KR100905066B1

KR100905066B1 - 마이코플라즈마 뉴모니아성 폐렴 진단을 위한 재조합단백질 및 이를 이용한 진단 키트

Info

Publication number: KR100905066B1
Application number: KR1020070125055A
Authority: KR
Inventors: 정점규; 조남정; 박종진; 정광면; 유재철; 이상오; 오하나; 박선옥
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2007-12-04
Filing date: 2007-12-04
Publication date: 2009-06-30
Anticipated expiration: 2027-12-04
Also published as: KR20090058327A; WO2009072708A1

Abstract

본 발명은 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체와 특이적으로 반응하는 재조합 단백질, 이를 포함하는 마이코플라즈마 뉴모니아 진단용 조성물, 상기 조성물을 이용한 마이코플라즈마 뉴모니아 진단키트 및 상기 진단키트를 이용하여 마이코플라즈마성 폐렴을 진단하는 방법에 관한 것이다.

마이코플라즈마 뉴모니아, 마이코플라즈마성 폐렴, 진단키트

Description

마이코플라즈마 뉴모니아성 폐렴 진단을 위한 재조합 단백질 및 이를 이용한 진단 키트 {The recombinant proteins for the diagnosis of diseases infected from Mycoplasma pneumoniae and the diagnostic kits comprising the same}

본 발명은 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체들과 특이적으로 반응하는 재조합 단백질들과 이를 이용하여 마이코플라즈마 뉴모니아의 감염 및 마이코플라즈마성 폐렴을 신속하게 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기의 재조합 단백질에 대한 항체를 생산하는 융합세포에 관한 발명이다.

폐렴의 경우, 그 원인에 따라 바이러스성과 마이코플라즈마성으로 구별할 수 있다. 바이러스성 폐렴의 경우는 호흡기 합포체 바이러스 (RSV, respiratory syncytial virus)와 아데노바이러스 (adenovirus), 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus)가 흔한 원인이며, 학령기 소아에서는 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)가 흔한 원인이다.

한편, 사람에서 분리되는 16가지의 마이코플라즈마 중에서 호흡기 감염을 일으키는 데에는 마이코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)가 주된 원인이며, 그 외에는 우레아플라즈마 아레리티쿰 (Ureaplasma urealyticum)이나 마이코플라즈마 호미니스 (Mycoplasma hominis)에 의해 비뇨생식기 감염과 주산기 감염이 발생하는 것으로 알려져 있다.

마이코플라즈마 감염의 20%는 증상이 없으며 75% 정도에서는 기관지염, 인두염 등 경미한 호흡기 감염을 일으키며, 3∼10% 정도에서는 폐렴과 같은 심한 감염을 일으킨다. 소아에서의 경우, 유행 시에는 달라지지만 폐렴 원인의 10∼40%를 마이코플라즈마 뉴모니아의 감염이 차지한다. 감염은 일년 내내 일어날 수 있지만 늦여름이나 초가을에 제일 흔하며, 발생률은 매년 다르지만 대개 4년마다 유행이 일어난다고 알려져 있다.

마이코플라즈마 뉴모니아는 세포벽이 없기 때문에 베타락탐계 항생제에는 잘 치료되지 않는다. 그러므로 반드시 단백질이나 DNA 합성을 저해하는 항생제인 마크로리드 (macrolide), 퀴놀론 (quinolone), 혹은 테트라사이클린 (tetracycline)으로 치료를 해야 한다. 마이코플라즈마 뉴모니아는 소아 호흡기 감염의 가장 흔한 원인 중 하나이지만 현재까지 진단의 어려움 때문에 가장 적게 진단되는 질환이라고 할 수도 있다. 이와 같은 이유로 최근까지도 마이코플라즈마 뉴모니아 감염에 의한 폐렴을 제대로 진단하지 못하여 다른 종류의 항생제를 과다 투여하여 부작용 을 초래하는 경우도 종종 있는 실정이다.

현재까지 알려진 마이코플라즈마 뉴모니아 감염의 표준 진단방법은 배양을 통한 균의 동정, 혈청학적 검사, 그리고, 중합효소반응(PCR)을 통한 유전자 검사가 있다. 배양을 통한 균의 동정의 경우, 균을 동정하는데 7∼21일이 걸리며 40∼90%에서만 배양되기 때문에 임상 현장에서 실제적으로 이용하는데 한계가 있다. 그리고 마이코플라즈마 뉴모니아 감염의 혈청학적 진단은 가장 널리 이용되고 있는 방법이지만, 이들 보체결합법(CF test, complement fixation test)은 시간이 오래 걸리고 낮은 민감도를 나타내는 등 문제가 있어 최근에는 젤라틴 입자응집법 (예, Fujirebio 사의 SeroDia MycoII)이나 효소면역측정법 (ELISA; 예, Bio-Rad 사의 Platelia Myco IgM/IgG)이 보편적으로 사용되고 있다. 하지만, 이들 두 면역측정법들 역시 사용 방법이 복잡하며, 검사 시간이 3~4 시간으로 오래 걸리고, 고가의 장비를 사용하여야 하므로 현장에서 검사를 실시할 수 없는 단점이 있다. 그리고, 이들 입자응집법과 효소면역측정법 사이에 결과 일치율이 낮아서 일선에서 어떤 방법을 바탕으로 진단결과를 내려야하는지에 대해서도 혼선을 빚고 있는 실정이다. 이와 같은 문제들 때문에 국내외에서 혈액을 이용하여 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체를 효과적으로 검사할 수 있는 현장검사(POCT; point-of-care testing) 키트들을 개발하려는 노력들이 활발하게 진행되고 있다.

효과적인 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체 검사를 위해서는 항원성이 높고 동종간에 진화적으로 잘 보존된 단백질이 확보되어야 한다. 마이코플라즈마 뉴모니아의 경우 사람의 호흡기 표피세포에 부착하여 서식하며, 이로 인한 질병을 수반하는데, 이들 흡착에는 어드헤신 피1 (Adhesin P1; 170 kDa), 어드헤신 피30 (Adhesin P30; 30 kDa), 어드헤신 피40 (Adhesin P40; 40 kDa), 그리고 어드헤신 피90 (Adhesin P90; 90 kDa) 등이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이들 중에서 어드헤신 피1 (adhesin P1)이 사람과 동물에게서 강한 항원성을 보이는 것으로 알려져 있다. 하지만, 이 어드헤신 피1 (Adhesin P1) 단백질은 분자량이 매우 크고, 유전암호 특성상 대장균에서는 정지 코돈으로 인지되는 21개의 UGA 코돈들을 다수 포함하고 있기 때문에 대장균에서도 재조합 단백질을 생산하는 것이 어려운 실정이다. 이처럼 항원성이 높은 재조합 단백질을 생산하는 것이 어렵기 때문에 현재 상용화 되어 있는 진단 키트들은 배양된 마이코플라즈마 뉴모니아의 용출액을 그대로 생산에 이용하고 있어 제품의 특이도가 낮은 문제점을 갖고 있다.

이에 본 발명자들은 마이코플라즈마 뉴모니아 항원성이 높을 것으로 예상되는 어드헤신 피1 (Adhesin P1)의 유전자 중 일부를 클로닝하여 재조합 단백질을 제조하고, 이에 대한 항체를 생성하는 융합세포를 만들었으며, 상기 항체를 이용하여, 마이코플라즈마 뉴모니아에 대해 높은 특이도를 가지는 마이코플라즈마성 폐렴 진단 키트를 제작하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 마이코플라즈마 뉴모니아의 어드헤신 피1 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 어드헤신 피1 재조합 단백질에 대한 단클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기한 융합세포에서 생산된 항체를 포함하는 마이코플라즈마 뉴모니아 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 마이코플라즈마 뉴모니아 진단키트를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 항원성이 높은 마이코플라즈마 뉴모니아 특이 항원인 어드헤신 피1 재조합 단백질을 제공한다.

어드헤신 피1(adhesin P1) 단백질은 사람 및 동물에게서 강한 항원성을 가지고 있으나, 분자량이 매우 크고, 유전암호 특성상 대장균에서는 정지 코돈으로 인지되는 21개의 UGA 코돈들을 다수 포함하고 있다. 이에, 본 발명자들은 1) UGA 코돈을 포함하지 않아 단백질 발현 시 끊김 현상 (truncation)이 없고, 2) 에피토프 (epitope) 예측 프로그램으로부터 많은 에피토프를 포함하며 강한 항원성을 나타내며, 3) 등전하 (pI)가 산성이고, 평균 소수성 값이 0이하이어서 재조합 단백질이 수용성으로 발현이 되는 부위를 선정하였다. 구체적으로, 1) 하바드 대학에서 개발한 HLA 펩타이드 결합 예측 프로그램 (HLA Peptide Binding Prediction Program, 미국)으로부터 최소 20 개 이상의 MHC 펩타이드 결합 모티프 (motif)를 포함하며, 2) 스위스 생물정보학 연구소 (Swiss Institute of Bioinformatics, 스위스)에서 개발한 ExPASy 시스템을 이용하여 분자량이 38.24 kDa이고, pI가 4.72이며, 3) SOSUI 시스템 (나고야 대학, 일본)으로부터 트랜스멤브레인 부위 (transmembrane domain)가 없으며 평균 소수성 (hydrophobicity) 치가 -0.535인 부위를 선정하였다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 이의 구체적인 염기서열은 서열번호 2로 나타내었다.

상기 재조합 단백질의 구체적인 제조방법은 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍을 이용하여 증폭한 후, 이 증폭된 유전자를 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝하였다. 상기 어드헤신 피1의 재조합 단백질의 발현은 pGEX 발현시스템 (GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴)을 이용하였다. 즉, pGEX-4T-1 발현벡터로 어드헤신 피1의 유전자를 서브클로닝하고, 이 재조합 플라스미드로서 대장균 BL21(DE3)을 형질 전환하여 재조합 어드헤신 피1을 생산하는 숙주세포를 제작하였다. 형질 전환된 대장균에 1 mM 농도의 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 처리하여 재조합 어드헤신 피1 단백질을 대량 발현시키고 이를 GSH-결합 세파로스 (Sepharose)를 이용한 친화크로마토그래피를 수행하여 64.0kDa의 순수한 재조합 어드헤신 피1 단백질을 얻었다 (도 3).

본 발명의 또 하나의 양태로서, 상기 어드헤신 피1 재조합 단백질에 대한 단클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제공한다.

본원의 바람직한 실시예에서는, 상기의 방법으로 얻어진 어드헤신 피1 재조합 단백질을 생쥐에 면역화하여 얻은 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 융합세포주를 제조하였다. 우선, 상기의 정제된 어드헤신 피1 재조합 단백질을 6-8주령 생쥐의 복강에 주사하여 면역화시키고, 비장을 적출하여 단일세포화 한 후, 골수종세포와 반응시켜 융합세포를 만든다. 이렇게 만든 융합세포를 안정한 단클론 세포주가 얻어질때 까지 클로닝을 반복하여 단클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하였다. 이렇게 제조된 융합세포주는 2007년 11월 15일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 11242BP으로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 진단 키트의 생산에 사용되는 마이코플라즈마의 어드헤신 피1에 특이적인 신규한 단클론 항체들을 제공한다.

본원에 사용되는 용어, “단클론 항체”는 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 결정기(epitope)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론 항 체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또다른 장점을 갖는다. 상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Mislstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991 등 참조) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 예에서는, 상기의 방법으로 얻어진 융합세포주를 생후 6-8주된 생쥐의 복강에 주사하여 면역화하고, 복수가 차면 이를 채취하였다. 이로부터 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 단클론 항체를 정제하였다. 간략히 설명하자면, 채취한 복수에 황산 암모늄을 첨가하고 원심분리하여 항체를 분리하고, 투석한 후, 컬럼을 이용하여 정제하였다. 상기 방법에 의하여 제조된 단클론 항체는 단클론 항체 2G6D7이다.

상기의 방법으로 정제된 항체는 진단키트의 제조에 사용된다. 구체적으로는, 키트의 스트립 부분에는 검체의 결과 확인을 위한 검사선(test line, T)과 검사의 유효성을 확인하는 대조선(control line, C) 부분이 있는데, 검사선에는 단백질 A (Protein A)를, 그리고 대조선 위치에는 상기의 정제된 어드헤신 피1 단클론 항체를 각각 분주하고 항체가 니트로셀룰로오스 멤브레인에 완전히 부동화되도록 한다.

상기의 정제된 단클론 항체는 다른 한편으로는 마이코플라즈마 뉴모니아의 항원을 직접 검출하는 데에 응용이 될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는 마이코플라즈마 뉴모니아 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 양태로서, 상기한 융합세포에서 생산된 단클론 항체를 이용하여 마이코플라즈마 뉴모니아 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 진단 키트에서, 항원-항체 복합체는 색채입자결합법으로 검출하며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 본 발명에서는 바람직하게 금 콜로이드를 이용한다.

또한, 본 발명의 상기 진단 키트에서, 항원-항체 복합체와 결합하는 포획체 (capture)로는 단백질 A (Protein A) 이외에 단백질 G (Protein G) 또는 항 사람 면역글로불린 (anti-human IgG)를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시에서는 상기 포획체로서 단백질 A (Protein A)를 이용하였다.

본 발명의 진단 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아 니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. 본 발명의 면역크로마토그래피법을 이용한 마이코플라즈마 진단 키트에 있어 보다 상세하게는 표면에 두 개의 눈에 보이지 않는 선이 그어져 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인과 재조합 단백질-금 축합체가 건조 상태로 보관되어 있는 유리섬유 패드의 두 가지 주요 부분으로 구성되어 있다. 상기 니트로셀룰로오스 멤브레인에 눈에 보이지 않는 선에는 서로 다른 두 가지 단백질이 고정화 되어 있다. 구체적으로 아래쪽에 있는 검사선 (test line, T)은 단백질 A (Protein A)를, 위쪽의 대조선(control line, C)에는 항 어드헤신 피1 단클론 항체가 고정되어 있다. 유리섬유 패드에는 재조합 어드헤신 피1 단백질을 금입자에 축합(conjugation)시킨 항원-금 축합체가 유리섬유 패드에 흡수된 후 건조되어 있다. 이렇게 구성되어 있는 키트의 검체 적하부에 검체를 가하면 유리섬유 패드에 건조 상태로 보관되어 있는 항원-금 축합체가 수화되고 검체 중의 항체와 결합하면서 동시에 모세관 현상에 의하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 있는 미세구멍을 통하여 이동한다. 이어, 상기 보이지 않는 선에 고정되어 있는 단백질 A (Protein A)가 항원-금 축합체에 결합된 항체과 반응하면서 항원-금 축합체가 띠고 있는 붉은 색 때문에 눈에 보이는 붉은 선으로 나타나게 된다. 또한, 위쪽 선에 고정되어 있는 항 어드헤신 피1 단클론 항체는 반응을 하지 않고 검사선 부위를 지나온 항원-금 축합체와 반응할 수 있으므로 매 검사마다 반드시 나타나고, 이것으로 검사가 적절 하게 수행되었는지를 확인할 수 있다. 즉, 마이코플라즈마에 대한 항체가 있으면 그 키트의 검사선과 대조선이 동시에 나타나고, 이에 대한 항체가 없으면 검사선은 나타나지 않고 대조선만 나타난다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 마이코플라즈마에 대한 사람 면역글로불린 M (human IgM)과 사람 면역글로불린 G (human IgG)를 구별하여 검출할 수 있다. 보다 상세하게는 검사선1에는 항 사람 면역글로불린 G를, 검사선2에는 항 사람 면역글로불린 M을, 그리고 대조선에는 항 어드헤신 피1 단클론 항체를 각각 고정화시킨다. 그 후, 검체를 전개시키면, 금 축합패드에서 검체내의 항 어드헤신 피1 항체가 항원-금 축합체와 결합을 하게 되며, 이 항체가 IgG이면 검사선1과 반응을, 이 항체가 IgM이면 검사선2와 반응을 하게 된다. 그 결과, 검체 내에 항 어드헤신 피1에 대한 IgG가 존재하면 검사선1에서 붉은 색의 띠가 형성되며, 검체 내에 항 어드헤신 피1에 대한 IgM이 존재하면 검사선2에서 띠가 형성된다.

본 발명의 진단 키트를 이용한 마이코플라즈마성 폐렴 진단의 민감도 및 특이도는 시판되고 있는 진단 키트(예, SeroDia Myco II 키트(Fujirebio사, 일본) 등)와 비교한 결과 90% 이상의 민감도 및 특이도가 있었으며, 종래 진단 키트에 비하여 신속하고 간편하게 진단할 수 있었다(실시예 7 참조). 따라서, 본 발명의 진단 키트는 폐흡충증의 진단에 간편하고 쉽게 이용할 수 있을 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 진단 키트를 이용하여 마이코플라즈마 를 진단하는 방법을 제공한다.

구체적으로는, 생물학적 시료를 본 발명의 상기 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하여 흡수되도록 방치한 후, 반응이 종료된 진단 키트의 검사선의 유무에 따라 마이코플라즈마 뉴모니아에 감염된 것으로 추정되는 채취된 혈액 (혈청 또는 혈장)을 상기의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하여 흡수되도록 하여 방치한 후, 반응이 종료된 진단 키트의 검사선의 유무에 따라 마이코플라즈마 뉴모니아 감염 여부를 판단하는 방법이다.

본원에서 사용한 용어, “생물학적 시료”는 폐흡충증이 의심되거나 검사하려는 인간을 포함한 포유동물의 혈청, 혈장 등을 말하며, 본 발명에서는 편의상 “검체” 또는 “샘플”이라고 지칭하기도 한다. 상기 생물학적 시료는 본 발명의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않고 사용할 수 있다.

종래의 마이코플라즈마 뉴모니아 진단법인 젤라틴 입자응집법이나 효소면역측정법보다 검사 시간이 빠르며, 사용법이 간편하여, 마이코플라즈마 감염을 효과적으로 진단할 수 있다. 아울러 오진에 의한 항생제의 오남용을 줄일 수 있으며 보 다 향상된 치료 효과를 얻을 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 마이코플라즈마 뉴모니아의 어드헤신 피1의 유전자 클로닝, 발현, 그리고 정제

1-1. 마이코플라즈마 뉴모니아의 어드헤신 피1의 유전자의 클로닝

마이코플라즈마 뉴모니아의 지놈 DNA(genomic DNA)은 어드밴스드 바이오테크놀러지 사 (Advanced Biotechnologies Inc, 미국)으로부터 직접 구매를 하여 확보하였다. 이 지놈 DNA로부터 서열 번호 2로 나타내는 1053 bp 크기의 어드헤신 피1 유전자 일부를 증폭하였다. 즉, 준비된 마이코플라즈마 뉴모니아 DNA를 주형으로 하여, 어드헤신 피1 유전자 중에서 1) UGA 코돈을 포함하지 않아 단백질 발현 시 끊김 현상 (truncation)이 없고, 2) 에피토프 (epitope) 예측 프로그램으로부터 많은 에피토프를 포함하며 강한 항원성을 나타내며, 3) 등전하 (pI)가 산성이고, 평균 소수성 값이 0이하이어서 재조합 단백질이 수용성으로 발현이 되는 부위를 선정하였다. 어드헤신 피1 유전자의 일부인 1053 bp 크기에 해당하는 부분을 서열 번 호 3 및 4로 표시된 2종의 프라이머, 즉 AP1F(서열번호 3)와 AP1R(서열번호 4)을 이용하여 증폭시킨 다음, 이를 pGEM-Easy T 벡터 (Promega 사, 미국)로 클로닝을 하였다. 이렇게 클로닝된 유전자의 염기서열을 (주)바이오니아 (청원, 한국)에 의뢰하여 분석하였다. 그 결과, 초기의 1053 bp의 어드헤신 피 유전자 서열과 동일한 서열임을 확인하였고, 이 결과를 GeneBank에 있는 마이코플라즈마 뉴모니아의 염기서열 (GeneBank Accession Number: AF290001)과 비교 분석한 결과, 마이코플라즈마 뉴모니아의 어드헤신 피1 단백질의 유전자임을 확인하였다. 그 후, 이 유전자를 대장균에서 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터 pGEX-4T-1 (GE Healthcare 사, 스웨덴)로 서브클로닝 (subcloning)하였다. 이에 사용된 유전자의 제한효소는 5‘ 방향으로는 EcoRI을 그리고 3’ 방향으로는 XhoI을 이용하였으며, 재조합 단백질의 발현용 대장균은 BL21(DE3) 종을 이용하였다.

1-2. 어드헤신 피1 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제

pGEX-4T-1-P1 플라스미드로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3)를 배양을 하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 0.6 ~ 0.8이 되면 배양액에 1 mM 농도의 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 처리한 후, 4~5 시간 더 배양하여 어드헤신 피1 재조합 단백질의 대량 발현을 유도하였다. 재조합 단백질이 발현된 대장균을 원심분리로 수거하고 초음파 분쇄기를 사용하여 세포를 파쇄시킨 후, 원심분리하여 상층액만을 취하였다. 단백질의 정제는 GSH-결합 세파로스 (Sepharose)를 이용한 친화크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로는, GSH-결합 세파로스가 충 진된 컬럼에 원심분리 상층액을 주입하여 GST-어드헤신 피1 융합 단백질을 충진제에 결합시키고 결합되지 않은 다른 물질들을 충분한 양의 완충용액으로 세정하였다. 그 후, 100 mM의 GSH (glutathion)을 포함하는 트리스 완충용액 (pH 7.0)을 이용하여 GST-어드헤신 피1 융합 단백질을 컬럼으로부터 용출 (elution)하였다. 분리된 GST-어드헤신 피1 융합 단백질을 별도의 처리 없이 투석과 농축을 한 후, 발명에 이용하였다. 단, 필요한 경우, 트롬빈 (thrombin, GE Healthcare 사, 스웨덴)을 처리하여 GST를 제거하고 어드헤신 피1 재조합 단백질만을 분리하여 발명에 이용하였다.

실시예 2 : 재조합 어드헤신 피1에 대한 단클론 항체의 제작

2-1. 어드헤신 피1 재조합 단백질을 이용한 면역화

상기의 실시예 1에서 얻은 어드헤신 피1 재조합 단백질 100 ㎍이 들어 있는 용액과 같은 부피의 컴플리트 프레운즈 아주번트 (complete Freund's adjuvant)가 섞인 현탁액을 만들어 생후 6-8주령 암컷 생쥐 (BALB/C, 대한바이오링크(주), 한국)의 복강 내에 주입하였다. 2주 후에 인컴플리트 프레운즈 아주번트 (incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 다시 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하였다. 마지막 면역처리 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 1/1000으로 희석하여 엘리자 (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 만약 역 가가 낮게 나오면 2주 후에 다시 면역화시켰다.

2-2. 비장세포 (Splenocyte)와 골수종 (Myeloma) 세포의 융합

상기 실시예 2-1에서와 같은 방법으로 면역화된 쥐에서 비장을 꺼내고, 조직분쇄기로 비장을 으깬 후, 세포 혼탁액을 용기에 담고 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 골수종 세포는 세포배양용 플라스크에서 회수하여 RPMI1640 배지에 현탁하고 세포수를 계수하였다. 비장세포 역시 세포수를 계수하였다. 1× 10⁷개의 골수종 세포와 1× 10⁸개의 비장세포를 50 ml 용기로 옮겨 RPMI1640 배지를 적당량 첨가한 후 200× g로 5 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 현탁시켜 RPMI1640 배지에 천천히 흔들어 주면서 1 ml의 PEG (50% polyethylene glycol) 용액을 1분 동안 가하였다. 5 분 후에 1 ml의 RPMI1640 배지를 30 초에 걸쳐 천천히 첨가하고, 다시 3 ml의 RPMI1640 배양액을 30 초에 걸쳐 첨가하였다. 또 다시 17 ml의 RPMI1640 배양액을 1 분에 걸쳐 넣은 다음 20 ml의 RPMI1640 배양액을 더 넣어주고, 5 분 동안 반응시켰다. 이를 200× g로 5 분간 원심분리한 후 배지는 제거하였다. 50 ml의 1% HAT (hypoxathine-aminopterin-thymidine)을 함유하는 RPMI1640 배양액에 주의하여 현탁한 후, 피더 세포 (feeder cell)가 들어있는 96웰 세포배양용 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 상기 세포를 넣어준 후 37 ℃, 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다.

2-3. 융합세포주의 클로닝 및 복수를 이용한 항체생산

상기의 실시예 2-2와 같이 배양된 세포를 10일 간 배양한 후에, 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면 96웰 세포배양용 플레이트에서 배지를 약 100 ㎕ 취하여 엘리자 방법으로 정제된 어드헤신 피1 항원 대한 항체를 생산하는 세포가 자라는 웰을 확인하고, 그 웰의 세포를 회수하여 24웰 세포배양용 용기로 옮긴 다음 배양한 후, 안정한 단클론 세포주가 얻어질 때까지 클로닝을 계속하였다. 클로닝이 완료되면 티 플라스크 (T flask)로 옮겨 대량으로 배양하여 얼린 후 액체 질소에 보관하였다.

생후 6-8주령 생쥐 (BALB/C)의 복강에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 0.5 ml 주사하였다. 1 주일째 되는 날 융합세포를 인산염 완충액에 현탁하고 계수하여, 쥐 한 마리당 1.5× 10⁶개의세포를 0.5 ml 인산염 완충액에 현탁한 후 복강에 주사하였다. 1-2 주가 지나면서 복수(ascitic fluid)가 적당히 차오르면 주사기를 이용하여 복수를 채취한 후 냉동 보관하였다.

2-4. 단클론 항체의 정제

상기의 실시예 2-3과 같은 방법으로 채취한 복수에 황산 암모늄 (ammonium sulfate)을 10%의 농도로 첨가하여 30 분간 혼합한 후, 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리하고 상층액을 취하였다. 다시 이 상층액에 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨 가한 후 4 ℃에서 30 분간 방치하였다. 다시 15,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 20 mM 인산완충용액에서 18 시간 이상 투석한 후, 20 mM 인산완충용액 (pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼 (Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거해 주었다. 컬럼에 결합된 항체는 10 mM 글리신용액 (glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출 (elution) 시켰다. 이 때 1 M 트리스(Tris, pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피로 첨가해 주어 pH가 7.0 ~ 7.5가 되도록 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축한 후 150 mM 인산완충용액에서 투석하고, 투석이 끝나면 브래드포드법 (Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고 사용 전까지 냉동 보관하였다. 정제된 단클론 항체를 단클론 항체 2G6D7으로 명명하였다.

실시예 3: 재조합 항원을 이용한 신속 면역크로마토그래피법 스트립 형태 진단 키트의 제조

3-1. 단백질 A 및 항 어드헤신 피1 단클론 항체의 부동화

도 4에서와 같이 플라스틱 카드에 부착된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 특정 위치, 즉 검사선 (test line, T)에는 단백질 A (Protein A)를, 그리고 대조선(control line, C) 위치에는 항 어드헤신 피1 단클론 항체(anti-adhesin P1 monoclonal antibody) 2G6D7을 각각 분주하고 30 ℃ 인큐베이터에서 2 일간 건조시켜 단백질 A와 단클론 항체가 니트로셀룰로오스 멤브레인에 완전히 부동화되도록 하였다.

3-2. 금 축합체(gold conjugate)의 제조 및 금 축합패드의 제조

어드헤신 피1 재조합 단백질을 약 40 nm 크기의 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)와 섞은 후 37 ℃ 항온 수조에서 1 시간 동안 반응하여 서로가 결합되도록 하였다. 1 시간 후, 소 혈청 알부민 (BSA, bovine serum albumin)과 수크로오스 (sucrose)를 각각 3% 및 1%되게 첨가한 후, 다시 1 시간 동안 반응시켜 항체가 결합하지 못한 콜로이드성 금 입자의 부위와 반응토록 하였다. 그 후, 10,000 rpm에서 20 분간 원심 분리시켜 재조합 단백질이 결합된 금 축합체를 회수하고, 540 nm에서 흡광도를 측정한 후 냉장 보관한다. 제조된 금 축합체를 플라스틱 재질의 마이크로웰 플레이트 (microwell plate)에 주입시킨 후, 건조시켜 금 축합웰 (gold conjugate well)을 제조하였다.

3-3. 스트립 키트의 조립

도 4에 예시되어 있는 바와 같이 단백질 A (Protein A) 및 단클론 항체가 결합된 니트로셀룰로오스 멤브레인이 붙어있는 플라스틱 카드의 상단부에는 검체 및 버퍼를 흡수할 수 있는 흡수패드 (absorbance pad)를 부착하여 스트립 형태 키트를 완성하였다.

실시예 4 : 재조합 항원을 이용한 신속 면역크로마토그래피법 디바이스 형태 진단 키트의 제조

4-1. 단백질 A 및 항 어드헤신 피1 단클론 항체의 부동화

도 4에서와 같이 플라스틱 카드에 부착된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 특정 위치, 즉 검사선 (test line, T)에는 단백질 A (Protein A)를, 그리고 대조선(control line, C) 위치에는 항 어드헤신 피1 단클론 항체 (anti-adhesin P1 monoclonal antibody) 2G6D7을 각각 분주하고 30 ℃ 인큐베이터에서 2 일간 건조시켜 단클론 항체가 니트로셀룰로오스 멤브레인에 완전히 부동화되도록 하였다.

4-2. 금 축합체 (gold conjugate)의 제조 및 금 축합패드의 제조

어드헤신 피1 재조합 단백질을 약 40 nm 크기의 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)와 섞은 후 37℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응하여 서로가 결합되도록 하였다. 1시간 후, 소 혈청 알부민 (BSA, bovine serum albumin)과 수크로오스 (sucrose)를 각각 3% 및 1%되게 첨가한 후, 다시 1 시간 동안 반응시켜 항체가 결합하지 못한 콜로이드성 금 입자의 부위와 반응토록 하였다. 그 후, 10,000 rpm에서 20 분간 원심 분리시켜 재조합 단백질이 결합된 금 축합체를 회수하고, 540 nm에서 흡광도를 측정한 후 냉장 보관한다. 제조된 금 축합체를 유리 섬유 (glass fiber) 재질의 패드 (pad)에 흡수시킨 후, 건조시켜 금 축합 패 드를 제조하였다.

4-3. 디바이스 형태 키트의 조립

도 6에 예시되어 있는 바와 같이 단백질 A (Protein A)와 단클론 항체가 결합된 니트로셀룰로오스 멤브레인이 붙어있는 플라스틱 카드의 상단부에는 검체 및 버퍼를 흡수할 수 있는 흡수패드 (Absorbance pad)를 부착하고, 하단부에는 검체를 적하하는 샘플패드 (Sample pad)와 축합패드 (conjugate pad)를 부착시켰다. 디바이스 형태의 경우 이렇게 조립된 반제품을 도 6에 명시되어 있는 바와 같이 플라스틱 재질의 하우징 (housing)에 넣어 키트를 완성시켰다.

실시예 5 : 스트립 형태 키트의 검사 방법

키트와 함께 제공되는 금 축합웰에 세척액을 1 방울 떨어뜨린다. 그 후, 혈청 검체 4 마이크로리터 (microliter)를 피펫을 이용하여 넣고 섞는다. 그 후, 스트립 형태 키트를 꽂아서 검액이 흡수되도록 하고 10 분간 방치한다. 3 방울의 세척액을 세척웰에 넣은 다음 검액이 흡수된 스트립 형태의 키트를 꽂고 10 분간 방치하여 세척반응을 시킨다. 반응이 종료된 스트립은 도 5에 명시되어 있는 바와 같이 검사선 상에 나타난 붉은 색의 띠의 위치에 따라 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체 여부를 판독한다.

실시예 6 : 디바이스 형태 키트의 검사 방법

알루미늄 파우치 (Aluminum pouch)에 들어있는 디바이스 키트를 꺼내 평편한 바닥에 놓는다. 혈청 검체를 4 마이크로리터 (㎕, microliter) 채취하여 도 6a에 명시되어 있는 바와 같이 검체 적하부(sample window)에 넣고 검액이 흡수되도록 한다. 그 후, 세척액 (assay buffer)을 3 방울 떨어뜨린 후 15 분간 방치하였다. 반응이 종료된 키트는 도 7에 명시되어 있는 바와 같이 검사선 상에 나타난 붉은 색의 띠의 위치에 따라 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체 여부를 판독하였다.

실시예 7 : 마이코플라즈마 항체 검출을 위한 신속 면역크로마토그래피법 스트립 형태 및 디바이스 형태 키트의 효능 시험

7-1. 양성 민감도 효능 시험

상기 실시예 3 내지 4에 의해 제조된 진단 키트를 이용하여 마이코플라즈마 양성 임상 검체에 대한 키트의 민감도 성능을 테스트 하였다. 본 진단 키트의 민감도를 확인하기 위한 시험은 청주성모병원 (충북 청주, 한국)으로부터 제공된 95 건의 양성 임상검체를 이용하여 수행하였다. 또한, 동일한 검체를 이용하여 SeroDia Myco II 키트 (Fujirebio 사, 일본)를 이용하여 병행 시험을 하고, 본 발명에서 이룩한 진단 키트와 비교하였다. 그 결과는 표 1에 나타나 있는 바와 같다.

7-2. 음성 특이도 효능 시험

상기 실시 예 3 내지 4에 의해 제조된 진단 키트를 이용하여 마이코플라즈마 항체 음성 임상 검체에 대한 키트의 특이도 성능을 테스트 하였다. 본 진단 키트의 특이도를 확인하기 위한 시험은 성균관대학교 의과대학 기생충학교실에서 제공된 120건의 음성 임상 검체를 이용하여 수행되었다. 또한, 동일한 검체를 이용하여 SeroDia Myco II 키트 (Fujirebio 사, 일본)를 이용하여 병행 시험을 하고, 본 발명에서 이룩한 진단 키트와 비교하였다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.

7-3. 민감도 및 특이도 시험결과를 통한 결론

상기와 같이, 본 발명의 진단 키트는 기존의 진단 키트와 비교해 사용법이 무척 간편하고 고가의 장비의 도움 없이도 신속하게 검사함에도 불구하고 특이도 및 민감도가 높아서 임상적으로 유효성이 있음을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 마이코플라즈마 뉴모니아의 형태를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명에 따른 마이코플라즈마 뉴모니아의 어드헤신 피1 (Adhesin P1)의 재조합 단백질의 제작 방법을 나타낸 흐름도이다.

도 3은 본 발명에 따른 재조합 어드헤신 피1을 분리정제한 결과를 나타내는 도면이다. 이 도면에서 M은 단백질 분자량 표지자 (marker)를, 1번 레인 (lane)은 단백질 발현 후 세포 용출액을, 2번 레인은 단백질 발현 전 세포 용출액을, 3번 레인은 정제한 재조합 어드헤신 피1을 에스디에스-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행한 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 감염 환자로부터 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체를 진단하기 위한 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태의 구성 모식도를 나타내는 도면이다.

도 5는 본 발명에 따른 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체를 진단하기 위한 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태의 검사결과에 대한 사진을 나타내는 도면이다.

도 6은 본 발명에 따른 감염 환자로부터 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체를 진단하기 위한 신속 면역크로마토그라피법 디바이스 형태의 구성 모식도를 나타내는 도면이다.

도 7은 본 발명에 따른 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 항체를 진단하기 위 한 신속 면역크로마토그라피법 디바이스 형태의 검사결과에 대한 사진을 나타내는 도면이다.

<110> Bioland Ltd. <120> The recombinant proteins for the diagnosis of diseases infected from Mycoplasma pneumoniae and the diagnostic kits comprising the same <130> PA070684 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 357 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <220> <221> ACT_SITE <222> (1)..(357) <223> adhesin P1 <400> 1 Phe Arg Gly Ser Trp Val Asn Arg Leu Gly Arg Val Glu Ser Val Trp 1 5 10 15 Asp Leu Lys Gly Val Trp Ala Asp Gln Ala Gln Ser Asp Ser Gln Gly 20 25 30 Ser Thr Thr Thr Ala Thr Arg Asp Ala Leu Pro Glu His Pro Asn Ala 35 40 45 Leu Ala Phe Gln Val Ser Val Val Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Pro Asn 50 55 60 Thr Ser Ser Gly Gln Thr Gln Ser Thr Asn Ser Ser Pro Tyr Leu His 65 70 75 80 Leu Val Lys Pro Lys Lys Val Ile Gln Ser Asp Lys Leu Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Lys Asn Leu Leu Asp Pro Asn Gln Val Arg Thr Lys Leu Arg Gln 100 105 110 Ser Phe Gly Thr Asp His Ser Thr Gln Pro Gln Pro Gln Ser Leu Lys 115 120 125 Thr Thr Thr Pro Val Phe Gly Thr Ser Ser Gly Asn Leu Ser Ser Val 130 135 140 Leu Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gln Ser 145 150 155 160 Gly Val Asp Leu Ser Pro Val Glu Lys Val Ser Gly Trp Leu Val Gly 165 170 175 Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr Ser Ser Thr Asn Asn Leu 180 185 190 Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val Val Gly Val Gly Arg Leu 195 200 205 Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Glu Thr Asn Asp Asp Val Asp Gly 210 215 220 Ile Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly Glu Gly Gln Thr 225 230 235 240 Ala Asp Thr Gly Pro Gln Ser Val Lys Phe Lys Ser Pro Asp Gln Ile 245 250 255 Asp Phe Asn Arg Leu Phe Thr His Pro Val Thr Asp Leu Phe Asp Pro 260 265 270 Val Thr Met Glu Thr Leu Val Tyr Asp Gln Tyr Ile Pro Leu Phe Ile 275 280 285 Asp Ile Pro Ala Ser Val Asn Pro Lys Met Glu Thr Val Arg Leu Lys 290 295 300 Val Leu Ser Phe Asp Thr Asn Glu Gln Ser Leu Gly Leu Arg Leu Glu 305 310 315 320 Phe Phe Lys Pro Asp Gln Asp Thr Gln Pro Asn Asn Asn Val Gln Val 325 330 335 Asn Pro Asn Asn Gly Asp Phe Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ser Ser Gln 340 345 350 Gly Pro Gln Thr Leu 355 <210> 2 <211> 1053 <212> DNA <213> Mycoplasma pneumoniae <220> <221> gene <222> (1)..(1053) <223> adhesin P1 <400> 2 tttcgtggca gttgggtcaa ccggttgggc cgcgtggaga gtgtgtggga tttgaagggg 60 gtgtgggcgg atcaagctca gtccgactcg caaggatcta ccaccaccgc aacaagggac 120 gccttaccgg agcacccgaa tgctttggcc tttcaggtga gtgtggtgga agcgagtgct 180 tacaagccaa acacgagctc cggccaaacc caatccacta acagttcccc ctacctgcac 240 ttggtgaagc ctaagaaagt tatccaatcc gacaagttag acgacgatct taaaaacctg 300 ttggacccca accaggttcg caccaagctg cgccaaagct ttggtacaga ccattccacc 360 cagccccagc cccaatcgct caaaacaacg acaccggtat ttgggacgag tagtggtaac 420 ctcagtagtg tgcttagtgg tgggggtgct ggagggggtt cttcaggctc aggtcaatct 480 ggcgtggatc tctcccccgt tgaaaaagtg agtgggtggc ttgtggggca gttaccaagc 540 acgagtgacg gaaacacctc ctccaccaac aacctcgcgc ctaatactaa tacggggaat 600 gatgtggtgg gggttggtcg actttctgaa agcaacgccg caaagatgaa cgacgatgtt 660 gatggtattg tacgcacccc actcgctgaa ctgttagatg gggaaggaca aacagctgac 720 actggtccac aaagcgtgaa gttcaagtct cctgaccaaa ttgacttcaa ccgcttgttt 780 acccacccag tcaccgatct gtttgatccg gtaactatgt tggtgtatga ccagtacata 840 ccgctgttta ttgatatccc agcaagtgtg aaccctaaaa tggttcgttt aaaggtcttg 900 agctttgaca ccaacgaaca gagcttaggt ctccgcttag agttctttaa acctgatcaa 960 gatacccaac caaacaacaa cgttcaggtc aatccgaata acggtgactt cttaccactg 1020 ttaacggcct ccagtcaagg tccccaaacc ttg 1053 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer(APIF) <400> 3 actatggatt ctttcgtggc agttgggtc 29 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer(APIR) <400> 4 ggttctcgag caaggtttgg ggacct 26

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 마이코플라즈마 뉴모니아의 어드헤신 피 1 재조합 단백질에 특이적인 단클론 항체를 포함하는 마이코플라즈마 뉴모니아 진단용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 마이코플라즈마 뉴모니아의 어드헤신 피 1 재조합 단백질에 특이적인 단클론 항체는 단클론 항체 2G6D7인 진단용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 단클론 항체 2G6D7는 기탁번호 KCTC 11242BP 융합세포에 의해 생산된 것인 진단용 조성물.
제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 마이코플라즈마 뉴모니아 진단 키트.
제5항에 있어서, 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입의 진단 키트.
제5항에 있어서, 면역크로마토그래피법을 이용한 디바이스 타입의 진단 키 트.
제5항에 있어서, 항원-항체 복합체를 색채입자결합법으로 검출하는 진단 키트.
기탁번호 KCTC 11242BP의 융합세포주에서 생산되는 항체 2G6D7.
기탁번호 KCTC 11242BP의 융합세포.