명세서 및 청구의 범위에서 '자외선 차단 효과' 또는 '자외선으로 인한 세포 변이 억제'라는 용어는 자외선 노출로 인하여 야기되는 비정상적 세포 형태의 변화 또는 세포 수준의 비정상적 반응을 차단, 억제, 방지한다는 의미로 사용된다. 이와 같은 비정상적 세포 형태의 변화 또는 세포 수준의 비정상적 반응으로는 세포막 파괴, 미토콘드리아막 파괴 등으로 인한 세포계획사, DNA 응축과 같은 염색체 변형 등을 포함하여, 자외선 노출로 인하여 야기될 수 있는 세포 수준에서의 모든 비정상적 반응 내지는 변형을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명자는 인동초, 예를 들면 인동등(忍冬藤)으로부터 추출한 성분의 효능에 대한 지속적인 연구를 통하여 인동초를 물을 이용하여 추출한 뒤, 소정의 처리를 통하여 얻어진 인동 추출물을 마우스의 피부 및 배양 세포 등에 처리하면 자외선 노출로 인하여 야기될 수 있는 세포 수준에서의 비정상적 반응을 억제 또는 방지할 수 있다는 점을 확인하였다.
본 발명에 따라 자외선 차단 효과 또는 자외선 노출로 인한 세포 변이를 억제할 수 있는 인동 추출물을 얻는 공정에 대해서 설명한다. 도 1은 본 발명에 따라 인동으로부터 자외선 차단 효과를 갖는 추출물을 얻기 위한 공정을 개략적으로 도시한 플로 차트이다. 본 발명에 따라 자외선 차단 효과 내지는 자외선 노출로 인한 세포 수준에서의 변이 억제 효과를 갖는 인동 추출물은 크게 추출물을 얻기 위한 준비 공정과, 준비 공정에 따라 얻어진 인동으로부터 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분을 분리하는 공정 및 선택적으로 얻어진 활성 성분을 정제하는 공정으로 구분될 수 있다.
우선 도 1에 도시된 것과 같이 식품원료로 사용될 수 있는 인동을 준비한다(S100). 본 발명에 따른 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분이 되는 원료로서 인동초는 바람직하게는 인동 줄기가 특히 바람직하지만, 인동의 잎과 인동 줄기의 인동등은 물론이고, 인동의 꽃인 금은화, 뿌리 등의 기관을 사용할 수 있다. 이어서, 준비된 인동초를 아주 잘게 절단하는 세절 단계가 수행된다(S102). 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 준비된 인동은 대략 0.1 ~ 1.0 ㎜의 크기로 세절될 수 있을 것이다.
상술한 준비 공정 후에는 인동으로부터 자외선 차단 효과를 활성 성분을 분리, 추출하는 공정이 수행된다. 본 발명에 따라 인동으로부터 자외선 노출로 인한 세포 변이를 방지, 억제할 수 있는 활성 성분을 분리, 추출하는 공정은 세절된 인동을 물과 배합하여 열탕 처리하는 단계(S104)와, 열탕 처리에 의하여 생성된 현탁액을 원심분리하는 단계(S106)와, 원심분리에 의하여 얻어진 상층액을 유기 용매로 처리하여 침전물을 얻는 단계(S108)로 크게 구분될 수 있다.
우선 세절된 인동초에 물을 배합하고, 이를 열탕 처리하여(104)의 물 추출물을 얻는 단계가 수행된다. 본 발명과 관련하여 세절된 인동과 배합될 수 있는 물은 바람직하게는 증류수이나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니고 정제수 또는 음용 가능한 물을 사용할 수 있다. 본 발명과 관련해서 세절된 인동과 배합되는 물은 세절된 인동을 기준으로 5-15배의 부피, 바람직하게는 8-12배의 부피로 배합될 수 있으며, 이와 같이 인동과 물이 배합되면 이를 열탕 처리하여 중간 추출물을 얻을 수 있다. 이어서, 물에 의한 열탕 추출에 의하여 생성되는 성분 중에서 고형분이 제거된 현탁액을 원심분리하여 자외선 차단 효과를 갖는 성분이 함유되어 있는 상층액을 얻는다(S106). 계속해서 회수된 상층액에 적절한 유기용매를 혼합하여 처리하면 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분이 포함된 침전물을 얻을 수 있다(S108). 이때, 사용될 수 있는 유기용매로는 아세톤 등의 비극성 유기용매를 포 함하며, 원심분리에 의하여 회수된 상층액과 유기용매는 약 1:1 ~ 1:3의 부피비율로 혼합시켜 회수된 상층액이 충분히 침전될 수 있도록 한다. 특히 유기 용매로의 처리 단계(S108)는 상온에 비하여 훨씬 낮은 온도, 예를 들면 -40 ~ -5℃, 바람직하게는 -30 ~ -10℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 이와 같이 유기용매에 의한 침전 처리가 이루어지는 경우에는 후기 원심분리를 수행하여 얻어진 침전물에 유기용매가 잔존할 우려가 있으므로 충분히 건조시키는 것이 좋다. 이어서, 유기용매의 처리를 통하여 얻어진 침전물을 원심분리(S110)하여 자외선 차단 효과를 갖는 침전 추출물을 얻을 수 있다.
상술한 것과 같은 분리, 추출 공정을 통해서 얻어진 침전물 내에도 자외선 차단 효과 내지는 자외선 노출로 인한 세포 변이를 억제, 방지할 수 있는 활성 성분을 얻을 수 있으나, 바람직하게는 얻어진 침전물을 정제하는 공정이 수행됨으로써 자외선 차단 효과가 농축되어 있는 인동 추출물을 얻을 수 있다.
즉, 상술한 2차 원심분리(S110) 단계를 통하여 얻은 침전 추출물을 투석(dialysis) 등의 방법을 통하여 활성 성분을 1차로 정제하고(S112), 투석을 통하여 회수한 추출물을 다시 소정의 속도로 원심분리한 뒤(S114), 원심분리에 의하여 회수된 상층액을 여과함으로써(S116), 자외선 노출로 인한 세포 변이를 방지/억제할 수 있는 활성 성분을 얻을 수 있다. 특히 본 발명의 실시예에 따르면 원심분리에 의하여 얻어진 상층액을 여과한 뒤에 여과된 추출물을 소정의 압력에서 감압, 농축한 뒤 이를 동결 건조시키는 단계가 수행될 수 있는데, 특히 감압/농축 과정은 예를 들어 대략 0.1 Torr 이하, 바람직하게는 0.001~0.1 Torr, 보다 바람직하게는 0.001~0.01 Torr 범위의 압력 및 30~80℃의 온도, 바람직하게는 40~80℃에서 이루어질 수 있다.
아울러, 여과 단계를 통하여 얻어진 추출물을 고온에서 건조시키는 과정(S118)이 수행될 수 있다. 이와 같은 정제 단계를 통하여 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분의 함량 비율이 보다 인동 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명과 관련해서 정제된 추출물의 건조 단계(S118)는 100℃ 이상의 고온에서 수행될 수 있으며, 일례로 100~120℃의 온도에서 충분히 긴 시간 동안, 예를 들어 4~8 시간 동안 수행될 수 있다.
한편, 현재까지의 자외선에 대한 연구 결과에 따르면, 적당량의 자외선은 살균 작용 및 건강한 피부 유지에 기여하지만, 자외선의 과잉 노출은 피부 노화의 원인이 되고, 홍반, 부종 등을 유발할 뿐만 아니라 피부암의 발생을 촉진시킨다.
특히, 파장이 280~320㎚인 UVB는 피부의 핵산, 단백질 등의 합성을 억제할 뿐만 아니라 면역학적 기능을 억제시켜 세포성 매개 면역에 심각한 장애를 일으키고 접촉성 항원 물질 및 다양한 감염증에 대한 피부 면역 기능을 억제시킨다. 최근의 연구에서는 UVB에 지속적으로 노출되었을 경우, T-cell 매개 면역 기능을 억제시켜 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity)을 감소시키는 것으로 확인되었다. 일반적으로 접촉성 과민반응이란 니켈, 크롬, 코발트 등의 화학물질이나 유기화합물 등의 항원에 지속적으로 자극을 받으면 동일한 자극물질에 대한 기억 T- cell이 분열하여 림포카인을 분비함으로써 유발되는 피부의 염증 반응을 말하는데, 자외선에 지속적으로 노출되면 피부 내 면역 세포를 손상시켜 접촉성 과민반응을 억제하게 된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상술한 과정을 통하여 얻어진 추출물 및 이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 피부에 도포하거나 또는 세포 내로 처리한 마우스를 자외선에 노출시킨 결과 자외선 노출로 야기될 수 있는 다양한 세포 변이적 반응 또는 증상을 방지, 억제할 수 있는 것으로 확인되었다. 특히, 접촉성 과민반응과 관련하여 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물을 마우스의 피부에 도파하는 방법으로 처리한 결과, 자외선 노출에 의하여 야기되는 접촉성 과민반응의 감소가 크게 억제, 방지되었다(도 3).
한편, 자외선에 지속적으로 노출되면 세포의 핵에 존재하는 DNA에서 상보적 결합을 이루고 있는 A-T 결합은 G-C 결합으로 변이되고, 세포 내의 DNA 복구 시스템(DNA repair system)이 제대로 작동하지 않는 경우에는 조직 내에 A-T 결합으로 돌연변이가 일어난 세포가 존재하게 된다. 이때, 자외선에 지속적으로 노출된 세포에서는 세포 분열에 관여하는 사이클린(cycline) 또는 CDK와 같은 단백질의 조절이 일어나지 않게 될 뿐만 아니라 일부 변이가 일어난 세포에서는 프로그래밍에 따른 세포계획사(apoptosis)가 일어난다. 즉, 세포가 자외선에 노출되면 세포 내의 신호 전달(signal transduction) 기작을 통하여 NF-kB 또는 JNK와 같은 조절 인자를 활성화시킴으로써, 세포계획사(apoptosis)를 유도한다.
특히, 앞서 살펴본 바와 같이 접촉성 과민반응과 관련해서는 세포 내에 존재하는 면역관련 세포 중에서 수지상 세포가 큰 역할을 수행한다. 면역 반응에 관여하는 다양한 세포 중에서 수지상세포(dendritic cell, DC)는 B lymphocyte 및 대식세포(macrophage)와 같은 전문적 항원제시세포로서, lymphocyte의 증식 및 분화를 유도할 수 있는 유일한 항원제시세포로 작용하여 바이러스 또는 세균 감염 등과 같은 항원에 대한 획득 면역 반응(adaptive immune response)의 유도 및 NK 세포의 활성 유도 등에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. 즉, 수지상세포는 표면의 나뭇가지 모양으로 뻗은 수상돌기를 이용하여 항원의 구조를 변화시키지 않고 B-세포에 항원을 전달하여 항체 생산을 유도하고, 식균 또는 흡음작용 등을 통하여 외부항원을 포획하여 활성화시킨 뒤, 외부항원을 분해하여 MHC 분자를 통하여 세포 표면에 제시함으로써 항원특이적인 T-세포의 활성을 유도한다.
이에 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물을 마우스에 투여한 결과 림프구 생산에 관여하는 비장 세포(spleen cell) 및 항체를 생성하는 b-세포의 증식은 물론이고, 면역 반응에 관여하는 사이토카인, 림포카인 등의 분비를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 일례로, 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물은 항-염증 반응(anti-inflammatory response)에 관여하는 인터류킨-1β(IL-1β); B세포의 자극 및 성장을 유도하고, 인터페론베타2(Interferon-β2)를 자극시키거나, T세포 등의 성장 및 분화에 영향을 주는 사이토카인인 IL-6; IgE 생성 조절, 염증 반응 조절 및 TH1 세포 분화 조절 등에 관여하는 IL-12; TH1 세포에 의하여 분비되며, 대식세 포 활성화, 임파구의 미토겐(mitogen) 유도, NK세포 및 TH1 세포 자극, MHC 분자 발현 자극, 항바이러스 기능 및 항암 작용을 갖는 물질로서 면역 인터페론으로도 알려진 물질인 인터페론-감마(INF-γ); 대식세포 활성화, MHC 발현 유도, 림프구 생성 유도, 세포자살(apoptosis) 유도, 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α)등의 사이토카인의 분비를 특히 촉진하는 것으로 확인되었다.
아울러, 본 발명에 따라 얻어진 인동 추출물을 마우스에 처리한 뒤, 일정시간 자외선에 노출시켰을 경우에 자외선 노출로 인한 세포계획사가 크게 억제 또는 방지되는 것을 확인하였다. 본 발명에 따라 자외선을 조사하여 얻어지는 인동 추출물을 우선 처리한 뒤 자외선에 노출시킨 경우에 세포 주기 상 휴지기에 해당하여 세포가 사멸한 것으로 인식되는 subG1기의 세포 수는 자외선만을 조사한 경우와 비교하여 감소하였으며(도 5), 수지상세포 막의 파괴(도 6), 미토콘드리아막의 붕괴 내지는 파괴(도 7)가 크게 줄어드는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 인동 추출물은 자외선 조사로 야기될 수 있는 염색체의 응축(도 8)을 방지 또한 억제하였으며, 이와 아울러 세포표면의 공동자극분자(co-stimulatory molecule)의 발현을 유도함으로써, 수지상세포의 성숙을 자극하는 것으로 확인되었다(도 9a 내지 도 9e). 즉, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 수지상세포의 표면에 존재하여 림프구에 활성 신호를 전달하는 공동자극분자 및 세포간 접촉에 관여하는 부착분자로서 CD11c와 같은 자극 분자의 발현이 크게 증가한 것으로 확인되었다.
이에 따라, 본 발명에 따라 제조된 인동 추출물은 예를 들어 화장품 조성물로 포함될 수 있음은 물론이고, 건강식품 중에 함유되거나 또는 약학적 조성물 중에 함유될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인동 추출물이 화장품 조성물 중에 사용되는 경우에는 국소 투여용으로 적합한 담체 또는 부형제등과 함께 사용될 수 있는데, 이 경우 화장품 조성물은 크림, 유제, 로션, 겔, 파우더, 졸, 마이크로스피어 또는 나노스피어 형태의 중합체, 비누, 또는 샴푸의 형태로 공급될 수 있다. 본 발명에 따른 인동 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장품은 자외선으로 인하여 야기되는 각종 질환의 예방 및 억제를 위하여 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 인동 추출물이 졸 또는 액상 타입의 비경구적인 약제 조성물 중에 함유될 수 있다. 이 경우, 약제 조성물에는 본 발명에 따른 인동 추출물 외에 약학적으로 허용되는 담체가 함께 사용될 수 있으며, 그 약제 조성물은 소장, 비경구적, 국소적인 방법을 통하여 투여될 수 있다.
소장을 통한 투여를 위해서 약제 조성물은 예를 들어 정제, 젤라틴 형태의 캡슐, 시럽, 현탁제, 액제, 과립제, 유제, 조절된 방출이 가능한 마이크로스피어 또는 나노스피어 형태일 수 있으며, 비경구적 투여를 위해서는 그 조성물은 주입용 액제 또는 현탁제의 형태일 수 있다. 한편, 국소 투여를 위해서는 예컨대 연고, 크림, 유제, 산제, 패드, 액제, 겔, 졸, 로션, 현탁제의 형태로 공급될 수 있거나 조절된 방출이 가능한 마이크로스피어 또는 나노스피어 또는 지질 또는 중합체성 소포체, 또는 하이드로겔(hydrogel)의 형태로 제공될 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 인동 추출물이 화장품 또는 약학적 조성물 중에 함유되는 경우에 그 조성물에는 기능성 첨가제가 더욱 포함될 수 있다. 예를 들어 인동 추출물이 함유되는 화장품 조성물 중에는 옥틸메톡시신나메이트 (octyl methoxycinnamate), 3-(4-메틸벤질리덴) 캄파 (3-(4-methylbenzylidene) camphor), 비스-에틸 헥실옥시페놀 메톡시페닐 트리아진 (bis-ethyl hyxyloxy phenol methoxyphenyl triazine), 산화티타늄(titanium oxide)/디메티콘(dimethicone)/수산화알루미늄(aluminum hydroxide)/스테아르산(stearic acid) 등과 같은 화장품의 주성분은 물론이고, 세틸디메티콘 폴리올(cetyl dimethicone polyol), 소르비탄 세스퀴올레이트(sorbitan sesquioleate) 등과 같은 유화제, 탄소수 12-15개의 알킬기로 치환된 벤조에이트(benzoate), 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(caprylic/capric/myristic/stearic triglyceride), 부틸렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트(bythylene glycol dicaprylate/dicaprate), 사이클로메티콘(cyclomethicone) 등과 같은 피부 컨디셔닝제, 이소도데칸(isododecane) 등과 같은 점도 조절제, 메틸 파라벤(methyl paraben), 프로필 파라벤(propyl paraben), 이미다졸리디닐 우레아(imidazolidiny urea) 등과 같은 보존제, 베타인(betaine), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 글리세린 등과 같은 보습제, 소듐 클로라이드와 같은 유화안정제, 연화제, 알란토인(allantoin) 등과 같은 피부보호제, 착향제 및 용제를 포함할 수 있다. 한편, 약학 조성물 중에는 네오마이신, 테트라사이클린 등과 같은 항생제가 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 인동 추출물이 예를 들어 크림 타입의 화장품 조성물 또는 약제 조성물 중에 사용되는 경우에는 인동 추출물은 전체 조성물 총중량에 대하여 0.1~1.0 중량%의 농도로 함유될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 인동 추출물이 액제 또는 졸 형태의 조성물 중에 함유되는 경우에는 인동 추출물은 전체 조성물 중에 1~1000 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 만약 인동 추출물의 함량이 이를 초과하는 경우에는 인동 추출물에 의하여 조성물이 변색되거나 부패할 우려가 있고, 이보다 적은 경우에는 자외선 차단 효과를 기대하기 어렵기 때문이다.
이하, 본 발명의 예시적인 실시예에 대하여 기술한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.
실시예 1 : 인동 추출물의 제조
식품공전에 식품원료로 사용 가능한 것으로 등재되어 있는 인동의 줄기를 세절하여 혼합한 다음, 10 배 양의 증류수를 가하고 2시간동안 열탕 추출한 뒤, 고형분을 제거한 현탁액을 200×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 acetone으로 처리(추출물과 acetone 비율은 1 : 2 )하여 -20℃에서 1시간 침전시킨 후, 4℃에서 15,000g에서 10분간 원심분리하여 상층액은 제거하고, 남은 침전물을 충분히 건조시켜 인산식염수 완충액(PBS)에 녹였다. 그런 다음, 추출물을 투석막에 넣어서 인산식염수 완충액으로 이틀을 투석 시키고 회수한 추출물을 25℃에서 40,000g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액을 여과하여 감압, 농축 후 동결 건조시켜서 추출물을 얻었다. 이 추출물을 생리적 식염수(PBS)에 적당량 녹여서 0.45㎛ filter에 통과시켜 무균처리를 한 다음 일정량을 110℃에서 6시간 이상 건조시켜 건조중량을 측정하여 사용하였다.
실시예 2 : 접촉성 과민반응 억제에 대한 자외선 조사량 결정
본 실시예에서는 피부 면역세포인 랑게르한스(Langerhans) 세포에 의한 접촉성 과민반응(CHS)을 유도하는 자외선 조사량을 결정하기 위하여 시험을 수행하였다. 실험 마우스는 (주)대한바이오링크(충북 음성군, 대한민국)에서 특정병원체부재(specific pathogen free) C57BL/6 마우스를 공급받아 실험동물 사육실에서 폴리카보네이트 사육상자(18×20㎝)당 6개체의 밀도를 유지하여 사육하였다. 이들 마우스는 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 낮과 밤의 주기를 각각 12시간씩 조절하면서 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하면서 생후 8-12주 사이의 마우스를 실험에 사용하였다.
자외선을 조사하기 이틀 전, 사육된 마우스의 복부 털을 전기 제모기를 이용하여 제거하고, 화학제모제를 사용하여 완전히 제거하였다. 다음날 마우스를 디에틸에테르로 마취하고 알루미늄 포일로 얼굴을 덮은 후, 접촉성 과민반응을 유도하는 자외선 조사량을 결정하기 위하여 마우스의 복부 피부에 각각 10 mJ/㎠, 30mJ/㎠, 100mJ/㎠의 UVB를 조사하였다. UVB 조사를 위하여 F20T10 lamp(Sankyo, Japan)를 사용하였으며 UVB 방출량 측정은 UVB Solarmeter(Mat SCIENCE TECH)를 사용하였다.
UVB 조사 2시간 후에 피부 감작을 위하여 노출된 마우스의 복부에 합텐으로 서 1.5% 옥사졸론(Oxazolone, 4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one, Simga Chemicals, St. Louis, Mo, USA)이 용해된 에탄올을 용해시켜 100㎕씩 마우스의 복부에 도포하고, 5일 후 아세톤 :올리브유(sigma chemical, St. Louis, MO, USA) (4:1)에 1% 옥사졸론을 녹여 마우스의 왼쪽 귀의 앞면과 뒷면에 각각 10㎕씩 도포하여 면역반응을 유도하였다. 24시간 후 마우스 왼쪽 귀의 부풀어 오른 두께를 Thick gauge를 이용하여 측정하였다. 마우스 왼쪽 귀에 1% 옥사졸론으로 면역하는 것을 3일 간격으로 3회 실시하였고, 그 측정 결과는 도 2 및 하기 표 1에 표시되어 있다.
표 1. UVB 조사에 따른 마우스의 귀 두께 변화
| UVB (mJ/) | UVB 조사 후 경과(일) | |||
| 3 | 8 | 11 | 14 | |
| (-) | 372.5±51.23 | 735.0±21.21 | 925.0±35.36 | 1205.0±35.36 |
| 10 | 317.5±12.58 | 645.0±21.21 | 885.0±91.92 | 1240.0±113.14 |
| 30 | 340.0±14.14 | 575.0±35.36 | 730.0±70.71 | 985.0±91.92 |
| 100 | 352.5±29.86 | 535.0±7.07 | 765.0±21.21 | 930.0±155.56 |
자외선을 조사하지 않은 대조군에서는 항원을 피부의 수지상세포가 포획하여 인접 림프절로 이동시키는데, 이곳에서 T-cell이 활성화되어 기억 T-cell이 생성되기 때문에 진피 내에 도달한다. 따라서 대조군에서는 동일한 항원에 재차 노출되면 진피 내에 있는 기억 T-cell에 항원이 제시되고 T-cell은 각종 사이토카인을 분비하여 염증 반응이 진행되어 귀가 부풀어 오른다. 이에 반하여 자외선을 조사하면 T-cell을 활성화시키는 피부 수지상세포가 손상을 받기 때문에 사이토카인에 의한 염증반응이 유도되지 않아 귀가 부풀어 오르는 접촉성 과민반응이 억제된다.
도 2 및 표 1에서 알 수 있는 것과 같이, 자외선을 조사하지 않은 대조군의 귀 두께는 정상적인 피부 면역세포인 랑게르한스 세포에 의해 항원이 전달되어 두 번째(8일), 세 번째(11일), 네 번째(14일) 측정할 때 계속적으로 부풀어서 첫 번째 측정할 때와 비교해서 약 3배정도 증가하였다. 그리고 자외선을 조사하지 않은 대조군에 비해 10mJ/㎠ UVB를 조사한 생쥐의 귀 두께가 두 번째 측정할 때는 억제되었지만 세 번째, 네 번째 측정할 때는 점차 회복되어 대조군과 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 30mJ/㎠, 100mJ/㎠ UVB을 조사한 생쥐의 귀 두께는 두 번째 측정할 때부터 대조군과 유의한 차이가 나기 시작하였고 세 번째와 네 번째 측정할 때까지 계속해서 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 실험 결과로 생쥐 복부에 자외선을 30mJ/㎠, 100mJ/㎠ 조사하였을 때 피부 면역세포인 랑게르한스 세포가 UVB에 의해 손상을 받아 항원을 제대로 전달하지 못하여 접촉성 과민반응이 억제된 것으로 생각된다. 따라서 다음 실험에서 피부 면역세포인 랑게르한스 세포가 UVB에 의해 손상을 받아 접촉성 과민반응이 억제되는 100mJ/㎠를 사용하였다.
실시예 3 : 인동 추출물의 접촉성 과민반응 억제 방지 효과
본 실시예에서는 자외선 조사로 억제된 접촉성 과민반응에 대한 인동 추출물의 회복/방지 효과를 살펴보았다. 우선, 상술한 실시예 1을 통하여 얻은 인동 추출물이 0.6% 또는 0.15%가 포함된 크림과 대조군으로 인동 추출물을 처리하지 않은 크림을 각각 UVB를 조사하기 24시간과 15분 전에 면봉을 이용하여 마우스 복부에 마우스 한 마리당 0.2g을 골고루 도포한 후, 상기 실시예 2와 동일한 절차에 따라 옥사졸론을 도포하고, 100 mJ/㎠의 UVB을 조사한 뒤, 일정 간격마다 마우스의 귀가 부풀어 오르는 정도를 측정하였다. 본 발명에 따라 사용된 크림에는 주성분으로서
옥틸메톡시신나메이트 7.50 g, 3-(4-메틸벤질리덴) 캄파 3.00 g, 비스-에틸 헥실옥시페놀 메톡시페닐 트리아진 2.10 g, 산화티타늄(titanium oxide)/디메티콘(dimethicone)/수산화알루미늄(aluminum hydroxide)/스테아르산(stearic acid) 5.00 g, 유화제로서 세틸디메티콘 폴리올 2.50 g, 소르비탄 세스퀴올레이트 0.20 g, 피부 컨디셔닝제로서 탄소수 12-15개의 알킬기로 치환된 벤조에이트 2.00 g, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.00 g, 부틸렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트 2.00 g, 사이클로메티콘 5.00 g, 점도 조절제로서 이소도데칸 2.00 g, 보존제로서 메틸 파라벤 0.10 g, 프로필 파라벤 0.05 g, 이미다졸리디닐 우레아0.10 g, 보습제로서 베타인 3.00 g, 프로필렌글리콜 6.00 g, 글리세린 2.00 g, 유화 안정제로서 소듐클로라이드 1.00 g, 피부보호제로서 알란토인 0.10 g 및 착향제로소 조합 향료인 CREAM HP-38246 0.10 g을 함유하고 있으며 용제로서 정제수 53.25g을 첨가하여 전량을 100 g로 맞추었다.
도 3은 본 실시예에 따라 인동 추출물로 처리한 크림으로 도포한 마우스와 인동 추출물 없이 크림만으로 도포한 대조군의 귀가 부풀어 오른 정도를 측정한 그래프이며, 하기 표 2는 본 실시예에 따른 측정 결과를 표시하고 있다. 도 3 및 표 2에서 알 수 있는 것과 같이, 본 발명에 따라 제조된 인동 추출물은 자외선을 조사하지 않은 대조군만큼의 접촉성 과민반응이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 8일째 결과를 보게 되면 인동 0.6% 포함된 cream을 바를 경우 0.15% 포함된 cream보다 더 많이 귀가 부풀어 올랐고 11일째에는 자외선을 조사하지 않은 대조군만큼 부어올랐으며 14일째에는 인동 0.6%는 자외선을 조사하지 않은 대조군보다 더 귀가 부풀어 오르는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로 인동 추출물을 피부에 도포하였을 때 UVB 조사로 억제된 귀의 부풀어 오른 정도가 UVB를 조사하기 않은 컨트롤만큼 회복되어 자외선에 대한 보호 효과가 있는 것으로 확인되었다.
표 2. 자외선 조사로 유도되는 마우스의 귀 두께 회복(0.01㎜)
| UVB (100mJ/) | UVB 조사 후 경과(일) | |||
| 3 | 8 | 11 | 14 | |
| (-) | 203.3±5.8 | 483.3±11.5 | 520.0±40.0 | 733.3±35.1 |
| (+) | 203.3±5.8 | 380.0±10.0 | 443.3±35.1 | 653.3±68.1 |
| 인동추출물(0.6%) | 206.7±5.8 | 456.7±15.3 | 510.0±17.3 | 770.0±17.3 |
| 인동추출물(0.15%) | 210.0±10.0 | 426.7±20.8 | 510.0±10.0 | 726.7±25.2 |
실시예 4 : 세포계획사를 유도하는 자외선 강도 결정
본 실시예에서는 세포 주기 중 프로그래밍에 의한 세포계획사(apoptosis)로 간주되는 subG1기에 해당하는 세포수를 측정하였다. 세포의 세포주기 중 subG1은 세포내 DNA함량이 세포 휴지기인 G1보다 적은 상태를 나타내며 세포계획사에 의해 죽은 세포를 가리킨다. 따라서 세포계획사로 죽은 세포를 관찰하기 위해 DNA를 propidium iodide로 염색한 후 유세포분석기로 분석하여 각 세포주기에 해당하는 세포수를 측정하였다.
우선, 마우스의 수지상세포를 배양하기 위하여 C57BL/6 마우스를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 1㎖ 주사기를 이용하여 대퇴골(femur)안에 있는 골수를 분리하여 단일세포로 만들었다. 적혈구 용해 완충액(Tris-buffered ammonium chloride; 90㎖ of 0.16M NH4Cl, 10㎖ of 0.17M Tris, PH 7.2)을 처리하여 적혈구를 제거한 후, washing 용액으로 1,200 rpm에서 5분 동안 3회 원심분리하여 충분히 세척하고, 혈구계산반을 이용하여 세포수를 계산하였다.
골수세포를 수지상세포로 분화, 유도하기 위하여 재조합 마우스 GM-CSF(R&D, Minneapolis, USA, 1000 U/㎖)와 IL-4(R&D, 1000 U/㎖)와, 세포 배양에 필요한 항생제(antibiotic-antimycotic, Hyclone, Grand Island, NY, USA), FBS(Hyclone), 2-mercaptoethanol(2-ME, Sigma chemical), sodium biocarbonate(NaHCO3, Sigma chemical), ovalbumin(OVA, Sigma chemical), Motomycin C(MMC, Sigma chemical)가 첨가되어 있는 배지 RPMI 1640(Hyclone, FCS 10%)에 부유된 골수세포(1×106 개/5㎖/well)를 6-well micro-plate에서 배양하였다. 배양 4일 후 1㎖의 완전배지와 동량의 GM-CSF, IL-4(1,000u/㎖)를 첨가하고, 배양 5일째에 위 실시예 1에서 얻은 인동 물 추출물 100㎍/㎖로 처리한 다음, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 수거하여 실험을 진행하였다.
위와 같이 유도 배양하여 마우스 골수로부터 유도 배양된 수지상세포를 회수 하여 PBS에 현탁한 후, 동량의 세포(3×105)를 6-well culture plate에 넣고, 1200 rpm에서 3분(25℃)간 원심 침전하여 세포를 바닥에 가라앉힌 다음에 UVB 램프를 이용하여 24시간 동안 자외선을 조사하였다. 이때, 자외선의 강도는 UVB Solarmeter를 사용하여 1초에 1mJ/㎠의 에너지가 방출되도록 조절하였다. 본 실시예에서는 세포계획사를 유도하는 UVB의 강도를 확인할 수 있도록 자외선 강도를 3, 10, 30, 100, 300mJ/㎠의 강도로 조사하였다.
자외선 조사 후 24-well plate에 24시간 배양한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. Trypsin(Sigma, St. Louis, USA)을 처리하여 세포를 고정한 후, Ribonuclease A(Sigma, St. Louis, USA)로 처리하였다. Propidium iodide(416㎍/㎖)을 넣고 냉암소에서 2시간 염색한 후, 유세포분석기(COULTER, Epics XL, USA)로 분석하였다. 그 측정 결과가 도 4 및 하기 표 3에 표시되어 있다.
표 3. UVB 강도에 따른 수지상세포의 subG1 세포주기의 변화
| UVB (mJ/㎠) | 세포주기(%) | |||
| subG1 | G1 | S | G2/M | |
| (-) | 13.8 | 72.2 | 4.7 | 8.5 |
| 3 | 16.3 | 68.2 | 5.2 | 8.6 |
| 10 | 31.7 | 56.2 | 4.5 | 5.2 |
| 30 | 52.2 | 37.3 | 4.0 | 4.2 |
| 100 | 48.9 | 39.7 | 3.8 | 5.0 |
| 300 | 53.9 | 35.4 | 3.7 | 4.7 |
도 4 및 표 3에서 알 수 있듯이, 아무것도 처리하지 않은 수지상세포에 UVB를 3, 10, 30, 100, 300mJ/㎠로 조사한 실험군은 세포계획사로 죽은 세포를 나타내 는 subG1이 무처리 대조군 13.8%에 비해 16.3%, 32.1%, 52.8%, 49.6%, 54.7%로 증가하는 것을 관찰하였다. 따라서 다음 실험부터는 UVB의 강도를 30mJ/㎠로 하였다.
실시예 5 : 인동 추출물 처리에 따른 세포주기 변화 측정
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 얻어진 인동 추출물로 처리한 마우스에 일정 강도의 자외선을 조사한 뒤의 마우스의 수지상세포의 세포주기에 따른 세포수를 측정하였다. 우선, 인동 추출물을 배양된 마우스의 수지상세포에 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 이어서 배양된 수지상세포를 수거하여 얻어진 5×105개의 세포에 각각 30 mJ/㎠의 자외선을 조사한 후 24-well culture plate에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서 실시예 4와 동일한 절차에 따라 세포수를 측정하였다. 비교를 위하여 자외선에 노출시키지 않은 수지상세포와 인동 추출물로 처리하지 않고 자외선만을 노출시킨 수지상세포의 세포주기에 따른 세포수를 또한 측정하였다. 도 5는 본 실시예에 따라 인동 추출물로 처리하거나 처리하지 않은 마우스의 수지상세포의 세포주기에 따른 세포수 측정 결과를 측정한 그래프이고, 하기 표 4는 그 결과를 수치로 표시한 것이다. 도 5 및 표 4에서 알 수 있는 것과 같이, 자외선 30mJ/㎠을 조사한 실험군의 sub G1세포수가 47.2% 반면에 인동 추출물을 처리한 후 조사하였을 때 sub G1 세포 수는 31%로 sub G1 세포수가 줄어드는 것을 알 수 있다. 즉 자외선으로 유도되는 sub G1 세포수의 억제율이 45.5%로 나타났다. 이상의 결과 인동을 처리하였을 때 자외선에 의한 DNA 손상으로 발생하는 subG1 세포의 수가 감소하 는 것으로 나타나 DNA 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 생각된다.
표 4. UVB에 의하여 유도되는 subG1 세포에 대한 인동 추출물의 억제
| UVB (30mJ/㎠) | 세포 주기(%) | |||
| subG1 (% of inhibition) | G1 | S | G2/M | |
| (-) | 11.5(0) | 78.1 | 2.7 | 6.7 |
| (+) | 47.2(100) | 45.7 | 2.3 | 2.1 |
| 인동추출물 | 31(45.5) | 60.0 | 2.9 | 4.4 |
실시예 6 : 수지상세포의 세포막 변화
본 실시예에서는 인동 추출물로 처리한 마우스의 수지상세포에 자외선을 조사하였을 경우에 세포막 변화의 억제 정도를 측정하였다.
본 발명의 실시예 1에서 제조된 인동 물 추출물로 24시간 처리한 마우스의 수지상세포를 수거하여 인동 물 추출물로 24시간 처리한 수지상 세포를 수거하여 5×105개에 30mJ/cm2 자외선을 조사 한 후 24-well plate에 6시간 배양한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포막의 내부막에 존재하는 Phosphatidyl serine에 특이적으로 부착하는 Annexin V-FITC(pharmingen, San Diego, CA, USA)와 DNA를 염색하는 propidium iodide로 염색한 후, 유세포분석기(COULTER, Epics XL, USA)로 분석하였다.
세포에 UVB를 조사하게 되면 세포계획사(apoptosis)가 일어나는데, 이러한 세포의 죽음은 세포의 형태적 변화를 유도한다. 세포계획사의 형태적 변화 중에서 초기에 일어나는 것은 세포막이 부분적으로 손상되어 세포의 내막에만 존재하는 phosphatidyl-serine 등이 세포의 외막으로 노출되는 것으로 초기 세포계획사(early apoptosis)라고 한다. 그 후 계속적으로 세포계획사가 진행되면 세포막이 완전히 파괴되어 세포 외부의 물질이 자유롭게 안으로 들어갈 수 있는데 이를 후기 세포계획사(late apoptosis)라고 한다. 따라서 UVB를 조사한 수지상세포의 초기 세포계획사 정도를 알아보기 위하여 phosphatidyl-serine에 특이적으로 결합하는 단백질인 AnnexinV-FITC로 염색하여 유세포분석기로 관찰하였다.
도 6은 본 실시예에 따라 인동 추출물로 처리하거나 처리하지 않은 마우스의 수지상세포의 세포막 변화 정도를 측정한 결과이고, 하기 표 5는 이를 수치화한 값을 표시하고 있다. 도 6 및 표 5에서 알 수 있는 것과 같이 UVB를 조사한 마우스의 수지상세포에서는 자외선에 의하여 초기 세포계획사가 일어났으며, 본 발명에 따른 인동 추출물에 의하여 초기 세포계획사가 31% 정도 억제되어 자외선에 의한 세포막의 변화를 감소시키는 방호효과가 있는 것으로 생각된다.
표 5. 자외선에 의한 세포막 변이에 대한 인동추출물의 억제 효과
| UVB (100mJ/㎠) | 초기 세포계획사 (% of inhibition) | 후기 세포계획사 |
| (-) | 28.4(0) | 8.8 |
| (+) | 42.4(100) | 12.5 |
| 인동 추출물 | 38.0(31.4) | 11.6 |
실시예 7 : 인동 추출물 처리에 따른 미토콘드리아막 전위차 변화 측정
본 실시예에서는 인동 추출물로 처리한 마우스의 수지상세포에 자외선을 조사한 경우에 세포 내부의 미토콘드리아막의 전위차(Δψm) 변화를 측정하였다.
본 발명의 실시예에서 제조된 인동 물 추출물로 24시간 처리한 마우스의 수지상 세포를 수거하여 1×106개에 30mJ/cm2 자외선을 조사 한 후 24-well plate에 6시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양하였다. 미토콘드리아막의 전위차 변화를 JC-1 assay kit(Eugene, OR, USA)를 이용하여 관찰하였다. 즉 수지상세포 (1×106개)를 인산완충용액 1㎖에 현탁한 후, 50μM이 되도록 carbonyl cyanide-3-chlorophenyl hydrazone(CCCP, Eugene)를 첨가하여 37℃에서 5분 동안 처리하여 염색하였다.
5,5'6,6'-tetrachloro-1,1'-3,3'-tetraethylbenaimidazolylcarbocyanine (JC-1, Eugene)의 최종 농도가 2μM이 되도록 처리한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 15~30분 동안 반응시켰다. 그 다음에 이를 원심 침전하여 세포를 분리한 후, 인산완충용액에 현탁하여 유세포분석기(COULTER, Epics XL, USA)로 분석하였다.
UVB와 같은 자극에 의해 세포에 손상이 생기면, 미토콘드리아막은 탈분극(depolarization)되어 세포계획사를 유도한다. 미토콘드리아의 변화를 양이온성 염료인 JC-1로 관찰하였는데, JC-1은 미토콘드리아의 막 투과성이 높을 경우 red fluorescence(590nm)에서 나타나지만, 막 투과성이 낮을 경우 green fluorescence(525nm)에서 관찰된다. 즉 자극에 의해 미토콘드리아의 막의 탈분극이 일어나고, 이로 인해 막 투과성이 낮아지게 되면 red/green fluorescence의 비율이 감소하게 된다. 도 7은 본 실시예에 따른 미토콘드리아막의 탈분극으로 인한 막 투 과성 저하를 알아보기 위하여 JC-1의 적색 형광과 녹색 형광의 발생 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 하기 표 6은 본 실시예에 따른 미토콘드리아막의 전위 변화 비율과 인동 추출물에 의한 억제율을 표시하고 있다. 도 7 및 표 6에서 알 수 있는 것과 같이, UVB로 유도되는 미토콘드리아의 막 투과성 변화를 관찰한 결과, UVB를 조사하지 않은 무처리 대조군의 경우 세포계획사apoptosis가 18.7%로 나타난 반면, UVB만을 조사한 대조군의 경우 41%로 증가하였다. 인동 추출물을 처리한 실험군은 22.2%로 나타났고, UVB에 유도되는 미토콘드리아막의 투과성 변화가 84%이상으로 억제하는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 인동 추출물은 자외선에 의한 미토콘드리아막의 전위차 변화를 감소시키는 보호효과가 있는 것으로 생각된다.
표 6. 자외선에 의한 미토콘드리아막 전위 변화에 대한 인동 추출물의 억제
| UVB (100mj/cm2) | 미토콘드리아 막 전위 (% of inhibition) |
| (-) | 18.7 (0) |
| (+) | 41 (100) |
| 인동추출물 | 22.2 (84.3) |
실시예
8 :
인동
추출물 처리에 따른 염색체 응축 측정
본 실시예에서는 인동 추출물로 처리한 마우스 수지상세포에 자외선을 조사하였을 경우에 세포 내의 염색체 응축 정도의 변화를 측정하였다.
본 발명의 실시예에 따라 제조된 인동 추출물로 24시간 처리한 마우스의 수지상세포를 수거하여 5×105개를 30mJ/cm2 자외선을 조사 한 후 6-well plate에 6시 간 배양한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. Hoechst 33342(10㎍/㎖)로 형광 염색한 후 형광현미경(OLYMPUS BX 50, JAPAN)으로 관찰하였다. 인산완충용액을 이용하여 Hoechst 33342를 제거한 후, 광학현미경(Olympus BX50, Japan)에 장착된 SPOT digital camera(Nicon, JP)를 이용하여 핵 내 염색체의 응축 정도를 관찰하고 사진 촬영을 하였다. UVB로 세포계획사가 유되되면 또 다른 세포내 변화가 일어나는데 우선 핵 내의 염색체가 응집하여 세포전체가 위축하면서 단편화하여 apoptotic body를 형성하게 된다. 이러한 현상은 염색체를 특이적으로 염색하는 시약인 Hoechst33342를 이용하면 세포를 염색하고 형광현미경으로 관찰하면 육안으로 관찰할 수 있다.
도 8은 본 실시예에 따라 인동 추출물로 처리하거나 처리하지 않은 마우스의 수지상세포에 UVB를 조사한 뒤, 각 수지상세포에서의 DNA 응축 정도를 촬영한 사진이다. 도 8에서 알 수 있는 것처럼, UVB에 의해 세포계획사가 유도된 실험군은 정상적인 세포의 형태를 보이는 무처리 대조군에 비해 대부분의 세포가 apoptotic body를 형성하는 것으로 나타났다. 인동 추출물을 처리한 경우는 UVB만 조사한 대조군보다 apoptotic body를 형성하는 세포의 수가 감소하는 것으로 나타났다. 이상의 결과 인동 추출물을 처리하였을 때 자외선에 의한 염색체가 응축되는 세포의 수가 감소하는 것으로 나타나 염색체 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 생각된다.
실시예 9 : 인동 추출물의 사이토카인 분비 유도 측정
본 실시예에서는 본 발명에 따른 인동 추출물의 마우스의 수지상세포에 대한 사이토카인 분비 정도를 측정하였다.
마우스의 수지상세포를 배양하고 배양 5일째에 인동 물 추출물 100㎍/㎖로 처리한 다음, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 상층액을 수거하여 상층액에 포함된 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α의 양은 효소항체법(enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA)을 이용하여 측정하였다. 즉, plate-bottom micro-well에 goat anti-mouse cytokine 1차 항체(2㎍/㎖)를 coating buffer(0.1 M NaHCO3, pH 8.2)에 희석하여 50㎕/well로 분주하고 4℃에서 하룻밤 둔 다음, washing 용액(0.05% Tween 20/PBS)으로 세척하였다. 세척된 micro-well은 10% FBS가 첨가된 PBS로 2시간 동안 실온에서 blocking 한 다음, 다시 washing 용액으로 세척하였다. 실험실에서 채취한 배양 상층액을 적당한 비율로 희석한 후 각 well에 분주하여 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 다음, biotin이 부착된 2차 항체(1㎍/㎖) 100㎕/well와 일정시간 실온에서 반응시킨 후, avidin-peroxidase(2.5㎍/㎖) 100㎕/well을 첨가하였다. 마지막으로 기질(2,2'-azino-bis, 0.1M citritic acid, H2O2)을 첨가하여 발색시킨 다음, Micro-plate reader를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α의 농도는 표준곡선을 이용하여 계산하였고, 이때 각 사이토카인의 측정 한계치는 10pg/㎖이었다. 하기 표 7은 본 실시예에 따라 측정된 사이토카인의 분비 측정 결과를 표시한 것이다.
사이토카인(cytokine)은 신체에서 다양한 세포에 의해서 유리되는 작은 단백 이며, 대개 활성화 자극에 의해 유리되고, 특별한 수용체와 결합하면서 반응을 유도한다. 그것들은 자가분비(autocrine)방법의 형태로 싸이토카인을 분비하는 세포의 행동에 영향을 미치거나, 측분비(paracrine)방법의 형태로 인접세포의 행동에 영향을 미칠 수 있다. 일부 싸이토카인은 비록 순환계로 들어가는 능력과 반감기에 따라 영향을 받으나 내분비 방법으로 행동하여 멀리 떨어져 있는 세포의 행동에 영향을 미칠 수 있을 만큼 안정적이다. 표 7에서 알 수 있는 것과 같이, 인동 추출물을 100㎍/㎖씩 처리하였을 때, IL-12, IL-6, TNF-α, IFN-γ의 cytokine 분비가 유도되었으며, 특히 무처리 대조군에 비해 많은 cytokine을 분비가 되었다. 인동 추출물은 IL-12에서 7배, IL-6에서 16배, TNF-α에서는 19배 그리고 IL-1β에서는 15배 이상 많은 양이 분비되었다. 이상의 결과로, 수지상 세포는 인동에 의해 여러 cytokine의 분비를 유도하는 것으로 생각된다.
표 7. 인동 추출물의 사이토카인 분비 측정
| 사이토카인 (cytokines) | 농도(ng/㎖) | |
| (-) | 인동 추출물 | |
| IL-1β | < 0.01 | 0.15±0.00 |
| IL-2 | <0.01 | < 0.01 |
| IL-6 | 1.43±0.06 | 22.78±0.12 |
| IL-7 | < 0.01 | < 0.01 |
| IL-10 | < 0.01 | < 0.01 |
| IL-12 | 0.06±0.01 | 0.47±0.04 |
| IFN-γ | 1.54±0.14 | 4.83±0.00 |
| TNF-α | 1.40±0.00 | 27.12±0.90 |
실시예 10 : 인동 추출물의 세포표면분자 유도 측정
본 실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 인동 추출물의 세포표면분자의 발현 을 유도하는 정도를 측정하였다.
수지상세포를 활성화시키는 물질로 알려진 세균의 LPS와 인동 물 추출물(100, 10, 1㎍/㎖)을 배양 5일째의 수지상세포에 각각 처리하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 수지상세포(5×105개)를 수거하여 anti-CD16/CD32(FcγⅢ/ⅡReceptor)mAb로 4℃에서 30분 동안 blocking하고 washing 용액(1% FBS·0.1% NaN3/PBS)으로 세척하였다. 그리고 PE-conjugated anti-CD40, anti-MHC Ⅱ, anti-CD80, anti-CD86 mAb로 4℃에서 30분 동안 염색하였고, washing 용액으로 세척한 후, FITC-conjugated anti-CD11c mAb로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 염색된 세포는 다시 washing 용액으로 세척한 후, 인산완충용액에 현탁하여 유세포분석기로 분석하였다. 도 9a 내지 도 9e는 각각 본 실시예에 따라 세포표면분자를 측정한 그래프로서, 도 9a는 아무런 처리를 하지 않은 컨트롤, 도 9b는 LPS를 사용한 대조군, 도 9c 내지 도 9e는 인동 추출물을 각각 100, 10, 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 마우스의 수지상세포에서의 세포표면분자의 발현 정도를 측정한 것이다. 도면에서 X축은 CD11c의 농도를 나타내고 있다. 한편, 하기 표 8은 본 실시예에 따른 측정 결과를 수치로 표시한 것이다.
수지상세포는 조혈모세포에서 분화하며 항원을 포식한 후 이를 가공·처리하여 표면에 제시하는 능력이 뛰어나다. 또한 림프구에 활성신호를 전달하는 다양한 공동자극분자(co-stimulatory molecule)와 세포간의 접촉에 관여하는 여러 종류의 부착분자를 표면에 많이 발현하고 있어 다른 면역세포들과 구분되는 전문적인 항원 제시세포로 알려져 있다. 표 8에서 알 수 있는 것처럼, 인동 추출물 1, 10, 100㎍/㎖을 처리한 실험군에서는 세포표면분자가 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히 인동 100㎍/㎖에서 CD11c/MHCⅡ, CD11c/CD80, CD11c/CD86은 22.4%, 15.2%, 18.7%으로 이미 수지상세포의 성숙을 자극하는 물질로 알려진 LPS 처리군의 22.8%, 15.0%, 17.3%와 유사한 정도로 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. 이상의 결과로, 인동 추출물은 수지상세포의 공동자극분자인 MHC Ⅱ, CD40, CD80, CD86 발현을 증가시킨다는 점을 또한 확인하였다.
표 8. 세포표면분자의 발현에 대한 인동 추출물의 효과
| 조건 | 농도 (㎍/㎖) | CD11c | |||
| CD40 | CD80 | CD86 | MHC class Ⅱ | ||
| (-) | 0 | 5.9 | 16.0 | 8.0 | 11.8 |
| LPS | 1 | 24.9 | 17.3 | 15.0 | 22.8 |
| 인동 추출물 | 1 | 6.9 | 17.1 | 8.7 | 12.0 |
| 10 | 9.2 | 16.6 | 10.2 | 15.9 | |
| 100 | 16.4 | 18.7 | 15.2 | 22.4 | |
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 기술하였으나, 이는 어디까지나 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고해 낼 수 있을 것이다. 그러나 그와 같은 변형과 변경은 본 발명의 기본정신을 훼손하지 아니하는 범위 내에서 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 후술하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.
본 발명에 따라 얻어진 인동초 추출물에는 자외선의 노출로 인하여 야기될 수 있는 각종 세포 변이를 억제 또는 방지할 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따라 제조된 인동 추출물은 접촉성 과민반응의 억제를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 세포계획사, DNA 변이 등은 물론이고 사이토카인의 분비 및 세포표면분자의 발현을 촉진하였다.
따라서, 본 발명은 인동초로부터 소정의 처리를 통하여 세포 변이를 억제, 방지 기능을 갖는 추출물을 제조할 수 있음은 물론이고, 이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장품, 각종 건강식품 및 의약적 제재로도 응용될 수 있다.
Claims (10)
- 인동을 절단하는 단계와;상기 절단된 인동에 물을 배합하여 열탕 추출하는 단계와;상기 열탕 추출에 의하여 얻어진 현탁액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 회수하고, 상기 회수된 상층액을 아세톤으로 처리한 뒤 원심분리하여 침전물을 얻는 단계와;상기 얻어진 침전물을 투석하여 추출물을 회수하고, 상기 회수된 추출물을 원심분리하여 상층액을 회수한 뒤, 회수된 상층액을 여과하는 단계를 포함하는 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 인동 분획물을 추출하는 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,상기 여과 단계에 의하여 얻어진 인동 분획물을 건조시키는 단계를 더욱 포함하는 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 인동 분획물을 추출하는 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 여과 단계에 의하여 얻어진 인동 분획물을 감압, 농축한 상태에서 동결 건조시키는 단계를 더욱 포함하는 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 인동 분획물을 추출하는 방법.
- 절단된 인동을 물로 열탕 처리하여 얻어진 현탁액을 원심분리하고, 원심분리에 의하여 얻어진 상층액을 아세톤으로 처리한 뒤, 원심분리하여 얻어진 침전물을 투석하여 추출물을 회수하고, 상기 회수된 추출물을 원심분리하여 상층액을 회수한 뒤, 회수된 상층액을 여과하여 얻어지는 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 인동 추출물.
- 제 5항에 있어서,상기 인동 추출물은 자외선에 의한 세포계획사를 억제하는 효과를 갖는 인동 추출물.
- 제 5항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인동 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 접촉성 과민 반응 억제를 방지할 수 있는 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 인동 추출물은 전체 조성물 총량을 기준으로 0.05 ~ 1.0 중량%의 비율로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 인동 추출물은 전체 조성물 총량을 기준으로 1 ~ 1000㎍/㎖의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 조성물은 크림, 로션, 겔, 파우더, 졸, 고형체, 나노스피어 또는 마이크로스피어 형태의 중합체의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
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