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KR100875003B1 - 누클레오시드의 위치 변형에 의한 올리고누클레오티드 ＣｐＧ 매개성 면역 자극의 조절 - Google Patents

누클레오시드의 위치 변형에 의한 올리고누클레오티드 ＣｐＧ 매개성 면역 자극의 조절 Download PDF

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KR100875003B1
KR100875003B1 KR1020027014597A KR20027014597A KR100875003B1 KR 100875003 B1 KR100875003 B1 KR 100875003B1 KR 1020027014597 A KR1020027014597 A KR 1020027014597A KR 20027014597 A KR20027014597 A KR 20027014597A KR 100875003 B1 KR100875003 B1 KR 100875003B1
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서드허 아그로월
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이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 CpG 디누클레오티드 함유 화합물에 의해 유도된 면역 반응을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 안티센스 적용을 위해 면역자극 효과를 감소시켜줄 뿐만 아니라 면역요법 적용을 위해 면역자극 효과를 증가시켜줄 수 있다.

Description

누클레오시드의 위치 변형에 의한 올리고누클레오티드 ＣｐＧ 매개성 면역 자극의 조절 {MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES}
본 발명은 올리고누클레오티드의 치료적 용도로서 이를 안티센스 방법에 사용하고 면역자극제로서 사용하는 것에 관한 것이다.
올리고누클레오티드는 현대 분자생물학에서 필요불가결한 도구가 되었으며, 진단 프로빙 방법에서부터 PCR 및 유전자 발현의 안티센스 억제에 이르기까지 광범위하게 다양한 기술에 사용되고 있다. 올리고누클레오티드가 이렇게 광범위하게 사용됨에 따라 올리고누클레오티드를 합성하기 위한 신속하고 저렴하고 효율적인 방법에 대한 요구가 증가해 오고 있다.
안티센스 및 진단적 적용을 위한 올리고누클레오티드의 합성은 현재 일상적으로 수행될 수 있다 [참조: Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., 1991); and Uhlmann and Peyman, supra. Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995); and Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993]. 초기 합성 방법은 포스포다이에스테르 및 포스포트리에스테르 화학을 포함하였다. 문헌 [Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209 (1972)]에는 올리고누클레오티드 합성을 위한 포스포다이에스테르 화학이 기재되어 있다. 문헌 [Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143-3179 (1978)]에는 올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드의 합성을 위한 포스포트리에스테르 화학이 기재되어 있다. 이들 초기 방법은 대부분 합성에 대해 보다 효율적인 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트 방법으로 바뀌었다. 뷰케이지(Beaucage) 및 카루터스(Caruthers)의 문헌 [Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)]에는 폴리누클레오티드 합성에서 데옥시누클레오시드 포스포라미다이트를 사용하는 것이 기재되어 있다. 아그로월(Agrawal) 및 자멕닉(Zamecnik)의 미국 특허 제 5,149,798호 (1992)에는 H-포스포네이트 방법에 의한 올리고누클레오티드의 최적화된 합성이 기재되어 있다.
이러한 최신식 방법 둘 모두를 사용하여 다양한 변형된 누클레오티드간 결합을 지닌 올리고누클레오티드를 합성하였다. 아그로월과 굳차일드(Goodchild)의 문헌[Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)]에는 포스포라미다이트 화학을 사용하여 올리고누클레오티드 메틸포스포네이트를 합성하는 것이 기재되어 있다. 코놀리(Connolly) 등의 문헌[Biochemistry 23:3443 (1984)]에는 포스포라미다이트 화학을 사용하여 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트를 합성하는 것이 기재되어 있다. 재거(Jager) 등의 문헌[Biochemistry 27:7237 (1988)]에는 포스포라미다이트 화학을 사용하여 올리고누클레오티드 포스포라미데이트를 합성하는 것이 기재되어 있다. 아그로월 등의 문헌[Proc. Antl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)]에는 H-포스포네이트 화학을 사용하여 올리고누클레오티드 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트를 합성하는 것이 기재되어 있다.
더욱 최근에는, 다수의 연구자들이 질병의 치료적 처리에 대한 안티센스 방법의 타당성을 입증하였다. 크루케(Crooke)의 문헌[Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii]에는 인간 사이토메갈로바이러스 유도된 망막염의 치료를 위한 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 성공적인 마케팅 승인이 기재되어 있다. 불운하게도, 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드를 사용하는 것은 처음 예상했던 것 보다 복잡해졌다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 의해 야기된 몇몇 효과는 예상된 안티센스 메카니즘에 의해 설명될 수 없었다. 예를 들어, 맥인타이어(McIntyre) 등의 문헌[Antisense Res. Dev. 3:309-322 (1993)]에는 "센스(sense)" 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 특이적 면역 자극을 일으킨다고 교시되어 있다. 이러한 부작용 및 그 밖의 부작용은 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 대한 윤곽을 복잡하게 만들었다.
다른 한편, 포스포다이에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 면역 자극을 유도시킬 수 있다는 결과는 이러한 부작용을 치료적 도구로서 개발하는 것에 대한 관심을 불러일으켰다. 이러한 노력은 디누클레오티드 CpG를 함유하는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 초점을 맞추었다. 쿠라모토(Kuramoto) 등의 문헌[Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)]에는 CpG 디누클레오티드를 포함하는 팔린드롬을 함유하는 포스포다이에스테르 올리고누 클레오티드가 인터페론-알파 및 감마 합성을 유도시키고 내츄럴 킬러 활성을 향상시켜줄 수 있다고 교시되어 있다. 크리에그(Krieg) 등의 문헌[Nature 371:546-549 (1995)]에는 포스포로티오에이트 CpG 함유 올리고누클레오티드가 면역자극성임이 기재되어 있다. 리앙(Liang) 등의 문헌[J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)]에는 이러한 올리고누클레오티드가 인간 B 세포를 활성화시킨다고 기재되어 있다. 몰도베누(Moldoveanu) 등의 문헌[Vaccine 16:1216-124 (1998)]에는 CpG 함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 향상시킨다고 교시되어 있다. 맥클루스키(McCluskie)와 데이비스(Davis)의 문헌[The Journal of Immunology 161:4463-4466 (1998)]에는 CpG 함유 올리고누클레오티드가 효능적 애쥬번트로서 작용하여, B형 간염 표면 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다고 교시되어 있다.
이들 보고서는 CpG 함유 올리고누클레오티드에 의해 야기되는 면역 반응을 조절할 필요가 있음을 분명히 해준다. 이상적으로는, 이러한 조절은 안티센스 적용을 위해 면역자극 효과를 감소시키는 것 뿐만 아니라 면역요법 적용을 위해 면역자극 효과를 증가시키는 것을 포함해야 한다.
발명의 개요
본 발명은 CpG 디누클레오티드 함유 화합물에 의해 야기되는 면역 반응을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 안티센스 적용을 위해 면역자극 효과를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 면역요법 적용을 위해 면역자극 효과를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 둘 모두의 적용을 위해 최적 수준의 면역자극 효과를 지닌 화합물 및 이러한 올리고누클레오티드를 제조하고 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명자들은 CpG 함유 올리고누클레오티드의 위치 변형이 이들의 면역자극 능력에 극적으로 영향을 미친다는 것을 의외로 발견하였다. 특히, 올리고누클레오티드의 2' 또는 3' 당 또는 염기 변형, 또는 CpG 디누클레오티드의, 5' 또는 3' 말단 변형을 포함하는, 특정 위치 5' 또는 3'에서의 변형된 누클레오시드간 결합의 도입은 재현가능하고 예측가능한 방식으로 이들의 면역자극 효과를 향상시키거나 감소시킨다.
첫 번째 일면에 있어서, 본 발명은 면역조절 부분을 CpG 디누클레오티드의 5' 또는 3' 위치에 도입시킴으로써 CpG 디누클레오티드 함유 화합물의 면역자극 효과를 조절하기 위한 방법을 제공한다.
두 번째 일면에 있어서, 본 발명은 CpG 디누클레오티드 및 면역조절 부분을 포함하는 면역자극 효과가 증가하거나 감소한 화합물을 제공하며, 이러한 증가하거나 감소된 면역조절 효과는 면역조절 부분이 없는 유사한 화합물과 비교된다.
세 번째 일면에 있어서, 본 발명은 특정 유전자에 상보적이고 CpG 디누클레오티드 및 면역조절 부분을 포함하는 올리고누클레오티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여 포유동물의 특정 유전자의 발현을 안티센스 특이적으로 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 올리고누클레오티드는 면역조절 부분이 없는 유사한 올리고누클레오티드 보다 낮은 면역자극 효과를 지닌다.
네 번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유동물에게 CpG 디누클레오티드 및 면역조절 부분을 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함하여 인간을 포함하는 포유동물에게서 면역 반응을 유도시키는 방법을 제공하며, 상기 화합물은 면역조절 부분이 없는 유사한 화합물 보다 높은 면역자극 효과를 지닌다.
도 1은 본 발명에 따른 면역조절 부분의 바람직한 구체예를 도시한다. 본 도면이 3'측에 대해 X3X4가 사용되고 5'측에 대해 X1X2가 사용됨이 주목된다. 이러한 사용은 본 도면과 관련해서만 예시된 것이며, 본원에 교시된 Y 및 X 표시를 사용하고 있는 청구의 범위를 해석하는 데에 사용되지 않아야 한다.
도 2는 본 발명에 따른 변형된 화합물 및 이 화합물을 사용한 비장 검정의 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 또 다른 변형된 화합물 및 이 화합물을 사용한 비장 검정의 결과를 도시한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 안티센스 적용에 사용되고 면역자극제로서 사용되는 올리고누클레오티드의 치료적 용도에 관한 것이다. 본원에 인용된 특허 및 특허출원은 당 분야의 지식 수준을 나타내며, 이들은 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있다. 본원에 인용된 임의의 문헌의 교시내용과 본원 명세서 내용이 상충되는 경우, 본 발명의 목적상 본원 명세서가 우선한다.
본 발명은 CpG 디누클레오티드 함유 화합물에 의해 야기되는 면역 반응을 조 절하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 안티센스 적용을 위해 면역자극 효과를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 면역요법적 적용을 위해 면역자극 효과를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 둘 모두의 적용을 위해 최적 수준의 면역자극 효과를 지닌 올리고누클레오티드 및 이러한 올리고누클레오티드를 제조하고 사용하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명자들은 CpG 함유 올리고누클레오티드의 위치 변형이 이들의 면역자극 능력에 극적으로 영향을 미친다는 것을 의외로 발견하였다. 특히, 올리고누클레오티드의 2' 또는 3' 당 또는 염기 변형, 또는 5' 또는 3' 말단 변형을 포함하는, CpG 디누클레오티드의 특정 위치 5' 또는 3'에서의 변형된 누클레오시드간 결합의 도입, 또는 이들의 조합은 재현가능하고 예측가능한 방식으로 이들의 면역자극 효과를 향상시키거나 감소시킨다.
첫 번째 일면에 있어서, 본 발명은 면역조절 부분을 CpG 디누클레오티드의 5' 또는 3' 위치에 도입시킴으로써 CpG 디누클레오티드 함유 화합물의 면역자극 효과를 조절하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 바람직한 화합물은 일반적으로 추가의 올리고누클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 방법을 사용하여 특정 유전자 또는 유전자 전사체에 상보적인 올리고누클레오티드를 제조한다. 특정한 바람직한 구체예에 있어서, 올리고누클레오티드는 안티센스 활성을 지닌다. 몇몇 바람직한 구체예에 있어서, 오로지 하나의 면역조절 부분이 올리고누클레오티드에 존재하는 각각의 CpG 디누클레오티드에 대해 올리고누클레오티드내로 도입된다. 몇몇 바람직한 구체예에 있어서, 오로지 하나의 면역조절 부분이 올리고누클레오티드 내로 도입된다.
특정한 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 이러한 일면에 따라 제조된 올리고누클레오티드는 안티센스 활성을 지니지 않고/않거나 특정 유전자에 상보적이지 않다.
본원에 사용된 용어 "상보적"이란 생리적 조건하에서 게놈 영역, 유전자 또는 이의 RNA 전사체에 하이브리드화할 수 있는 능력을 지님을 의미한다. 이러한 하이브리드화는 대개, 바람직하게는 왓슨-크릭 또는 후그스틴 염기쌍을 형성하는, 상보적 가닥들 사이의 염기 특이적 수소 결합의 결과이지만, 다른 형태의 수소 결합 뿐만 아니라 염기 스태킹(stacking)도 하이브리드화를 초래할 수 있다. 실제적인 측면에서, 이러한 하이브리드화는 특정 유전자 발현 억제의 결과로부터 추론될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "안티센스 활성"은 올리고누클레오티드가, 세포 또는 동물내로 도입된 경우, 이에 상보적인 유전자의 발현의 감소를 야기함을 의미한다.
본 발명의 이러한 일면에 따른 방법은 CpG 디누클레오티드의 혼입 직후 또는 다른 방식으로 단순히 적합한 면역조절 부분 단량체 신톤(synthon)을 합성 공정에 주기적으로 사용함으로써 널리 공지된 합성 기술 중 어느 하나를 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 바람직한 단량체로는 포스포라미다이트, 포스포트리에스테르 및 H-포스포네이트가 있다.
본 발명의 목적상, "면역조절 부분을 위치 Y2내로 도입시키는 것"은 하기 구조식을 참조하여 이러한 위치에 면역조절 부분을 지닌 올리고누클레오티드를 합성하는 것을 의미한다:
5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3'
상기 식에서, C는 시토신이고, G는 구아노신 또는 이노신 및 7-데아자구아노신을 포함하는 치환된 구아노신이고, 각각의 X 및 Y는 독립적으로 누클레오시드 또는 면역조절 부분이고, m은 -9 내지 +20의 숫자이며, n은 -6 내지 +20의 숫자이다.
올리고누클레오티드를 합성하기 위한 절차는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
두 번째 일면에 있어서, 본 발명은 CpG 디누클레오티드 및 면역조절 부분을 포함하는 면역자극 효과가 증가하거나 감소된 화합물을 제공하며, 이러한 증가하거나 감소된 면역조절 효과는 면역조절 부분이 없는 유사한 화합물과 비교된다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 바람직한 화합물은 일반적으로 추가의 올리고누클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 올리고누클레오티드 서열은 약 6개 내지 약 50개의 누클레오티드, 가장 바람직하게는 약 12개 내지 약 35개의 누클레오티드를 지닐 것이다.
본 발명에 따른 특정한 바람직한 화합물은 하기 구조식을 지닌다:
5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3'
상기 식에서, C는 시토신이고, G는 구아노신 또는 이노신 및 7-데아자구아노신을 포함하는 치환된 구아노신이고, 각각의 X 및 Y는 독립적으로 누클레오시드 또는 면역조절 부분이고, m은 -9 내지 +20의 숫자이며, n은 -6 내지 +20의 숫자이다.
특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 화합물을 제공하도록 변형된 염 기 서열은 다음과 같다:
5'-CTATCTGACGTTCTCTGT-3'
또는
5'-CCTACTAGCGTTCTCATC-3'
바람직한 면역조절 부분으로는 하나 이상의 어베이직(abasic) 누클레오시드, (치환되거나 치환되지 않은) 1,3-프로판디올 링커, 및/또는 니트로피롤, 니트로인돌, 데옥시우리딘, 이노신, 이소구아노신, 2-아미노퓨린, 네뷸라린, 7-데아자구아노신, 4-티오데옥시우리딘, 4-티오티미딘, d-이소구아노신, d-이소-5-메틸시토신, P-염기 및 3'-3' 결합을 포함하는 변형된 염기 함유 누클레오시드를 포함한다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 Y6, Y5, Y4 또는 Y3에 도입시키는 것, 또는 이의 조합은 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 증가시킨다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 Y2에 도입시키면 면역자극 효과를 유지시킨다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 Y1에 도입시키면 면역자극 효과를 유지시키거나 감소시킨다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 C에 도입시키면 면역자극 효과를 제거시킨다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 G에 도입시키면 면역자극 효과를 제거시키지만, 단, 7-데아자구아노신은 면역자극 효과를 유지시킨다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 X1에 도입시키면 면역자극 효과를 유지시키거나 감소시킨다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 X2에 도입시키면 면역자극 효과에 대해 거의 영향을 주지 않는다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 X3에 도입시키면 면역자극 효과를 유지시키거나 증가시킨다. 일반적으로, 면역조절 부분을 위치 X4, X5, X6, X7-Xm, 또는 이들의 임의의 조합된 위치에 도입시키면 면역자극 효과를 증가시킨다.
본 발명의 이러한 일면에 따른 특정한 바람직한 올리고누클레오티드는 특정 유전자 또는 유전자 전사체에 상보적이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 올리고누클레오티드는 안티센스 활성을 지닌다. 몇몇 바람직한 구체예에 있어서, 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드에 존재하는 각각의 CpG 디누클레오티드에 대해 오로지 하나의 면역조절 부분을 지닌다. 몇몇 바람직한 구체예에 있어서, 올리고누클레오티드는 오로지 하나의 면역조절 부분을 지닌다. 그 밖의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 이러한 일면에 따른 화합물은 안티센스 활성을 지니지 않고/않거나 특정 유전자에 상보적이지 않다.
세 번째 일면에 있어서, 본 발명은 특정 유전자에 상보적이고 CpG 디누클레오티드 및 면역조절 부분을 포함하는 올리고누클레오티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여 포유동물의 특정 유전자의 발현을 안티센스 특이적으로 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 올리고누클레오티드는 면역조절 부분이 없는 유사한 올리고누클레오티드 보다 낮은 면역자극 효과를 지닌다.
몇몇 바람직한 구체예에 있어서, 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드에 존재하는 각각의 CpG 디누클레오티드에 대해 오로지 하나의 면역조절 부분을 지닌다. 몇몇 바람직한 구체예에 있어서, 올리고누클레오티드는 오로지 하나의 면역조절 부분을 지닌다.
본 발명의 이러한 일면에 따른 방법에 있어서, 바람직하게는 안티센스 올리고누클레오티드의 투여는 비경구, 경구, 설하, 경피, 국소, 비내, 기관내, 또는 직장내 경로를 통해 이루어진다. 치료용 조성물의 투여는 질병의 증상 또는 대용 마커를 감소시키기에 효과적인 용량 및 기간을 적용하여 공지된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 전신적으로 투여되는 경우, 치료용 조성물은 약 0.001 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰의 혈중 올리고누클레오티드 농도를 수득하기에 충분한 용량으로 투여되는 것이 바람직하다. 국소 투여의 경우, 이 보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있으며, 훨씬 높은 농도는 관용될 수 있다. 바람직하게는, 올리고누클레오티드의 전체 용량은 1일 당 환자 체중 1kg 당 약 0.1㎎ 내지 약 200㎎ 올리고누클레오티드일 것이다. 개체에게 치료적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 치료용 조성물을 1회 처리 에피소드로서 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 조성물이 투여된 후, 보체 활성화, 미토제네시스(mitogenesis) 및 트롬빈 응괴 형성의 억제로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 효과에 대한 하나 이상의 측정이 수행된다.
본 발명의 이러한 일면에 따른 방법은 질병 또는 유전자 발현의 동물 모델에서 유용하며, 인간 또는 동물 질병의 치료적 처리를 위해 추가로 유용하다.
네 번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유동물에게 CpG 디누클레오티드 및 면역조절 부분을 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함하여 인간을 포함하는 포유동물에게서 면역 반응을 유도시키는 방법을 제공하며, 상기 화합물은 면역조절 부분이 없는 유사한 화합물 보다 높은 면역자극 효과를 지닌다.
본 발명의 이러한 일면에 따른 방법에 있어서, 바람직하게는 화합물의 투여는 비경구, 경구, 설하, 경피, 국소, 비내, 기관내, 또는 직장내 경로를 통해 이루어진다. 치료용 조성물의 투여는 질병의 증상 또는 대용 마커를 감소시키기에 효과적인 용량 및 기간을 적용하여 공지된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 전신적으로 투여되는 경우, 치료용 조성물은 약 0.001 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰의 혈중 올리고누클레오티드 농도를 수득하기에 충분한 용량으로 투여되는 것이 바람직하다. 국소 투여의 경우, 이 보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있으며, 훨씬 높은 농도는 관용될 수 있다. 바람직하게는, 올리고누클레오티드의 전체 용량은 1일 당 환자 체중 1kg 당 약 0.1㎎ 내지 약 200㎎ 올리고누클레오티드일 것이다. 개체에게 치료적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 치료용 조성물을 1회 처리 에피소드로서 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 조성물이 투여된 후, 보체 활성화, 미토제네시스 및 트롬빈 응괴 형성의 억제로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 효과에 대한 하나 이상의 측정이 수행된다.
특정한 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 백신, 항체, 세포독성제, 안티센스 올리고누클레오티드, 유전자 요법용 벡터, DNA 백신 및/또는 애쥬번트와 조합된 형태로 투여되어 면역 반응의 특이성 또는 크기를 향상시킨다. 화합물 또는 백신, 또는 둘 모두는 키홀 림펫 헤모시아닌, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 또는 임의의 다른 면역원성 캐리어 단백질과 같은 면역원성 단백질과 임의로 결합될 수 있다. 프로인트 완전 애쥬번트를 포함하는 과잉의 애쥬번트 중의 어느 하나가 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 일면의 목적상, "조합된 형태로"란 동일한 환자의 동일한 질병을 치료하는 도중을 의미하며, 올리고누클레오티드 및/또는 백신 및/또는 애쥬번트를 동시 투여 뿐만 아니라 수 일 이하의 간격의 시간적으로 간격을 둔 순서를 포함하는 임의의 순서로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 조합 처리는 올리고누클레오티드, 및/또는 독립적으로 백신, 및/또는 독립적으로 애쥬번트의 1회 이상 투여를 또한 포함할 수 있다. 올리고누클레오티드 및/또는 백신 및/또는 애쥬번트의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 이러한 일면에 따른 방법은 면역계의 모델 실험에 대해 유용하며, 인간 또는 동물 질병의 치료적 처리에 대해 추가로 유용하다.
본 발명의 모든 일면의 목적상, "올리고누클레오티드"란 용어는 둘 이상의 데옥시리보누클레오티드의 중합체, 또는 2'-할로-누클레오시드, 2' 또는 3' 치환된, 2' 또는 3'-O-치환된 리보누클레오시드, 데아자누클레오시드 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 임의의 변형된 누클레오시드를 포함한다. 이러한 단량체들은 다수의 공지된 누클레오시드간 결합 중 어느 하나에 의해 서로 커플링될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예에 있어서, 이들 누클레오시드간 결합은 포스포다이에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포라미데이트 결합, 상기 결합 중 어느 하나의 2'-5' 결합, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 올리고누클레오티드란 용어는 화학적으로 변형된 염기 또는 당을 지니고/지니거나 친지성 그룹, 인터킬레이팅 작용제, 디아민 및 아다만탄을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 추가의 치환기를 지니는 이러한 중합체를 또한 포함한다. 올리고누클레오티드란 용어는 PNA, LNA 및 비-5탄당 (예를 들어, 6탄당) 주쇄 또는 주쇄 섹션을 포함하는 올리고누클레오티드를 또한 포함한다. 본 발명의 목적상, "2'-O-치환된" 및 "3'-O-치환된"이란 용어는 (각각) 할로겐 (바람직하게는 Cl, Br, 또는 F), 또는 1개 내지 6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유하는 -O-저급 알킬 그룹, 또는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 지닌 -O-아릴 또는 알릴 그룹에 의한 5탄당 잔기의 2' (또는 3') 위치의 치환을 의미하며, 이러한 알킬, 아릴 또는 알릴 그룹은 예를 들어 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르발콕실, 또는 아미노 그룹에 의해 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나; 이러한 2' 치환은 하이드록시 그룹 (리보누클레오시드를 생성시킴), 아미노 또는 할로 그룹에 의해 이루어질 수 있지만 2' (또는 3') H 그룹에 의해서는 이루어질 수 없다. 본 발명의 모든 일면의 목적상, "CpG" 또는 "CpG 디누클레오티드"란 용어는 디누클레오티드 5'-데옥시시티딘-데옥시구아니딘 또는 데옥시구아니딘 유사체-3'를 의미하며, p는 누클레오티드간 결합이고, 디누클레오티드의 당 주쇄는 리보오스, 데옥시리보오스, 또는 2' 치환된 리보오스, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 본 발명의 처음 3가지 일면의 바람직한 구체예에 있어서, p는 포스포다이에스테르, 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포트리에스테르, 입체특이적 (Rp 또는 Sp) 포스포로티오에이트 또는 알킬포스포네이트, 및 상기 물질 중 어느 하나의 2'-5' 공유 결합으로부터 선택된다. 비-포스포다이에스테르, 비-포스포로티오에이트 구체예는 면역자극 효과를 추가로 감소시킬 것이다. 본 발명의 최후 3가지 일면의 바람직한 구체예에 있어서, p는 포스포다이에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포르디티오에이트로부터 선택된다.
하기 실시예는 본 발명의 특정한 바람직한 구체예를 추가로 예시하는 것으로 의도되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
시험관내에서의 면역자극 효과의 조절
CpG 모티프를 함유하는 PS-올리고의 화학적 변형의 부위의 영향을 실험하기 위해, 본 발명자들은 두 가지 올리고누클레오티드를 선택하였다. 올리고 1 및 올리고 2는 각각 하나의 CpG 모티프를 함유한다. 본 실험에서 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 마우스 비장 세포 증식 검정을 사용한다.
마우스 비장 림프구를 0.1, 1 및 10㎍/㎖의 농도에서 올리고누클레오티드와 배양하였다. 올리고 1 및 올리고 2는 세포 증식에 대한 용량 의존성 효과를 유도시켰다. 0.1㎍/㎖에서, 증식 지수가 증가하였다. 올리고 1 또는 올리고 2의 CpG 모티프의 5'-플랭킹 데옥시누클레오시드 (Y1)를 본 발명에 따른 면역조절 부분으로 치환시키면 사용된 모든 농도에서 세포 증식이 완전 억제되었다 (도 1). 0.1㎍/㎖에서, 세포 증식 지수는 배지 단독의 경우와 유사하였다. 올리고 1 또는 올리고 2의 CpG 모티프의 3'-플랭킹 데옥시누클레오시드 (X1)를 2'-OMe로 치환시키면 세포 증식에 대해 위와 같은 영향을 주지는 않았지만, 증식을 약간 감소시킬 수 있었다. 유사한 치환이 올리고 1 또는 올리고 2에서 CpG 모티프에 대한 3'-플랭킹 영역에서 이루어졌다. 데옥시누클레오시드가 위치 X3, X4, X5 또는 X6에서 본 발명에 따른 면역조절 부분에 의해 치환된 올리고가 합성되었다. 이들 올리고의 증식 지수는 증가하였다.
실시예 2
비장 중량에 대한 면역조절 부분의 효과
세포 배양 검정을 기초로 하여 상기 치환이 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 조절함을 관찰한 후, 본 발명자들은 표 1에 기재된 올리고누클레오티드를 마우스에 복강내 투여하고, 비장 중량을 측정하여, 치환이 생체내에서 유사한 효과를 지니는 지를 확인하였다. 올리고 1 또는 올리고 2의 투여는 비장 중량의 상당한 증가를 야기하였다. CpG 모티프로부터 5'-말단 위치 Y6, Y5, Y4 또는 Y3 쪽으로의 데옥시누클레오티드의 치환은 비장 중량의 점진적 증가를 야기시켰으며, 이는 이들의 면역자극 활성의 증가를 확인해준다. CpG 모티프의 3'-말단쪽으로의 데옥시누클레오시드의 치환은 일반적으로 비장 중량의 덜 현저한 증가를 야기시켰다. 데이터는 도 2 및 도 3에 도시되어 있다.
실시예 3
면역조절 부분을 함유하는 올리고누클레오티드의 합성
올리고누클레오티드를 자동 DNA 합성기 (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 1 마이크로몰 규모로 합성하였다. 표준 데옥시누클레오시드 포스포라미다이트를 퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems)로부터 입수하였다. 1',2'-디데옥시리보오스 포스포라미다이트, 프로필-1-포스포라미다이트, 2'-데옥시-5-니트로인돌-리보푸라노실 포스포라미다이트, 데옥시우리딘 포스포라미다이트, dP 포스포라미다이트, d-2-아미노퓨린 포스포라미다이트, d-네뷸라린 포스포라미다이트 및 d-7-데아자구아닌 포스포라미다이트를 글렌 리서치(Glen Research; Sterling, VA)로부터 입수하였다. 데옥시이노신 포스포라미다이트를 켐진즈(ChemGenes; Ashland, MA)로부터 입수하였다. 정규의 커플링 사이클을 모든 포스포라미다이트에 대해 사용하였다. 뷰케이지(Beaucage) 시약을 산화제로서 사용하여 포스포로티오에이트 변형을 수득하였다. 합성 후, CpG-결합된 올리고누클레오티드를 실온에서 1.5 내지 2시간 동안 농축된 암모늄 하이드록사이드 용액과 인큐베이션시킨 후, 암모늄 하이드록사이드 상층액을 55℃에서 12시간 동안 인큐베이션시킴으로써 올리고누클레오티드를 탈보호시켰다. 암모늄 하이드록사이드 용액을 스피드-백(speed-vac)에서 증발 건조시키고, 5'-DMTr-올리고누클레오티드를 0.1M 암모늄 아세테이트 및 1:5 비의 아세토니트릴 중의 0.1M 암모늄 아세테이트의 용매 시스템을 사용하여 C18 역상 매트릭스상에서의 HPLC에 의해 정제하였다. 그 후, 올리고누클레오티드를 80% 아세트산으로 처리하여 DMTr 그룹을 제거하고, 나트륨 형태로 전환시키고, 증류수에 대한 투석에 의해 탈염시켰다. 올리고누클레오티드를 동결건조시키고, 물에 재용해시켰다. 변성 PAGE 및 MALDITOF 질량 분석법에 의해 특징화하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Hybridon, Inc. <120> Modulation of Oligonucleotide Cp-G-Mediated Immune Stimulation by Positional Modification of Nucleosides <130> 47508-529 <140> PCT/US01/13682 <141> 2001-04-30 <150> US 60/201,578 <151> 2000-05-01 <160> 13 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <400> 1 ctatctgacg ttctctgt 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <400> 2 cctactagcg ttctcatc 18 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotides 1-5 and 12-16 are "n" wherein "n" = any nucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Nucleotide 6 is "n" wherein "n" is X1 = R which is Abasic (1',2'- dideoxyribose). <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is "n" wherein "n" is X2 = A. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Nucleotide 10 is "n" wherein "n" is X3 = T. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is "n" wherein "n" is X4 = T. <400> 3 nnnnnnncgn nnnnnn 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotides 1-5 and 12-16 are "n" wherein "n" = any nucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Nucleotide 6 is "n" wherein "n" is X1 = G. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is "n" wherein "n" is X2 = R which is abasic (1',2'- dideoxyribose). <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Nucleotide 10 is "n" wherein "n" is X3 = T. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is "n" wherein "n" is X4 = T. <400> 4 nnnnnnncgn nnnnnn 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotides 1-5 and 12-16 are "n" wherein "n" = any nucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Nucleotide 6 is "n" wherein "n" is X1 = R which is abasic (1,3-pr opanediol). <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is "n" wherein "n" is X2 = A. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Nucleotide 10 is "n" wherein "n" is X3 = T. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is "n" wherein "n" is X4 = T. <400> 5 nnnnnnncgn nnnnnn 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotides 1-5 and 12-16 are "n" wherein "n" = any nucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Nucleotide 6 is "n" wherein "n" is X1 = R which is 1'-(3-Nitropyr role)-2'-deoxyribose. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is "n" wherein "n" is X2 = A. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Nucleotide 10 is "n" wherein "n" is X3 = T. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is "n" wherein "n" is X4 = T. <400> 6 nnnnnnncgn nnnnnn 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotides 1-5 and 12-16 are "n" wherein "n" = any nucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Nucleotide 6 is "n" wherein "n" is X1 = G. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is "n" wherein "n" is X2 = R which is 1'-(3-Nitropyr role)-2'-deoxyribose. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Nucleotide 10 is "n" wherein "n" is X3 = T. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is "n" wherein "n" is X4 = T. <400> 7 nnnnnnncgn nnnnnn 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotides 1-5 and 12-16 are "n" wherein "n" = any nucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Nucleotide 6 is "n" wherein "n" is X1 = R which is 1'-(5-Nitroind ole)-2'-deoxyribose. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is "n" wherein "n" is X2 = A. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Nucleotide 10 is "n " wherein "n" is X3 = T. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is "n " wherein "n" is X4 = T. <400> 8 nnnnnnncgn nnnnnn 16 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotides 1-5 and 12-16 are "n" wherein "n" = any nucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Nucleotide 6 is "n" wherein "n" is X1 = G. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is "n" wherein "n" is X2 = A. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Nucleotide 10 is "n" wherein "n" is X3 = T. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is "n" wherein "n" is X4 = R which is 1'-(5-Nitroin dole)-2'-deoxyribose. <400> 9 nnnnnnncgn nnnnnn 16 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Nucleotides 4 and 5 are "n" wherein "n" = X which is abasic (1',2 '-dideoxyribose). <400> 10 ctanntgacg ttctctgt 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Nucleotide 9 is "n" wherein "n" = X which is abasic (1',2'-dideox yribose). <400> 11 ctatctgang ttctctgt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Nucleotides 4 & 5 are "n" wherein "n" = X which is abasic (1',2'- dideoxyribose). <400> 12 cctnntagcg ttctcatc 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Nucleotide 9 is "n" wherein "n" = X which is abasic (1',2'-dideox yribose). <400> 13 cctactagng ttctcatc 18

Claims (29)

  1. 면역조절 부분을 CpG 디누클레오티드의 5' 또는 3' 위치에 시험관내에서 도입시킴으로써 하기 구조식을 지닌 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 조절하는 방법:
    5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3'
    상기 식에서, C는 시토신이고, G는 구아노신, 이노신 또는 7-데아자구아노신이고, 각각의 X 및 Y는 독립적으로 누클레오시드 또는 면역조절 부분이고, n은 -6 내지 +20의 숫자이고, m은 -9 내지 +20의 숫자이며, 상기 면역조절 부분은 1,3-프로판디올, 니트로피롤, 니트로인돌, 데옥시우리딘, 이노신, 이소구아노신, 2-아미노퓨린, 네뷸라린, 7-데아자구아노신, 4-티오데옥시우리딘, 4-티오티미딘, d-이소구아노신 및 d-이소-5-메틸시토신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 하기 구조식을 지니며 증가된 면역자극 효과를 지니는 올리고누클레오티드로서, 상기 올리고누클레오티드의 면역자극 효과가 면역조절 부분이 없는 동일한 올리고누클레오티드의 면역자극 효과에 비해 증가된 것인 올리고누클레오티드:
    5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3'
    상기 식에서, C는 시토신이고, G는 구아노신, 이노신 또는 7-데아자구아노신이고, 각각의 X 및 Y는 독립적으로 누클레오시드 또는 면역조절 부분이고, n은 -6 내지 +20의 숫자이고, m은 -9 내지 +20의 숫자이며, 단, X3 내지 X6 또는 Y3 내지 Y6 중의 하나 이상은 면역조절 부분이고, 상기 면역조절 부분은 1,3-프로판디올, 니트로피롤, 니트로인돌, 데옥시우리딘, 이노신, 이소구아노신, 2-아미노퓨린, 네뷸라린, 7-데아자구아노신, 4-티오데옥시우리딘, 4-티오티미딘, d-이소구아노신 및 d-이소-5-메틸시토신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  6. 삭제
  7. 삭제
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  9. 제 5항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이 유전자에 상보적임을 특징으로 하는 올리고누클레오티드.
  10. 제 5항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이 유전자에 상보적이지 않음을 특징으로 하는 올리고누클레오티드.
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  18. 하기 구조식을 지닌 올리고누클레오티드를 포함하는 포유동물용 면역자극제로서, 상기 올리고누클레오티드의 면역자극 효과가 면역조절 부분이 없는 동일한 올리고누클레오티드의 면역자극 효과에 비해 증가된 것인 면역자극제:
    5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3'
    상기 식에서, C는 시토신이고, G는 구아노신, 이노신 또는 7-데아자구아노신이고, 각각의 X 및 Y는 독립적으로 누클레오시드 또는 면역조절 부분이고, n은 -6 내지 +20의 숫자이고, m은 -9 내지 +20의 숫자이며, 단, X3 내지 X6 또는 Y3 내지 Y6 중의 하나 이상은 면역조절 부분이고, 상기 면역조절 부분은 1,3-프로판디올, 니트로피롤, 니트로인돌, 데옥시우리딘, 이노신, 이소구아노신, 2-아미노퓨린, 네뷸라린, 7-데아자구아노신, 4-티오데옥시우리딘, 4-티오티미딘, d-이소구아노신 및 d-이소-5-메틸시토신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  19. 제 18항에 있어서, 포유동물이 인간임을 특징으로 하는 면역자극제.
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  29. 하기 구조식을 지니며 감소된 면역자극 효과를 지니는 올리고누클레오티드로서, 상기 올리고누클레오티드의 면역자극 효과가 면역조절 부분이 없는 동일한 올리고누클레오티드의 면역자극 효과에 비해 감소된 것인 올리고누클레오티드:
    5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3'
    상기 식에서, C는 시토신이고, G는 구아노신, 이노신 또는 7-데아자구아노신이고, 각각의 X 및 Y는 독립적으로 누클레오시드 또는 면역조절 부분이고, n은 -6 내지 +20의 숫자이고, m은 -9 내지 +20의 숫자이며, 단, X1 또는 Y1은 면역조절 부분이고, 상기 면역조절 부분은 1,3-프로판디올, 니트로피롤, 니트로인돌, 데옥시우리딘, 이노신, 이소구아노신, 2-아미노퓨린, 네뷸라린, 7-데아자구아노신, 4-티오데옥시우리딘, 4-티오티미딘, d-이소구아노신 및 d-이소-5-메틸시토신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
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