KR100881058B1 - Ｗｎｔ５ａ 단백질의 억제제를 포함하는 신경교아종 치료및 예방용 조성물 - Google Patents
Ｗｎｔ５ａ 단백질의 억제제를 포함하는 신경교아종 치료및 예방용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신경교아종에서 Wnt5a 단백질의 새로운 역할 규명에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Wnt5a 단백질의 발현이나 작용의 억제제를 포함하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 신경교아종세포의 증식과 종양형성능에 영향을 미치는 Wnt5a 단백질 발현을 siRNA 또는 shRNA 등과 같은 RNA 간섭(interference)을 이용하여 조절함으로써 신경교아종 유전자 치료제 개발에 이용 되어질 수 있다.
Description
본 발명은 신경교아종에서 Wnt5a 단백질의 새로운 역할 규명에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Wnt5a 단백질의 발현이나 작용의 억제제를 포함하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.
다형성 신경교아종은 발생빈도가 가장 높고 치료가 어려운 뇌종양이다. 그러나 최근에 다양한 유전적 변화를 이용하여 신경교아종 발생에 관여한 치료법이 제시 되고 있다. 신경교아종이 발생함에 따라 다양한 유전적 변화가 일어남이 보고된 바 있으며, 이러한 인자를 과 증식 또는 억제를 통한 종양치료방법이 이용되어 지고 있다. (A.D. Norden 등, Glioma therapy in adults, Neurologist 12 (2006) 279-292)
그 중 Wnt2, Wnt7b, Wnt5a와 같은 Wnt 유전자 들이 다양한 종양형성에 관여한다고 보고된 있다. (M.J. Smalley 등, Wnt signalling in mammalian development and cancer, Cancer Metastasis Rev. 18 (1999) 215?230 ; M. Jonsson 등, Wnt and fibroblast growth factor gene expression during development of the mammary gland and role of wnts in human cancer, in: R.B. Dickson 등, Hormones and Growth Factors in Development and Neoplasia, Wiley & Liss, New York (1998) 361?382))
Wnt5a는 갑상선암(N. Kremenevskaja 등, Wnt5a has tumor suppressor activity in thyroid carcinoma, Oncogene 24 (2005) 2144-2154), 유방암(M. Jonsson 등, Loss of Wnt5a protein is associated with early relapse in invasive ductal breast carcinomas),혈액암(H. Liang 등, Wnt5a inhibits B cell proliferation and functions as a tumor suppressor in hematopoietic tissue, Cancer Cell 4 (2003) 349-360)등에는 종양억제인자로 작용하지만, 위암(M. Kurayoshi 등, Expression of Wnt5a is correlated with aggressiveness of gastric cancer by stimulating cell migration and invasion, Cancer Res. 66 (2006) 10439-10448), 흑색종(T.B. Lewis 등, Molecular classification of melanoma using real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction, Cancer 104 (2005) 1678-1686)등에는 종양촉진인자로써 작용해 왔다. 이런 보고들은 종양의 종류에 따라 Wnt5a가 억제인자 또는 촉진인자로써 다르게 작용함을 알 수 있었다. 따라서, 특정 종양에 Wnt5a가 억제인자로 작용할지 또는 촉진인자로 작용할지는 예측하기 어렵다. 또한 Wnt 신호전달은 신경계에 신경발생을 포함은 다양한 발생과정에 관여한다고 알려져 있다 (J. Huelsken, W. Birchmeier, New aspects of Wnt signaling pathways in higher vertebrates, Curr Opin Genet Dev. 11 (2001) 547-553). 그러나 신경교아종에서 Wnt5a의 역할에 대해서는 아직 보고 되지 않았다.
뇌신경교아종의 발생률이 증가되고 있지만 방사선 치료 및 화학요법 따른 재발의 위험성이 높기 때문에 대체 치료법이 요구되어지고 있다. 그렇기 때문에 신경교아종의 증식에 관여하는 새로운 억제인자의 발굴이 필요하다.
이에 본 발명은 Wnt5a(wingless-type MMTV integration site family, member 5A)가 신경교아종 형성에 관여하는 중요인자임을 확인하고, 이러한 인자를 억제하여 신경교아종 치료에 기반을 제공한다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 신경교아종 발생 및 증식에서 Wnt5a의 역할을 규명하고 이를 억제함으로써 종양 치료에 이용하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Wnt5a의 발현을 억제시키는 새로운 신경교아종 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wnt5a 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물을 제공한다. 본 발명에서는 Wnt5a가 신경교아종 조직과 세포에서 높게 발현되고 신경교아종 형성 능력과 관련된 단백질임을 밝힘으로써 상기 Wnt5a 의 발현이나 작용을 억제하면 신경교아종을 치료 또는 예방할 수 있음을 처음으로 제시하였다.
본 발명에 있어서, 상기 Wnt5a 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 기존에 단백질의 발현이나 작용을 억제하기 위해 알려진 어떤 물질이나 방법도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 Wnt5a 유전자의 전사 또는 번역을 하향조절하거나, Wnt5a 단백질의 작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물을 제공한다. 여기서 Wnt5a 유전자의 전사 또는 번역을 하향조절한다는 것은 Wnt5a 유전자의 프로모터에 결합하여 전사를 하향조절하거나, 전사후 mRNA를 분해하거나, 번역을 저해하는 등의 모든 하향 조절을 포함한다. 또한, Wnt5a 단백질의 작용을 억제한다는 것은 상기 단백질의 활성을 억제하거나, 상기 단백질의 리간드 결합부위에 경쟁적으로 결합하여 작용을 방해하는 것 등을 포함한다. 상기 후자의 예로서는 Wnt5a의 경쟁적인 inhibitor인 Frizzled 4-CRD protein (T. Netor H. Masckauchan 등, Wnt5a Signalling Induces Proliferation and Survival of Endothelial Cells in vitro and Expression of MMP-1 and Tie-2, Mol Biol Cell. 17 (2006):5163-72)의 이용한 Wnt5a 억제와 anti-Wnt5a neutralizing antibody (Blumenthal A등, The Wingless homolog WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation, Blood. 108 (2006) 965-73)를 이용한 Wnt5a 억제를 들 수 있다.
상기 전자의 예로는 Wnt5a 유전자의 RNA 간섭(RNA interference)을 이용한 siRNA (short interfering RNA) 또는 shRNA (short hairpin RNA)를 들 수 있다. RNA 간섭(이하 "RNAi"로 약칭함)은 많은 진핵생물에서 보존된 전사후 유전자 조절의 한 방법이다. RNAi는 세포에 존재하는 짧은 이중나선 RNA("dsRNA") 분자에 의해서 유도된다 (Fire A 등 (1998), Nature 391: 806-811). "siRNA"라고도 불리우는 이러한 짧은 dsRNA 분자는 단일가닥으로 분리된 후 "RNA-유도 침묵 복합체(RNA induced silencing, RISC)"에 결합하여 표적화된 mRNA를 절단하거나 번역을 저해한다 (Elbashir SM 등 (2001), Genes Dev, 15: 188-200).
그러므로, 본 발명은 Wnt5a 유전자의 mRNA를 표적화하는 약 17개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 이중쇄 RNA를 포함하는 분리된 siRNA를 제공한다. 상기 siRNA는 센스 RNA 가닥과 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하고, 이들 두 가닥은 표준 왓슨-크릭 염기쌍 상호작용에 의해서 서로 결합(annealing)한다(이하 "염기쌍을 형성한(base-paired)"으로 표현함). 상기 센스가닥은 표적 mRNA 내의 표적서열에 동일한 핵산서열을 포함한다. siRNA의 표적서열을 선택할 수 있는 기술은 예를 들면 문헌 (Tuschl T 등, "The siRNA User Guide" revised Oct. 11, 2002)에 기술되어 있다. 본 발명의 siRNA를 제조하는데 사용된 Wnt5a mRNA 표적 서열은 5‘-uuccaccuucgaugucggaau-3'(서열번호 2)이다.
본 발명의 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 두개의 상보적이고 단일쇄(single-stranded)의 RNA 분자를 포함하거나, 두 개의 상보적 부분이 염기쌍을 형성하고 단일쇄의 "머리핀(hairpin)" 영역에 의해서 공유결합된 단일 분자를 포함할 수 있다. 상기 후자의 경우를 shRNA(short hairpin RNA)라고 부르며, 상기shRNA는 single strand로 약 50-70 nucleotide 길이이며, in vivo상에서 stem-loop 구조 를 이루고 있다. 5-10 nucleotide의 loop 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29 nucleotide의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 stem을 형성한다. shRNA는 일반적으로 in vivo상에서 Pol III promoter에부터 상보적인 DNA sequence의 전사에 의해 합성된다. Pol-III로 유도된 전사는 well-defined start site에서 시작되어 4개 이상의 thymidine으로 이루고 있는 선상(-TTTT-)의 second residue에서 종결되어 non-poly(A) transcript 생성한다. Pol III promoter는 모든 세포에서 활성되며 shRNA의 발현이 가능하다. 전사 후 shRNA는 Dicer에 의해 loop가 절단되고 siRNA처럼 RISC와 작용하게 된다 (참조, Tuschl, T. (2002), Cell 110(5): 56374).
본 발명의 siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 알려진 많은 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 예를 들면, siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법에 의해서 생산될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 siRNA는 적절히 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미디트(ribonucleoside phosphoramidites)와 종래의 DNA/RNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. siRNA는 상보적이고 분리된 두개의 RNA 분자 또는 두개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 합성될 수 있다. 다른 방법으로서, siRNA는 또한 적절한 프로모터를 이용하여 재조합 DNA 플라스미드로 부터 발현될 수 있다. 플라스미드로 부터 본 발명의 siRNA를 발현시키는 데 적절한 프로모터는 예를 들면 U6 또는 H1 RNA pol Ⅲ 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 프로모터를 포함한다. 또한, 본 발명의 재조합 플라스미드는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위해서 유도성 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 재조합 플라스미드로부터 상보적이고 분리된 두 개의 RNA 분자 또는 두개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 발현될 수 있다. 본 발명의 siRNA를 발현시키는 데 적절한 플라스미드의 선택, siRNA를 발현시키기 위한 핵산서열을 플라스미드 내로 삽입하는 방법, 및 재조합 플라스미드를 목적하는 세포로 전달하는 방법은 본 발명이 속하는 분야의 기술 범위 내에 있다. 예를 들면, 문헌 [Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448]; [Brummelkamp TR 등 (2002), Science 296: 550- 553]; [Miyagishi M 등 (2002), Nat. Biotechnol . 20: 497-500]; [Paddison PJ 등 (2002), Genes Dev . 16: 948-958; Lee NS 등 (2002), Nat. Biotechnol . 20: 500-505]; 및 [Paul CP 등 (2002), Nat. Biotechnol . 20: 505-508]을 참고하면 되고, 상기 문헌은 본 발명에서 참고문헌으로 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 Wnt5a 단백질의 발현 억제제는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 Wnt5a siRNA(short interfering RNA), 서열번호 3 (5'-uuccaccuucgaugucggaauuugauauccgauuccuacaucgaagguggaa-3')의 염기서열을 갖는 Wnt5a shRNA(short hairpin RNA) 또는 이를 전사하는 유전자인 것을 특징으로 하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 Wnt5a shRNA를 전사하는 유전자는 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 이중가닥 DNA 인 것을 특징으로 하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물을 제공한다. (서열번호 4: 5’-GTT ACC CGT TCC ACC TTC GAT GTC GGA ATT TGA TAT CCG ATT CCG ACA TCG AAG GTG GAA TTT TTT CCA AGC-3’, 서열번호 5: 5’-GGC CGC TTG GAA AAA ATT CCA CCT TCG ATG TGC GAA TCG GAT ATC AAA TTC CGA CAT CGA AGG TGG AAC GG-3’ ) 상기 밑줄친 부분은 서로 상보적인 서열로서 이중가닥 DNA를 형성하게 하며 이로부터 상기 Wnt5a shRNA가 전사된다. 나머지 밑줄치지 않은 부분은 클로닝을 위한 제한효소 부위로서 재조합벡터의 종류에 따라 본 발명의 범위내에서 변동될 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 Wnt5a shRNA를 전사하는 유전자는 생체내 세포로 전달하기 위한 재조합 바이러스 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 유용한 재조합 바이러스 벡터의 선택, shRNA를 발현시키기 위한 핵산서열을 벡터 내로 삽입하는 방법, 및 바이러스 벡터를 목적하는 세포로 전달하는 방법은 본 발명이 속하는 분야의 기술 범위 내에 있다. 예를 들면, 문헌 [Dornburg R (1995), Gene Therap . 2: 301-310; Eglitis MA (1988), Biotechniques 6: 608-614]; [Miller AD (1990), Hum Gene Therap . 1: 5-14]; 및 [Anderson WF (1998), Nature 392: 25-30]을 참고하면 되고, 상기 문헌은 본 발명에서 참고문헌으로 기재되어 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터의 예로는 pWPT-GFP vector (실시예 2), pLenti6-GW/U6-laminshrna (Invitrogen Life Technologies Inc.), pLenti4/V5-DEST™, (Invitrogen Life Technologies Inc.), pLenti6/V5-DEST™, (Invitrogen Life Technologies Inc.), pLenti6.2/UbC/V5-DEST™ (Invitrogen Life Technologies Inc.), pLenti6/BLOCK-iT-DEST (Invitrogen Life Technologies Inc.), pLenti6/V5- DEST (Invitrogen Life Technologies Inc.), pLenti6/-TOPO (Invitrogen Life Technologies Inc.), U6.1/Lenti vector (GenScript), pRNAT-U6.2/Lenti (GenScript), pRNATin-H1.4/Lenti (GenScript), Lenti-CRE™ (with EF-1α/HTLV promoter)-Lentigene, Lenti-GFP™ (with EF-1α/HTLV promoter)-Lentigene, Lenti-GFP™ (with SCMV promoter)-Lentigene, Lenti-LacZ™ (with SCMV promoter)-Lentigene, Lenti-Luciferase™ (with EF-1α/HTLV promoter)-Lentigene, Lenti-RFP™ (with EF-1α)-Lentigene, Lenti-RFP™ (with the SCMV promoter)-Lentigene, Lenti-YFP (with the SCMV promoter)- Lentigene, psiLentGene™ (promega) 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 신경교아종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) Wnt5a 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 동물세포에서 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Wnt5a 단백질을 발현이 감소되는지 여부를 결정하는 단계. 상기 (a) 단계에서, 상기 동물세포는 의도적으로 Wnt5a를 과발현하는 플라스미드(실시예 2 참조)로 트랜스펙션 시킬 수도 있다. 상기 (b) 단계에서, 발현 감소여부는 RT-PCR를 통해 RNA 레벨에서, 단백질 항체에 의한 ELISA 등을 통해 단백질 레벨에서 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 정상 뇌조직보다 신경교아종 조직에서 발현이 증가되는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wnt5a 단백질을 포함하는 신경교아종 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 Wnt5a 유전자에 대한 shRNA(short hairpin RNA) 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 Wnt5a shRNA 분자를 전사할 수 있는 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 이중가닥 DNA를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 바이러스 벡터는 도 3의 개열지도를 갖는 pWPT-GFP-siWnt5a인 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 바이러스 벡터를 293T 세포에서 패키징시킨 바이러스 클론을 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 도 3의 바이러스 벡터를 이용하여 lentivirus 클론을 제조하였다.
본 발명의 약제학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 이외의 본 발명 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 함유되는 Wnt5a 유전자에 대한 shRNA의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여방법, 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 하나의 예시로서, 약 0.01ug 내지 약 100ug/kg의 범위일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 정상 뇌조직과 신경교아종 조직에서의 Wnt5a protein 발현 차이
정상 뇌조직, 신경교아종 조직에서 Wnt5a가 발현 차이를 확인하기 위해 면역조직염색과 RT-PCR을 실시하여 확인하였다. 정상 뇌조직, 신경교아종 조직보다 낮은 단계에 성상세포종 조직(Grade II), 신경교아종 조직(Grade IV)를 4 %paraformaldehyde로 고정시킨 다음, 5% serum + 0.3% Triotn +PBS 용액으로 1시간동안 blocking 시키고, Wnt5a primary antibody (R&D systems)와 1 시간 반응 시킨다. 잘 씻어준 후, secondary antibody (FITC-conjugated anti-goat , Jackson Immunoresearch Laboratorie) 와 반응시킨다. 도 1은 인체 정상 뇌조직과 신경교아종에서 분리한 조직에서 Wnt5a의 발현 차이를 비교한 결과 정상조직에 비해 신경교아종에서 Wnt5a 발현이 증가함을 확인한 결과이다. 그 결과 정상조직과 성상세포종 조직(Grade II)에 비해 신경교아종 조직(Grade IV)에서 Wnt5a 발현이 증가됨을 확인하였다. (도 1-A,B,C) 정상 뇌조직과 신경교아종 조직에서 total RNA를 분리하여 total RNA를 reverse transcriptase(RT) 와 oligo(dT) primer를 이용하여 cDNA로 전환한 다음 Taq polymerase와 Wnt5a primers (Forward: 5'-GGA ATA TTA AGC CCA GGA GT-3', Reverse: 5'- AGT GGC ACA GTT TCT TCT GT-3')를 이용하여 RT-PCR로 Wnt5a을 증폭시켰다. 그 결과 정상조직(Normal)에 비해 신경교아종 조직(GBM)에서 Wnt5a 발현이 증가됨을 확인하였다.(도 1-D, E) Wnt5a 아미노산 서열 (서열번호 1)은 미국 NCBI (www.ncbi.nlm,nih.gov)의 unigene database에서 사람의 Wnt5a 아미노산서열 검색을 통해 찾아냈으며, ACCESSION 번호가 NM_003392 이다.
실시예 2: 신경교아종세포에서 Wnt5a가 증식에 미치는 영향
1) 신경교아종 세포에서 Wnt5a의 과발현
신경교아종 세포 증식에 Wnt5a가 미치는 영향을 확인하기 위하여 신경교아종 세포주에 Wnt5a를 과발현시켰다. 실험에 사용한 세포는 신경교아종 환자로부터 분리하여 세포주를 확립한 GBM-05 (한국세포주연구재단, 기탁번호 KCLRF-BP-00118)와 신경교아종 세포주인 U87MG (human grade IV glioblastoma 얻어짐, ATCC, HTB-14)를 사용하였다. GBM-05와 U87MG 세포에 Wnt5a plasmid (Upstate, USA) 를 transfection 하여 과 발현 시킨 후 2틀 뒤 각각의 세포를 12 well culture dish에 1,000/cm2 개씩 깔고 24, 48, 72 시간 후 세포를 떼어내 hemocytometer로 세포수를 세었다. 도 2는 신경교아종 세포에서 Wnt5a를 과 발현 시켰을 때 증식을 증가됨을 나타낸 결과이다. 그 결과 Wnt5a 과 발현된 GBM-05와 U87MG 세포에서 증식이 증가됨을 확인하였다.
2) Wnt5a shRNA를 포함하는 Lentivirus의 제조
GBM-05와 U87MG 세포에 Wnt5a 발현을 억제시키기 위해 RNA interference 이용하였다. Wnt5a 발현을 억제시킬 수 있는 shRNA 시퀀스를 포함하는 벡터로 만든 GFP-Lentivirus를 제작하기 위해, 우선 shRNA의 포유동물 발현에 많이 사용되는 pAVU6+27 plasmid (Good PD 등,(1997) Gene Ther. (4), 45-54)로 부터 human U6 promoter gene을 U6 forward (5’-AAA ACT GCA GGG ATC CAA GGT CGG GC -3’)와 reverse (5’-TTT TCT GCA G GC GGC CGC ACT AGT GGT AAC CTA GTA TAT GTG CTG CCG AAG-3’) primers을 이용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. 이 양쪽의 primers에 oligonucleotides encoding shRNAs의 유도에 효율성을 높이기 위해, 5‘-말단에 Pst I site를 3’-말단에는 Not I 과 BstE II sites를 포함시킨다. 증폭된 PCR 생성물을 Pst I과 Not I 제한효소로 자르고 이를 pBluescript-II KS plasmid (Stratagene, LaJolla, CA)안으로 연결시켜 PKS-U6 plasmid를 만든다. 상기 pKS-U6 plasmid를 BamH I과 Xho I 제한효소로 자르고, 잘려진 fragment를 다시 pDNR-CMV plasmid (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)안으로 삽입하여 cloning한다. 완성된 pDNR-CMV-U6 plasmid에서 U6 promoter를 Lentivirus vector인 pWPT-GFP lox P site로 cloning하기 위해, pDNR-CMV-U6 plasmid와 pWPT-GFP lentivirus plasmid (Mammalian expression,Lentiviral,Cre/Lox, Addgene, USA, 도 3a)와 Cre recombinase (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)를 함께 배양하여, Lentivirus vector인 pWPT-GFP-U6 plasmid를 완성했다. U6 promoter를 가지는 lentivirus vector(pWPT-GFP-U6)에 Not I과 BstE II 사이로 Wnt5a 발현을 억제시킬 수 있는 shRNA 시퀀스 (서열번호 3,4)를 cloning하여 재조합 벡터 pWPT-GFP-siWnt5a (도 3b)를 만들었다. 상기 pWPT-GFP-siWnt5a 벡터를 DNA sequencing하여 siRNA sequence의 cloning을 확인한다. 이들 vector와 invitrogen에서 공급하는 3rd generation packaging mix (pLP1, pLP2, pLP/VSVG vector)와 함께 293T cell에 lipofectamine plus (Invitrogen)로 transfection하고 24시간 간격으로 상층액을 회수하여 lentivirus 클론을 만든다.
3) Wnt5a 발현이 억제된 신경교아종 세포의 증식능 시험
Wnt5a 발현을 억제시킬 수 있는 shRNA 시퀀스를 포함한 vector로 만든 GFP-Letivirus를 신경교아종 세포에 6시간 처리하여 Wnt5a 발현을 억제 시켰다. 72시간 배양한 후 0.25 % trypsin/EDTA로 세포를 떼어낸 후 GFP가 발현하는 세포를 BD FACSCanto™ II Flow Cytometry System(BD biosciences)을 이용하여 세포를 분리한다. Wnt5a 발현이 억제됨을 확인하기 위해 RT-PCR과 western blot을 실시한 결과 Wnt5a 발현이 억제됨을 확인하였다.(도 4-A, B) Wnt5a 발현이 억제된 GBM-05와 U87MG 세포에 증식능력을 확인하기 위해 세포집락 형성(colony forming assay) 실험을 실시하였다. 그 결과 Wnt5a 발현이 억제된 신경교아종세포의 세포집락 형성능과 현저히 감소함을 확인하였다. (도4-C,D,E) 도 4는 신경교아종 세포에 RNA interference를 이용하여 Wnt5a를 억제시켰을 때 증식을 억제시킴을 나타낸 결과이다.
4) Wnt5a 발현이 억제된 신경교아종 세포의 종양 형성능 시험
생체 내에서 Wnt5a 발현이 억제된 GBM-05와 U87MG 세포에 종양 형성 확인하기 위해서 Wnt5a 발현이 억제된 세포를 각각 2x105 갯수로 면역결핍 마우스에 이식하였다. 5주후에 쥐의 행동, 털의 빛깔, 몸무게 등에서 이상이 보이면 쥐를 희생하여 뇌를 적출하여 종양의 생성 유무를 확인 (도 5-A) 하고 종양의 부피 (도5-B)를 측정해 보았다. 도 5는 생체내에서 Wnt5a 기능이 억제된 신경교아종 세포의 종양 형성능을 나타낸 결과이다. 그 결과 대조군에 비해서 Wnt5a 발현이 억제된 GBM-05와 U87MG 세포에서 종양형성 능력이 현저히 감소됨을 확인하였다. 이는 Wnt5a 발현 억제가 신경교아종세포의 증식 및 종양 형성능을 억제함을 나타낸 결과이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 신경교아종세포의 증식과 종양형성능에 영향을 미치는 Wnt5a 단백질 발현을 siRNA 또는 shRNA 등과 같은 RNA 간섭(interference)을 이용하여 조절함으로써 신경교아종 유전자 치료제 개발에 이용 되어질 수 있다.
도 1은 인체 정상 뇌조직과 신경교아종에서 분리한 조직에서 Wnt5a의 발현 차이를 비교한 결과 정상조직에 비해 신경교아종에서 Wnt5a 발현이 증가함을 확인한 결과이다.
도 2는 신경교아종 세포에서 Wnt5a를 과 발현 시켰을 때 증식을 증가됨을 나타낸 결과이다.
도 3는 본 발명에 따라 제조된 Wnt5a sh RNA를 전사하는 재조합 바이러스벡터의 지도이다.
도 4는 신경교아종 세포에 RNA interference를 이용하여 Wnt5a를 억제시켰을 때 증식을 억제시킴을 나타낸 결과이다.
도 5는 생체내에서 Wnt5a 기능이 억제된 신경교아종 세포의 종양 형성능을 나타낸 결과이다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation
<120> Composition for treatment and prevention of human glioblastoma
comprising Wnt5a inhibitor
<130> PN070241
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 380
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Lys Lys Ser Ile Gly Ile Leu Ser Pro Gly Val Ala Leu Gly Met
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val Ala Leu Ala Ile
20 25 30
Phe Phe Ser Phe Ala Gln Val Val Ile Glu Ala Asn Ser Trp Trp Ser
35 40 45
Leu Gly Met Asn Asn Pro Val Gln Met Ser Glu Val Tyr Ile Ile Gly
50 55 60
Ala Gln Pro Leu Cys Ser Gln Leu Ala Gly Leu Ser Gln Gly Gln Lys
65 70 75 80
Lys Leu Cys His Leu Tyr Gln Asp His Met Gln Tyr Ile Gly Glu Gly
85 90 95
Ala Lys Thr Gly Ile Lys Glu Cys Gln Tyr Gln Phe Arg His Arg Arg
100 105 110
Trp Asn Cys Ser Thr Val Asp Asn Thr Ser Val Phe Gly Arg Val Met
115 120 125
Gln Ile Gly Ser Arg Glu Thr Ala Phe Thr Tyr Ala Val Ser Ala Ala
130 135 140
Gly Val Val Asn Ala Met Ser Arg Ala Cys Arg Glu Gly Glu Leu Ser
145 150 155 160
Thr Cys Gly Cys Ser Arg Ala Ala Arg Pro Lys Asp Leu Pro Arg Asp
165 170 175
Trp Leu Trp Gly Gly Cys Gly Asp Asn Ile Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe
180 185 190
Ala Lys Glu Phe Val Asp Ala Arg Glu Arg Glu Arg Ile His Ala Lys
195 200 205
Gly Ser Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu
210 215 220
Ala Gly Arg Arg Thr Val Tyr Asn Leu Ala Asp Val Ala Cys Lys Cys
225 230 235 240
His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Cys Trp Leu Gln Leu
245 250 255
Ala Asp Phe Arg Lys Val Gly Asp Ala Leu Lys Glu Lys Tyr Asp Ser
260 265 270
Ala Ala Ala Met Arg Leu Asn Ser Arg Gly Lys Leu Val Gln Val Asn
275 280 285
Ser Arg Phe Asn Ser Pro Thr Thr Gln Asp Leu Val Tyr Ile Asp Pro
290 295 300
Ser Pro Asp Tyr Cys Val Arg Asn Glu Ser Thr Gly Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu
325 330 335
Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asp Gln Phe Lys Thr Val Gln Thr
340 345 350
Glu Arg Cys His Cys Lys Phe His Trp Cys Cys Tyr Val Lys Cys Lys
355 360 365
Lys Cys Thr Glu Ile Val Asp Gln Phe Val Cys Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA of Wnt5a
<400> 2
uuccaccuuc gaugucggaa u 21
<210> 3
<211> 52
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA of Wnt5a
<400> 3
uuccaccuuc gaugucggaa uuugauaucc gauuccuaca ucgaaggugg aa 52
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA strand of Wnt5a shRNA
<400> 4
gttacccgtt ccaccttcga tgtcggaatt tgatatccga ttccgacatc gaaggtggaa 60
ttttttccaa gc 72
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA strand of Wnt5a shRNA
<400> 5
ggccgcttgg aaaaaattcc accttcgatg tgcgaatcgg atatcaaatt ccgacatcga 60
aggtggaacg g 71
Claims (10)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wnt5a 단백질의 발현 억제제로 서열번호 2의 염기서열을 갖는 Wnt5a siRNA(short interfering RNA), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 Wnt5a shRNA(short hairpin RNA), 또는 이를 전사하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물.
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- 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 이중가닥 DNA 인 것을 특징으로 하는 신경교아종 치료 및 예방용 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는 신경교아종 치료제의 스크리닝 방법:(a) Wnt5a 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및(b) 상기 동물세포에서 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Wnt5a 단백 질을 발현이 감소되는지 여부를 결정하는 단계.
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