KR100850743B1

KR100850743B1 - 바실러스 서브틸리스 및 이를 이용한 생균제

Info

Publication number: KR100850743B1
Application number: KR1020060123480A
Authority: KR
Inventors: 문병헌; 김창현; 윤성조
Original assignee: (주)셀텍
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2008-08-06
Anticipated expiration: 2026-12-07
Also published as: KR20080051798A

Abstract

본 발명은 포도상구균에 항균성이 있는 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 바실러스 서브틸리스 CT-10(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁번호: KFCC11381P, 기탁일: 2006. 11. 28.), 및 포도상구균에 항균성을 가지는 바실러스 서브틸리스 CT-10을 유효성분으로 포함하는 생균제가 제공된다.

Description

바실러스 서브틸리스 및 이를 이용한 생균제{Bacillus subtilis and Probiotics Using the Same}

도1은 본 발명에 따른 CT-10균의 포도상구균에 대한 항균력을 보여주는 사진 도면,

도2는 본 발명에 따른 CT-10 균의 카탈라제 생성 사진도면,

도3은 본 발명에 따른 CT-10 균의 말라카이트 그린 포자 염색 사진도면,

도4는 블라스트 프로그램을 이용한 본 발명 CT-10 균의 16s rDNA 유전자에 대한 상동성을 보여주는 도면,

도5는 본 발명에 따른 CT-10 균의 디버전스에 의한 염기서열 일치도를 보여주는 도면,

도6은 본 발명에 따른 CT-10 균의 계통 수형도,

도7과 도8은 본 발명에 따른 CT-10의 포도상구균에 대한 항균력을 나타내는 사진도면,

도9는 본 발명에 따른 CT-10 균의 용혈반응을 보여주는 사진도면,

도10은 본 발명에 따른 CT-10 균이 황화수소 균이 아님을 보여주는 사진도면,

도11은 본 발명에 따른 CT-10의 인공위산 생존율을 보여주는 도면,

도12는 본 발명에 따른 CT-10의 내담즙성을 보여주는 도면,

도13은 배지 배양 시간대별 효소 활력을 보여주는 본 발명에 따른 CT-10의 성장률 측정결과를 나타내는 도면,

도14는 본 발명에 따른 CT-10의 배지배양 동안 시간대별 pH 변화를 보여주는 도면.

(기술분야)

본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제에 관한 것이며, 보다 상세하게는 포도상구균에 항균성이 있는 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제에 관한 것이다.

(배경 기술)

가축의 장내에는 많은 종류의 미생물이 상호 연관성을 가지고 공존하면서 하나의 생태계를 이루고 있다. 장내 세균은 지속적으로 공급되는 사료를 이용하여 혐기 혹은 미호기 발효를 하고 있으며, 가축의 체내에는 온도, pH, 삼투압, 산화 · 환원 등의 물리· 화학적인 환경이 거의 일정하기 때문에 미생물의 생식 밀도와 물질 대사 활성이 활발하게 이루어지고 있다. 하지만 극단적인 기후, 밀사 등의 환경적인 스트레스와 가축의 농후 사료 과다 섭취로 인한 과산증 등은 가축의 장내에 항상성이 파괴되고 결과적으로 면역력의 저하 등으로 인한 질병, 폐사 등 가축의 생산성 저하에 많은 영향을 미친다.

이에 대한 예방 및 치료로써 항생제나 화학 요법과 같은 의약품이 성공적으로 사용되어 왔다. 항생제에 의한 성장 촉진 기작은 Vistek(1978)(Vistek, W. J. 1978. The mode of growth promotion by antibiotics. J. Anim. Sci. 46:1447-1469)과 Walton(1980)(Walton, J. R. 1980. Modes of action of growth promoting agent. Forstschr. Vet. Med. 33:77-82)에 의해서 보고되었던 것처럼 열악한 환경에서 좋은 성장률을 보였고 생산성도 향상되었다.

가축 사료에 항생제를 첨가함으로써 영양소 이용률과 생산성이 증진되고 각종 질병 발생 억제 및 치료뿐만 아니라 최근에는 가축의 성장, 비육 촉진, 사료 효율 개선 효과 등의 목적으로 사용되어 가축의 생산성 향상에 지대한 공헌을 하고 있다.

그러나 항생제 사용은 장내 유효 미생물의 수를 감소시키고, 오남용으로 인해 항생 물질에 내성을 가지는 미생물이 증가되어 그의 효능이 떨어지거나 가축의 체내에 잔류하게 되어 인간이 섭취할 때 인체에 악영향을 미친다는 보고가 있은 후, 성장 촉진을 위한 목적으로서 항생 물질의 사용 억제가 한층 더 강화되고 있다.

유럽에서는 그동안 사료 첨가제로 사용을 허용 하였던 항생 물질 중 진크 박시트라신(zinc bacitracin), 스피라마이신(Spiramycin), 티로신 포스페이트(tylosin phosphate), 버지니아마이신(virginiamycin)의 사용을 금지하였다. 이러한 사용 금지 조치는 가축의 성장 촉진용으로 사용되는 항생물질에 내성을 가진 세균이 인체에 기생하는 세균에게 그 내성을 전달하여 인체에 사용되는 약품들에도 내성을 일으켜 사람의 질병 치료를 어렵게 하고 건강을 해칠 우려가 있다는 전제하에서 실시되었다.

이런 배경에서 항생제의 육류 내 잔류성이 없고, 섭취하는 인간의 건강에 안전 하면서도 가축의 성장을 촉진시키고, 항생제와 같이 세균성 질병을 예방 및 보조 치료할 수 있는 생균제(probiotics)를 개발하기 시작하였다.

생균제는 '다른 미생물의 생장을 촉진하는 미생물 또는 미생물들에 의해서 장내 세균 균형에 도움을 주는 물질', 또는 '인간 또는 동물 장내 세균의 균형을 개선시켜 숙주에 효과를 주는 살아있는 미생물 단독 또는 혼합배양물', '숙주에 유익한 작용을 갖는 미생물제제 또는 미생물의 성분' 등으로 정의된다.

생균제로서 갖추어야 할 바람직한 조건은, 병원성이나 독성이 없을 것, 소화효소, 위산, 담즙산에 파괴되지 않을 것, 병원성 미생물이 장관 수용체나 영양소와 부착하는 것을 경쟁적으로 억제하야야 할 것, 장내에 단기간에 정착하고 빠른 증식이 가능해야 할 것, 항균물질이나 유기산을 생산. 장관 내 유용한 균의 발육증식 및 정상 세균총을 유지해야 할 것, 유전적으로 병원성 미생물과 교잡 가능성이 없어야 할 것, 항생제나 화학요법제와 같이 사용해도 길항 작용이 없어야 할 것, 실온에서 사멸이 적고 안정성이 있어야 할 것 등이 제시되고 있다.

생균제가 장수의 원인이라고 보고 된 이후, 가축의 장내에서 생균제의 투여가 미생물들 간의 경쟁적인 관계로 작용한다고 보고한 이래 많은 종류의 생균제가 분리 및 동정되었다. 이러한 균들은 장내에서 유익한 미생물 수를 유지하는 작용을 하며, 유해한 균들과 경쟁 관계로 유익한 미생물의 효율을 극대화 할 수 있으며, 대규모 농장의 사양 시험에서도 생산성을 개선 할 수 있는 인자로 규명되었다.

가축에서 생균제로 사용 될 수 있는 세균은 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 엔테로코쿠스(Enterococcus) 속, 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 락티바실러스 스포로제네스(Lactibacillus sporogenes), 바실러스(Bacillus) 속 등이 있고, 이중에서도 바실러스(Bacillus) 속 생균제들은 다양한 항균 펩티드와 효소를 분비하고, 활성 아포를 형성하여 장에서 발아되어 장기간 장 질환에 대한 예방, 치료 및 소화율 향상 등의 효과가 보고되고 있다.

Bacillus는 토양, 물, 먼지, 공기 등 자연계에 다양하게 분포한다. Bacillus spp는 호기성 또는 통성 혐기성의 내생 포자를 형성하는 그람양성 간균으로서, 크기는 0.5∼2.5×1.2∼10㎛이고, 저온성, 중온성, 고온성, 호산성, 호염성, 내염성 등이 있고, 유기물을 영양원으로 하며, 당, 유기산 또는 알코올을 탄소원으로 하고 암모늄을 질소원으로 한 조성이 비교적 단순한 합성 배지에서 잘 생육하는 것으로 알려져 있다.

Bacillus spp로부터 여러 종류의 항생물질이 생산되는 것으로 알려져 있다. 널리 알려진 바와 같이 이런 항생물질은 주로 펩티드계이며, 대표적으로 B. subtilis는 약 66종류의 펩티드 항생물질을 분비하고, B. brevis는 23종류의 펩티드 항생물질이 분비되는 것으로 보고되었다. Bacillus spp는 각기 다양한 효소를 분비하고, 효소의 특성과 활성도 배양 배지 및 조건에 따라 매우 다르게 변한다고 알려져 있다.

가축 생균제로서 사용가능한 미생물의 종류에는 유산균, Bacillus 균, 곰팡이균, 효모 등이 있다. 특히 Bacillus 속은 고분자 형태의 유기물 분해 능력이 뛰어나 장류 발효에 이용되는 균으로서, 단백질을 분해하여 아미노산을 많이 생산할 뿐만 아니라 다양한 효소와 항생물질 등 항균 펩티드를 생산하며, 배양의 편의성, 빠른 성장속도, 보존성, 효소의 산과 열에 대한 안정성 면에서 생균제로서 적합한 특성을 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 목적은, 가축 질병 등의 원인이 되는 포도상구균에 항균성을 가지는 바실러스 서브틸리스 신균주를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 포도상구균에 항균성을 나타내는 바실러스 서브틸리스 신균주를 포함하는 생균제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따라, 바실러스 서브틸리스 CT-10(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁번호: KFCC11381P, 기탁일: 2006. 11. 28.)이 제공된다.

본 발명에 따라, 상기 바실러스 서브틸리스 CT-10을 유효성분으로 포함하는 생균제가 제공된다.

본 발명에 따라, 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 항균성을 가지는 바실러스 서브틸리스 CT-10을 유효성분으로 포함하는 생균제가 제공된다.

Staphylococcus aureus는 그람양성 구균으로, 사람과 동물의 피부에 상재하는 정상세균이지만, 적당한 환경조건이 주어지면 여러 가지 질병을 일으키는 기회 감염균이다. 특히 황금색 색소를 생성하고, 만니톨(mannitol)을 발효시키는 균으로 병원성이 강하고, 조직침습성이 높아 인간과 동물에 농가진, 피하 및 연조직농양, 봉와직염 등의 피부감염증, 창상감염, 골수염, 경부임파선염, 식중독, 폐렴, 패혈증 및 뇌수막염 등의 감염증을 일으킨다고 알려져 있다. 특히 젖소에서는 유방염의 주요한 원인균으로 문제시 되고 있다. 또한 잠복기간은 매우 짧아 1~6시간 이며, 이 균이 생성하는 장독소는 끓는 온도에서도 안정성을 유지하므로 이 균에 오염된 사료나 식품을 섭취하는 것은 아주 위험하다고 보고하고 있다. 그러므로 본 발명의 CT-10을 생균제로 사료에 첨가하여 투여할 경우에 포도상구균의 위해성을 감소시킬 것이다.

이하, 실시예와 첨부도면을 참조하여 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 및 이를 이용한 생균제를 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

실시예 1( Bacillus spp 및 Bacillus sp의 분리)

돼지 및 야생멧돼지의 장과 분을 채취하여 시료로 사용하였다. 도축장 및 돈사, 및 야산에서 총 7회에 걸쳐 시료를 채취 했으며, 시료는 도축 돼지의 소장에서 2,000g, 도축돼지 대장에서 1,000g, 야생멧돼지 소장에서 1,000g, 야생멧돼지 배설물(분)에서 1,000g을 각각 채취했다.

(1). 시료 중탕 후 포자형성 균 분리

포자형성균의 분리를 위해 채취된 시료를 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 첨가하여 진탕한 후 80℃ 수조에서 10분간 중탕했다. 그리고 현미경(Olympus BX 41, Japan)에서 400배율로 총 균수를 확인한 다음, 시료별 균수에 따라 10^-1-10^-8까지 십진 희석 후 100㎕을 취하여 영양배지(Nutrient Agar: beef extract 3g, bacto-peptone 5g, 아가 15g 물 1L, Difco, USA)에 유리봉으로 도말하고 30, 37℃에서 24-48h 배양했다. 그 후 생성되는 콜로니들의 형태, 색깔, 특징, 성상이 다른 것들을 백금이로 1차 분리했다.

1차로 분리한 것들을 영양배지(Nutrient broth)(Difco, USA)에서 30, 37℃에서 각각 24시간 배양 후 10^-6-10^-8까지 십진 희석 후 영양배지(NA: Difco, USA)에 도말하였다. 순수 분리를 위해 위의 과정을 2-4번 반복했다.

확보한 균주들을 CT-1번부터 순서대로 라벨링하고 미크로 밴크(Micro bank)(PRO-LAB, Canada)를 이용하여 -70℃ 초저온 냉동고(OPERON, Korea)에 보관 하였다.

(2) 포자형성 후 중탕에 의한 분리

포자형성균의 회수율을 높인 후 분리를 위하여 채취된 시료를 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 첨가하여 진탕한 다음 침전물을 가라앉히고 실온에서 정치한 후 상등액 100㎕ 취하여 NA(영양배지)에 유리봉으로 도말하고, 각각 30와 37℃에서 24-48h 배양했다. 그 후 아가 플레이트를 꺼내 실온에서 4-10일 동안 방치 하면서 중간 중간 샘플링하여 현미경 상으로 포자 형성 여부를 확인한 후 멸균 생리 식염 수에 아가 전체를 긁어 현탁한 후 수조에서 80℃ 10분간 중탕 하였다. 그 후 분리 과정은 1차 때와 동일하게 진행하였다.

(3) 여과지에 의한 분리

포자형성균과 항균력이 있는 균을 분리하기 위해 E. coli K-99, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae을 전 배양 한 후 미리 멸균하여 굳혀 둔 LB(Luria Bertani, Difco, USA) 아가 플레이트 상에 100㎕ 씩 도말하였다.

직경 6mm 페이퍼 디스크를 아가 플레이트 상에 8개씩 올린 후 배양액 40㎕을 현탁하였다. 37℃ 24시간 배양 후 클리어존(clear zone)을 형성하는 디스크 페이퍼를 회수해서 재차 순수 분리, 항균력 측정 및 포자 형성 여부를 확인하였다.

(4) 포크 방법에 의한 분리

배양액의 pH 변화로 인한 항균활성을 감안해서 E. coli K-99, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae을 전 배양 한 후 미리 멸균하여 굳혀 둔 LB 아가 플레이트에 100㎕ 씩 도말한 후 분리된 균들의 콜로니들을 플레이트 위에 포킹(forking)한 후 클리어존의 형성으로 항균성 여부를 확인하였다.

(5). 결과

장과 분에서 포자를 형성하는 200종을 스크린 한 결과 야생멧돼지 소장에서 분리한 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 보이는 본 발명에 따른 균주를 1개 분리하였고, 이를 CT-10으로 명명하고 이하의 테스트에 사용하였 다. 나머지 균들은 항균성이 없거나 아주 미미하였다.

도1은 Bacillus spp의 스크린과정 중에 포크방법에 의한 Staphylococcus aureus에 대한 항균력을 보여주는 사진 도면이다. 도1에 나타난 바와 같이 본 발명의 CT-10균 콜로니 주위로 선명한 클리어존이 형성되어 있다.

실시예 2(분리된 균의 동정)

(1). 과 및 속의 동정

야생멧돼지 장으로부터 분리한 항균 활성을 보이는 분리 균을 동정하기 위하여 생화학적인 테스트를 다음과 같이 하였다. 그람 염색(Gram staining), 세포형태분석(cell morphology), 카탈라제 테스트(catalase test), 및 포자염색(spore stain)을, Buchanan 등(1986)(Buchanan, R. E., and N. E. Gibbone. 1986. Bergey's manual of determination bacteriology. 8th ed. Williams and Wikins. Batimore M. D.), MacFaddin(1980)(MacFaddin, J. F. 1980. Biochemical tests for identification of medical bacteria, 2nd ed. Williams Wilkins. London.) 및 Benson(1990)(Benson, H. S. 1990. Microbiological Application 5th ed : A laboratory manual in general microbiology. WCB.) 등의 방법에 따라서 실시하였다.

(2). API CHB 50 키트에 의한 동정

분리된 균을 API 50CHB 키트(Merieux, France)를 사용하여 당 발효 이용성을 확인하여 동정하였다.

(3). 16S rDNA 유전자 염기 서열을 이용한 최종 동정

분리된 균주의 16S rDNA 단편을 PCR 반응으로 증폭하기위해 콜로니에서 게놈 DNA를 추출 하였고, 추출한 게놈 DNA를 9F, 923R(9F, 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'; 926R, 5'- CCGTCAATTCCTTTRAGRTT -3')을 사용하여 증폭하였다. PCR에 사용된 시약과 재료에는 주형 DNA 3㎕, Taq 폴리머라제 0.5㎕, 10Ex Taq 버퍼 5㎕, dNTP 혼합물 5㎕, 9F 프라이머 5㎕, 926R 프라이머 5㎕, DW 26.5㎕를 사용하여 총용량을 50㎕로 하여 증폭하였고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 35회 반복하였다.

증폭된 샘플은 1% 아가로스 겔에 전기영동 후, 아가로스 겔 추출 키트(Intron, Korea)를 이용하여 회수 하였고 pGEM-T 이지 벡터(Easy Vector)와 리게이션(ligation)하여 16℃에서 24시간 반응하였다. 또한 형질전환(transformation) 후 리게이션 된 플라스미드를 가지고 있는 콜로니를 구별하기 위해 20% IPTG와 x-gal을 첨가하여 능력세포(competent cell)에 형질전환하고 LB 평판배지에 도말하여 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 선별된 균주를 미니 조제(mini preparation) 하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드와 PCR에 사용되어진 프라이머를 이용하여 DNA염기서열 결정에 사용하였다.

(4). 결과

(A). 카탈라제 생성

본 발명에 따른 CT-10 균의 카탈라제 생성 사진은 도2와 같다. 도2는 본 발명의 CT-10의 콜로니를 슬라이드 글라스 위에 도말하고 3% 과산화수소를 떨어뜨린 후 관찰된 결과로서 기포가 많이 형성되어 있음을 알 수 있다. 이것은 과산화수소가 카탈라제에 의해 물과 산소로 분해되면서 산소가 가스 형태로 발생되는 것을 의미한다. Bacillus는 대부분 카탈라제를 생성하는데, 미생물들은 호기호흡동안 과산화수소 또는 독성의 과산화물을 생성하며, 미생물들이 이런 물질을 효소적으로 분해하지 못한다면 축적되어 결국 미생물의 사멸한다.

(B). 포자 염색

Bacillus는 포자 형성 균으로서, 본 발명에 따른 CT-10 균의 말라카이트 그린 포자 염색 사진은 도3과 같다. 포자의 세포벽은 치밀한 지질막이나 지단백으로 구성되어 있어서 일반염색은 침투할 수 없으므로 가온 염색을 통하여 염료의 지질 결합성으로 염색하였다. 도3에서 녹색부분이 포자이고, 붉은색은 포자가 형성되지 않은 세포이며, 녹색중앙에 붉은색 가장 자리의 염색이 된 세포는 중간 단계의 세포로서, 포자와 영양세포가 확연히 구분되었다.

(C). API CHB 50 키트 동정

아래의 표1은 본 발명의 CT-10 균의 API CHB 50 키트(Merieux, France)로 당 이용성을 평가한 동정결과이다. 동정 결과가 배양온도와 동정자에 따라서 상이하게 나타났다. 이는 키트 색깔이 애매하게 변한 부분에 대한 판독여부의 차이였다. 하지만 전체적으로 Bacillus spp에 포함됨을 알 수 있다. API 카트를 이용한 결과의 차이는 Barbosa 등(2005)(Barbosa, T. M., C. R. Serra., R. M. La Ragione., M. J. Woodward, and A. O. Henriques. 2005. Screening for Bacillus isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract. J. AEM. 71.2.968-978.)를 참조할 수 있다. Barbosa 등은 브로일러(broiler) 위장관에서 분리한 Bacillus spp 239종을 API 시스템과 16s rDNA을 이용한 동정 실험을 하였으며, API 시스템에서 정확하게 동정된 것은 239종 중 가장 일반적으로 알려진 Bacillus spp 19종뿐이라고 하였다.

구분	온도	가능한 세균	가능성(%)
A	30℃	Bacillus stearothemophilus	98.2
		Bacillus amyloliquefaciens	40.8
		Bacillus stearothemophilus	23.4
		Brevibacillus laterosporus	20.1
		Bacillus subtilis	15.4
	37℃	Bacillus stearothemophilus	ND
	37℃	Bacillus circulans	ND
B	30℃	Bacillus circulans	94.8
		Bacillus amyloliquefaciens	52.9
		Bacillus subtilis	44.4
	37℃	Bacillus amyloliquefaciens	ND
	37℃	Bacillus circulans	ND

(ND는 결정되지 않은 것을 의미함)

(D). 16s rDNA 동정

분리균은 16s rDNA 동정방법으로 염기서열을 확인한 후 블라스트(Blast) 프로그램을 이용한 진뱅크(Gene Bank) 데이터베이스에서 유전자 상동성으로 동정을 하였다.

도4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 CT-10 균(target gene)의 16s rDNA 유전자는 9종의 미생물과 염기서열 상동성을 나타나며, 즉 본 발명의 CT-10 균은 다른 9종과 염기서열이 거의 일치한다.

도5는 본 발명의 CT-10 균(target gene)의 디버전스(divergence)에 의한 염기서열 일치도를 나타낸 것으로서, 도시된 바와 같이 CT-10은 B. subtilis, B. vallismortis, B. atrophaeus와 염기서열의 상동성이 100%이다.

도6은 CT-10 균의 계통 수형도로서, CT-10 균은 Bacillus 계통 중에서 B. subtilis, B. vallismortis, B. atrophaeus와 가깝고 B. subtilis와 가장 가깝게 나타났다.

결과적으로 본 발명의 CT-10 균은 B. subtilis와 종족 계통 발생학적으로 유연관계가 가장 있는 것으로 나타났다.

실시예 3(항균활성)

(1). 가축의 설사 및 호흡기 질환에 관여하는 대표적인 병원성 균인 E. coli K-99, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토토쿠스 다이스갈락티아에(Streptococcus dysgalactiae)에 대한 억제 효과의 정도를 조사하였다.

배양온도에 따른 항생물질의 분비를 알아보기 위하여 NB(영양배지)에서 30 및 37℃로 나누어 시간대 별로 배양하였다. 항균력 측정은 LB 아가 플레이트에 각각을 100㎕ 접종하여 도말 후 직경 6mm의 여과지 디스크를 올려놓고, 분리균의 배양액 또는 4℃에서 13,000rpm으로 원심분리 한 상등액을 각각 40㎕씩을 현탁하여 37℃에서 24시간 배양한 후 투명 환의 생성여부와 크기를 조사하였다.

(2). 결과

도7에 도시된 바와 같이, 배양액 적용시 CT-10의 Staphylococcus aureus에 대한 항균력을 나타내는 클리어존의 형성을 보여주고 있다. 클리어존의 직경은 13mm이고 CT-10 균 주위로 선명하게 나타났다.

도8은 CT-10의 배양액 또는 세포가 제거된 상등액을 여과지 디스크에 40㎕ 적용하고 30℃ 24시간 배양한 결과로서, Staphylococcus aureus 대한 뚜렷한 클리어존이 형성되었다. 이로부터 2차 대사산물의 활성이 확인되었으며, 항균제 감수성 및 최소증식 저지 농도(minimal inhibitory concentration) 측정법을 통해 감수성이나 적용량을 결정할 수 있다.

표2는 CT-10의 배양액과 상등액(균이 제거된)에서의 배양온도차에 따른 항균활성의 크기(직경, mm)를 나타낸 것이다. 표2에서 보는 바와 같이 배양시간에 따른 항균력의 크기는 30℃에서 48시간 이후 상등액에서 높은 항균활성을 보였다. 이는 영양원의 고갈 등 배양조건이 열악해 지면서 내생포자형성으로 인한 항생물질의 분비가 된다는 이론과 부합되는 것으로 보인다.

Staphylococcus aureus
시간(h)	30℃		37℃
시간(h)	배양액	상등액	배양액	상등액
24	13	11	18	13
48	11.5	9	14	ND
72	13	13	14.5	ND
96	14	14	15	ND

나머지 병원성 균인 E. coli K-99, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus dysgalactiae에서는 항균력이 없거나 미약하였다.

실시예 4(안정성 및 유용성)

(1). 용혈성(β-hemolysis)

β-용혈이란 유해균 중 인지질 효소를 생산하여 적혈구에 의해서 공급되는 인지질을 가수 분해 하여 적혈구를 용혈시키는 작용이며(Maheswaran, S. K., and Lidorfer, R. K. 1967. Staphylococcal β-hemolysin Ⅱ. phospholipase. C. activity of purified β-hemolysin, Ⅰ. purification of β-hemolysin, J. Bacteriol. 94:300. 참조), 이에 관한 테스트로 용혈성을 판별할 수 있다.

분리균의 용혈성을 알아보기 위하여 앞서 참조한 MacFaddin(1980)의 방법에 의거하여 5% 양혈(sheep blood)를 함유하고 있는 트립신 소이 아가(Tryptic soy agar)(Difco, USA) 평판 배지에 선형 접종(streaking)한 후, 30 과 37℃에서 72시간 동안 배양하여 존의 형성 여부로 음성 또는 양성을 확인하였다.

(2). 황호수소(Hydrogen sulfide)의 생성

황화수소(H₂S)는 독성과 부식성이 강하고 심한 냄새가 나기 때문에 환경배출에 있어 엄격한 통제를 받는다. 쥐가 H₂S를 1시간 호흡했을 경우 50%가 사망하는 H₂S의 농도(LD50)는 673,713ppm이며, 사람의 경우 14ppm에 15분간 노출될 때 폐활량이 감소하며, 더 장시간 노출될 경우 호흡기 질환, 불임, 폐기능장애, 폐암 등이 발병 할 수 있다.

H₂S는 시스테인 또는 메티오닌 등 황을 함유하는 아미노산이 분해되거나, 티오황산염, 황산염 및 아황산염 등의 무기 황 화합물이 환원되어 생성된다. 어떠한 유기 종속(heterotrophic) 미생물은 황을 함유하고 있는 능력이 있고, H₂S 가스를 생성할 수 있다. 펩톤, 티오황산염, 황산염 및 아황산염 등은 황 화합물의 자원이지만, 황을 함유하고 있는 화합물 혹은 H₂S를 생성하는 아미노산의 이용성은 각각의 균마다 차이가 있다. 이러한 활력을 나타내는 효소를 시스테인 탈황화수소효소이다.

분리균의 장내 이상 발효 유무를 알아보기 위하여 MacFaddin(1980) 방법을 약간 변형하여 Kligler's 아이언(Iron) 아가(KIA, Difco, USA)에 배양균을 접종한 다음 30 또는 37℃에서 72시간 까지 배양한 후 플레이트의 색깔이 흑색이면 양성이고, 아무런 변화가 없으면 음성으로 판단했다.

(3). 인공 위산 내성

순수한 위액의 pH는 1.4~3.0 정도로 거의 대부분의 미생물은 사멸되나 섭취된 음식물의 완충 작용에 의해 다소 pH가 높아져 미생물의 사멸을 어느 정도 감소시킬 수 있으나 생균제로서의 균이 체내에서 여러 가지 생리적 기능을 발휘 하려면 위내에서 생존성이 높아야 한다. 본 발명의 CT-10 균이 생균제로서의 기능을 발휘하기 위해서는 강산성의 위액을 통과하여야 한다. 내산성 실험으로는 생체내에서 직접 생존율을 확인하는 방법(Shin. M-S ; H-K. Kim ; G-T. Kim, C-S. Huh, H-S. Bae and Y-J. Baek. Selection and characteristics of Lactobacillus acidophilus isolated from Korean feces. Korean J. Food Sci Technol. 31 : 1999, pp. 495-501. 참조)과 인공위액을 이용해 간접적으로 측정하는 방법이 알려져 있다. 생균제의 사멸은 주로 HCl에 의한 pH의 저하에 의한 것이며(Conway, P. L., Gorbach, and B. R. Goldin. "Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells" J. Dairy Sci. 1987. 70:1-12. 참조), 생체외와 생체내에서의 실험결과가 거의 일치한다는 사실이 보고되어 있다(Campbell, G. L. and M. R. Bedford. " Enzyme applications for monogastric feeds " A review. Can. J. Anim. Sci. 1992, 72:449-466. 및 Park, C-J., J-S. Pyeon, Y-K. Cho, S-S. Hong, and H-S. Lee. Characteristics of Enterococcus sp isolated from animal intestine and power. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 24, 1996, pp. 393-398. 및 상기 Conway 등(1987) 참조).

Clark 등(1993)(Clark, P. A., Cotton, L. W., and Martin, J. H. 1993. Cultured of Dairy products Journal. 28:11-14.)의 방법을 변형하여 NB(영양배지)를 2N HCl로 컨트롤(pH 7.0)과 pH 2, 3, 4, 5로 조절한 용액 9ml이 들어있는 시험관에 24시간동안 배양한 분리균액 1ml을 접종하여 37℃에서 2시간 동안 정치한 후, 표준한천평판배지(Plate count agar)(PCA, Difco )에서 생성된 균수를 측정하였다.

(4). 인공 담즙산 내성

생균제로서의 균의 담즙산에 대한 내성의 중요성은 Gilliland 등(1984)(Gilliland, S. E., Stahly, T. E. and Bush, L. J. 1984, Importance of bile tolerance of L. acidophilus used as a dietary adjust. Journal of Dairy Science 67:3045-3051.)에 의해서 강조되어 왔다. 간의 담즙낭에서 분비되는 담즙은 소화기능을 도와주는 중요한 기능이다. 담즙산은 물질의 표면 장력을 낮추어 주는 역할을 하고 장내에서 지방을 유화시켜 지방산을 용해한다. 또한 담즙은 독성과 담즙 색깔, 과잉 콜레스테롤, 항생물질, 구리, 아연, 수은과 같은 무기 물질을 제거하는 기능을 가지고 있다(Harpere, H. A., Rodwell, V. W. and Mayes, P. A. 1979. Digestion and absorption from the gastrointestinal tract. : Review of physiological chemistry, 17th edition. Lange Medical Publication, Los Altos, California. 참조). 십이지장으로 들어간 담즙은 대부분의 미생물에 아주 강한 살균성을 가진다. 이러한 이유는 모든 미생물이 가지고 있는 세포벽 성분 중에 지질과 지방산이 담즙산에 의해서 공격을 받아 세포벽이 파괴되기 때문이다. 상기 Gilliland 등(1984)은 생균제 균으로 인정받을 수 있는 관건은 선발된 균이 담즙산에 강한 내성을 가지고 있는지 유무에 따라서 판결 된다고 하였다. 하지만 담즙산이 오히려 균을 성장시킬 수 있다는 보고도 있다(Park, H-S., S-H. Lee, and T-B. Uhm. Selection of microorganisms for probiotics and their characterization. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 27, 1998, pp. 433-440.).

전술한 Gilliland(1984)의 방법을 변형하여 10ml의 NB(영양배지)에 담즙산(bile salt)를 0, 0,1, 0.3, 0.5 및 1%씩 각각 첨가한 후 121℃에서 15분간 멸균한 다음 각각의 배양액 1%를 접종하였다. 37℃에서 6시간 동안 정치한 후 NA 플레이트에 도말하고 생성된 콜로니의 수를 측정하였다.

(5). 결과

(A). β-용혈

도9는 양혈 아가 플레이트 상에서 CT-10 균의 용혈반응을 실시한 것으로서, CT-10은 양혈 5% 첨가한 아가 플레이트 상에 접종한 결과 용혈성을 나타내지 않았음을 알 수 있다.

(B). 황화수소

도10은 황화수소 생성균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typimurium)을 Kligler's Iron Agar(KIA, USA)에 천자 접종한 것(A)과 Kligler's Iron Agar(KIA, USA)에 CT-10을 주입평판법(Pour plate method)을 적용 확인한 것으로서, 전자(A)의 황화수소 균은 황화수소가 철 이온들과 결합하여 검은색으로 변했으나, 후자(B)는 배지의 색깔은 변함이 없었다. 이로써 본 발명에 따른 CT-10은 황화수소 균이 아님을 알 수 있다.

(C). 인공 위산 내성

CT-10의 인공위산 생존율은 도11에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 컨트롤(pH 7.0)에서의 총균수는 2.0×10⁷, pH 5.0에서 7.2×10⁵, pH 4.0 에서 4.0×10² , pH 3.0에서 8.0×10¹CFU/ml으로 나타났고, pH 2.0에서는 측정되지 않았다. 결과적으로 NB에서의 배양 시 총균수가 낮았고, pH가 낮아질수록 삼투압 등에 의해 급격한 생존율 저하를 보였다. 이는 포자 형성율이 낮았기 때문으로 판단된다.

강 등(2002)은 B. polyfermenticus SCD, Bacillus spp와 유산균을 각각 pH 2.0과 3.0로 조절한 후 시간대별로 4시간까지 생존율 측정하고, B. polyfermenticus SCD와 Bacillus spp는 충분히 내생포자를 형성 시킨 후 실험을 하였다. 그 결과 B. polyfermenticus SCD는 균은 pH 2.0과 3.0에서 2시간 생존율이 각각 85.6%와 92.6%였고, 4시간 생존율은 62.8%와 81.2%였다고 하였다. 이는 다른 Bacillus sp.들 보다 생존율이 높았고, 반면 내생포자를 형성하지 않는 유산균들의 생존율은 매우 낮았다고 하였다. 이로부터 CT-10을 생균제로서의 활용성을 높이기 위해 포자형성율을 증가시키면 될 것임을 알 수 있다.

(D). 인공 담즙산 내성

CT-10의 내담즙성은 도12와 같다. CT-10의 생존 세포는 담즙산이 0%에서 1.0×10⁶, 0.1%에서 1.01×10⁶, 0.3%에서 2.98×10⁵, 0.5% 에서 4.13×10⁶, 1%에서 5.28×10⁵CFU/ml으로 각각 나타났다(SEM 0.864, Pvalue 0.0016). 이는 CT-10이 담즙산염에 0.3%이상부터 유의차를 보였고, 또한 5배에서 7배 이상 감소한 것으로 나타났다.

실시예 5(배양시간대별 성장률)

분리균의 성장곡선을 알아보기 위하여 NB에서 약 12시간 전 배양하여 활력을 높인 후, 1%를 접종하고 37℃, 200rpm의 진탕 배양기에서 배양하였다. 30분 단위로 샘플링하여 스펙트로포토미터(V-530, JASCO, Japan)를 이용하여 595nm에서의 흡광도(OD값)를 측정하였다.

배지(Nutrient broth)에서 배양 시간대별 효소 활력을 알아보기 위하여 CT-10의 성장률 측정하였고 그 결과는 도13과 같다. 정체기는 배양 후 6시간째에 도달했으며, 배양 15시간 이후부터 사멸기에 접어들었다.

실시예 6(배양시간대별 pH)

pH 변화는 성장률 측정 시 샘플링하여 pH 미터(Mettler ToLeDe GMbH 8603 Schwerzenbach Switzerland)를 이용하여 30분 단위로 측정하였다.

배지(Nutrient broth)에서 37℃ 200rpm으로 교반 배양하는 동안 30분 간격의 pH 변화는 도14와 같다. 배양 후 2시간째부터 pH가 떨어지기 시작하여 대수성장기 시작 시점인 3~4시간 째 pH 5.5까지 떨어졌다가 점차적으로 상승하여 배양 16시간 때부터는 pH 7.6~7.8인 상태로 유지되었다. 백 등(2002)(백형동, 김원석, 김성미, 박규용, 이광호, “프로바이오틱 비스루트균의 아포 생산을 위한 최적배지 개발”, Kor, J, Food Sci, Tech, 34(2), 2002, 263-268. )은 B. polyfermenticus가 증식함에 따라 배양 초기에는 pH가 감소하다가, 시간이 경과함에 따라 서서히 증가하여 pH가 거의 8.0∼8.5 수준에 이르는 결과를 보였다고 하였다. 그 이유는 균체가 증식함에 따라 유기산을 생성하면서 pH의 감소가 이루어졌으며, 생성된 유기산을 세포의 동화작용에 의하여 pH가 증가되었다고 하였다(Spudich, J. A. and Kornberg, A. Biochemical studies of bacterial sporulation and germination ; protein turnover during sporulation of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 243, 1968, pp. 4600-4605., 및 Warriner, K, and Waites, W. M. Enhanced sporulation in Bacillus subtilis grown on medium countaining glucose ; ribose. Lett. Appl. Microbiol. 1999, pp. 29:97-102. 참조).

실시예 7(가수분해 효소의 활력)

(1). 조효소액의 채취

배양시간에 따른 효소활성을 알아보기 위하여, 각 0, 1, 3, 6, 12 및 24에서 배양한 병에서 상층액을 채취하여 13,000 rpm에서 4℃로 5분간 원심분리기(Eppendorf Centrifuge 5415R, Eppendorf, Germany)를 이용하여 원심분리한 후 최종 상층액을 효소활력 분석을 위한 조효소액으로 사용하였다.

(2). CMCase 활력

배양액을 13,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 조효소로 이용하였다. 0.5M 구연산 버퍼(pH 5.5)로 용해시킨 1% CMC(carboxymethyl cellulose, No. C-4888, Sigma, USA)의 기질을 이용하여 각각 블랭크 튜브에 1% CMC 용액 0.5ml과 구연산 버퍼(0.05M, pH 5.5) 0.5ml를 넣어주었다. 샘플 튜브에 1% CMC 용액과 0.5ml과 조효소액 0.5ml를 넣어 45℃ 수조에서 1시간 동안 정치 배양하였다. 1시간 동안 반응시킨 후 효소 반응을 중지시키기 위하여 각 튜브를 5분 동안 끊인 후, 얼음물에서 5분 동안 냉각하였다. 냉각된 반응액을 13,000rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액 0.2ml를 채취하여 DNS(dinitrosalicylic acid)용액을 0.6ml씩 넣어준 다음, 반응을 위해 5분 동안 끓인 후 후, 얼음물에서 5분 동안 냉각하였다.

증류수 4.2ml를 각각의 튜브에 5ml 되게 희석시킨 후 550nm에서 흡광도(OD값)를 측정하였으며, 기질로부터 유리된 환원당의 양은 글루코스를 표준물질로 하여 μmol/ml/min 단위로 환산하였다.

(3). 아밀라제 활성

0.05M 인산칼륨 버퍼(pH 7.0)로 용해시킨 1% 용해 녹말(Sigma, USA)의 기질을 이용하여 각각 블랭크 튜브에 1% 녹말의 0.5ml과 0.05M 인산칼륨 버퍼(pH 7.0)의 0.5ml를 넣어주었다. 샘플 튜브에 1% 녹말용액의 0.5ml과 조효소의 0.5ml를 넣어 45℃ 수조에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 배양이 끝나면 5분 동안 끓인 후, 얼음물에서 5분 동안 냉각하였다. 테스트 튜브에 배양된 반응액의 상층액 0.2ml를 채취하여 DNS(dinitrosalicylic acid)용액 0.6ml씩 넣어준 다음, 반응을 위해 5분 동안 끓인 후, 얼음물에서 5분 동안 냉각하였다. 증류수로 각각의 튜브에 5ml 되게 희석시킨 후 550nm에서 흡광도(OD값)를 측정하여 기질로부터 유리된 환원당의 양을 글루코스를 표준물질로 하여 μmol/ml/min 단위로 환산하였다.

(4). 크실란아제(Xylanase) 활성

0.05M 인산칼륨 버퍼(pH 7.0)로 용해시킨 2% 크실란(oat spelt xylan)(No. X0627, Sigma, USA)의 기질을 이용하여 각각 블랭크 튜브에 2% 크실란 0.5ml과 인산칼륨 버퍼(0.05M, pH 7.0) 0.5ml를 넣어주었다. 샘플튜브에 2% 크실란 0.5ml과 조효소의 0.5ml를 넣어 45℃ 진탕수조에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 분석 방법은 앞의 CMCase 분석방법과 같은 방법으로 분석하였다. 분석 후 기질로부터 유리된 환원당의 양은 크실로스(xylose)(No. X3877, Sigma, USA)를 표준물질로 하여 μmol/ml/min 단위로 환산하였다.

(5). 프로테아제 활성

0.25N NaOH 버퍼(pH 7.0)로 용해시킨 아조카세인(Azocasein)(No. X0627, Sigma, USA)의 기질을 이용하여 각각 블랭크 튜브에 조-효소(crude enzyme) 0.5ml과 인산칼륨 버퍼(0.05M, pH 7.0) 1.75ml를 넣어주었다. 샘플 튜브에 0.5ml 조-효소와 반응버퍼 2ml를 넣어 39℃ 진탕수조에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 컨트롤 튜브에 0.25ml 컨트롤 기질과 모든 튜브에 30% TCA 0.5ml를 넣고 39℃ 진탕수조에서 5분 동안 배양하고, 13,000 rpm, 4℃로 15분간 원심분리한 후 분석 후 기질로부터 유리된 Azo기의 양을 분석하여 μg/ml/min 단위로 환산하였다.

(6). 결과

아래의 표3은 시간대별 가수분해 효소의 활력을 나타낸 것이다. 프로테아제의 효소 활력은 배양 10시간 때 11.23(± 2.46) ㎍/ml/min으로 제일 높았다. 아밀라아제는 배양 7시간 때 4.27(± 6.24)㎛ol/ml/min으로 가장 높았으나 시간대별 변이차가 컸다. 크실란아제와 CMCase의 활력은 미약하여 CT-10이 NB 배지에서의 배양은 두 효소 생산능력이 낮은 것으로 생각된다.

배양 시간(h)	효소활성
배양 시간(h)	프로테아제 ㎍/ml/min)	아밀라아제 (㎛ol/ml/min)	크실란아제 (㎛ol/ml/min)	CMCase (㎛ol/ml/min)
1	2.05 ± 0.41	0.16 ± 0.21	2.95 ± 0.56	0.44 ± 0.36
4	2.17 ± 0.04	0.39 ± 0.35	2.03 ± 0.20	0.57 ± 0.17
7	2.10 ± 0.93	4.30 ± 6.24	1.41 ± 0.74	0.41 ± 0.30
10	11.23 ± 2.46	0.86 ± 0.23	2.67 ± 0.95	0.56 ± 0.82
15	8.82 ± 1.80	1.46 ± 1.26	1.54 ± 0.31	1.92 ± 1.26
24	8.36 ± 3.80	1.63 ± 0.32	1.78 ± 0.84	0.45 ± 0.21

이상에서 설명한 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 CT-10(KFCC11381P)은, 가축 질병의 원인균인 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 우수한 항균성을 나타낼 뿐만 아니라 안전성과 융용성 등 가축의 생균제로서 활용할 수 있는 여러 특성을 보유하고 있으므로, 사용 목적에 따라 다양한 산업용 배양 배지를 이용하여 포자형성율을 높이고 항균물질과 효소 등을 유도하면 생균제 균주로서 널리 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

바실러스 서브틸리스 CT-10(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁번호: KFCC11381P, 기탁일: 2006. 11. 28.)
포도상구균에 항균성을 가지는 청구항 1의 바실러스 서브틸리스 CT-10을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제.