KR100883909B1

KR100883909B1 - Ddr2 단백질의 티로신 키나아제 활성 저해 화합물

Info

Publication number: KR100883909B1
Application number: KR1020067018588A
Authority: KR
Inventors: 양범석; 양경미; 김해종; 박인성; 박성대; 이장혁; 권혁만; 우병영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2004-03-12
Filing date: 2005-01-05
Publication date: 2009-02-17
Anticipated expiration: 2025-01-05
Also published as: KR20050091462A; WO2005092896A1; KR20070012648A

Abstract

본 발명은 신규한 푸로피리미딘 화합물, 이들의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이들을 포함하는 DDR2(Discoidin Domain Receptor 2) 티로신 키나아제 활성 저해제에 관한 것이다. 상기 푸로피리미딘 화합물은 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4로 정의되는 화합물, 이들의 전구체일 수 있으며, 유리 형태 또는 산 부가염 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 푸로피리미딘 화합물은 DDR2 티로신 키나아제의 활성을 억제하는 효과를 갖기 때문에, 간경화, 류마티스 관절염, 암 등과 같이, DDR2 티로신 키나아제 활성이 관여하여 발생하는 질환의 치료에 유용하다.

Description

DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성 저해 화합물{COMPOUND FOR INHIBITING TYROSINE KINASE ACTIVITY OF DDR2 PROTEIN}

본 발명은 신규한 푸로피리미딘 화합물, 이들의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이들을 포함하는 DDR2(Discoidin Domain Receptor 2) 티로신 키나아제 활성 저해제에 관한 것으로, 본 발명의 푸로피리미딘 화합물은 DDR2 티로신 키나아제의 활성을 억제하는 효과를 갖기 때문에, 간경화, 류마티스 관절염, 암 등과 같이, DDR2 티로신 키나아제 활성이 관여하는 질환의 치료에 유용하다.

디스코이딘 도메인 수용체(DDR)는 콜라겐을 활성 리간드로 하는 수용체 티로신 키나아제에 속하는 단백질 패밀리로서, DDR1과 DDR2의 두 형태의 단백질이 여기에 속한다. 이들 단백질은 세포외 부위(N-말단), 막통과부위 및 세포질 부위(C-말단)으로 구성되며, 세포질에 노출된 C-말단 부위에 티로신 키나아제 활성을 나타내는 부위를 갖고 있다.

DDR2 단백질은 섬유아세포, 간 조직의 간성상 세포, 류마티즘 환자에서 추출한 활액 섬유아세포(synovial fibroblast) 등의 성장, 이들 세포에 의한 콜라겐 합성, MMP-1 또는 MMP-2의 생성 등을 촉진하는 작용을 하는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 작용에 있어서, DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성이 중요하다고 알려졌다. 또한, 전이성 암세포에서 DDR2 단백질의 발현이 증가하는 것이 보고 되었다. 이러한 사실은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성이 조직의 섬유화 병변, 류마티즘, 또는 암 질환의 새로운 치료제 개발의 신규 표적이 될 수 있음을 의미한다.

현재 키나아제 패밀리를 표적으로 하는 저분자 신약 개발은 대부분 표적 키나아제의 효소 활성 포켓을 표적으로 하여 키나아제 기질 중의 하나인 ATP의 활성 포켓 부착을 방해하는 작용을 하는 화합물의 개발이 주류를 이루고 있으며, 대표적인 예로서, 최근 개발된 신약인 EGFR 키나아제 저해 신약인 이레사 또는 abl 키나아제 저해제인 글리벡이 있다.

도면의 간단한 설명

따라서, 간경화 등과 같은 조직 섬유화, 류머티즘 및 암 등으로 대표되는 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성으로 인하여 매개 되는 질환을 치료하기 위하여, 본 발명은 DDR2 티로신 키나아제 활성을 저해하는 신규한 저분자 화합물 또는 이를 포함하는 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성으로 인하여 매개되는 질환의 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 2는 간 성상세포 HSC T6에서 제1형 콜라겐에 의하여 유도된 DDR2 단백질의 티로신 인산화에 대한 본 발명의 화합물의 저해 활성을 보여주는 전기영동 사진이다.

본 발명은 DDR2 (Discoidin Domain Receptor 2) 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는 신규한 푸로피리미딘 화합물, 이의 , 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 이들을 포함하는 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성과 관련된 질병의 치료제에 관한 것이다.

도 4a는 본 발명의 화합물을 HSC T6 세포 배양액에 처리한 후, MMP-2 특이적 항체를 이용한 ELISA 통하여 배양액 중의 상대적인 MMP-2 양을 정량한 그래프이다.

도 4b는 본 발명의 화합물을 HSC T6 세포에 처리한 후, 평활근 액틴 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 통하여 세포내 평활근 액틴량을 정량한 것이다.

우선, 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 푸로피리미딘 링에 다양한 유도체를 도입한, 다음의 화학식 1로 정의되는 푸로피리미딘 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

도 6은 담즙관 봉합을 시술한 쥐에 캐리어(DMSO) 또는 DMSO에 녹인 본 발명의 화합물을 10 mg/kg로 2주간 꼬리정맥에 주사 후 채취한 각각의 간 조직 및 대조실험으로 모조시술한 후 방치한 쥐에서 채취한 간 조직을 각각 동결시킨 후, 동결박막을 만들고, 마손 염색법으로 염색한 후, 400 배율의 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 7은 본 발명의 화합물을 처리한 류마티즘 환자에서 추출한 활막섬유아세포의 생존률을 처리 화합물 농도에 따라 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 화합물을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 활막섬유아세포 내의 MMP-1 mRNA양을 비교하여 보여주는 전기영동 사진이다.

기술적 과제

상기한 바와 같이, 간경화 등과 같은 조직 섬유화, 류머티즘 및 암 등으로 대표되는 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성으로 인하여 매개되는 질환을 치료하기 위하여, 본 발명은 DDR2 티로신 키나아제 활성을 저해하는 신규한 저분자 화합물 및 이를 포함하는 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성으로 인하여 매개되는 질환의 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

R₁은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시 또는 아미노, 모르폴린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기 또는 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

R''은 수소, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시 또는 아미노, 모르폴린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 또는 할로겐이 치환된 페닐기에 의하여 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

상기 A 링은 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 시클로헥실, 피페리딘 또는 모르폴린을 나타내고,

우선, 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 푸로피리미딘 링에 다양한 유도체를 도입한, 다음의 화학식 1로 정의되는 푸로피리미딘 화합물, 이의 전구체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

화학식 1

또한, 본 발명은, DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 상기의 화학식 1의 치환기 R이 다음의 화학식 5의 화합물이고, R''가 수소인 다음의 화학식 2로 정의되는 푸로피리미딘 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

상기 식 중,

Z는 O, S 또는 NH이고,

n은 0에서 4 사이의 정수이고,

R 은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 이실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시나 아미노, 모포린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

R"는 수소, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 이실옥시기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시나 아미노, 몰포린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 페닐기를 나타내며,

상기 A 링은 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 시클로헥실, 피페리딘 또는 모폴린을 나타내고,

R₂는 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, C1-C5의 알킬기, C1-C5의 할로알킬기, 알킬에스테르, 페닐기, 할로겐이 치환된 페닐기, C1-C4의 알콕시기가 치환된 페닐기 또는 C1-C4의 할로알콕시기가 치환된 페닐기를 나타내며,

R은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO2H, CONH2, CSNH2, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기 또는 C1-C4의 알킬술폰아미드기에 의해 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타낸다.

또한, 본 발명은, DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 상기의 화학식 1의 치환기 R이 다음의 화학식 5의 화합물이고, R"가 수소인 다음의 화학식 2로 정의되는 푸로피리미딘 화합물, 이의 전구체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

화학식 5

R₁ 및 R₃는, 각각 독립적으로 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시 또는 아미노, 모르폴린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환 되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

상기 A 링은 각각 독립적으로 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 시클로헥실, 피페리딘 또는 모르폴린을 나타내고,

B 링은 피롤, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 피페리딘, 피롤리딘, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 이미다졸린, 피롤리돈, C3-C6 시클로알킬 또는 피페리돈을 나타내고,

상기 식 중,

또한, 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 다음의 화학식 3으로 정의되는 푸로피리미딘 화합물과 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

X는 O, S 또는 NH이고,

Y는 C 또는 N이고,

n은 0에서 4 사이의 정수이고,

n'는 0에서 4 사이의 정수이고,

R₁ 및 R₃는, 각각 독립적으로 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 이실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시나 아미노, 모포린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환 되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

R₁은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시 또는 아미노, 모르폴린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

또한, 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 다음의 화학식 3으로 정의되는 푸로피리미딘 화합물, 이의 전구체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

화학식 3

또한, 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 상기의 화학식 1의 치환기 R이 다음의 화학식 6의 화합물이고, R''가 수소인 다음의 화학식 4로 정의되는 푸로피리미딘 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

상기 식 중,

Z는 O, S 또는 NH이고,

n은 0에서 4 사이의 정수이고,

R₁은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 이실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시나 아미노, 모포린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

R은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기 또는 C1-C4의 알킬술폰아미드기에 의해 일치환 되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타낸다.

또한, 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 상기의 화학식 1의 치환기 R이 다음의 화학식 6의 화합물이고, R"가 수소인 다음의 화학식 4로 정의되는 푸로피리미딘 화합물, 이의 전구체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

화학식 6

R₁ 및 R₃'는, 각각 독립적으로 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시 또는 아미노, 모르폴린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의해 일치환 되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

B' 링은 피롤, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 피페리딘, 피롤리딘, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 이미다졸린, 피롤리돈 또는 피페리돈을 나타내고,

상기 식 중,

Z는 O, S 또는 NH이고,

또한, 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 상기의 화학식 1 내지 4의 화합물의 중간 산물인, 다음의 화학식 XI과 화학식 XII로 정의되는 푸로피리미딘 화합물 또는 이의 약리적으로 허용되는 염을 제공한다.

n은 0에서 4 사이의 정수이고,

n'는 0에서 4 사이의 정수이고,

R₁ 및R₃'는, 각각 독립적으로 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 이실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시나 아미노, 모포린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의해 일치환 되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

상기 A 링은 각각 독립적으로 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 시클로헥실, 피페리딘 또는 모폴린을 나타내고, B' 링은 피롤, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 피페리딘, 피롤리딘, 피퍼라진, 모폴린, 티오모폴린, 이미다졸린, 피롤리돈 및 피퍼리돈 을 나타내고,

R₂는 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, C1-C5의 알킬기, C1-C5의 할로알킬기, 알킬에스테르, 페닐기, 할로겐이 치환된 페닐기, C1-C4의 알콕시기가 치환된 페닐기 또는 C1-C4의 할로알콕시기가 치환된 페닐기를 나타낸다.

본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4로 정의되는 화합물은 유리형태(free base) 또는 염산, 황산, 시트르산 또는 푸마르산 등의 산 부가염 형태로 존재 할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 억제하는 작용을 하는, 상기의 화학식 1 내지 4의 화합물의 중간산물인, 다음의 화학식 XI 또는 XII 로 정의되는 푸로피리미딘 화합물, 이의 전구체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

화학식 XI

화학식 XII

상기 식중 치환기의 정의는 상기한 바와 같다. 또한, 하기하는 반응식 및 표에서 상기 화학식 XI 또는 XII로 정의되는 화합물 중 R"가 수소인 경우를 각각 VI 및 VII로 나타내었다.

본 발명의 화합물은 모두 다음의 화학식 IV로 표현되는 화합물로부터 합성될 수 있다.

화학식 IV

화학식 2의 화합물의 경우 화학식 IV의 치환기 R'는 화학식 5로 정의되는 치환기에 의하여 치환가능한 작용기를 생성할 수 있는 것이 하여야 하므로, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO2H, CONH2, CSNH2, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기 또는 C1-C4의 알킬술폰아미드기인 것이 바람직하다.

예컨대, 본 발명의 화학식 2와 화학식 4의 화합물은 R'가 -OCH3인 화학식 IV의 화합물 (IV')를 출발물질로 하여 다음의 반응식 1과 같이 제조할 수 있다:

반응식 1

R_1,R₃및 R₃'는, 각각 독립적으로 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 아실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시 또는 아미노, 모르폴린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

Z는 O, S 또는 NH이고,

X는 O, S 또는 NH이고,

Y는 C 또는 N이고,

n'는 0에서 4 사이의 정수이고,

m은 0에서 4 사이의 정수이고,

R₁,R₃ 및 R₃'는, 각각 독립적으로 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, C1-C4의 알킬티오기, C1-C4의 알킬아미드기, C1-C4의 아실아미노기, C1-C4의 이실옥시기, C1-C4의 알킬술폰아미드기, C1-C4의 알킬술포네이트기, 이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 티오이미딕산 C1-C4 알킬에스테르, 히드록시나 아미노, 몰포린, 아세테이트, 아세트아미드, 메탄술폰아미드기가 치환된 메틸기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C4의 알콕시기, 할로겐이 치환된 벤질옥시기에 의하여 일치환되거나 독립적으로 이치환된 경우를 나타내고,

상기 A 링은 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 시클로헥실, 피페리딘 또는 몰포린을 나타내고,

상기 반응식 1은 화합물 2 및 화합물 4를 제조할 수 있는 하나의 예시일 뿐이며, 상기 반응식 1에 예시된 것과 다른 화합물 IV를 사용하여 제조하거나, 상기 식 중 화합물 VI'에 이소아밀니트라이트와 CCl₄를 첨가하여 -NH₂이 -Cl로 치환된 화합물 VII'를 제조하는 과정 없이 화합물 VI'의 -OCH₃를 디메틸레이션시켜서 반응을 진행시킬 수도 있다.

또한, 상기 화학식 1 또는 3의 화합물은 출발물질인 화합물 VI의 R'가 최종 화합물까지 그대로 유지되어 있으므로 상기한 R과 동일한 R'을 갖는 화학식 IV의 화합물(IV")을 사용하여 제조할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 다음의 반응식 2에 의하여 제조할 수 있다:

반응식 2

또한, 본 발명의 화학식 3의 화합물은, 예컨대, 다음의 반응식 3에 의하여 제조할 수 있다:

반응식 3

상기 반응식 2 및 반응식 3에 있어서,

또한, 본 발명은 유효성분으로서 상기의 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 XI 또는 화학식 XII로 표현되는 DDR2 티로신 키나아제의 활성을 억제하는 효과를 갖는 신규한 푸로피리미딘 유도체 또는 그의 약리적으로 허용되는 염 중 한 가지 이상을 치료적 유효량으로 포함하는 DDR2 티로신 키나아제 활성 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 유효성분으로서 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 XI 또는 화학식 XII로 표현되는 신규한 푸로피리미딘 유도체 또는 그의 약리적으로 허용되는 염 중 한 가지 이상을 치료적 유효량으로 포함하는 간경화, 류마티스 등과 같이 DDR2 티로신 키나아제의 활성에 관계된 질병의 치료제를 제공한다.

상기 반응식 2에 있어서, n은 0에서 4 사이의 정수를 의미한다.

본 발명의 구체예에서 상기 화학식 1,2,3 및 4의 화합물은 하기의 표 6-1 내지 6-12에 나타낸 번호 5 내지 132의 화합물일 수 있다.

또한, 본 발명은 유효성분으로서 상기의 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3과 화학식 4, 및 화학식 XI 및 화학식 XII로 표현되는 DDR2 티로신 키나아제의 활성을 억제하는 효과를 갖는 신규한 푸로피리미딘 유도체 및 그의 약리적으로 허용되는 염 중 한 가지 이상을 치료적 유효량으로 포함하는 DDR2 티로신 키나아제 활성 억제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 유효성분으로서 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 XI 및 화학식 XII로 표현되는 신규한 푸로피리미딘 유도체 및 그의 약리적으로 허용되는 염 중 한 가지 이상을 치료적 유효량으로 포함하는 간경화, 류마티스 등과 같이 DDR2 티로신 키나아제의 활성에 관계된 질병의 치료제를 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 약리적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 하기의 표 11로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 최종 생성물인 화학식 1 내지 4의 화합물 뿐 아니라, 중간체인 화학식 XI 및 XII(표 중에는 R"가 수소인 VI 및 VII으로 나타냄)의 화합물도 우수한 DDR2 티로신 키나아제 저해 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 화학식 XI 및/또는 XII의 화합물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

상기한 바와 같이, DDR2 단백질은 티로신 키나아제 활성을 갖는 수용체 단백질로서, C-말단에 티로신 키나아제 활성 부위를 포함한다. DNA 재조합 기술 및 바큐로 바이러스 발현 기술을 이용하여, 곤충세포에서 과잉 발현하며, 세포질 노출 부위인 C-말단 부위(아미노산 441-825)의 티로신 키나아제 활성을 갖는 단백질을 확보할 수 있다. 또한, 이러한 키나아제 활성 부위에 여러 방법으로 티로신 인산화를 유도하여 변형시킴으로써 그 키나아제 활성을 증진시킬 수 있다 (한국특허출원 제2002-0067233호 "변형된 DDR2 타이로신 카이네이즈 활성단백질" 및 한국특허출원 제2003-0076967호 "DDR2 티로신 키나아제활성의 변형 방법 및 이와 같은 방법으로 변형된 키나아제 활성을 갖는 DDR2 단백질" 참조).

유리한 효과

이러한 티로신 키나아제 활성을 갖는 DDR2 단백질에 대한 본 발명의 화합물의 억제 활성을 측정하였다. DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성부위의 티로신 키나아제 활성 측정은 여러 가지 방법으로 가능하다. 예컨대, 펩타이드 기질로서 프로메가사가 제공하는 바이오틴이 부착된 poly(D4Y)n을 이용하거나, 히스톤 H2B 단백질을 이용하여 측정하거나, DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성 부위의 자가 인산화 정도를 측정할 수 있다. 키나아제 활성에 의한 기질인 ATP로부터 또 다른 기질인 펩타이드로의 인산기의 이동은, ATP의 감마위치 인산기를 ³²P 동위원소로 표식 후 사용함으로써, ³²P 방사성의 펩타이드 기질에서의 검출정도로 활성 정도를 측정할 수 있다.

본 발명에서 합성된 화합물의 DDR2 티로신 키나아제 저해 활성을, DDR2 티로신 키나아제 활성을 50% 저해하는 각 화합물의 농도를 각 화합물의 IC 값으로 정의함으로써, 하기의 표 11에 나타내었다. 표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화학식 1, 2 및 3 뿐 아니라 화학식 VI 및 VII로 표현되는 화합물이 모두 500 uM 이하의 IC 값을 나타내며, 우수한 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 저해 능력이 있음을 알 수 있다.

본 발명의 화합물들은 DDR2 키나아제의 기질 중 하나인 ATP에 대하여 경쟁적으로 결합함으로써, 저해 효과를 나타낸다. 본 발명의 화합물의 대표 화합물 100(표6)이 ATP 경쟁적 기전에 의해 DDR2 키나아제 활성을 저해함을 확인하기 위하여, 상기 화합물을 0 uM, 0.2 uM 및 1.2 uM 농도로 처리하고 기질인 ATP 양을 변화시키며 반응속도를 구한 후 이를 리시프로칼 프로팅한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 리시프로칼 프로팅 결과는 Y 축상에서 한 점에서 만나고 X 축의 절편이 변하는 것으로 DDR2 키나아제 활성이 저해됨을 확인할 수 있다.

따라서, 이와 같은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 저해 활성에 의하여, 본 발명의 화합물을, 예컨대, 간경화, 류머티즘 및 암과 같이, DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성과 관련된 각종 질병의 치료제로서 사용 가능하다.

또한, 간 성상세포에서 DDR2 수용체 단백질의 티로신 키나아제 활성 증가가 세포의 증식과 관련 있음이 알려졌다. 이러한 사실에 근거하여, 본 화합물들을 간 성상세포 배양 중에 처리할 때, 간 성상세포의 증식과 활성을 억제하는 효과를 검증하고자 여러 가지 실험을 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

도 2는 본 발명의 화합물이 활성화된 간 성상세포 모델인 HSC T6 세포에서 제1형 콜라겐에 의하여 유도된 DDR2 단백질의 티로신 인산화를 저해하는 것을 보여주는 것으로, 본 발명의 화합물(표 6의 번호 100)을 5 uM 내지 20 uM 농도로 24 시간동안 처리하고, 인산화된 티로신 특이적 항체를 이용한 웨스턴 브로팅에 의하여 하여 HSC T6 세포내의 DDR2 단백질의 티로신 인산화 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, DDR2 수용체의 활성 리간드인 제1형 콜라겐에 의해서 유도된 DDR2 단백질의 티로신 인산화가 처리농도 의존적으로 감소함을 알 수 있다.

도 3은 본 발명의 화합물이 선택적으로 HSC T6 세포의 성장을 저해함을 SRB 세포성장 저해 에세이법을 통하여 보여주는 것으로, 본 발명의 표 6의 대표 화합물(번호 100)을 48 시간 처리시, 활성화된 DDR2 티로신 키나아제를 발현하는 것으로 확인된 HSC T6 (-●-)의 세포 생존률(cell viability)이 대조세포들인 rat2 섬유아세포(-▼-) 또는 HT1080 세포(..○..)와 비교하여 현저하게 감소됨을 알 수 있다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 DDR2 키나아제 활성의 특이적 저해를 통하여 DDR2를 발현하는 세포에 대하여 선택적으로 작용함을 알 수 있다.

한편, 간 경변에 있어서 간 성상세포의 수가 증가하고, 동시에 활성화되어 있다는 것이 알려져 있다. 활성화된 간 성상 세포는 콜라겐과 더불어 MMP-2와 평활근 액틴 단백질 생성을 증가시킨다. 이러한 이유로, 간 경변에서 활성화된 간 성상 세포의 활성 억제 및 제거가 간 경화의 치료 효과를 달성하기 위한 주요 전략으로 생각된다.

본 발명의 화합물이 활성화된 간 성상 세포의 특징들인 MMP-2 및 평활근 액틴 단백질의 생성을 감소시키는지를 확인하기 위하여, 본 발명의 표 6의 대표 화합물(번호 100)을 활성화된 간 성상 세포의 모델인 HSC T6 세포에 24 시간 처리한 후 세포 배양액을 취하여 ELISA 에세이를 통하여 생성된 MMP-2양을 측정하여 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 보다 상세하게, 세포 배양액을 20 배 농축시킨 후, 단백질을 96 웰 맥시솔브 프레이트에 부착시키고, 5 % 스킴 밀크 용액을 이용하여 마스킹 하고, 이어서 MMP-2 특이적 항체를 반응시킨 후, 세척하고, 퍼록시데이즈가 부착된 2차 항체를 이용하는 통상적인 퍼록시데이즈 발색 반응을 통하여 부착된 MMP-2 항체의 양을 정량하였다. 도 4a에 보여준 바와 같이, 본 발명의 화합물 처리 농도에 비례하여 MMP-2의 생성이 저해됨을 확인 할 수 있었다.

또한, 본 발명의 화합물의 활성화된 간 성상 세포의 또 다른 특징인 평활근 액틴 단백질의 생성 감소 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 표 6의 대표 화합물(번호 100)을 활성화된 간 성상 세포의 모델인 HSC T6 세포에 24 시간 처리한 후, 세포를 수거하고, 1x램리 버퍼에 녹인 후, 이를 평활근 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 브로팅하여, 화합물 처리에 따른 평활근 액틴 단백질의 양의 변화를 측정하여 도 4b에 나타내었다. 도 4b에 보여준 바와 같이 화합물 처리 농도에 비례하여 평활근 액틴 단백질의 생성이 감소하였다.

또한, 본 발명의 화합물이 활성화된 간 성상세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 활성이 있음을 확인하여, 간경화에 대하여 우수한 치료 효과를 가짐을 증명하였다. 본 발명의 화합물이 DDR2 키나아제 활성을 억제하여 실질적으로 간 성상세포의 세포사멸을 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명의 화합물 (표 6의 번호 100)을 간 성상세포인 HSC T6 세포에 24 시간 처리한 후, 전체 게놈 DNA의 절편화 현상을 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물을 처리 시 30 uM의 높은 농도에서 DNA 절편화 현상이 크게 관찰되었으며, 이는 본 발명의 화합물이 활성화된 간 성상세포를 효과적으로 제거하여 간경화에 대한 치료효과를 보일 수 있음을 보여주는 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 간 경변의 주된 원인으로 꼽히는 간 성상세포의 성장 및 활성을 억제하고, 활성화된 간 성상 세포의 특징인 MMP-2 및 평활근 액틴 단백질의 생성을 감소시키고, 세포사멸을 유도함으로써, 간 경변에 탁월한 치료 효과를 가질 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 화합물은 간경화의 주 원인으로 알려진 간 섬유화를 유발하는 간 조직 내 콜라겐의 축적을 억제함으로써, 간경화를 치료할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 화합물의 간 조직 내 콜라겐 축적 억제 효과를 확인하기 위하여, 7 주령의 수컷 whistar rat을 이용하여 담즙관 봉합에 의한 간 경화 동물 모델을 만든 후, 이 동물에 본 발명의 화합물(표 6의 번호 100)을 꼬리 정맥 주사를 통하여 10 mg/kg의 용량으로 매일 1 회씩 2 주간 투여하였다. 담즙관 봉합시술 후 2 주동안 본 발명의 화합물을 투여한 군과 투여하지 않은 군(대조군)으로 나누어, 이들의 간 조직 내의 하이드록시 프롤린의 양을 측정하고, 담즙관 봉합시술을 받지 않은 군으로부터 측정한 값과 함께 하기의 표 12에 나타내었다.

하이드록시 프롤린은 체내의 다른 단백질에는 거의 존재하지 아니하며 콜라겐을 구성하는 아미노산으로서, 본 발명에서는 간 조직내의 콜라겐 양을 직접적으로 나타내는 지표로서 간 조직의 하이드록시 프롤린 양을 측정하였다.

표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 담즙관 봉합 시술 후 본 발명의 화합물을 투여하지 아니한 군의 하이드록시 프롤린의 양은 담즙관 봉합 시술을 받지 아니한 군과 비교하여 약 2.5배 증가되는데, 이는 담즙관 봉합으로 인하여 간 조직 내의 콜라겐 축적이 상당량 진행되어 간 경화 병변이 진행되었음을 보여주는 것이다. 반면, 담즙관 봉합 시술 후 2 주간 방치한 군과 비교하여, 본 발명의 화합물이 투여된 군은 간 조직 내의 하이드록시 프로린 양의 증가가 현저히 완화되는 결과를 보여주었다.

이러한 결과는 본 발명의 화합물이 간 성상세포의 증식 및 활성 억제 활성과 더불어 간 조직내 콜라겐의 축적을 억제함으로써 간경화 병변에 대해 항 섬유화 효과가 있음을 보여주는 것으로, 본 발명의 화합물의 우수한 간경화 치료 효과를 다시 한 번 증명하는 것이다.

도 6은 상기와 같이 담즙관 봉합 시술 후 본 발명의 대표 화합물 100(표6)을 투여한 쥐의 간 조직과 캐리어만을 투여한 쥐의 간 조직, 및 대조군으로 담즙관 봉합을 하지 않은 쥐의 간 조직을 채취하여 각각 동결건조 섹션을 만든 후, 이를 마손 염색법을 통하여 콜라겐 침착정도를 염색하여 비교한 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 화합물에 의한 간 조직내 콜라겐 침착의 감소를 확인할 수 있다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 담즙관 봉합 시술 후 본 발명의 화합물을 투여한 쥐의 간 조직에서는 캐리어만을 투여한 쥐의 간 조직과 비교하여 파란색으로 염색되는 콜라겐이 현저히 감소하여 담즙관 봉합을 하지 않은 대조군 쥐의 간 조직과 같이 콜라겐 침착이 거의 관찰되지 않았다.

또한, 본 발명의 화합물은 간경화 뿐 아니라, 류머티즘 등의 관절염 병변인자에 대해서도 우수한 억제 효과를 갖는다. 류머티즘 등의 관절염 병변의 한 특징은 활막의 활막세포의 활성화 및 과다증식이다. 활성화된 활막세포는 MMP-1 단백질을 과잉으로 분비하여 연골조직을 구성하는 콜라겐 단백질을 파괴함으로써 류머티즘 병변을 심화시킨다.

최근 류머티즘 병변시 활막세포에 DDR2 단백질의 발현이 증가함이 관찰되었다. 활막세포가 상기한 간 성상세포와 마찬가지로 섬유 세포(fibrotic cells)의 일종이라는 점에서 간 성상세포에서와 마찬가지로 활막세포에서도 DDR2의 발현이 병인 인자라고 유추할 수 있다.

본 발명의 화합물이 활막세포의 성장을 억제함으로써 류머티즘에 대하여 치료 효과를 갖는다는 것을 증명하기 위하여, 류머티즘 환자에서 추출한 활막 섬유아세포에 본 발명의 화합물 (표 6의 화합물 번호 100)을 농도별로 48 시간 처리한 후의 살아있는 세포수와 화합물 처리 직전 세포수를 SRB 정량을 통하여 비교하여 % 세포 생존률을 구하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물의 농도와 비례하여 활막 섬유아세포의 세포 생존률이 감소함을 알 수 있으며, 이는 DDR2 키나아제 활성의 특이적 저해 물질인 본 발명의 화합물이 류머티즘의 원인인 활막 섬유아세포의 성장 및 활성을 억제함으로써 류머티즘에 대하여 치료 효과를 갖는다는 것을 보여주는 것이다.

또한, 본 발명의 화합물은 활막 섬유아세포에서의 MMP-1 (matrix metalloproteinase-1)의 발현 저해 활성을 가짐으로써, 관절염에 대하여 치료 활성을 갖는다. 도 8은 본 발명의 대표 화합물(표 6의 화합물 번호 100)로 처리된 활막 섬유아세포에 통상적인 노던 블로팅을 실시하여 MMP-1 m-RNA를 정량한 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 화합물에 의하여 활막 섬유아세포에서의 MMP-1 발현이 현저히 저해됨을 확인할 수 있다. 이와 같은 사실은 본 발명의 화합물이 DDR2의 키나아제 활성 저해 활성에 의하여 류머티즘 병변 치료제로의 유용함을 증명하고, 아울러 MMP-1의 활성이 여러 암의 전이에 중요하다고 알려진 사실로부터 MMP-1 발현의 억제를 통한 악성종양 치료제로서 또한 사용될 수 있음을 보여주는 것이다. 이러한 사실을 더욱 뒷받침해주는 선행연구결과로서 Vesna Evtimova 등의 연구자에 의해 Tumor Biology 2003년 24권 189쪽에서 198쪽에 실린 'Identification of genes cell lines associated with the invasive status of human mammary carcinoma cell lines by transcriptional profiling' 제목의 연구논문의 연구결과를 들 수 있다. 상기 연구논문에 의하면 전이가 되는 활성이 높은 암 세포주에서 DDR2 유전자 발현양이 서로 높은 연관성을 가지고 증가하는 것으로 확인되었다.

발명의 실시를 위한 형태

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 화합물, 제조방법 및 그 생물학적 활성을 보다 상세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 또한, 다음의 실시예에서는 몇 몇 특징적인 화합물의 제조방법에 대하여 예시하였지만, 이들을 제외한 본 발명의 화합물들은 다음의 실시예에 기재된 방법을 기초로 하여 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 제조할 수 있는 것이다.

I. 본 발명의 화합물의 제조

우선, 하기 반응식 4와 같은 제조 공정에 의하여 화합물 I, II, III 및 IV를 제조하였다:

반응식 4

실시예 1: 4-메톡시페닐아세틸클로라이드(화합물 I)의 제조

4-메톡시페닐아세트산 16.62 g (0.1 mol)에 벤젠 10 ml을 가하여 용해시킨 후, 티오닐클로라이드(SOCl₂) 29 ml (0.2 mol)을 첨가하고, 가열 환류하여 1시간 동안 교반하였다. 반응액에 잔류하는 티오닐클로리드와 용매를 농축시켜 제거하여 정량적인 수율로 액상의 생성물 4-메톡시페닐아세틸클로라이드(화합물 I)를 얻어 정제 없이 사용하였다.

실시예 2: 1-페닐-2-(4-메톡시페닐)에타논(화합물 II)의 제조

알루미늄(III)클로라이드 40g (0.3 mol)에 디클로로메탄 200 ml를 가하여 교반하였다. 여기에 벤젠 29.5 ml (0.33 mol) 및 상기 실시예 1에서 얻어진 4-메톡시페닐아세틸클로라이드 18.5 g (0.1 mol)을 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 100ml에 희석한 희석물을 약 30분 동안 천천히 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 얻어진 반응액을 1 M 염산 수용액 400 ml에 가하고 유기층을 추출하여 건조 및 농축시킨 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여 미색 고체의 생성물의 1-페닐-2-(4-메톡시페닐)에타논(화합물 II)을 얻었다. 동일한 방법으로 화합물 1-(4-토릴)-2-(4-메톡시페닐)에타논 내지 1-(4-토릴)-2-(4-시아노페닐)에타논, 1-(4-메톡시페닐)-2-페닐에타논, 1-(4-메톡시페닐)-2-(4-클로로페닐)에타논을 얻었다.

실시예 3: 알파-브로모케톤계 화합물(화합물 III)의 제조

(1) 2-브로모-4'-클로로프로피오페논(화합물 IIId)

4'-클로로프로피오페논 16.86 g (0.1 mol)에 아세트산 50 ml를 적가하고, 0℃로 냉각 시킨 후, 브롬 5.14 ml (0.1 mol)를 천천히 적가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 물 270 ml를 가하고 여과하여 충분한 물로 세척 및 건조하여 백색 고체의 생성물 2-브로모-4'-클로로프로피오페논(IIId) 24.13 g을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 1의 화합물 IIIf 내지 IIIi, 화합물 IIIk, 화합물 IIIIl, 화합물 IIIn, IIIu, 및 화합물 IIIx를 각각 얻었다.

(2) 2-브로모-4'-메톡시프로피오페논(화합물IIIe)

4'-메톡시프로피오페논 32.84 g (0.2mol)과 CuBr2 89.34 g (0.4mol)에 디옥산 450 ml를 적가한 후, 6 시간 동안 가열 환류하였다. 실온으로 냉각시켜 디옥산을 제거 한 후, 물을 가하고 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻은 유기층을 건조 및 농축하고, n-헥산으로 재결정하여, 미색 고체의 생성물 2-브로모-4'-메톡시프로피오페논(IIIe) 48.62 g을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 1의 화합물 IIIy 를 얻었다.

(3) 2-브로모-1-(4'-클로로페닐)-3-메틸-1-부타논(화합물IIIm)

클로로벤젠 1.02 ml (10 mmol)에 카본디설파이드 14 ml를 적가하고, 알루미늄(III)클로라이드 1.6 g (12 mmol)을 가하여 가열 환류하였다. 여기에 이소바레릴 클로라이드 1.46 ml(10 mmol)를 카본디설피드 2 ml에 녹인 용액을 약 30분 동안 천천히 첨가하고, 6 시간 동안 가열 한 후, 실온으로 냉각시켜 농축하였다. 얻어진 반응액에 1 M 염산 수용액을 가하고, 디에틸에테르로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 10% 수산화나트륨 수용액으로 세척, 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체의 생성물 1-(4'-클로로페닐)-3-메틸-1-부타논 1.85 g을 얻었다.

¹H NMR (400 MHz DMSO-d₆) δ 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.81 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.36~2.20 (m, 1H), 0.99 (d, J = 6.4 Hz, 6H)

상기에서 얻은 1-(4'-클로로페닐)-3-메틸-1-부타논 1.85 g (9.4 mmol)과 CuBr2 2.1 g (9.4 mmol)에 에틸아세테이트 14 ml 및 클로로포름 14 ml를 적가한 후, 2시간 동안 가열 환류하였다. 실온으로 냉각하여 고체를 제거한 후, 여액을 건조 및 농축하여, 백색 고체의 생성물 2-브로모-1-(4'-클로로페닐)-3-메틸-1-부타논(IIIm)을 얻었다.

(4) 2-브로모-4'-페녹시프로피오페논(화합물 IIIj)

페놀 13.2 ml (150 mmol), 탄산칼륨(K₂CO₃) 16.6 g (120 mmol) 및 4'-플루오로프로피오페논 19.4 ml (140 mmol)에 디메틸아닐린 100 ml를 적가하여, 4 시간 동안 가열 환류하였다. 실온으로 냉각하여 물을 가한 후, 디에틸에테르로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축하고, 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체의 생성물 4'-페녹시프로피오페논 27.6 g 을 얻었다.

¹H NMR (400 MHz DMSO) δ 7.99 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.49∼7.43 (m, 2H), 7.28~7.22 (m, 1H), 7.15~7.10 (m, 2H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.00 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.07 (t, J = 6.8 Hz, 3H)

디에틸에테르 20 ml에 상기와 같이 얻어진 4'-페녹시프로피오페논 11.3 g (50mmol)과 알루미늄(III)클로리드 50 mg (0.4 mmol)을 첨가하고, 0℃로 냉각시킨 후 브롬을 천천히 적가하였다. 동일 온도에서 3시간 동안 교반한 후, 물을 가하고 디에틸에테르로 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축하였다. n-헥산으로 재결정하여 2-브로모-4'-페녹시프로피오페논(IIIj)을 얻었다.

상기 실시예 3에서 얻어진 알파-브로모케톤계 화합물 IIId 내지 IIIy의 분석결과를 다음의 표 1에 나타내었다.

표 1

또한, 출발물질 IV를 다음의 반응식 5에 의하여 제조하였다:

반응식 5

실시예 4: 알파-히드록시케톤계(화합물 V) 화합물의 제조

(1) 4,4'-디클로로벤조인(Vv)의 제조

클로로벤즈알데히드 14 g (0.1 mol)에 에틸알콜 120 ml를 적가한 후, 여기에 물 10 ml에 녹인 시안화칼륨(KCN) 14.98 g (0.23 mol) 용액을 천천히 가하여 12 시간동안 가열 환류하였다. 실온으로 냉각하여 물을 가한 후, 여과 및 건조하고 재결정 또는 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 연한 노란색 고체의 생성물 4,4'-디클로로벤조인(Vv)을 얻었다.

(2) 2-히드록시-2-페닐-(4-메톡시)아세토페논(Vx)의 제조

벤조인 2.12 g (10 mmol)에 에틸알콜 50 ml 가하여 녹인 용액에 아니즈알데히드 1.36 g (2 mmol)와 포화 시안화칼륨(KCN) 수용액 30 ml를 첨가한 후, 가열 환류하여 3시간 동안 교반하였다. 상기 반응액에 물을 가하고 에틸아세테이트로 2 내지 3회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축시킨 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여 연한, 노란색 고체의 생성물 2-히드록시-2-페닐-(4-메톡시)아세토페논(Vx)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 2의 화합물 Vq 및 Vr을 각각 얻었다.

상기 실시예 4에서 얻어진 알파-히드록시케톤계 화합물 Vv, Vx, Vq 및 Vr의 분석 결과를 다음의 표 2에 나타내었다.

표 2

실시예 5: 2-아미노-3-푸로니트릴계 화합물(화합물 IV)의 제조

(1) 2-아미노-3-시아노-5-(4-클로로페닐)푸란(IVa)의 제조

상기 실시예 3에서 얻어진 2-브로모-4'-클로로아세토페논(IIIa) 11.67 g (50 mmol)과 말로노나이트릴(CH₂(CN)₂) 3.3 g (50 mmol)에 디메틸포름아미드(DMF) 20 ml를 적가한 후, 0℃로 냉각하고, 디에틸아민(Et₂NH) 15.5 ml (150 mmol)를 약 30 분간 천천히 가하였다. 이 때 반응액의 온도를 40℃를 넘지 않도록 하였다. 그리고 나서, 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 물 60 ml를 가하여 여과하고, 물과 n-헥산으로 충분히 세척한 후, 건조하였다. 에틸알콜로 재결정하여 황갈색 고체의 생성물 2-아미노-3-시아노-5-(4-클로로페닐)푸란 (IVa)을 얻었다. 동일한 방법으로 화합물 다음의 표 3의 화합물 IVb 내지 IVp 및 화합물 IVs 내지 IVu, IVx, IVy를 각각 얻었다.

(2) 2-아미노-3-시아노-4,5-디(4-클로로페닐)푸란(IVv)의 제조

상기 실시예 4에서 얻어진 4,4'-디클로로벤조인(Vv) 7g (25 mmole)과 말로노니트릴 1.98 g (30 mmol)에 디메틸포름아미드(DMF) 15 ml를 가한 후, 0℃로 냉각하여 디에틸아민 100 mmol을 약 30 분간 천천히 적가하였다. 이때 반응액의 온도가 40℃를 넘지 않도록 하였다. 실온에서 18 시간 동안 교반한 후, 물 100 ml를 가하여 여과하고, 물과 n-헥산으로 충분히 세척한 후, 건조하였다. 그리고 난 후, 디에틸에테르로 재결정하여, 황갈색 고체의 생성물 2-아미노-3-시아노-4,5-디(4-클로로페닐)푸란(IVv)을 얻었다. 동일한 방법으로 아래의 표 3의 화합물 IVq, IVr 및 IVw를 각각 얻었다.

상기에서 얻은 2-아미노-3-푸로니트릴계 화합물 IVa 내지 IVy의 분석결과를 다음의 표 3에 나타내었다.

표 3

상기 실시예 5에서 얻어진 화합물 IV를 출발물질로 하여 다음의 반응식 6과 같이 4-아미노 푸로피리미딘계 화합물 VI 및 4-클로로 푸로피리미딘계 화합물 VII를 제조하였다:

반응식 6

실시예 6: 4-아미노 푸로피리미딘계 화합물 4-아미노-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIa)의 제조

상기 실시예 5에서 얻어진 2-아미노-3-시아노-5-(4-클로로페닐)푸란(IVa) 4.37 g (20 mmol)에 포름아미드 20 ml를 적가하여 12 시간 동안 가열 환류한 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 물 100 ml를 가하고, 생성된 고체를 여과하여, 물과 n-헥산으로 충분히 세척한 후 건조하였다. 그리고 나서, 아세톤과 에틸알콜로 재결정하여 갈색 고체의 생성물 4-아미노-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIa)을 얻었다. 동일한 방법으로 다음의 표 4의 화합물 VIb 내지 VIy를 각각 얻었다.

상기 실시예 5에서 얻어진 2-아미노-3-시아노-5-(4-클로로페닐)푸란(IVa) 4.37g (20 mmol)에 포름아미드 20 ml를 적가하여 12 시간 동안 가열 환류한 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 물 100 ml를 가하고, 생성된 고체를 여과하여, 물과 n-헥산으로 충분히 세척한 후 건조하였다. 그리고 나서, 아세톤과 에틸알콜로 재결정하여 갈색 고체의 생성물 4-아미노-6-(4-클로로페닐)vn로[2,3,d]피리미딘(VIa)을 얻었다. 동일한 방법으로 다음의 표 4의 화합물 VIb 내지 VIy를 각각 얻었다.

상기와 같이 얻어진 4-아미노 푸로피리미딘계 화합물 VIa 내지 VIy의 분석결과를 다음의 표 4에 나타내었다:

표 4

실시예 7: 4-클로로 푸로피리미딘계 화합물 4-클로로-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIIa)의 제조

상기 실시예 6에서 얻어진 4-아미노-6-(4-클로로페닐)-푸로[2,3,d]피리미딘(VIa) 7.37g (30 mmol)에 클로로포름 50 ml를 적가하고, 이소아밀니트라이트 8.6 ml (65.1 mmol)을 첨가하여, 14 시간 동안 가열 환류하였다. 그리고 나서, 실온으로 냉각하여 클로로포름을 감압 하에서 제거하고, 칼럼크로마토그래피로 정제하여 노란색 고체의 생성물 4-클로로-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIIa)을 얻었다. 동일한 방법으로 아래의 표 5의 화합물 VIIb 내지 VIIy를 각각 얻었다.

상기와 같이 얻어진 4-클로로 푸로피리미딘계 화합물 VIIa 내지 VIIy의 분석결과를 다음의 표 5에 나타내었다.

표 5

실시예 8: 4,5,6-치환 푸로피리미딘계 화합물의 제조

상기 실시예 6 또는 7에서 얻어진 화합물 VI 또는 VII을 출발물질로 사용하여 본 발명의 화합물 푸로피리미딘계 화합물을 제조하였다.

반응식 7

(1) 4-아닐리노-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(5)의 제조

4-클로로-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIIa) 79.5 mg (0.3 mmol)과 아닐린 55.9 mg (0.6 mmol)에 n-부틸알콜(또는 에틸알콜 또는 이소프로필알콜) 2 ml를 적가하고, 4 시간 동안 가열 환류한 후, 용매를 제거하였다.

디메틸술폭사이드 1 ml에 녹인 후 물 15 ml에 가하여 여과한 후 물, n-헥산으로 충분히 세척, 건조하여 미색 고체 생성물 4-아닐리노-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(5)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 6의 화합물 6 내지 64, 85, 89, 91 내지 93 및 107 내지 111, 118 내지 122, 127, 132를 각각 얻었다.

(2) 4-(4-메톡시벤조일아미노)-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(66)의 제조

실시예 6에서 제조한 4-아미노-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIa) 245.66 mg (1 mmol)에 피리딘 1 ml 및 4-메톡시벤조일 클로라이드 511.8 mg (3 mmol)을 가하여 2 시간 동안 가열 환류한 후, 감압 하에서 피리딘을 제거하였다. 1N 수산화나트륨 수용액을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 소금물로 세척, 건조 및 농축시킨 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 갈색 고체 생성물 4-(4-메톡시벤조일아미노)-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(66)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 6의 화합물 65, 및 67 내지 73을 각각 얻었다.

(3) 4-(3-메톡시페녹시)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(74)의 제조

3-메톡시페놀 37.2 mg (0.3 mmol)에 테트라히드로푸란(THF) 2 ml를 적가하고 소듐하이드리드(60％ NaH) 24 mg (0.6 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 약 10분 동안 교반하였다. 반응용액에 실시예 7에서 제조한 4-클로로-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIId) 0.3 mmol을 가하고, 실온에서 2 시간동안 교반한 후, 냉각하여 물 10 ml를 천천히 적가하였다. 생성된 고체를 여과하고 충분한 물과 n-헥산으로 세척 및 건조하여, 갈색 고체 생성물 4-(3-메톡시페녹시)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(74)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 6의 화합물 75 내지 78, 126을 각각 얻었다.

(4) 4-(3-히드록시아닐리노)-5,6-디(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(90)의 제조

상기에서 제조된 4-(3-히드록시아닐리노)-5,6-디(4-메톡시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(89) 150 mg (0.31 mmol)과 피리딘 염화물 752 mg (6.51 mmol)의 혼합물을 210℃에서 3 시간 동안 가열 환류하였다. 상기 반응물에 물을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 갈색 고체 생성물 4-(3-히드록시아닐리노)-5,6-디(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(90) 15 mg을 얻었다.

(5) 4-(2-피리딜아미노)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(96)의 제조

상기 실시예 7에서 제조된 4-클로로-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIId) 265.1 mg (1 mmol)과 2-아미노피리딘 141.17 mg (1.5 mmol)을 디메틸포름아미드 3 ml에 녹인 혼합물을 0℃로 냉각하여 소듐하이드리드(60％ NaH) 80 mg (2 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 3 내지 8 시간동안 교반하였다. 상기 반응액에 포화 염화암모늄(NH4Cl) 수용액을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻은 유기층을 건조 및 농축시킨 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 갈색 고체 생성물 4-(2-피리딜아미노)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(96)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 6의 화합물 94, 95, 및 97 내지 106, 116 내지 117, 123, 125, 129 내지 131을 각각 얻었다.

(6) 4-(트란스-4-히드록시시클로헥실아미노)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(113)의 제조

상기 실시예 7에서 제조된 4-클로로-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIId) 265.1 mg (1 mmol)과 트란스-4-아미노시클로헥산올 염화물 303.3 mg (2 mmol)을 n-부틸알콜 3 ml에 녹인 혼합물에 트리에틸아민(Et₃NH) 2.2 mmol을 첨가한 후, 가열 환류하여, 3 내지 12 시간동안 교반하였다. 상기 반응액에 포화 염화암모늄(NH4Cl) 수용액을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻은 유기층을 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 4-(트란스-4-히드록시시클로헥실아미노)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(113)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 6의 화합물 112, 114 및 115를 각각 얻었다.

(7) 4-(3-히드록시페녹시)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(79)의 제조

상기에서 제조된 4-(3-메톡시페녹시)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(74) 366.86 mg (1 mmol)에 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 5 ml를 가한 후, -78℃로 냉각시키고, BBr 0.25 ml(1M in 디클로로메탄)를 천천히 적가하였다. 실온에서 12 시간 교반한 후, 포화탄산수소나트륨(Na2HCO3) 수용액에 천천히 가하여, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻은 유기층을 소금물로 세척하고 건조 및 농축시킨 후, 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 4-(3-히드록시페녹시)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(79)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 6의 화합물 19, 69, 27, 25, 22, 59, 62, 123 및 127을 사용하여 화합물 80 내지 84, 86, 87, 124, 128을 각각 얻었다.

상기에서 얻은 4,5,6-치환 푸로피리미딘계 화합물의 분석결과를 아래의 표 6-1 내지 6-12에 나타내었다.

표 6-1

표 6-2

표 6-3

표 6-4

표 6-5

표 6-6

표 6-7

표 6-8

표 6-9

표 6-10

표 6-11

표 6-12

실시예 9

상기와 같이 얻어진 화합물 VII를 이용하여, 예컨대, 다음과 같은 반응식 8에 의하여, 본 발명의 화합물의 전구체인 화합물 A를 제조할 수 있다.

반응식 8

실시예 9-1: 4-클로로-5-메틸-6-(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIII-2)의 제조

상기 실시예 7에서 얻어진 4-클로로-5-메틸-6-(4-메톡시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIIe) 1.268 g (4.6 mmol)에 디클로로메탄 10 ml를 가한 후, -78℃로 냉각시키고, BBr 13.85 ml (1M in 디클로로메탄)를 천천히 적가하였다. 그리고 나서, 실온에서 12 시간동안 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨(NaHCO3) 수용액을 천천히 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 소금물로 세척하고, 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여, 노란색 고체 생성물 4-클로로-5-메틸-6-(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIII-2: 상기 반응식 8의 화합물 VIII 중 R2=메틸인 경우에 해당)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 7의 화합물 VIII-1, VIII-3 내지 VIII-5를 각각 얻었다.

실시예 9-2: 4-클로로-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX')의 제조

(a) 상기 실시예 9-1에서 얻은 4-클로로-5-메틸-6-(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIII-2) 859 mg (3.3 mmol), 세슘카보네이트(Cs2CO3) 2.37 g (7.26 mmol) 및 디메틸포름아미드 5 ml 혼합물에 2-클로로에틸 파라-톨루엔술포네이트 1.32 ml (7.26 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 상기 반응액에 물 20 ml를 가하고 여과한 후, 에틸아세테아트로 세척하였다. 여액을 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여 흰색 고체 생성물 4-클로로-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(상기 반응식 8의 화합물 IX': 반응식 1의 화합물 IX 중 n'=2인 경우에 해당) 205 mg을 얻었다. (수율: 19%)

(b) 상기 실시예 9-1에서 얻은 4-클로로-5-메틸-6-(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIII-2) 130.34 mg (0.5 mmol), 트리페닐포스핀(PPh₃) 262.29mg (1 mmol) 및 벤젠(C₆H₆)/테트라히드로푸란(THF) 1/3 ml 혼합물에 2-클로로에틸알콜 0.067 ml (1 mmol)를 첨가한 후 0℃로 냉각시킨 후 약 10분동안 교반하였다. 상기 반응액에 디이소프로필 아조디카르복실레이트(DIAD) 0.097 ml (1 mmol)를 가하여 실온에서 12시간 동안 교반한다. 상기 반응액에 포화소금물(NaCl) 20 ml를 가하고 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여 흰색 고체 생성물 4-클로로-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘[상기 반응식 8의 화합물 IX'(IX-2): 반응식 1의 화합물 IX 중 n'=2, R2=메틸인 경우에 해당] 148 mg을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 표 7의 화합물 IX-1, IX-3 내지 IX-5를 각각 얻었다.

표 7

실시예 9-3: 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(X')의 제조

상기 실시예 9-2에서 얻어진 4-클로로-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX-2) 79 mg (0.25 mmol)과 3-아미노페놀 53.5 mg (0.5 mmol)에 n-부틸알콜 2 ml를 가하여 4시간 동안 가열 환류하였다. 용매를 제거한 후, 물을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축하였다. 그리고 나서, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여, 갈색 고체 생성물 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘[상기 반응식 8의 화합물 X'(X-2): 반응식 1의 화합물 X 중 n'=2, R2=메틸인 경우에 해당] 80 mg을 얻었다 (수율: 83%). 동일한 방법으로 하기의 표 8-1의 화합물 X-1, X-3 내지 X-7 각각 얻었다.

실시예 9-4: 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-{4-[2-(4-몰포리닐)에톡시]페닐}푸로[2,3,d]피리미딘(A-1)의 제조

상기 실시예 9-3에서 얻어진 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(X-2) 19 mg (0.048 mmol)과 요오드화나트륨(NaI) 7 mg (0.046 mmol)에 과량의 몰포린 0.07 ml (0.8 mmol)를 첨가하고 90℃에서 24 시간동안 교반하였다. 상기 반응물에 포화탄산수소나트륨(Na2HCO3) 수용액을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여, 황색 고체 생성물 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-{4-[2-(4-몰포리닐)예톡시]페닐}푸로[2,3,d]피리미딘(A-2) 15 mg을 얻었다 (수율: 71 %). 동일한 방법으로 화합물 A-1, A-3 내지 A-17 각각 얻었다. 상기에서 얻은 화합물의 분석결과를 아래의 표 8-1 내지 8-3에 나타내었다.

표 8-1

표 8-2

상기 실시예 9-3에서 얻어진 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(X-2) 19 mg (0.048 mmol)과 요오드화나트륨(NaI) 7 mg (0.046 mmol)에 과량의 모르포린 0.07 ml (0.8 mmol)를 첨가하고 90 ℃에서 24 시간동안 교반하였다. 상기 반응물에 포화 탄산수소나트륨(Na₂HCO₃)수용액을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여, 황색 고체 생성물 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-4-[2-(4-몰포리닐)에톡시]페닐푸로[2,3,d]피리미딘(A-1) 15 mg을 얻었다. (수율 : 71 %) 동일한 방법으로 화합물 A-1, A-3 내지 A-17 각각 얻었다. 상기에서 얻은 화합물의 분석결과를 아래의 표 8-1 내지 8-3에 나타내었다.

표 8-3

실시예 10

상기와 같이 얻어진 화합물 VIII을 이용하여, 예컨대, 다음과 같은 반응식 9에 의하여, 본 발명의 화합물의 전구체인 화합물 B를 제조할 수 있다.

반응식 9

실시예 10-1: 4-클로로-5-메틸-6-[4-(메틸 2-아세톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(XV'-1)의 제조

상기 실시예 9-1에서 얻은 4-클로로-5-메틸-6-(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIII-2) 260.68 mg (1 mmol),세슘카보네이트(Cs₂CO₃) 716.8 g (2.2 mmol) 및 디메틸포름아미드 5 ml 혼합물에 메틸2-브로모아세토페논 336.5 mg (2.2 mmol)를 첨가한 후, 60℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 상기 반응액에 물 20 ml를 가하고 여과한 후, 에틸아세테아트로 세척하였다. 여액을 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축한 후, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여 흰색 고체 생성물 4-클로로-5-메틸-6-[4-(메틸 2-아세톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(상기 반응식 9의 화합물 XV': 반응식 1의 화합물 XV 중 m=1, R₂=메틸, R₆=메틸인 경우에 해당) 296 mg을 얻었다. (수율: 89 %) 동일한 방법으로 화합물 XV'-2(상기 반응식 9의 화합물 XV': 반응식 1의 화합물 XV 중 m=1, R₂=(4-클로로페닐), R₆=메틸인 경우에 해당)를 얻었다.

¹H NMR (400 MHz CDCl₃) δ (ppm) 8.68 (s, 1H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.72 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.61 (s, 3H)

화합물 XV'-2: ¹H NMR (400 MHz CDCl₃) δ (ppm) 8.66 (s, 1H), 7.51∼7.41 (m, 4H), 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.60 (s, 2H), 3.75 (s, 3H)

실시예 10-2: 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-[4-(메틸 2-아세톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(XVI'-1)의 제조

상기 실시예 10-1에서 얻어진 4-클로로-5-메틸-6-[4-(메틸2-아세톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(XV'-1) 83.18 mg (0.25 mmol)과 3-아미노페놀 53.5 mg (0.5 mmol)에 n-부틸알콜 2 ml를 가하여 4시간 동안 가열 환류하였다. 용매를 제거한 후, 물을 가하고, 에틸아세테이트로 2 내지 3 회 추출하여 얻어진 유기층을 건조 및 농축하였다. 그리고 나서, 칼럼크로마토그래피에 의하여 정제하여, 갈색 고체 생성물 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-[4-(메틸2-아세톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(상기 반응식 9의 화합물 XVI': 반응식 1의 화합물 XVI 중 m=1, R₂=메틸, R₆=메틸인 경우에 해당) 73 mg을 얻었다. (수율 72%) 동일한 방법으로 화합물 XVI'-2(상기 반응식 9의 화합물 XVI': 반응식 1의 화합물 XVI 중 m=1, R₂=(4-클로로페닐), R₆=메틸인 경우에 해당)를 얻었다.

¹H NMR (400 MHz DMSO-d₆) δ (ppm) 9.43 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.68 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.26~7.00 (m, 5H), 6.52 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 4.90 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.60 (s, 3H)

화합물 XVI'-2: ¹H NMR (400 MHz DMSO-d ₆) δ (ppm) 9.48 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.71~7.65 (m, 4H), 7.08 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.07 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.02∼6.97 (m, 3H), 6.90 (s, 1H), 6.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.84 (s, 2H), 3.70 (s, 3H)

실시예 10-3: 4-(3-히드록시아닐리노)-5-(4-클로로페닐)-6-[4-(카르복실릭메톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(XVI'-2)의 제조

상기 실시예 10-2에서 얻어진4-(3-히드록시아닐리노)-5-(4-클로로페닐)-6-[4-(메틸 2-아세톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(XVI'-2) 24mg (0.047 mmol)에 테트라히드로푸란(THF) 0.5 ml를 적가하고 0℃에서 0.1N-LiOH 0.056 ml (0.056 mmol)를 천천히 적가한 후 실온에서 1시간 동안 교반한다. 상기 반응액에 물(1 ml)를 첨가하고 에틸아세테이트(1ml)로 2 내지 3회 세척 한 후 1N-염산수용액 0.061 ml (0.061 mmol)로 중화시켜 에틸아세테이트로 2 내지 3회 추출한다. 얻어진 용액을 건조, 농축하여 화합물 4-(3-히드록시아닐리노)-5-(4-클로로페닐)-6-[4-(카르복실릭메톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(XVII'-2) 21 mg(수율 99%)을 얻었다.(상기 반응식 9의 화합물 XVII': 반응식 1의 화합물 XVII 중 m=1, R2=(4-클로로페닐), R6=메틸인 경우에 해당) 동일한 방법으로 화합물 XVII'-1을 얻었다.

¹H NMR (400 MHz DMSO-d ₆) δ (ppm) 9.50 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.70~7.64 (m, 4H), 7.39 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.07 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.01 (s. 1H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.91 (s, 1H), 6.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.44 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 4.68 (s, 2H)

실시예 11

상기와 같이 얻어진 화합물 VII을 이용하여, 예컨대, 다음과 같은 반응식 10에 의하여, 본 발명의 화합물의 전구체인 화합물 XXIII을 제조할 수 있다.

반응식 10

실시예 11-1: 4-클로로-5-브로모-6-(4-메톡시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(XVIII)의 제조

상기 실시예 7에서 얻어진 4-클로로-6-(4-메톡시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIIb) 380 mg (1.46 mmol)과 N-브로모숙신이미드 359.23 mg (1.53 mmol), α,α'-아조비스(이소브티로니트릴) 47.5 mg (0.146 mmol)에 카본테트라클로라이드 25 ml를 첨가한 후 12시간 동안 교반 환류한다. 실온으로 냉각시킨 후 농축하여 칼럼크로마토그래피 정제에 의해 4-클로로-5-브로모-6-(4-메톡시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(XVIII) 230 mg을 얻었다.(수율: 55 %)

¹H NMR (400 MHz CDCl₃) δ (ppm) 8.73 (s, 1H), 8.16 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H)

실시예 11-2: 4-클로로-5-브로모-6-(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIII-3)의 제조

상기 실시예 9-1과 동일하게 진행하여 4-클로로-5-브로모-6-(4-히드록시페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(VIII-3)을 얻었다.

상기에서 얻은 화합물의 분석결과를 상기 표 7에 나타내었다.

실시예 11-3: 4-(3-히드록시아닐리노)-5-브로모-6-{4-[2-(3-메틸피퍼리디닐)에톡시]페닐}푸로[2,3,d]피리미딘(A-12)의 제조

상기 실시예 9-2, 실시예 9-3, 실시예 9-4를 순차적으로 진행하여 4-(3-히드록시아닐리노)-5-브로모-6-{4-[2-(3-메틸피퍼리디닐)예톡시]페닐}푸로[2,3,d]피리미딘(A-12)을 얻었다.

상기에서 얻은 화합물의 분석결과를 상기 표 8-1 내지 표 8-2에 나타내었다.

반응식 11

실시예 12

실시예 12-1: 4-클로로-5-브로모메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX-6)의 제조

상기 실시예 9-1에서 얻어진 4-클로로-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX-2)를 사용하여 실시예 11-1과 동일하게 진행하였다.

¹H NMR (400 MHz CDCl₃) δ (ppm) 8.71 (s, 1H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 4.34 (t, J =6.0, 2H), 3.88 (t, J = 6.0, 2H)

실시예 12-2: 4-클로로-5-메톡시메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX-7)의 제조

상기 실시예 9-1에서 얻어진4-클로로-5-메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX-6) 160mg (0.04 mmol)에 메틸알콜 15 ml를 첨가한 후 6시간 동안 교반 환류한다. 상기 용액을 농축하여 칼럼크로마토그래피 정제에 의해 흰색 고체 4-클로로-5-메톡시메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX-7) 73mg (수율: 52 %)과 부 생성물로 4-메톡시-5-메톡시메틸-6-[4-(2-클로로에톡시)페닐]푸로[2,3,d]피리미딘(IX-7-1) 60 mg (수율: 43 %)을 각각 얻었다.

화합물 IX-7: ¹H NMR (400 MHz CDCl₃) δ (ppm) 8.67 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.08 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.75 (s, 2H), 4.32 (t, J = 6.0, 2H), 3.87 (t, J = 6.0, 2H), 3.58 (s, 3H)

화합물 IX-7-1: ¹H NMR (400 MHz CDCl₃) δ (ppm) 8.52 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.30 (t, J = 6.0, 2H), 4.17 (s, 3H), 3.86 (t, J = 6.0, 2H), 3.50 (s, 3H)

실시예 12-3: 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메톡시메틸-6-{4-[2-(3-메틸피퍼리디닐)에톡시]페닐}푸로[2,3,d]피리미딘(A-13)의 제조

상기 실시예 9-3, 실시예 9-4를 순차적으로 진행하여 4-(3-히드록시아닐리노)-5-메톡시메틸-6-{4-[2-(3-메틸피퍼리디닐)에톡시]페닐}푸로[2,3,d]피리미딘(A-13)을 얻었다.

반응식 12

실시예 13: 2,4,5,6-치환 푸로피리미딘계 화합물의 제조

실시예 13-1: 2-클로로메틸-4-클로로-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(XII-A)

상기 실시예 5에서 얻어진 2-아미노-3-시아노-5-(4-클로로페닐)푸란(IVd) 2.32g (10 mmol)을 디옥산 30 ml에 희석한 후 클로로아세토니트릴 0.69 ml(11 mmol)을 적가한다. 실온에서 염산 기체를 반응 용액에 6시간 동안 지속적으로 발생시키면서 교반한 후 12시간동안 방치한다. 반응용액을 물 100 ml에 가하여 생성된 고체를 여과하여 물, n-헥산으로 충분히 세척하여 건조하여 흰색 고체 2-클로로메틸-4-아미노-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(XI-A)을 544 mg 얻었다.(수율: 17%) 여액에 10% 암모니아수용액을 15 ml가하고 에틸아세테이트로 2~3회 추출하여 건조, 농축한 후 칼럼크로마토그래피로 정제하여 옅은 노란색 고체 2-클로로메틸-4-클로로-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(XII-A)을 2.09 g 얻었다. 동일한 방법으로 다음의 표 9의 화합물 XI-B, XI-C 및 XII-B 내지 XII-L을 각각 얻었다. 또한 R"가 수소인 경우는 상기 실시예 6 및 7을 순차적으로 진행하여 화합물 VI, 화합물 VII을 얻었다.

상기에서 얻은 화합물의 분석결과를 아래의 표 9에 나타내었다.

표 9

실시예 13-2: 2-클로로메틸-4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(141)

실시예 13-1에서 얻어진 2-클로로메틸-4-클로로-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(XII-A) 163.8 mg (0.5 mmol)과 3-아미노페놀 109.13 mg (1 mmol)에 n-부틸알콜 3 ml를 적가하고, 4 시간 동안 가열 환류한 후, 용매를 제거하였다. 디메틸술폭사이드 1 ml에 녹인 후 물 20 ml에 가하여 여과한 후 물, n-헥산으로 충분히 세척, 건조하여 미색 고체 생성물 2-클로로메틸-4-(3-히드록시아닐리노)-5-메틸-6-(4-클로로페닐)푸로[2,3,d]피리미딘(141)을 얻었다. 동일한 방법으로 하기의 화합물 142 내지 155를 각각 얻었다.

상기에서 얻은 2,4,5,6-치환 푸로피리미딘계 화합물의 분석결과를 아래의 표 10에 나타내었다.

표 10

Ⅱ. 본 발명의 화합물의 생물학적 활성 평가

이하, 상기에서 얻어진 화합물에 대한 DDR2의 생물학적 활성 평가 실험을 상세히 기술하고자 한다.

실시예 14: 본 발명의 화합물의 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성에 대한 저해 활성 측정

Tris-HCl(pH 7.5), MgCl₂ 5 mM, 활성화된 DDR2 키나아제 효소 단백질 100ng(한국특허출원 제2002-0067233호 및 한국특허출원 제2003-0076967호에 기재된 방법으로 제조됨), ATP 10 uM 및 P32-감마-ATP 0.2 uCi의 혼합 용액 20ul에서 펩타이드 기질로서 바이오틴이 부착된 폴리(D4Y)n(Promega, USA) 또는 히스톤 H2B 단백질 2 ug을 사용하여 10 내지 30 분간 반응시킨 후, 1/2 부피의 30% 인산 용액을 가하여 반응을 종결하였다.

이 반응액을, 바이오틴이 부착된 폴리(D4Y)n을 펩타이드 기질로 사용하는 경우에는 아비딘으로 코팅된 멤브레인(Promega, USA)에 스포팅하고, 히스톤을 기질로 사용하는 경우에는 p81 셀룰로오스 종이에 스포팅을 하였다. 두 경우 효소 반응 활성 측정에서 같은 결과를 보여 주었다. 이를 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 100 mM NaCl 용액으로 5 번 씻어낸 후, 멤브레인에 부착된 인산화된 펩타이드에서 발생하는 방사능을 BAS 방사능 이매징 측정기(Kodak)로 측정하여 효소 반응 정도를 정량하여, DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 측정하였다.

DDR2 키나아제 활성부위의 자가 인산화 활성 측정을 위해서는 상기의 조건에서 펩타이드 기질을 제외한 반응액에서 반응시킨 후 반응물을 10% PAGE겔에서 전기영동 후 쿠마지 염색하여, DDR2 키나아제 활성 부위 단백질의 존재를 확인 한 후, 이 겔을 건조하고 X-ray 필름을 이용한 오토라디오그라피를 하여, DDR2 단백질 부위의 자가 인산화 정도를 측정하였다.

화합물의 저해 활성 측정을 위하여, 효소반응 용액에 DMSO에 녹아 있는 화합물을 여러 농도로 미리 첨가한 후, DDR2 키나아제 효소를 첨가하여 효소반응을 진행하여 각 화합물의 특정 농도에서 효소 활성의 저해정도를 측정하고, 50 % 효소활성을 저해하는 각 화합물의 농도를 그 화합물의 IC₅₀(50% 활성 저해를 주는 농도값)으로 구하여 아래의 표 11에 나타내었다.

표 11

상기 표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 화합물은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성에 의하여 야기되는 간경화, 류머티즘 및 암의 전이에 대하여 치료 효과를 나타낼 것으로 기대될 수 있다.

이하의 실험에서는 본 발명의 화합물의 대표 화합물로서 상기 표 6의 번호 100 화합물을 사용하였으나, 상기 표 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 대표 화합물에 대한 효과는 그 외의 본 발명의 다른 화합물에도 적용된다고 예측할 수 있다.

본 발명의 화합물의 DDR2 티로신 키나아제 저해 기전을 확인하는 실험으로 대표 화합물 100(표6)의 0 uM, 0.2 uM, 1.2 uM의 각 농도에서 기질인 ATP 양을 변화시키며 상기한 효소 활성 측정법에 따라 반응속도를 구한 후 이를 통상적으로 알려진 리시프로칼 프로팅(Lubert Stryer, 생화학 제 4 개정판, 서울외국서적, pp. 202-205)을 했을 때 화합물의 농도에 따른 y 절편과 x 절편의 변화를 조사하였다. 도 1에서 보여 준 바와 같이 화합물의 농도에 따른 y 절편의 변화가 없는 것은 최대 반응 속도 Vmax는 변화가 없고 Km값을 나타내는 x 절편이 변화하는 것은 본 발명의 DDR2 키나아제 활성 저해 화합물이 ATP 경쟁적 기전에 의해 DDR2 키나아제 활성을 저해함을 증명한다.

실시예 15: 본 발명의 화합물의 HSC T6 세포내의 DDR2 단백질의 티로신 인산화 억제 활성 측정

HSC T6 세포(프리드만 교수, 마운트 사이나이 의과대학, 뉴욕, 미국) 20만개를 6웰 배양디쉬의 각 웰에 프레이팅한 후 24시간 배양하고 콜라겐 10ug/ml 농도로 24 시간 처리하거나, 콜라겐 10 ug/ml 농도와 함께 DMSO에 녹인 본 발명의 화합물 (표 6의 번호 100)을 농도별(0, 5, 10 및 20 uM)로 각각 24 시간 처리한 후, 1x 램리(lameli) 용액으로 세포를 회수하여 파쇄하고, 이 세포 파쇄액을 7 % PAGE 겔에서 전기영동 하였다. 겔의 전개된 단백질을 나이트로 셀룰로오스 종이에 이동시킨 후, 인간 DDR2를 특이적으로 인식하는 항체로 웨스턴 브로팅을 하여 130,000 달톤 분자량 위치에 DDR2 단백질의 양이 크게 차이가 없음과 그 위치를 확인하고, 이 멤브레인을 스트리핑한 후, 다시 인산화된 티로신을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 브로팅하여, DDR2가 위치한 부위의 티로신 인산화 정도가 대표 화합물 100의 처리 농도에 따라 감소함 확인하고, 이를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 이미 타 연구자들에 의해 보고된 결과와 일치하게 콜라겐 처리에 의해 HSC T6 세포내의 DDR2의 티로신 인산화가 유도됨을 확인할 수 있었고, 이러한 DDR2의 티로신 인산화는 DDR2 키나아제의 활성화를 의미하는 것이다. 그러나, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 본 발명의 대표 화합물 100의 처리에 의하여 콜라겐에 의한 DDR2 단백질의 티로신 인산화가 감소하는 것을 또한 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 콜라겐에 의한 DDR2 단백질의 활성화를 억제하는 활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 16: 본 발명의 화합물의 세포 증식 억제 활성 측정

본 발명의 화합물의 세포성장 억제능을 측정하기 위하여 간 성상세포 HSC-T6, HT 1080 및 Rat2 세포에 대한 활성을 각각 측정하여 비교하였다, 상기 세포들을 96웰 배양접시에 각 웰 당 1000 개의 세포씩 접종하였다. 접종 24 시간 후, day 0의 세포수를 정량하기 위하여 3개의 웰을 포르말린으로 픽싱하고 나머지 웰은 DMSO에 녹인 본 발명의 화합물(표 6의 번호 100)을 농도를 달리하여 처리하고, 48 시간 후(day 2)에 포르말린 용액으로 픽싱하였다. 여기에, 설퍼로다마인 B를 처리하여 염색한 후, 염색된 다이를 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)으로 추출하여, 이를 A520에서 흡광도를 측정하여 세포 수를 정량하였다. 흡광도는 웰에 존재하는 살아있는 세포수를 상대적으로 나타낸다. day 0의 웰의 흡광도를 0%으로 하고, 화합물을 처리하지 않고 이틀간 방치한 웰의 흡광도를 100%로, 그리고 웰에 살아있는 세포가 전혀 없어서 흡광도가 0이 나오는 상태를 -100%로 하여 각 화합물의 농도에서의 흡광도를 비례식으로 환산하여 화합물이 처리된 각 웰의 % 세포 생존도로 나타내었다. 각 실험은 n=3로 행해졌으며 측정값은 평균값을 구하여 나타내었다. 상기 세포는 5% 이산화탄소및 37℃하에서, HSC-T6 세포는 DMEM +10% FBS에서, 나머지 세포는 RPM116 40+10% FBS에서 배양하였다.

상기 시험 결과를 도 3에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 다른 세포와 비교하여 간 성상세포 HSC-T6 (-●-)에 대하여 상대적으로 높은 증식 억제활성을 보이는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 화합물은 간 성상세포에 대하여 선택적 성장 억제활성을 갖는다는 것을 확인 할 수 있다.

실시예 17: 본 발명의 화합물의 간 성상세포의 세포사멸 (apoptosis) 유도 확인

HSC T6 세포에 DMSO에 녹인 본 발명의 화합물(표 6의 번호 100)을 농도 별로 처리하고, 24 시간 후에 전체 게놈 DNA를 통상적인 방법으로 추출하였다.

세포사멸은 DNA의 절편화를 측정함으로써 확인하였다. 상기 추출한 DNA를 1.2% 아가로오스 젤에서 전개시킨 후, EtBr로 염색하여 UV 하에서 절편이 일어난 DNA를 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물의 높은 처리 농도에서 절편이 일어난 DNA가 많이 관찰되는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 HSC T6 세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 확인할 수 있다.

day 0의 웰의 흡광도를 0%으로 하고, 화합물을 처리하지 않고 이틀간 방치한 웰의 흡광도를 100%로, 그리고 웰에 살아있는 세포가 전혀 없어서 흡광도가 0이 나오는 상태를 -100%로 하여 각 화합물의 농도에서의 흡광도를 비례식으로 환산하여 화합물이 처리된 각 웰의 % 세포 생존도로 나타내었다. 각 실험은 n=3로 행해졌으며 측정값은 평균값을 구하여 나타내었다. 상기 세포는 5% 이산화탄소 및 37 ℃하에서, HSC-T6 세포는 DMEM +10% FBS에서, 나머지 세포는 RPMI1640+10% FBS에서 배양하였다.

7주령의 whistar rat의 담즙관을 봉합하여 간경화를 유도하였다. 여기에 DMSO에 녹인 본 발명의 화합물(표 6의 번호 100)을 10mg/kg의 농도로 매일 2주간 꼬리정맥에 주사 하였다. 대조군으로 담즙관 봉합 후 DMSO만(캐리어)을 주사한 것을 사용하였고 정상 대조군으로는 담즙관 봉합없이 모조 수술을 한 쥐를 사용하였다. 간 조직의 콜라겐 정량은 간 조직 내의 하이드록시 프로린 양을 통상적인 방법으로 정량하여 그 결과를 하기의 표 12에 나타내었다.

표 12

상기 표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 답즙관 봉합 시술을 한 경우가 하지 않은 경우 보다 하이드록시 프롤린 수치가 증가하는 것에 의하여 담즙관 봉합 시술에 의하여 간 경화가 유발되었음을 확인할 수 있으며, 이와 같이 간경화가 유발된 경우에 있어서, 본 발명의 화합물이 처리된 경우가 처리되지 않은 경우보다 하이드록시 프롤린 수치의 증가가 완화되는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 간 경화에 대하여 항 섬유화 활성을 갖는다고 할 수 있다.

실지로 담즙관 봉합에 의해 간 경화를 유발한 쥐의 간 조직에 본 발명의 화합물이 처리된 경우 콜라겐 침착이 감소함을 확인한 또 다른 방법으로 간 조직을 동결한 후 얇은 절편을 만들고 이 절편을 일반적으로 조직 내의 콜라겐 침착을 염색하는 방법인 마손 염색법을 이용하여 염색하여 400배 배율의 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 푸른색으로 염색된 부분이 침착된 콜라겐이 염색된 것이고 붉은색으로 염색된 부분은 간 조직내의 세포들이다.

실시예 19: 본 발명의 화합물의 활막 섬유아세포 증식 억제 활성 측정

5 % 이산화탄소를 공급하면서 10 % FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 37℃의 동물세포 배양기에서 배양한 류머티즘 환자에게서 추출한 활막 섬유아세포를 24 웰 배양접시에 한 웰당 5000개씩 접종한 후 하루를 더 배양하였다. 3개의 웰은 배지와같은 부피의 포르말린을 첨가하여 30 분간 픽싱하고 물로 씻은 후 건조시키고, 나머지 웰은 본 발명의 화합물 (표 6의 번호 100)을 농도별로 n=3으로 48 시간 처리하여 배양하거나, 또는 화합물을 처리하지 않고 48 시간을 연속적으로 배양한 후, 각 웰에 배지와 같은 부피의 포르말린을 첨가하여 30 분간 픽싱하고 물로 씻은 후 건조하였다. 포르말린 픽싱된 세포를 설퍼로다마인B 용액으로 통상적인 방법으로 염색한 후 이를 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 용액으로 세포에 흡착된 설퍼로다마인을 우려낸 후 520 nM 파장에서 흡광도를 측정하여 각 웰에 있는 상대적인 세포수를 정량하였다. 화합물을 처리하기 직전의 웰에 있는 세포수 (즉, 흡광도)를 기준점(0%)으로 하고 화합물을 처리하지 않고 48시간 연속적으로 배양한 웰의 세포수 (즉, 흡광도)를 100%로 하고 웰의 세포가 완전히 사멸하여 없을 때(즉, 흡광도 0)를 -100%로 하여, 48 시간 동안 본 발명의 화합물을 각 농도별로 처리했을 때의 세포수(즉, 흡광도)를 비례식으로 계산하여 각 화합물 농도에서의 % 세포 생존률을 구하여 도 7에 나타내었다.

도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 활막 섬유아세포의 증식에 대하여 억제 활성을 가지며, 이러한 증식 억제 활성은 처리된 화합물의 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 화합물은 활막 섬유아세포의 이상 증식에 의하여 유발되는 류머티즘에 대하여 치료효과를 갖는다고 할 수 있다.

실시예 20: 본 발명의 화합물의 MMP-1 mRNA에 대한 효과 측정

류머티즘 환자로부터 추출된 활막 섬유아세포를 지름 10 cm의 배양접시에서 10 % FBS를 포함하는 DMEM 배지와 5 % CO₂ 조건에서 배양한 후 배양접시의 세포밀도가 50% 정도 되어 세포가 활발히 자라고 있을 때 DMSO에 녹인 본 발명의 화합물을 10 uM의 농도로 24 시간 처리하거나 대조군으로 화합물을 처리하지 않고 24 시간 방치한 후 배양접시 내의 세포에 있는 전체 RNA를 정제하였다. 정제는 GIBCO BRL사에서 구입한 Triazol Reagent(카탈로그 번호: 15596-026)를 이용하였고, 그 정제방법은 GIBCO BRL사가 Triazol Reagent를 판매시 함께 제공하는 "Instruction for RNA Isolation" 방법에 따라 분리하였다. 정제된 전체 RNA 10 ug을 포름알데히드-아가로오스 겔에서 전기영동 후, 나이트란 멤브레인에 mRNA를 이동시켰다. MMP-1 c-DNA 절편을 이용하여 베린저 인겔하임에서 구매한 키트를 이용하여 32P 방사성 동위원소로 표식된 MMP-1 프로브를 제작하였다. 이와 같이 제작된 프로브를 이용하여 통상적인 노던 브로팅을 하여 MMP-1의 mRNA 양을 정량하였다.

상기 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물을 처리한 경우(10 uM)와 처리하지 않은 경우(0 uM)를 비교하여 볼 때, 본 발명의 화합물이 MMP-1의 mRNA 양을 감소시키는 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 MMP-1 양의 증가에 의하여 유발되는 류머티즘에 대하여 치료 활성을 갖는다고 할 수 있다.

본 발명의 신규한 푸로피리미딘 화합물들은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성에 대하여 뛰어난 억제활성을 가지며, 이러한 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 억제 활성에 의하여, DDR2의 티로신 키나아제 활성에 의하여 유발되는 각종 질병의 치료제로서 적용가능하고, 특히 간경화, 류머티즘 또는 암의 치료제로서 유용하다.

본 발명의 신규한 푸로피리미딘 화합물들은 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성에 대하여 뛰어난 억제활성을 가지며, 이러한 DDR2 단백질의 티로신 키나아제 억제 활성에 의하여, DDR2의 티로신 키나아제 활성에 의하여 유발되는 각종 질병의 치료제로서 적용 가능하고, 특히 간경화 또는 류머티즘의 치료제로서 유용하다.

Claims

다음의 화학식 1로 정의되는 푸로피리미딘 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:

[화학식 1]

상기 식 중,

Z는 O 또는 NH이고,

n은 0에서 4 사이의 정수이고,

R₁은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, 또는 C1-C4의 알킬티오기이고,

R''은 수소, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4 알킬에스테르, 모르폴린, 또는 C1-C4의 알콕시기 또는 할로겐이 치환된 페닐기이고,

상기 A 링은 벤젠, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 피페리딘, 벤조일, 또는 모르폴린이고,

R₂는 할로겐, C1-C5의 알킬기, 또는 C1-C7의 알콕시기이고,

R은 수소, 할로겐, 니트로, 히드록시, C1-C7의 알콕시기, 또는 C1-C4의 알킬티오기이다.
다음의 화학식 2로 정의되는 푸로피리미딘 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:

[화학식 2]

상기 식 중,

R₃는, 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 또는 C1-C4의 알킬기이고,

B 링은 피리미딘, 피롤리딘, 피페라진, 모르포린, 티오모르포린이고,

R₂는 할로겐, C1-C5의 알킬기이다.
삭제
삭제
다음의 화학식 XI 또는 XII로 정의되는 푸로피리미딘 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:

[화학식 XI]

[화학식 XII]

R₂는 할로겐, C1-C5의 알킬기, 또는 C1-C7의 알콕시기이고,

R는 수소, 할로겐, 니트로, 히드록시, C1-C4의 알킬기, C1-C7의 알콕시기, 또는 C1-C4의 알킬티오기이고,

R''는 수소, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4 알킬에스테르, 모르포린, C1-C4의 알콕시기 또는 할로겐이 치환된 페닐기이다.
유효성분으로서 다음의 화학식 1, 화학식 2, 화학식 XI 또는 화학식 XII로 정의되는 신규한 푸로피리미딘 유도체 및 그의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상을 치료적 유효량으로 포함하는, 간경화 또는 류머티즘의 치료를 위한 DDR2 단백질의 티로신 키나아제의 활성 억제제.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 XI]

[화학식 XII]

상기 식 중,

Z는 O 또는 NH이고,

n은 0에서 4 사이의 정수이고,

R₁은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, 또는 C1-C4의 알킬티오기이고,

상기 A 링은 벤젠, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 피페리딘, 벤조일, 또는 모르폴린이고,

상기 B 링은 피리미딘, 피롤리딘, 피페라진, 모르포린, 티오모르포린이고,

R₂는 할로겐, C1-C5의 알킬기, 또는 C1-C7의 알콕시기이고,

R은 수소, 할로겐, 니트로, 히드록시, C1-C7의 알콕시기, 또는 C1-C4의 알킬티오기이고,

R₃는, 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 또는 C1-C4의 알킬기이고,

R''는 수소, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4 알킬에스테르, 모르포린, C1-C4의 알콕시기 또는 할로겐이 치환된 페닐기이다.
제6항에 있어서, 약리적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 포함하는 것인 DDR2 단백질의 티로신 키나아제의 활성 억제제.
유효성분으로서 다음의 화학식 1, 화학식 2, 화학식 VII 또는 화학식 XI로 정의되는 신규한 푸로피리미딘 유도체 및 그의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상을 치료적 유효량으로 포함하는, DDR2 단백질의 티로신 키나아제 활성으로 인하여 유발되는 간경화 또는 류머티즘의 치료를 위한 약학적 조성물:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 XI]

[화학식 XII]

상기 식 중,

Z는 O 또는 NH이고,

n은 0에서 4 사이의 정수이고,

R₁은 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, 아미노, CO₂H, CONH₂, CSNH₂, 아미딘, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4의 알킬아미노기, 또는 C1-C4의 알킬티오기이고,

상기 A 링은 벤젠, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 피페리딘, 또는 모르폴린이고,

상기 B 링은 피리미딘, 피롤리딘, 피페라진, 모르포린, 티오모르포린이고,

R₂는 할로겐, C1-C5의 알킬기, 또는 C1-C7의 알콕시기이고,

R은 수소, 할로겐, 니트로, 히드록시, C1-C7의 알콕시기, 또는 C1-C4의 알킬티오기이고,

R₃는, 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 또는 C1-C4의 알킬기이고,

R''는 수소, C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, C1-C7의 알콕시기, C1-C4 알킬에스테르, 모르포린, C1-C4의 알콕시기 또는 할로겐이 치환된 페닐기이다.
삭제
제8항에 있어서, 약리적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.