KR100872695B1

KR100872695B1 - Ｇｒａｓ 미생물로부터 발현된 식품안전형 호열성아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의제조방법

Info

Publication number: KR100872695B1
Application number: KR1020060117792A
Authority: KR
Inventors: 김성보; 이영미; 박승원; 김정훈; 송상훈; 이강표
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2008-12-10
Also published as: CN101636491A; CN101636491B; EP2097521B1; WO2008066280A1; NZ576796A; AU2007326190B2; KR20080047842A; ES2397479T3; AU2007326190A1; US20080124771A1; DK2097521T3; EP2097521A4; EP2097521A1; JP2010510776A

Abstract

본 발명은 호열성 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고온균 지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22(Geobacilus stearothermophilus DSM22)로부터 유래된 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주로부터 식품안전형으로 발현된 호열성 아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22, 호열성, 아라비노스 이성화효소, 타가토스, 식품안전형, GRAS

Description

ＧＲＡＳ 미생물로부터 발현된 식품안전형 호열성 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법{FOOD GRADE THERMOPHILIC ARABINOSE ISOMERASE EXPRESSED FROM GRAS AND TAGATOSE MANUFACTURING METHOD BY USING IT}

도 1은 지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22 균주로부터 유래한 호열성 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pHT01-GSAI의 제조과정을 나타내는 도면이다.

도 2는 지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22 균주로부터 유래한 호열성 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pCJ-1-GSAI의 제조과정을 나타내는 도면이다.

도 3은 재조합 바실러스 숙주세포에서 생성된 호열성 아라비노스 이성화효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. A는 숙주세포(바실러스 써틸리스 168)만을 생육한 후 이로부터 얻어진 조효소액의 활성 측정값이며, B는 아라비노스 이성화효소 유전자를 포함하는 셔틀 벡터를 포함하는 재조합 바실러스 숙주세포(GSAIB-1)를 생육한 후 이로부터 얻어진 조효소액의 활성 측정값을 나타낸다.

도 4는 재조합 균주인 GSAIB-1에 대한 발현 최적 조건 및 효소활성 최적 조건을 실험한 결과를 나태낸 그래프이다.

도 5는 재조합 균주인 GSAIC-1의 최적화 배지에서의 균체 생육 결과를 나타 낸 그래프이다.

본 발명은 호열성 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고온균 지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22(Geobacilus stearothermophilus DSM22)로부터 유래된 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주로부터 식품안전형으로 발현된 호열성 아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 건강에 대한 관심이 높아지면서 각종 성인병을 유발시킬 수도 있는 설탕을 대체하기 위하여 비교적 부작용이 없는 대체 감미료로서 개발된 타가토스는 갈락토스의 이성질체이며, 프룩토스와 유사한 물리?화학적 성질을 갖고 있다고 알려진 물질이다. 최근 타가토스는 저칼로리 천연 당으로 미국 FDA에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 인정되어 식품, 음료, 건강식품, 다이어트 첨가물 등에 감미료로서 사용을 허가 받았다.

GRAS(Generally Recognized As Safe)는 일반적으로 안전하다고 여겨지는 물질로서 경험과 훈련을 거친 전문가들이 과학적 절차를 통해 물질의 의도된 사용조건 하에서 안전성을 평가하였을 때 안전하다고 판단하는 물질을 말한다. GRAS 제도 는 미국만이 가지고 있는 독특한 제도로서 안전성이 높은(일정한 사용조건 하에서) 식품 및 식품화학물질에 적용되지만 그 인식이 미국 내 뿐만 아니라, 국제적으로도 인식되고 있기 때문에 앞으로 추이가 주목되는 제도이다.

타가토스를 생산하는 방법으로는 주로 갈락토스에 촉매를 이용하여 이성화 방법에 의해 생산하는 화학적 방법과, 이성화효소를 이용하여 효소적인 방법으로 전환시키는 생물학적 방법이 있다. 화학적 생산 방법은 경제성이나 수율 측면에서 우수하나, 고온고압의 화학공정을 가지며 공정 자체가 복잡하고 산업 폐기물을 발생시키는 문제점을 가지고 있으므로 환경친화적인 생물학적 생산 방법에 대한 요구가 증가하고 있다.

이러한 생물학적 생산 방법으로는 알도스(aldose) 또는 알도스 유도체를 케토스(ketose) 또는 케토스의 유도체로 효소적인 방법에 의해 전환시키는 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다. 갈락토스에서 타가토스로의 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase)를 이용한 이성화 반응은 열역학적으로 높은 반응 온도에서 비례적으로 높은 전환율을 가지는 반응이다. 따라서 이성화효소를 이용한 타가토스의 생물학적 전환법은 고온에서 안정한 효소의 개발과 이를 이용한 타가토스의 생산법이 산업화의 핵심 기술이라고 할 수 있다. 이에 고온균 유래의 아라비노스 이성화효소의 탐색을 통하여 일차적으로 산업화가 가능한 고온 적합성 이성화효소의 개발 및 이를 이용한 이성화 공정의 개발이 각 연구팀들에 의하여 진행되어 왔다.

국내에서는 동양제과에서 아라비노스 이성화효소를 이용한 효소 이성화법을 개발하였다. 동양제과는 대장균 유래 아라비노스 이성화효소 유전자를 대장균에서 재조합 기술을 이용하여 대량 발현하였으며, 이 재조합 이성화효소는 30℃에서 24시간 반응시켰을 때, 갈락토스로부터 타가토스의 전환율이 25%로 열안정성 및 전환수율이 낮았다(대한민국 특허출원 제 99-16118호). 오덕근 교수팀(세종대학교)은 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래의 아라비노스 이성화효소를 대장균에서 재조합 기술을 이용하여 대량 발현하였으며, 이를 고정화하여 갈락토스의 타가토스로의 고온 이성화 공정을 제안하였다. 동양제과는 온천지역으로부터 스크리닝한 고온성 미생물 라이브러리로부터 고온성 이성화효소를 분리하고 재조합 대장균을 숙주로 하여 활성형으로 발현하여 갈락토스 고온 이성화 공정에 이용하였다. 비슷한 예로서, 케비젠은 지오바실러스 디니트리피컨스 DBG-A1(Geobacillus dinitrificans DBG-A1) 유래의 고온 이성화효소를 대장균에서 생산하고 이를 이용하여 고정화 방법으로 타가토스를 생산하는 기술을 개발하였다.

지오바실러스 유래의 미생물로부터의 이성화효소의 발현은 실질적인 산업화에 이용되기에는 그 단백질의 발현양이 적다. 따라서, 현재까지의 고온균 유래의 아라비노스 이성화효소를 이용한 타가토스의 생산기술은 재조합 대장균에서 대량 발현된 재조합 효소 혹은 이를 포함한 숙주를 이용한 갈락토스에서 타가토스로의 이성화 반응공정 개발에만 머물러 있다. 그러나 이러한 재조합 대장균을 이용한 타가토스의 생물공학적 생산은 식품안전성 측면에서 실질적으로 식품 소재로서의 타가토스 생산에 부적합하며, 이에 GRAS 미생물이면서 산업적으로 대량 생산이 가능한 숙주에서 발현된 아라비노스 이성화효소 및 이를 포함한 숙주를 이용한 대량 생 산이 필수적이다.

재조합 효소를 생산하기 위하여 산업적으로 사용 가능한 GRAS 미생물은 바실러스 속, 코리네박테리움 속, 락토바실러스 속 등의 식용 가능한 몇가지가 존재한다. 이중 바실러스와 코리네박테리움 속 균주는, 산업적으로 사용하기 위한 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라 다양한 공정 조건에서 높은 안전성을 가지는 균주이며, 실질적으로 재조합 효소 생산을 위한 산업적 이용은 GRAS 미생물 유래에서는 바실러스 속 및 코리네박테리움 속의 두가지 숙주가 유용하게 사용된다.

이에 본 발명자들은 GRAS 미생물인 바실러스 속 및 코리네박테리움 속 균주에서 고온균인 지오바실러스 속 유래의 아라비노스 이성화효소를 활성형으로 발현하였으며, 이렇게 발현된 식품안전형 재조합 효소를 이용하여 고농도의 갈락토스에서 타가토스로의 이성화 반응 기술을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GRAS 미생물 속으로부터 호열성 미생물 유래의 아라비노스 이성화효소를 활성형으로 발현하고, 이를 이용하여 갈락토스 이성화반응을 함으로써 식품안전성이 부여된 타가토스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고온균인 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래의 호열성 아라비노스 이성화효소 유전자를 GRAS 미생물에 삽입하여 식품안전형으로 재조합 효소를 생산하였으며, 이를 이용하여 갈락토스로 부터 타가토스를 연속 생산할 수 있음을 확인하였다.

이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물은 바람직하게는 바실러스 속 및 코리네박테리움을 속을 포함하며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미컴 KCTC 13032 (Corynebacterium glutamicum KCTC 13032) 및 바실러스 써틸리스 168 (Bacillus subtilis 168)이 이용된다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소의 유전자는, 바람직하게는 고온균으로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 고온균인 지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22(Geobacilus stearothermophilus DSM22)로부터 유래된 것이다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소 유전자는 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(directed evolution) 및 부위 특이적 돌연변이법 등에 의하여 당업자에 의하여 용이하게 변형될 수 있다. 따라서 임의에 따라 선택되어지는 GRAS 숙주에 일정한 정도 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지고 있고, 상기 숙주에서도 활성형으로 발현되는 재조합 효소 및 이를 포함하는 숙주 세포는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명에 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으나, 당업계에 알려진 임의의 벡터가 될 수 있다.

본 발명의 벡터는 호열성 이성화효소를 활성형으로 발현하기 위하여 바실러스 및 코리네박테리움에서 활성을 갖는 프로모터를 사용하였다.

상기 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터 서열은 대장균이나 고초균 등과 같은 다른 산업 미생물과는 달리 일반적인 구조가 알려지지 않았다. 따라서 산업적으로 많이 이용되는 코리네박테리움으로부터 유래되고, 대장균에서 발현가능한 강력한 프로모터가 개발되었다. tac 프로모터는 종래 가장 강력한 프로모터 활성을 갖는 것 중의 하나로 널리 알려져 있었다. tac 프로모터란 대장균의 트립토판 오페론 프로모터의 -35영역으로부터 얻어진 서열과 대장균의 유당 오페론 프로모터의 -10영역으로부터 얻어진 서열을 융합하여 얻어진 프로모터를 의미한다. 본 발명에 사용된 CJ-1으로 구성된 프로모터는 코리네박테리움 속 박테리아 세포에서 tac 프로모터 보다 효율적으로 유전자를 발현시킨다는 것이 확인 되었다(대한민국 특허 공개번호 10-2006-0068505).

또한, 본 발명에 사용된 바실러스형 프로모터는 바실러스 속 미생물 뿐 아니라 일반적으로 락토바실러스, 비피도박테리움 등의 젖산균형 미생물에서도 프로모터 활성을 갖는다. 코리네박테리움형 프로모터 또한 코리네박테리움 속 미생물 뿐만 아니라 에세리키아 속 박테리아 및 대장균 세포에서도 프로모터 활성을 갖는다. 특히 본 연구에서 사용된 프로모터는 에세리키아 속 박테리아 세포에서도 tac 프로모터에 비하여 2배 이상 더 강력한 프로모터 활성을 갖는다.

본 발명은 상기 벡터로 바실러스 및 코리네박테리움을 형질전환하여 제조된 재조합 균주를 배양하여, 이로부터 식품안전형으로 발현된 아라비노스 이성화효소 를 제공한다. 숙주 세포의 배양은 선택되어지는 숙주 세포에 따라 종래 알려진 임의의 배양 배지 및 배양 조건을 사용하여 이루어질 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 재조합 아라비노스 이성화효소를 이용하여 갈락토스를 기질로 사용하여 타가토스를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

본 발명의 실시예에서는 고도호열성 미생물인 지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22(Gcobacilus stearothermophilus DSM 22) 유래의 호열성 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자를 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터인 pCJ-1(대한민국 특허 공개번호 10-2006-0068505) 및 대장균-바실러스 셔틀 벡터인 pHT10(Mo Bi Tech., Goettingen, Germany)에 삽입하여 각각 최종적으로 숙주인 코리네박테리움 글루타미컴 KCTC 13032 (Corynebacterium glutamicum KCTC 13032) 및 바실러스 써틸리스 168 (Bacillus subtilis 168)에서 상기 단백질을 과량 발현하였다. 수득된 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미컴 GSAIC-1 및 바실러스 써틸리스 GSAIB-1을 각각 배양하여 배양 단계에 따라 세포 추출물을 준비하고, 타가토스 생산 활성을 측정하여 각 배양 시기별 생산되는 활성형 재조합 단백질의 양을 측정하였다. 이렇게 최적 발현된 배양 결과물은 세포 파쇄, 열처리, 이온교환수지 및 겔 크로마토그래피 등을 통하여 순수분리 정제하고 단백질 활성 측정을 통 하여 타가토스 생산 활성이 있음을 확인하였다.

실시예 1 : 아라비노스 이성화효소의 클로닝

지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22를 호기 조건에서 배양한 후, 이 균체를 8,000xg 에서 10분간 원심분리하여 수득하였다. 상기 수득한 균체로부터 세포 배양 DNA 미디 키트(Cell culture DNA Midi Kit; Qiagen, U.S.A.)를 사용하여 지노믹 DNA를 순수 분리하여 사용하였다. 상기 지노믹 DNA로부터 각각 XbaI 와 BamHI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 5'-TCTAGAATGATGCTGTCATTACGTCCTTATGAATTTTG-3'(서열번호 1) 및 5'-TCTAGATTACCGCCCCCGCCAAAACACTTCGTTCC-3'(서열번호 2) 의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래의 아라비노스 이성화효소 유전자를 포함하는 1494bp 크기의 DNA를 증폭하여 PCR 산물 1을 수득하였다. 또한 상기 지노믹 DNA로부터 각가 EcoRV 및 PstI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 5'-CCCGAT ATCATGCTGTCATTACGTCCTTATG-3'(서열번호 3) 및 5'-TGCACTGCAGTTACCGCCCCCG CCAAAACAC-3'(서열번호 4)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합연쇄 반응을 수행하였다. 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래의 아라비노스 이성화효소 유전자를 포함하는 1512bp 크기의 DNA를 증폭하여 PCR 산물 2를 수득하였다. 상기 두 개의 증폭된 유전자가 코딩하고 있는 아라비노스 이성화효소를 대량 발현하기 위하여, 보유하고 있는 바실러스 속 유래의 셔틀벡터 pHT01 및 코리네박테리움 속 유래의 셔틀벡터 pCJ-1 및 을 사용하였다. 상기 선별된 셔틀벡터 pCJ-1은 대장균 DH5alpha에 형질전환하여 2004년 11월 6일자로 국제기 탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였던 유전자원(수탁번호 KCCM-10611)을 사용하였으며, 셔틀벡터 pHT01은 분양 받은 유전자원(Mo Bi Tech Co., PBS001)을 사용하였다(표 1).

벡터명	프로모터명	벡터	수탁/분양 번호	유래 단백질
pCJ-1	Pcj1	pECCG117	KCCM-10611	열충격단백질 hsp60
pHT01	Pgrac	-	PBS001	-

제한효소 XbaI 및 BamHI으로 절단한 셔틀벡터 pHT01에 제한효소 XbaI 및 BamHI으로 절단된 상기 PCR 산물 1을 삽입하여 재조합 발현 벡터 pHT01-GSAI를 제작하였다(도 1 참조). 또한 제한효소 EcoRV 및 PstI로 절단한 셔틀벡터 pCJ-1에 제한효소 EcoRV 및 PstI으로 절단된 상기 PCR 산물 2를 삽입하여 재조합 발현 벡터 pCJ-1-GSAI를 제작하였다(도 2 참조). 재조합 발현 벡터 pHT01-GSAI 및 pCJ-1-GSAI로 코리네박테리움 글루타미컴 KCTC 13032 (Corynebacterium glutamicum KCTC 13032) 및 바실러스 써틸리스 168 (Geobacillus stearothermophilus 168)을 각각 형질 전환시켜 재조합 균주를 제조한 후 이를 각각 '코리네박테리움 글루타미컴 GSAIC-1' 및 '바실러스 써틸리스 GSAIB-1'로 명명하였으며, 그를 2006년 10월 18일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 각각 수탁번호 KCCM10789P 및 KCCM10788P로 기탁하였다.

실시예 2 : 바실러스에서 재조합 아라비노스 이성화효소의 발현

상기 실시예 1에서 제조된 재조합 균주 바실러스 써틸리스 GSAIB-1 (수탁번호 KCCM10788P)를 20㎍/㎖농도의 클로람페니콜(Chloramphenicol)을 포함한 LB 배지(Bacto-trypton10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl10g/L)에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 230rpm의 속도로 진탕 교반 배양하여 전배양액을 얻었다. 이렇게 얻어진 전배양액을 0.1% 농도로 동일 성분의 본배양액에 접종한 후 O.D.600 = 1에 도달할 때까지 37℃에서 230rpm의 속도로 진탕 교반 배양하여 재조합 아라비노스 이성화효소의 발현을 유도하였다. 발현된 아라비노스 이성화효소의 활성을 측정하기 위하여, 배양액을 12,000xg에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후, 50mM Tris-HCl (pH8.2) 버퍼 용액에 재 현탁하고, 이를 초음파 처리(170Watt, 2분당 1초 간격으로 얼음 냉각)로 세포를 파쇄 처리한 후 12,000xg에서 12분간 원심분리를 하여 상등액을 조효소액으로 사용하여 갈락토스 이성화 반응을 실시하였다.

갈락토스 이성화 반응은 기질로 100mM의 갈락토스를 25㎕, 조효소액을 100㎕ 혼합하여 60℃에서 1시간 반응시켜 수행하였다. 갈락토스 이성화 반응의 활성 측정은 40mM의 갈락토스를 기질로서 포함한 100ul의 조효소액과 1 ml의 반응 버퍼 용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.0)을 혼합하여 65℃에서 20분간 반응시켜 수행하였다. 이때 반응액 내에 최종 농도 5mM의 염화마그네슘(MgCl2)과 최종 농도 1mM의 염화망간(MnCl2)를 각각 첨가하여 사용하였다. 상기 활성 측정은 시스테인-카바졸-황산법(cystein-carbazol-sulfuric acid method; Dische, Z., and E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem., 192:583-587, 1951)으로 측정하였다. 조효소액 내의 단백질 정량은 브래포드 검정법(Bradford assay kit, Biorad, U.S.A.)을 사용하였으며, 그 결과 이성화효소 활성 0.2045±0.0078(mg-tagatose/mg-protein· h)으로 갈락토스 이성화 반응의 산물인 타가토스가 정상적으로 생성됨을 확인할 수 있었다(도 3).

각 배양액의 조성에 따른 효소 발현 최적화를 위하여, 일반적으로 바실러스의 배양에 사용되는 MB (Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl10g/L, Soytone 10 g/L) 및 LB (Bacto-trypton10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl10g/L) 배지를 기본 배지로 배양 최적화를 수행하였다. 재조합 균주 GSAIB-1 을 20㎍/㎖농도의 클로람페니콜을 포함한 LB배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L)배지에 접종하고 37℃, 230rpm 진탕 배양기(Shaking incubator)에서 12시간 배양한 결과물을 전배양물로 사용하였으며, LB배지에 여러 탄소원 (프룩토오스, 글루코오스, 숙신산, 소르비톨, 수크로오스) 10g/L 포함한 각각의 배지와 MB배지 (Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, soytone 10g/L)를 본배양물로 하여 전배양물 0.1%를 접종하여 O.D.600 = 1에 도달할 때까지 37℃, 230rpm 진탕 배양기에서 배양하여 재조합 아라비노스 이성화효소의 발현을 유도하였다. MB 배지에서의 효소 발현량은 LB 배지에서의 발현량에 비하여 대략 30% 정도 적은 것을 확인할 수 있었다. 또한 각 종류별 탄소원 첨가시의 단백질 발현 양상을 살펴보기 위하여 산업적으로 이용 가능한 탄소원인 글루코오스, 프룩토오스, 숙신산, 소르비톨, 수크로오스 등을 10 g/L 씩 첨가한 LB 배지에서 배양하고, 효소 발현량을 측정한 결과 숙신산 및 소르비톨 첨가시 효소 발현량이 소량 증가하는 결과를 얻을 수 있었다 (도 4).

실시예 3 : 코리네박테리움에서 재조합 아라비노스 이성화효소의 발현

상기 실시예 1에서 제조된 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미컴 GSAIC-1(수탁번호 KCCM10789P)는 10ug/ml 농도의 카나마이신을 포함한 MB 배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L)에 접종하고, 30℃에서 24시간동안 200rpm의 속도로 진탕 교반 배양하여 전배양액을 얻었다. 이렇게 얻어진 전 배양액을 1 % 농도로 본배양액에 접종한 후 O.D.600 = 0.1에 도달할 때까지 30℃에서 200rpm의 속도로 진탕 교반 배양하여 하여 재조합 아라비노스 이성화효소의 발현을 유도하였다. 발현된 아라비노스 이성화효소의 활성을 측정하기 위하여, 배양액을 8000xg 에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후, 50mM Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼 용액에 재 현탁하고, 이를 초음파 처리로 세포를 파쇄 처리한 후 8000xg에서 12분간 원심분리를 하여 상등액을 조효소액으로 사용하여 갈락토스 이성화 반응을 수행하였다. 조효소액 내의 단백질 정량은 브래포드 검정법(Bradford assay kit, Biorad, U.S.A.)을 사용하였으며, 그 결과 이성화효소 활성 1.387(mg-tagatose/mg-protein·h)으로 갈락토스 이성화반응 산물인 타가토스가 정상적으로 생성됨을 확인할 수 있었다.

활성형으로 발현됨이 확인된 재조합 균주 코리네박테리움 GSAIC-1에서의 아라비노스 이성화효소의 발현을 최적화하기 위하여, 재조합 균주를 10μg/ml 농도의 카나마이신을 포함한 MB 배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L)에 초기 농도 O.D. 600 = 0.6으로 접종하여 전배양액을 얻었다. 이를 두가지 종류의 코리네박테리움형 세균 기본 배지로 알려져 있는 MB 배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L) 및 변이 배지(Bacto-peptone 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 2.5g/L, Beef extract 5g/L)에 접종하여 생육을 비교하였다. 각각 25, 30, 37℃에서 배양 온도별 및 pH별 생육 비교, 기본 탄소원인 포도당과 설탕의 각각 농도별 첨가 생육 비교 및 정치 및 호기 조건에서의 생육 비교 실험을 수행하였다. 이렇게 선정된 다양한 조건에서의 생육 결과 및 효소 발현량을 시간별로 측정하여 재조합 아라비노스 이성화효소의 최적의 대량 발현 조건을 선정하였다(표 2 및 3) .

	변이 배지	MB 배지
	호기	정치	호기	25℃	30℃	37℃
OD₆₀₀	5.66	9.0	9.34	7.44	9.34	4.64
pH	7.6	7.8	7.6	7.5	7.6	7.6
활성 (mU/ml)	21.859	29.008	31.639	30.826	31.639	25.833

	0%	수크로오스				글루코오스
	0%	2.5%	5%	7.5%	10%	10%
OD₆₀₀	9.68	9.7	11.84	10.36	10.14	5.76
pH	7.6	4.7	4.4	4.4	4.6	4.4
활성 (mU/ml)	31.6	56.979	41.764	51.198	46.003	23.236
활성 (mU/ml)	31.6	56.979	41.764	51.198	46.003	23.236

이 때 발현된 재조합 아라비노스 이성화효소의 활성을 측정하기 위하여, 실시예 2에서 언급한 방법으로 효소를 처리한 후 정량한 결과 갈락토스 이성화 반응의 산물인 타가토스가 MB 배지에 수크로스 2.5%를 첨가하고 호기 조건에서 30℃ 배양하였을 경우, 기본 배양 조건에서 얻어진 31.6mU/ml에 비하여 1.8배 높은 57.0mU/ml의 효소 활성을 보임을 확인할 수 있었으며, 균체의 증식에 따라 비례적으로 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다. 상기 최적화 배지에서의 균체 생육 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 4 : 재조합 아라비노스 이성화효소의 순수 분리 정제

상기 실시예 3에서 얻어진 최적의 배양 조건에서 재조합 균주의 2L 배양을 실시하였으며, 이렇게 하여 수득된 배양액을 8000xg에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후 50mM Tris-HCl (pH 7.0) 버퍼 용액에 재 현탁하여 단백질 정제에 사용하였다. 상기 세포 현탁액은 고압 세포 파쇄기 T-시리즈 4.0kW (T-series 4.0kW; Constant systems, UK)을 이용하여 세포를 파쇄한 후 80℃에서 20분간 열처리를 하였으며, 10,000xg 에서 10분간 원심분리를 하여 재조합 발현된 호열성 아라비노스 이성화효소를 우선 분리하였다. 이렇게 하여 분리된 재조합 효소액은 분자량 10,000 에서 한외여과(ultrafiltration; Sartorius, U.S.A.)를 통하여 여과하였으며, 이때 얻어진 여과액은 다음 실험에 사용하였다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 호열성 미생물인 지오바실러스 속 유래의 아라비노스 이성화효소가 GRAS 미생물인 코리네박테리움 속 균주 및 바실러 스 속 균주에서 안정적으로 발현됨을 확인하였으며, 이렇게 발현된 활성형 재조합 효소 및 그를 이용하여 효율적 고정화 연속 반응을 수행하는 타가토스 제조방법을 제공한다. 미생물 효소를 이용한 생물공학적 식품소재의 생산은 제조 공정 중에 사용된 첨가물의 식품 안전성이 필수이며, 본 발명으로 완성된 기술을 통하여 지오바실러스 속 유래의 아라비노스 이성화효소를 식품안전형으로 발현하여 연속 반응 공정에 적용할 수 있으므로, 실질적인 산업화의 가능성이 있다.

<110> CJ Corporation <120> Food grade thermophilic arabinose isomerase expressed from GRAS and tagatose manufacturing method by using it <130> PA06-0313 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 tctagaatga tgctgtcatt acgtccttat gaattttg 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 tctagattac cgcccccgcc aaaacacttc gttcc 35 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 3 cccgatatca tgctgtcatt acgtccttat g 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 4 tgcactgcag ttaccgcccc cgccaaaaca c 31

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
셔틀벡터 pCJ-1(KCCM 10611P) 또는 pHT01(PCS001)에 지오바실러스 스테아로써모필러스 DSM 22(accession number AAD45718)로부터 유래된 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및

상기 재조합 벡터로 형질전환시킨 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물로부터 아라비노스 이성화효소를 생산하는 단계;

를 포함하는 식품안전형 호열성 아라비노스 이성화효소의 생산 방법.
제6항에 있어서,

상기 GRAS 미생물은 코리네박테리움, 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스 또는 이스트를 포함하는 식용 가능한 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 GRAS 미생물이 바실러스 써틸리스 GSAIB-1 (KCCM 10788P)인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 GRAS 미생물이 코리네박테리움 글루타미컴 GSAIC-1 (KCCM 10789P)인 것을 특징으로 하는 방법.