KR100890013B1

KR100890013B1 - 신규한 균주 바실러스 섭틸러스 ｋｋｇ－１과 이를함유하는 미생물제제 및 미생물농약

Info

Publication number: KR100890013B1
Application number: KR1020070105637A
Authority: KR
Inventors: 이귀재
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2007-10-19
Publication date: 2009-03-24
Anticipated expiration: 2027-10-19

Abstract

본 발명은 광범위한 항진균 활성을 갖으면서 작물 생육을 촉진하는 신규한 균주 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis) KKG-1과 이를 유효성분으로 함유하는 미생물제제 및 미생물농약에 관한 것이다.

바실러스 섭틸러스 KKG-1은 고추역병 방제에 있어서 고추역병균 파이토프소라 캡사이시( Phytophthora capsici)에 에 항진균 활성 스펙트럼을 갖는 미생물이며, 이를 함유하는 병원성 진균 방제용 미생물제제 및 농약이 제공된다.

본 발명의 바실러스 섭틸러스 KKG-1은 항진균 활성에 더하여 작물 생육을 촉진할 뿐 아니라 유기물 분해능, 농약내성 및 농약분해능을 지니고 있어 환경보전 및 정화작용이 있는 다기능성 농약제로 유용하게 사용될 수 있다.

바실러스 섭틸러스 KKG-1, 고추역병, 파이토프소라 캡사이시, 생육촉진, 다기능성 농약제

Description

신규한 균주 바실러스 섭틸러스 ＫＫＧ－１과 이를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약 {Bacillus subtilis KKG―1 and microbial agent and biopesticide containing the same}

본 발명은 고추역병 방제에 있어서 고추역병균 파이토프소라 캡사이시( Phytophthora capsici)에 항균 활성을 갖으면서 작물 생육을 촉진하는 신규한 균주 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis) KKG-1과 이를 유효성분으로 함유하는 미생물제제 및 미생물농약에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 길항성과 작물 생육 촉진을 동시에 갖는 균주를 분리동정하고 이 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물제제 및 미생물농약에 관한 것이다.

미생물 제제 및 농약의 개발에 있어 필수적인 요소는, 길항성이 뛰어난 유용 미생물을 선발하거나 변형하여 만들어내고, 선발된 미생물 또는 미생물이 분비하는 약제를 대량 생산하여 이들을 농작물에 효율적으로 전달하여 사용하는데 있다. 최근 미생물을 이용한 미생물농약의 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.

이와 관련하여 종래기술로는 한국 특허출원 1990-0017551호(신규의 바실러스 서브틸리스 아종 및 이로부터 생산되는 항진균 물질 KFR-001 복합체의 용도)에 항진균 올리고 펩티드계 물질을 생산하는 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스 (Bacilus subtilis subsp. Krictiensis) 에 관한 것이 있으나, 항진균 활성 스펙트럼이 좁은 문제점이 있었다.

또한 한국 특허출원 1998-0062437호(병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 미생물, 이를 함유하는 항진균성 미생물 농약제 및 그의 제조방법)에는, 바실러스 섭틸리스 변종 아밀로리쿠파시엔스(Bacilius subtilis var. amyloliquefaciens), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)등 항진균 활성을 나타내는 미생물과 이를 이용한 바이오 매트릭스에 관한 것이 기재되어 있으나, 바이오 매트릭스의 구성이 복잡하고 항진균 활성 스펙트럼이 좁은 문제점이 있었다.

한편, 본 발명의 대상이 되는 고추는 열대와 아열대 지방의 중요한 작물로 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 소비량이 많은 작물이며, 농가와 소비자들에게 영양학적 및 경제적인 가치가 매우 높다. 최근 고추 연작재배로 인하여 토양의 물리화학적 성질을 악화시키고, 독성 화합물의 축적으로 식물 병원균의 내성을 증가시켜 역병 방제의 어려움을 가지고 있다.

고추에 심각한 병을 일으키는 것중 하나인 역병은 난균강인 파이토프소라 캡사이시( Phytophthora capsici)에 의한 것으로, 병징은 뿌리와 crown 부패, 고추의 잎, 줄기, 열매의 마름병을 일으킨다(Mao등, 1998). 상기 파이토프소라에 의한 병이 고추 생산량을 감소시키는 가장 중요한 원인으로 보고되어 왔지만, 효과적인 방 제법은 없는 실정이다. 그 이유는 파이토프소라 캡사이시( Phytophthora capsici)의 난포자가 내건성이고, 낮은 온도와 다른 극심한 악조건에서도 저항성이 강해 수년동안 토양내에서 기주식물 없이도 생존할 수 있기 때문이다.

방제법으로는 연작의 회피와 이랑을 높게 하여 배수를 좋게 하면 병의 관리에 도움이 되지만 완벽한 방제법이라 할 수 없다. 또한, 메틸 브로마이드와 같은 살균제를 사용하여 좋은 결과를 얻을 수 있으나 식물 독소와 잔여 농약은 환경오염과 인체건강을 위협하는 주요한 문제로서 대두되고 있다. 더욱이 토양내 잔여농약은 유용 미생물의 밀도와 식물생장에 영향을 주어 작물 생산량의 감소를 초래하고 있다.

위와 같은 이유로 고추역병에 길항하며 작물의 생육에 도움을 줄 수 있는 다기능성 균주에 기초한 농약제를 제공할 필요가 제기되고 있다. 특히 최근 친환경 농산물의 수요가 급증하여 화학농약의 사용을 줄이고 친환경적 제품들의 사용이 증가하는 추세에 있으나 대부분 외국에서 제재화된 수입품들이며 국내 미생물로 방제하는 경우는 드물기에 신규한 미생물을 제공할 필요가 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 고추역병의 병원균인 파이토프소라 캡시사이에 대해 항균활성과 함께 작물 생육을 촉진하는 신규의 균주를 분리동정하고, 이 균주를 함유하는 미생물제제 및 농약을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 고추역병의 병원균인 파이토프소라 캡시사이의 생육을 억제하는 작용에 더하여 길항균에서 분비하는 물질(ACC deaminase)이 식물의 스트레스를 줄여줌으로써 생육을 촉진시키는 균주 바실러스 섭틸러스 KKG-1을 분리동정하고, 분리동정한 균주 바실러스 섭틸러스 KKG-1의 파이토프소라 캡시사에 대한 항균 활성과 길항균에서 분비하는 물질이 식물의 스트레스를 줄여 생육을 촉진시키는 활성을 확인한 다음, 바실러스 섭틸러스 KKG-1을 함유하는 미생물제제 및 농약을 제조하여 고추 역병 발생 억제 효과를 확인함으로써 완성하였다.

본 발명의 일견지에 의하면,

고추역병균 파이토프소라 캡사이시에 대해 항균활성을 가지는 바실러스 섭틸러스 KKG-1 균주를 제공한다.

본 발명의 제2 견지에 의하면,

상기 제1 견지에 의한 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 고추역병 발생억제용 미생물제제를 제공한다.

본 발명의 제3 견지에 의하면,

상기 제1 견지에 의한 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 고추역병 발생억제용 미생물농약을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 바실러스 섭틸러스 KKG-1은, 고추역병균 파이토프소라 캡사이시에 대해 항균활성을 갖을 뿐 아니라 작물의 생육을 촉진시키는 것으로 하기 실시예를 통해 규명되었다(도 1 및 3 참조).

이때 본 발명에서 분리된 균주는 하기표 1에 나타낸 것과 같이 내생포자를 형성하고 그램(+)의 간균으로써 크기는 0.6-0.8 x 2-5 μm 이고 배지상의 콜로니 형태는 가장자리가 둥글고 점질성의 유백색이었다(표2). 또한 분리균주의 세포막의 지방산 메틸에스터 분석을 위해 셔록 시스템 버전 3.00(Sherlock system Version 3.00 (Microbial Id Inc.))을 사용한 결과, 바실러스 sp.의 특성인 불포화지방산이 63 %으로 특이적으로 높았으며, Api 50 CHB kit는 생명공학(주) 마이크로 아이디에 의뢰하였고, 바실러스 섭틸러스와 84.7%의 유사성을 보여 바실러스 섭틸러스 KKG-1으로 동정되었으며, 2007년 4월 24일 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC11124BP로 기탁하였다.

또한, 작물의 생육 촉진작용은 길항균에서 분비하는 물질(ACC deaminase)이 식물의 스트레스를 줄여줌으로써 얻어지는 것으로 하기 실시예를 통해 규명되었다(도 2 및 4 참조).

또한, 본 발명은 상술한 바실러스 섭틸러스 KKG-1을 다음과 같이 혼합하여 미생물 제제, 미생물 농약을 만든다.

<미생물제제>

제1차공정	제2차공정	제3차공정
계면활성제	영양분1	영양분2

제4차공정	제5차공정	제6차공정
동결방지제	안정제	방부제

제7차공정	제8차공정	제9차공정
증점제1	증점제2	배양액

위와 같은 순서로 교반기를 이용하여 배양액을 포함한 구성성분을 잘 배합한다.

<미생물농약>

	제1차공정		제2차공정		제3차공정
	계면활성제		증점제		배양액

계면활성제 + 증점제 ; 50%, 배양액 50%로 하여 배합한다.

이같은 미생물 제제와 미생물 농약은 활성 세균의 생존 유지기간, 생존 발아율, 항균 활성유지, 항균물질 생성능력이 우수하므로, 항균 미생물농약, 종자 코팅제, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등에 이 용될 수 있다.

나아가, 본 발명에 의한 실러스 섭틸러스 KKG-1으로 만든 방제용 미생물 농약은 우리나라에서 자생하는 미생물을 이용하여 경제적인 대체 효과가 크고 고성능을 갖는 잇점이 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명 바실러스 섭틸러스 KKG-1은 항진균 활성에 더하여 작물 생육을 촉진할 뿐 아니라 유기물 분해능, 농약내성 및 농약분해능을 지니고 있어 환경보전 및 정화작용이 있는 다기능성 농약제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것을 아니다.

실시예 1 : 본 발명 신규한 길항 미생물의 분리 및 동정

토양 미생물의 분리

본 발명의 신규한 균주는 고추 재배지 근권(전라북도 전주시 덕진구 덕진동1가 고추포장)의 고추 뿌리로부터 다음과 같은 과정을 거쳐 분리동정한다.

길항균의 분리

근권에서 분리하여 King's medium B 배지나 nutrient agar 배지를 사용하여 분리하였다. 고추 뿌리를 포스페이트 버퍼 200ml에 넣고 교반한 다음 수세하였다. 10회 희석한 후에 KMB 배지에 100㎕ 분주하고 28℃에서 2일간 배양하였다.

모든 분리주는 colony 크기와 형태에 따라 분리하고 KMB/NA 사면배지에 넣어 4℃에서 보관하였다.

길항균의 동정

동정 방법은 길항균의 DNA를 추출하고 16s rDNA를 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 이용하여 증폭시켜 blast를 이용하여 염기서열의 상동성을 비교, 길항균을 동정하였다. 얻어진 결과는 다음과 같다.

<16S rDNA 29f-primer 염기서열 분석 결과>

CGCTGGCGGCGTGCCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCACACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA

<16S rDNA 1492r-primer 염기서열 분석 결과>

ATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGT

TACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTC

Gene bank의 blast를 이용하여 염기서열의 상동성을 분석한 결과 NC_000964의 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168과 725bp의 염기서열 상동성을 보여 Bacillus subtilis의 아종으로 밝혔다.

상기 분리균주는 하기표 1에 나타낸 것과 같이 내생포자를 형성하고 그램(+)의 간균으로써 크기는 0.6-0.8 x 2-5 μm 이고 배지상의 콜로니 형태는 가장자리가 둥글고 점질성의 유백색이었다(표2). 또한 분리균주의 세포막의 지방산 매틸

에스터 분석을 위해 셔록 시스템 버전 3.00(Sherlock system Version 3.00 (Microbial Id Inc.))을 사용한 결과, 바실러스 sp.의 특성인 불포화지방산이 63 %으로 특이적으로 높았으며, Api 50 CHB kit는 생명공학(주) 마이크로 아이디에 의뢰하였고, 바실러스 섭틸러스와 84.7%의 유사성을 보여 바실러스 섭틸러스 KKG-1으로 동정되었으며, 2007년 4월 24일 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC11124BP로 기탁하였다.

본 발명 바실러스 섭틸러스 KKG-1의 균학적 성질

특성	바실러스 섭틸러스 KKG-1	바실러스 섭틸러스
모양	간상	간상
그램 반응	+	+
세포크기	0.7×0.9×2-8㎛	0.8×0.7×2-5㎛
운동성	70-90%	90-100%
생육온도(고)	40-50℃	35-50℃
생육온도(저)	5-20℃	5-20℃

또한, 본 발명 바실러스 섭틸러스 KKG-1의 감자 액체 배지에서의 최적 pH를 알기위해 250mL의 PD 브로스(broth)가 담긴 500mL 삼각플라스크에 균주를 접종하고, 진탕배양기(100rpm)를 사용하여 30℃의 온도에서 24시간 동안 배양한 후 배양액의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기표 2에 나타내었고, pH 6에서 세포성장이 가장 활발함을 알 수 있었다.

본 발명 바실러스 섭틸러스 KKG-1의 pH에 따른 세포성장

pH	3	4	5	6	7	8
세포성장(Abs 660nm)	0.28	0.32	1.3	1.54	1.23	1.02

실시예 2: 생물학적 방제 실험( in vitro )

길항 세균은 각각의 액체 배양액에 실온에서 48시간동안 150rpm으로 진탕 배양하였다. 세균 세포들을 15분간 6,000rpm으로 원심분리한 다음 포스페이트 버퍼로 재현탁하였다. 세균의 농도는 분광 광도계로 흡광도 595nm에서 10⁸ cells/ml가 되면 접종원으로 사용하였다.

곰팡이

보관 배양된 길항 곰팡이를 PDA 배지에서 25℃/3일간 배양하였다. 첫번째 배지에서 균사의 크기가 5mm 길이 정도 자라면 2번째 PDA 배지로 옮겨 치상하고 7일동안 25℃에서 배양하여 포자 현탁액을 준비하였다. 준비된 현탁액을 유리 spreader 를 이용하여 colony안에 멸균 증류수를 넣으면 포자가 분리되는데 이를 이용하였다.

각 곰팡이 균주의 농도는 haemocytometer를 이용하여 계수하고 희석하여 10³cells/ml가 되면 적당하다.

각각 길항 곰팡이의 포자는 0.75% guar gum 용액에 현탁하고 이 현탁액을 고추 종자에 접종한다. 대조구의 고추 종자는 멸균 guar gum 용액에 담아 흡수하게 하였다.

이중 배양법

세균/곰팡이 분리주는 이중배양법(Yoshida등.,2001)을 이용하여 PDA와 CMA 평판 배지에서 P. capsici의 생장 억제 능력이 있는지를 검정하였다.

상기 P. capsici의 균사(1cm 크기)는 90mm 페트리디쉬 안에 한천배지 중앙에 치상하고 플레이트의 가장자리에 4개의 점을 만들어 분리주들의 현탁액을 접종하고 48시간동안 배양하였다. 곰팡이의 생장 억제는 저지대의 길이를 측정함으로써 확인할 수 있었다.

얻어진 결과를 하기표 3에 도시하였다.

구분	길항력
구분	P. capsici	P. citrophora	P. citricola
R13	++	++	+++
R14	++	+	+
R15	++	++	++
R19	+	+	+
R26	++	++	++
R34	++	++	+++
KKG-1	+++	+++	++

* +: 1-5mm 영역을, ++: 6-10mm 영역을, +++: 10mm 이상 영역을 나타낸다.

** 상기 결과는 3회 반복 실험의 평균값을 의미한다.

Vigour index

종자를 30초동안 1% 소디움 하이포클로라이트로 표면 살균처리하고 증류수에 몇차례 수세하였다. 종자에 각각 길항 미생물을 접종한 다음 습실 처리된 종이에 올려놓고 15일 동안 생장상에서 배양하였다.

종자의 발아율을 기록하고 vigour index를 하기 수학식 1에 도시한 바와 같이, Abdul baki와 Anderwon(1973)의 공식을 이용하여 계산하였다.

Vigour index=(뿌리길이+shoot길이)x발아(%).

상기 실험을 3회 반복하고 얻어진 결과 평균값을 하기표 4에 정리하였다.

구분	Vigour Index	대조군 대비 증가%
R13	630	54.4
R14	597.8	46.5
R15	621.6	52.24
R19	665	62.95
R26	631.4	54.70
R34	668.11	63.70
KKG-1	704.9	72.70
대조군	408.1

*대조군 : 증류수로만 생육

실시예 3: Detached leaves assay

본 실시예는 P. capsici의 감염 예방을 위해 길항 미생물의 능력을 평가하기 위한 것이다.

증류수로 길항 미생물 세포를 현탁하고 분리한 한달된 식물의 5cm 길이의 고추 잎에 분무하며 페트리디쉬 안에 젖은 필터페이터를 놓고 그 위에 잎을 놓았다. ml당 10³유주자가 함유된 P.capsici의 포자현탁액을 준비하여 길항 미생물을 분주한 잎 위에 분무하였다.

접종된 잎은 10일 동안 12시간 광/암 조건에서 20℃에서 배양하였다. 발병정도는 갈변한 잎의 부분에 따라 0-4단계로 평가하였다: 0: 무 병징, 1: 1-12%, 2:13-25%, 3: 26-50%, 4: 51-100%.

갈변 정도를 3회 반복 실험하고 얻어진 결과 평균값을 하기표 5에 정리하였다.

실험예 No.	구분	길항력
1	R13	1.8
2	R14	2
3	R15	1.5
4	R19	1.4
5	R26	1.7
6	R34	1.4
7	KKG-1	1.0
8	P. capsici	3.6

실시예 4: 묘목의 생물적 방제방법

표면 살균된 종자를 각각 길항 미생물에 접종하여 P. capsici(10³유주자/ml)의 포자 현탁액 200㎕를 분주한 평판 배지에 치상하였다.

생장상(70% 습도, 12시간 광조건 22℃, 12시간 암조건 20℃)에서 20일간 배양하였다. 발병 정도는 0-5단계로 평가하였다: 0: 무 병징, 1: 잎이 약간 시들고 줄기 끝이 갈변, 2:30-50% 고사, 3: 50-70% 고사, 4: 70-90% 고사, 5: 100% 모두 고사.

또한, 길항 미생물의 식물생장 촉진 능력 가능성은 묘목의 shoot길이, 뿌리길이, 생체량과 건초량을 측정하여 검정하였으며, 그 결과를 vigour index로 계산하여 표4에 나타내었다.

실시예 5: 생육촉진에 도움을 주는 ACC deaminase

토양 세균에서 분리되는 enzyme 중 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase(ACCD)를 분비하여 식물 호르몬 ethylene의 전구체 ACC를 α-ketobutyrate와 ammonium으로 전환시키는데 이를 확인하기 위하여 ACCD를 생산해 내는 gene의 유무를 확인하였다. 그 방법으로 ACC deaminase gene을 증폭시키기 위하여 sequence-specific forward(5'-ATGAACCTGCAACGATTC-3')와 reverse(5'-TCAGCCGTCTCGGAAGAT-3') primers를 사용하여 ACC deaminase gene를 증폭시켜 전기영동하여 그 결과를 확인한 결과를 도 4에 기재하였다.

제조예 1: 바실러스 섭틸러스 KKG -1을 함유하는 미생물제제의 제조

<미생물제제>

위와 같은 순서로 교반기를 이용하여 배양액을 포함한 구성성분을 잘 배합하였다.

제조예 2: 바실러스 섭틸러스 KKG -1을 함유하는 미생물제제의 제조 함유하는 미생물농약의 제조

본 발명의 바실러스 섭틸러스 KKG-1을 배양하여 농축하였다. 농축된 바실러스 섭틸러스 KKG-1을 뮤코폴리사카라이드(MPS: mucopolysaccharide)로 피막화하였다. 피막화된 바실러스 섭틸러스 KKG-1 균체 수가 바이오 매트릭스 그람당 10⁸ - 10⁹ 개 정도 되도록 혼합한 다음 homogenizer속에서 균일하게 섞었다.

이렇게 만들어진 바실러스 섭틸러스 KKG-1과 바이오 매트릭스 복합체를 건조하여 적당한 크기의 분말로 제조하여 미생물 농약을 제조하였다.

<미생물 농약의 안정성 및 성능 조사>

(1) 미생물 농약의 안정성

미생물 농약은 약효 수명이 최소한 1-2년 정도 유지되는 것이 중요하다.

상기 제조된 미생물 농약을 0, 3, 6, 9, 12개월 방치한 다음 희생되는 살아있는 미생물 수를 조사하였다.

농축된 바실러스 섭틸러스 KKG-1을 실험 구간을 설정하여 각각의 시료를 NA 평판배지 상에 도말한 다음 30℃에서 24시간 배양하고, 처음에 넣어준 미생물 수와 회생된 미생물 수를 비교하여 안정성을 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비하여 피막화되어 건조된 본 발명의 미생물 농약은 다소 차이는 있지만 12개월 저장기간 동안 아무런 변화없이 안정하였다.

또한 희생된 바실러스 섭틸러스 KKG-1의 항균 활성을 분석하기 위하여, 회생된 세균을 임의로 50개씩 선별하여 항균 활성(AF) 실험을 수행하였다. 그 결과 모두 AF+ 길항성을 보유하고 있어 회생된 균주들은 모두 생물학적인 항균 활성을 그대로 유지함을 확인하였다.

(2) 미생물 농약의 UV 저항성 조사

상기 제조예에서 제조한 미생물 농약의 UV 저항성을 조사하였다. 햇볕에 5시간 노출시킨 미생물 농약내 함유되어 있는 바실러스 섭틸러스 KKG-1의 생존률은 감소되지 않았다.

(3) 미생물 농약의 독성 조사

본 발명의 바실러스 섭틸러스 KKG-1를 함유한 미생물 농약과 시제품화한 다음 미새물 농약을 대상으로 마우스에 경구 투입시켜 세포 독성실험, 피부자극 실험 및 급성 독성실험을 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 미생물 농약은 일반 농약투입 기준보다 높은 2,000mg/kg을 투여하여도 전혀 독성을 나타내지 않았을 뿐만 아니라 대조군에 비하여 체중이 증가하는 효과도 나타내었다.

제조예 3: 미생물농약을 이용한 미생물 영양제의 제조

상기 제조예 2에서 제조된 미생물농약을 이용하여 미생물 영양제를 제조하였다.

본 발명의 미생물 농약과 생체고분자물질(microgel), 식물영양원(질소, 인산, 칼륨, 아미노산, 기타 무기물등), 전착제(sticker), 증량제(filler), UV 차단제 등을 혼합하여 분말 및 액상 형태의 미생물 영양제를 만들었다.

미생물 영양제의 경우, 식물체에 살포하였을 때 작물의 생육증진효과 뿐만 아니라 본 발명의 바실러스 섭틸러스 KKG-1이 함유되어 있기 때문에 식물병 방제효과도 뛰어났다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 고추역병의 병원균인 파이토프소라 캡시사이에 대해 항균활성과 함께 작물 생육을 촉진하는 신규의 다기능성 균주를 분리동정하고, 이 균주를 함유하는 미생물제제 및 농약을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 바실러스 섭틸러스 KKG-1으로 만든 방제용 미생물 농약은 우리나라에서 자생하는 미생물을 이용하여 경제적인 대체 효과가 크고 고성능을 갖는 잇점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 다기능성 효과중 식물병원균의 예방 효과를 도시한 도면으로 구체적으로 (a)는 식물병원균인 Phytophthora capsici에 길항하는 사진(A:길항균주, B:식물병원균)을, (b)는 처리구의 유묘기 때 길항작용사진(C:처리, D:무처리)을, (c)는 전처리한 미생물이 잎에서 식물병원균감염을 예방한 사진(C: 무처리, D: 처리)을 의미한다.

도 2는 본 발명의 다른 실시예에 의한 다기능성 효과중 작물생장 촉진 효과를 도시한 도면으로서, (a)는 발아 후 처리한 쪽이 약150% 뿌리가 더 발달함(A: 무처리, B: 처리)을, (b)는 모종시기에 처리하였을 경우 확연히 성장에 차이(A: 무처리, B: 처리)을, 그리고 (c)는 잎과 줄기의 생장촉진검정(A:무처리, B: 처리) 결과를 도시한다.

도 3은 본 발명의 실시예에 의한 길항균의 16S rNDA의 전기영동 사진이다.

도 4는 본 발명의 실시예에 의한 생육 촉진을 일으키는 ACC 유전자에 대한 전기영동 사진이다.

Claims

고추역병균 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 대해 항균활성을 가지고, 1-아미노사이클로프로판-1-카르복실레이트 디아미나제(1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase, ACCD) 유전자를 발현하여 작물의 생육을 촉진하는 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis) KKG-1 (KCTC11124BP) 균주.
제1항 기재의 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 고추역병 발생억제용 미생물제제.
제1항 기재의 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 고추역병 발생억제용 미생물농약.
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