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KR100846354B1 - 혈청 당단백질부터 분리한 폐암 진단용 마커 - Google Patents

혈청 당단백질부터 분리한 폐암 진단용 마커 Download PDF

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KR100846354B1
KR100846354B1 KR1020070027541A KR20070027541A KR100846354B1 KR 100846354 B1 KR100846354 B1 KR 100846354B1 KR 1020070027541 A KR1020070027541 A KR 1020070027541A KR 20070027541 A KR20070027541 A KR 20070027541A KR 100846354 B1 KR100846354 B1 KR 100846354B1
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protein
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lung cancer
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박재용
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Abstract

본 발명은 혈청 당단백질로부터 분리한 폐암 진단용 마커에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폐암 환자의 혈청에서 과량 발현되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 폐암 진단용 마커는 폐암 환자의 혈청에서 특이적으로 과량 발현되므로 폐암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하는데 매우 유용하다.
폐암, 진단, 마커, 혈청

Description

혈청 당단백질부터 분리한 폐암 진단용 마커 {Diagnostic biomarker for lung adenocarcinoma isolated from serum glycoproteins}
도 1은 본 발명의 방법에 따른 인간 혈청 단백질의 초고속 분석 방법의 개략적인 모식도이다.
도 2는 인간 혈청으로부터 다중-렉틴 친화성 칼럼에 의해 분리된 당단백질의 쿠마시 브릴란트 염색 결과(A) 및 겔코드 염색한 결과(B)와 디글리코실화한 혈청 당단백질의 쿠마시 브릴란트 염색 결과(C)이다.
도 2의 A 및 B
레인 1: 사이즈 마커, 레인 2, 4, 6: 정상 관류 시료
레인 3, 5, 7: 정상 용출 시료, 레인 8, 10, 12: 암 관류 시료
레인 9, 11, 13: 암 용출 시료
도 2의 C
레인 1: 사이즈 마커, 레인 2 내지 4: 정상 시료, 레인 5 내지 7: 암 시료
도 3은 본 발명에 따른 폐암 바이오마커의 세포 내 위치(A), 분자적 기능(B) 및 생리적 프로세스(C)에 따른 분류를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 폐암 바이오마커인 인터-알파 트립신 인히비터 H3(A) 및 AGT의 웨스턴 블롯팅 결과(B)를 나타낸 것이다.
본 발명은 혈청 당단백질로부터 분리한 폐암 진단용 마커에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폐암 환자의 혈청에서 과량 발현되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다.
폐암은 세계적으로 총 발생률이 12.3%이고, 전체 사망률이 17.8%로 추정되는 질환이다(Parkin, D. M., Lancet Oncol 2001, 2, 533-43). 또한, 국내에서 폐암의 발생률과 이로 인한 사망률이 지속적으로 증가하는 것으로 추정되고 있다. 최근의 암 치료법의 발달에도 불구하고 폐암의 경우, 생존율이 매우 낮다. 이는 암의 진단이 대부분 늦게 이루어지는데 원인이 있다. 따라서 폐암을 조기 진단하여 환자의 생존율을 증가시킬 수 있는 마커의 개발이 절실히 필요하다.
한편, 혈액 및 소변과 같은 인간의 체액은 진단을 위해 용이하게 수득할 수 있으며, 비정상 및 정상 상태에서 각각 다르게 발현하는 분비 단백질을 포함하고 있기 때문에 불규칙하고 병리적인 신체의 상태(종양, 면역 반응 및 혈관 질환 등과 관련된 상태)를 인지하는데 있어서 유용하다. 한편, 혈청 내에 다량 존재하는 단백질들(Abundant serum proteins)(알부민, IgG 및 트랜스페린 등과 같은)로 인해 새로운 바이오마커가 될 수 있는 미량 존재하는 단백질들(low abundant proteins)을 규명하는 데 어려움이 있다. 다수의 연구들은 다량 존재하는 혈청 단백질을 감소시키기 위해 여러 가지 방법들을 시도해 왔다. 다량 존재하는 단백질의 제거 방법은 일부 연구자들에 의해 도입되었으며 이들은 일반적으로 2개의 부분으로 분류된다. 이들 중 하나는 알부민, IgA, IgG, 트랜스페린, HP(haptoglobin) 및 안티트립신(antitrypsin)을 감소시키기 위하여 면역친화성 HPLC 컬럼을 사용하는 것이다(Okano, T. et al., Proteomics 2006, 6, 3938-48; Yu, K. H. et al., J Proteome Res 2005, 4, 1742-51). 다른 하나는 하이드라지드 화학(hydrazide chemistry)(Liu, T. et al., J Proteome Res 2005, 4, 2070-80) 또는 렉틴 친화력(Yang, Z. et al., J Chromatogr A 2004, 1053, 79-88; Yang, Z. et al., Proteomics 2005, 5, 3353-66; Vosseller, K. et al., Mol Cell Proteomics 2006, 5, 923-34; Zhang, H. et al., Mol Cell Proteomics 2005, 4, 144-55)을 이용한 혈청 당단백질의 분리이다.
최근의 두 연구에서 2-DE 및 MALDI-TOF(Maciel, C. et al., J Exp Ther Oncol 2005, 5, 31-8) 또는 2-DE 및 LC-MS/MS(Okano, T. et al., Proteomics 2006, 6, 3938-48)를 이용하여 폐암 환자와 건강한 사람의 혈청 사이에 다르게 발현되는 단백질이 보고 된 바 있으며, 현재 폐암의 혈장 마커로는 NSE, CEA 및 CYFRA 21-1 이 알려져 있다. 그러나 폐암 마커로서 이들의 민감도 및 특이성이 충분하지 않다(Tarro, G. et al., J Cell Physiol 2005, 203, 1-5). 이러한 이유로 인해, 폐암 특이적 새로운 바이오마커의 규명이 시급히 필요하다.
이에 본 발명자들은 폐암을 진단할 수 있는 새로운 진단 마커를 개발하고자 연구한 결과, 폐암 환자의 혈청으로부터 다중-렉틴 친화 칼럼을 이용하여 당단백질을 분리하고 상기 당단백질의 글리칸을 효소 처리하여 제거한 다음, 인-겔 트립신 소화에 의해 수득한 펩타이드를 LC-MS/MS로 분석한 결과, 폐암 환자의 혈청에서만 특이적으로 발현이 증가되므로 폐암을 진단하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있는 단백질을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 혈청 당단백질로부터 분리한 폐암 진단용 바이오마커를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐암 환자의 혈청에서 과량 발현되는 당단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 폐암 환자의 혈청에서 과량 발현되는 당단백질을 암호화하 는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "폐암 (lung cancer)"은 폐에 발생하는 악성종양을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "바이오 마커"란 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로 정상 세포에 비하여 암이 발병된 세포에서 증가를 보이는 유기 생체 분자를 말한다. 상기 유기 생체 분자로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질 및 당 등이 포함된다.
본 발명자들은 새로운 폐암 진단용 마커를 규명하고자, 폐암 환자의 혈청과 정상인 혈청 사이에서 다르게 발현되는 당단백질을 동정하였다. 이를 위해, 다중-렉틴 친화성 칼럼을 이용하여 혈청으로부터 당단백질을 분리하고, 효소처리에 의해 당단백질을 디글리코실화한 후 트립신 처리하여 펩타이드를 확보하였다. 상기에서 확보된 펩타이드를 액상 크로마토그래피로 분리하면서 이온 트랩형 질량분석기(LC- MS/MS)로 분석하였다. 상기 LC-MS/MS 데이터를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 IPI 인간 단백질 데이터베이스에서 검색함으로써 폐암 환자의 혈청에 존재하는 당단백질을 규명하고 이를 정상인 혈청 유래 당단백질과 비교함으로써 폐암 환자의 혈청에서만 특이적으로 존재하므로 폐암의 바이오마커로 사용할 수 있는 당단백질을 규명하였다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 폐암 환자 혈청 내 바이오마커의 규명을 위한 실험 방법은 도 1에 도시한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서는 폐암 환자와 정상인으로부터 각각 6종의 혈액 시료를 수득하고 이를 원심분리하여 혈청 시료를 확보하였다(실시예 <1-1> 참조). 상기에서 수득한 혈청 시료로부터 다중-렉틴 친화성 칼럼을 이용하여 당단백질을 분리하고 아세톤 침전에 의해 농축시켰다(실시예 <1-2> 참조).
본 발명의 일 실시예에서는 다중-컬럼 친화성 칼럼에 의해 수득된 용출액(농축된 당단백질) 및 관류 분획(flow-through fraction)을 대상으로 쿠마시 브릴란트 염색(coomassie brilliant straining) 및 겔코드(GelCode) 당단백질 염색을 수행하여 다중-렉틴 친화성 칼럼에 의한 당단백질의 분리 효율을 확인한 결과(실시예 <1-3> 참조), 다중-렉틴 친화성 칼럼에 의해 혈청 내 당단백질이 농축되고 알부민이 제거되었음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
이에 본 발명자들은 상기에서 수득한 농축된 혈청 당단백질을 펩타이드-N-글라이코시데이즈 F(peptide-N-glycosidase F, PNGase F)로 처리하여 당 부분을 잘라 내고 1D-SDS PAGE를 수행하고(실시예 <2-1> 참조), 인-겔 소화에 의해 펩타이드 혼합물을 수득하였다(실시예 <2-2> 참조). 상기에서 수득한 펩타이드 혼합물을 LC-MS/MS 분석하여 정상 혈청에 비해 암 환자 혈청에서만 특이적으로 발현되는 단백질 38개를 동정하였다(실시예 3 참조).
상기 38개의 동정된 단백질 중 일부는 폐암 환자의 혈청 또는 혈장에서, 폐암의 표지자로 사용할 수 있을 것이라고 보고 된 것들이다. 그 예로는 헵토글로빈(Heptoglobin, HP), 인터-알파-트립신 인히비터 H4(inter-alpha-trypsin inhibitor H4, ITI-H4), 보체 C3 전구체(complement C3 precursor), 루신-리치 알파 2 당단백질(leucin-rich alpha 2 glycoprotein) 등이 있다. 이들 이외의 단백질들은 아직까지 폐암 표지인자 또는 바이오마커로서 알려져 있지 않다.
나아가, 본 발명자들은 폐암 환자의 혈청에서만 특이적으로 존재하는 것으로 규명된 단백질 중 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)가 폐암 환자의 혈청에서만 특이적으로 발현하는지 여부를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과(실시예 4 참조), 상기 단백질은 정상인 혈청에 비해 폐암 환자의 혈청에서 높게 발현됨을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
따라서 본 발명에서 폐암 환자의 혈청에서만 특이적으로 발현하는 것으로 규 명한 당단백질들은 폐암 진단 마커로 사용될 수 있다.
생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 표 4에 나타낸 보체 성분 c8 베타 사슬 전구체(Complement component c8 beta chain precursor), 단백질 s100-a9 (Protein s100-a9), C4b-결합 단백질 알파 사슬 전구체(C4b-binding protein alpha chain precursor), 아포리포단백질-II 전구체의 아형 2(Isoform 2 of apolipoprotein-l1 precursor), 단백질 s100-a8(Protein s100-a8), 카비아 포셀루스 포스파딜산 포스파타아제 2A mRNA 유사체(Similar to cavia porcellus phosphatidic acid phosphatase 2A mRNA), 보체 성분 c9 전구체(Complement component c9 precursor), 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor), Flj00385 단백질(Flj00385 protein (fragment), 응고인자 xii 전구체(Coagulation factor xii precursor), Ig 알파-2 사슬 c 영역(Ig alpha-2 chain c region), 보체 성분 c8 알파 사슬 전구체(Complement component c8 alpha chain precursor), 코르티코스테로이드-결합 글로불린 전구체(Corticosteroid-binding globulin precursor), 클러스테린 전구체(Clusterin precursor), 감마-g 글로빈(Gamma-g globin), 혈청 아밀로이드 p-성분 전구체(Serum amyloid p-component precursor), 혈장 칼리크레인 전구체(Plasma kallikrein precursor), Igha1 단백질(Igha1 protein), 헤파린 보조인자 2 전구체(Heparin cofactor 2 precursor), 16 kDa 단백질(16 kDa PROTEIN), Ig 카파 사슬 v-iii 영역 gol(Ig kappa chain v-iii region gol), 보체 인자 I 전구체(Complement factor I precursor), 헤모글로빈 서브유닛 베타(Hemoglobin subunit beta), 트리파타이트 모티브 단백질 49 유사체(Similar to tripartite motif protein 49), 보체 인자 b 전구체의 아형 1(Isoform 1 of complement factor b precursor (fragment), 알파-1-항트립신 전구체(Alpha-1-antitrypsin precursor), 카르복시펩티다제 n 서브유닛 2 전구체(Carboxypeptidase n subunit 2 precursor), 보체인자 h-관련 단백질 3 전구체(Complement factor h-related protein 3 precursor), 혈장 프로테아제 c1 인히비터 전구체(Plasma protease c1 inhibitor precursor), Ig 카파 사슬 c 영역(Ig kappa chain c region), 알파 2 마크로글로불린 변이체(Alpha 2 macroglobulin variant), 덤시딘 전구체(Dermcidin precursor), 보체 c5 전구체(Complement c5 precursor) 및 임신 단백질 전구체(Pregnancy zone protein precursor)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)에 특이적인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.
표 4에 나타낸 단백질들은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 상기 공지된 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.
예를 들어, 다클론 항체는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 단백질에 특이적인 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 마커 단백질의 존재여부를 확인할 수 있는 방법으로는 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 이용할 수 있다.
따라서 본 발명은 표 2에 나타낸 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 펩타이드는 본 발명의 마커 단백질로부터 유래된 7~35개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다.
상기 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 시료가 적용되는 샘플패 드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.
상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.
또한, 본 발명은 표 4에 나타낸 보체 성분 c8 베타 사슬 전구체(Complement component c8 beta chain precursor), 단백질 s100-a9 (Protein s100-a9), C4b-결합 단백질 알파 사슬 전구체(C4b-binding protein alpha chain precursor), 아포리포단백질-II 전구체의 아형 2(Isoform 2 of apolipoprotein-l1 precursor), 단백질 s100-a8(Protein s100-a8), 카비아 포셀루스 포스파딜산 포스파타아제 2A mRNA 유사체(Similar to cavia porcellus phosphatidic acid phosphatase 2A mRNA), 보체 성분 c9 전구체(Complement component c9 precursor), 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor), Flj00385 단백질(Flj00385 protein (fragment), 응고인자 xii 전구체(Coagulation factor xii precursor), Ig 알파-2 사슬 c 영역(Ig alpha-2 chain c region), 보체 성분 c8 알파 사슬 전구체(Complement component c8 alpha chain precursor), 코르티코스테로이드-결합 글로불린 전구체(Corticosteroid-binding globulin precursor), 클러스테린 전구체(Clusterin precursor), 감마-g 글로빈(Gamma-g globin), 혈청 아밀로이드 p-성분 전구체(Serum amyloid p-component precursor), 혈장 칼리크레인 전구체(Plasma kallikrein precursor), Igha1 단백질(Igha1 protein), 헤파린 보조인자 2 전구체(Heparin cofactor 2 precursor), 16 kDa 단백질(16 kDa PROTEIN), Ig 카파 사슬 v-iii 영역 gol(Ig kappa chain v-iii region gol), 보체 인자 I 전구체(Complement factor I precursor), 헤모글로빈 서브유닛 베타(Hemoglobin subunit beta), 트리파타이트 모티브 단백질 49 유사체(Similar to tripartite motif protein 49), 보체 인자 b 전구체의 아형 1(Isoform 1 of complement factor b precursor (fragment), 알파-1-항트립신 전구체(Alpha-1-antitrypsin precursor), 카르복시펩티다제 n 서브유닛 2 전구체(Carboxypeptidase n subunit 2 precursor), 보체인자 h-관련 단백질 3 전구체(Complement factor h-related protein 3 precursor), 혈장 프로테아제 c1 인히비터 전구체(Plasma protease c1 inhibitor precursor), Ig 카파 사슬 c 영역(Ig kappa chain c region), 알파 2 마크로글로불린 변이체(Alpha 2 macroglobulin variant), 덤시딘 전구체(Dermcidin precursor), 보체 c5 전구체(Complement c5 precursor) 및 임신 단백질 전구체(Pregnancy zone protein precursor)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 본 발명은 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)를 암호화 하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.
또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 문 헌(Sambook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989)에 공지된 바와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.
상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법(Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오타이드 연장 분석(Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법(Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화(single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피(Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션(Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션(Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003) 및 마이크로어레이(Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.
상기 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이의 형태로 제공될 수 있다.
예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명의 마커 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함하는 RT-PCR 키트, 본 발명의 마커 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착된 기판을 포함하는 DNA 칩 등이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
인간 혈청으로부터 당단백질의 분리 및 디글리코실화
<1-1> 혈청 시료
경북대학교 병원에서 65세의 흡연 남자 중 폐암(lung adenocarcinoma) 환자 3명과 건강한 정상인 3명로부터 동의를 받아 6종의 혈액 시료를 수득하였다(표 1). 혈액시료를 4℃에서 12000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 수득하고 실험에 사용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다.
폐암 및 정상인 환자의 특성
폐암 그룹 정상 그룹
개체수(명) 3 3
병력 폐암 건강함
성별 남자 남자
나이 64 64
흡연여부 흡연자 흡연자
<1-2> 다중-렉틴 친화성 칼럼을 이용한 당단백질의 분리 및 농축
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 혈청 시료로부터 당단백질을 분리 및 농축하기 위해 다중-렉틴 친화성 칼럼을 사용하였다. 상기 다중-렉틴 친화성 칼럼(Qiagen, USA)은 ConA(concanavalinA), LCH(lentil lectin), GNA(snowdrop lectin), WGA(wheat germ agglutinin), SNA(Elderberry lectin), MAL(maackia amurensis lectin), AIL(jacalin) 및 PNA(peanut agglutinin)으로 충진 된 것을 사용하였다. ConA, LCH 및 GNA는 N-글리코실화 된 단백질을 캡처 할 수 있으며, WGA, SNA 및 MAL은 시알산 변형 단백질(sialic modified protein)에 결합할 수 있다. 또한, AIL 및 PNA는 O-글리코실화 된 단백질을 분리할 수 있다. 500rpm에서 2분간 원심분리하여 스핀 칼럼에 결합 완충액 500㎕를 보충하고 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 각 혈청 50㎕에 프로테아제 인히비터 용액(protease inhibitor solution)이 함유된 결합 버퍼 500㎕를 첨가하여 희석한 다음 스핀 칼럼에 로딩하고 실온에서 1분간 인큐베이션하였다.
칼럼의 효율을 확인하기 위하여, 2분간 500rpm으로 원심분리하여 관류 분획(Flow-through fraction)을 회수하였다. 용출 버퍼를 첨가하여 용출액을 회수하고 아세톤 침전에 의해 농축 및 탈염하였다.
<1-3> 쿠마시 블루 및 겔코드 당단백질 염색
상기 다중-렉틴 친화성 칼럼에 의한 당단백질의 분리 효율을 확인하기 위하여 실시예 <1-2>에서 다중-컬럼 친화성 칼럼에 의해 수득된 용출액(농축된 당단백질) 및 관류 분획(flow-through fraction)을 대상으로 쿠마시 브릴란트 염색(coomassie brilliant straining) 및 겔코드(GelCode) 당단백질 염색을 수행하였다.
쿠마시 브릴란트 염색은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 실시예 <1-2>에서 수득한 용출액 및 관류 분획을 각각 전기영동한 후 겔을 ddH20로 5분간 3회 세척하고, 바이오-세이프 쿠마시 염색 용액(Coomassie G250 Stain; Bio-Rad)을 이용하여 실온에서 부드럽게 교반하면서 1시간 동안 염색하였다. 인큐베이션 후 겔을 ddH2O로 탈염하고 10분마다 ddH20를 3회 보충하였다.
겔코드(GelCod) 당단백질 염색(PIERCE)은 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 즉, 겔을 50% 메탄올에 30분간 침지시켜 고정한 다음 3% 아세트산 100ml로 10분간 2회 세척하였다. 산화제(oxidizing solution)를 처리하여 15분간 인큐베이션하고 3% 아세트산을 이용하여 5분간 세척하였으며 이를 3회 반복 수행하였다. 겔코드 당단백질 염색 시약을 첨가하고 15분간 서서히 교반하였다. 마지막으로 염색된 겔을 3% 아세트산 및 증류수로 순차적으로 세척하였다.
실험 결과, 폐암 환자 및 정상인 유래 관류 분획에서 일부 염색되지 않은 단백질 특히 약 40kDa 및 100kDa 이상의 단백질들이 다중-렉틴 친화성 칼럼의 용출액에서 검출되었다. 혈청 알부민 밴드는 관류 분획 모두에서 관찰되었으나 쿠마시 염색에 의해서는 약하게 염색되었다. 이러한 실험 결과로부터 다중-렉틴 친화성 칼럼의 용출액 내에 미량 존재하는 단백질들(low abundant proteins)이 농축되어 있음을 알 수 있었다(도 2의 A). 또한, 겔코드 당단백질 염색에 의해 용출액 내의 단백질들은 관류 분획에 비해 보다 명확하게 염색되는 것으로 나타났다(도 2의 B). 따라서 다중-렉틴 친화성 칼럼이 혈청 내 당단백질의 농축 및 알부민 제거에 있어서 효율적인 도구임을 알 수 있었다.
<실시예 2>
당단백질의 디글리코실화 및 펩타이드의 확보
<2-1> 당단백질의 디글리코실화
상기 실시예 1에서 농축된 혈청 당단백질을 위하여, 펩타이드-N-글라이코시데이즈 F(peptide-N-glycosidase F, PNGase F)를 처리하여 당 부분을 잘라내고 1D-SDS PAGE를 수행하였다.
농축된 당단백질 15㎍을 메캅토에탄올 100mM과 2% 옥틸 베타-D-글루코피라노사이드를 함유한 버퍼 내에서 100℃에서 10분간 변성시키고 실온에서 냉각하였다. 그 다음 PNGase F(Sigma, Germany) 5㎕를 함유한 반응 버퍼에서 37℃로 3시간 동안 인큐베이션하였다. 디글리코실화된 단백질을 SDS-PAGE에 로딩하여 시료를 분리하고 쿠마시 브릴란트 염색을 수행하였다. SDS-PAGE 결과는 도 2의 C에 나타낸 바와 같다.
<2-2> 인-겔 소화
상기 실시예 <2-1>의 쿠마시 염색 겔을 절단하여 수득한 단백질 밴드를 75mM 암모늄 바이카보네이트/ 40% 에탄올(1:1)을 처리하여 탈염하였다. 탈염 후, 튜브에 충분한 양의 DTT 용액(5mM 디티오트레이톨/ 25mM 암모늄 바이카보네이트)을 첨가하고 60℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 액체를 제거하고 겔 조각을 실온에서 냉각하였다. 단백질의 알킬화를 위해, 겔을 55mM 아이오도아세토아미드(iodoaceto amide)에 넣고 실온에서 30분간 인큐베이션한 다음 겔 조각을 100% 아세토니트릴로 탈수시킨 다음 건조시켰다. 겔 조각을 20㎍/ml의 변형 시퀀싱 그레이드 트립신(modified sequencing grade trypsin)(Roche Applied Science)을 함유한 25mM 암모늄 바이카보네이트 버퍼 10㎕에서 팽창시키고 트립신 분해를 위해 37℃에서 하룻밤(overnight) 동안 인큐베이션하였다. 트립신에 의해 생성된 펩타이드 혼합물을 LC-MS/MS 분석을 위해 0.1% 포름산으로 용출시켰다.
<실시예 3>
LC-ESI-MS/MS 분석
<3-1> LC-ESI-MS/MS
상기 실시예 2에서 생성된 펩타이드 혼합물을 LC-MS/MS를 이용하여 다음과 같은 방법으로 분석하였다. LC-MS/MS는 나노스프레이 이온화 소스(nonospray ionization; NSI sources, San Jose, CA)가 장착된 써모 핀니간스 프로테옴X 워크스테이션 LTG 리니어 이온 트랩 MS(Thermo Finnigan's ProteomeX workstation LTQ linear ion trap MS, Thermo Electron, San Jose, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 펩타이드 혼합물 12㎕를 펩타이드 트랩 카트리지(Agilent, Palo Alto, CA)에 주입 및 로딩하였다. 트랩된 펩타이드를 하우징 내에 패킹된 10cm 역상 피코프릿 칼럼(PicoFrit column, 5㎛, 300Å 직경 C18)을 이용하여 용출시키고, 그래디언트에 의해 역상 칼럼(reverse phase column; RP column)에서 분리하였다. 이동상으로는 각각 용액 A(H2O) 및 B(아세토니트릴, ACN)를 사용하였고, 상기 용액은 모두 0.1%(v/v) 포름산을 함유하였다. 유속은 200nL/min으로 유지하였다. 그래디언트는 2%의 이동상 B로 시작하였고 50분 내에 이동상 B가 60%에 이르도록 리니어 그래디언트를 수행하였다. 그 다음 5분 내에 이동상 B가 80%에 이르도록 하고 그 다음 15분 내에 이동상 A가 100%가 되도록 하였다.
데이터-의존적 포착 모드(Data-dependent acquisition mode)를 작동시켰으며 (m/z 300-1800), 전체 MS 스캔 후 30초 다이나믹 배제 옵션을 가진 5개의 MS/MS 스캔이 이루어지도록 하였다. 분사 전압은 1.9 kV, 이온 트랜스퍼 튜브의 온도는 195℃가 되도록 조절하였다. 표준화된 충돌 에너지는 35%로 조절하였다. 상기 LC-MS/MS 분석은 각 시료에 대해 독립적으로 2회 실시하였다.
<3-2> 데이터 분석
상기 실시예 <3-1>에서 수득한 MS/MS 데이터를 바이오워크스 소프트웨어(BioWorks software, version 3.2)에 포함된 SEQUEST 알고리즘(Thermo Electron, San Jose, CA)을 이용하여 IPI 인간 단백질 데이터베이스에서 검색하였다. 상기 데이터베이스 검색은 시스테인 잔기 상의 고정된 변이(카르복시아미도메틸레이션, 57Da), 메티오닌 잔기 상의 다양한 변이(옥시데이션, 16 Da), 펩타이드 질량 오차(mass tolerance) 1.5 Da 및 단편 질량 오차 1Da를 허용한다.
SEQUEST 결과를 Xcorr에 대한 전하 상태(charge state)에 의해 필터링하였다. Xcorr은 단일 전하 이온 1.9, 이중 전하 이온 2.2 및 삼중 전하 이온 3.75와 일치되도록 사용하였다. 델타 Cn ≥ 0.1, Rsp ≤ 4 및 확률치 ≤ 1.0E-3으로 설정하였다. 단백질 동정은 상응하는 펩타이드 동정을 기초로 하였다. 추가의 필터링은 10 이상의 점수를 갖는 단백질 및 단백질의 동정을 위한 2개 이상의 상응하는 펩타이드를 가지는 단백질에 관하여 수행하였다. 본 발명자들은 N- 및 O-결합 글리코실화를 통계적으로 분석하기 위한 도구로서 각각 NetNGlyc 1.0 및 NetOGlyc 3.1을 사용하였으며, 감산 프로테옴 분석을 위해 인-하우스 인포메틱 도구인 ProtAN을 사용하였다.
실험 결과, 3개의 정상 시료를 대상으로 한 2회의 반복실험에서 74, 121 및 80개의 단백질들이 각각 동정되었으며, 3개의 암 시료를 대상으로 한 2회 반복실험에서 99, 115 및 101개의 단백질들이 순서대로 동정되었다. LC-MS/MS 분석으로부터 동정된 단백질들은 암 시료 및 정상시료에서 65.6% 내지 76.1%였다(표 2).
LC-MS/MS 분석에 의해 동정된 단백질의 수
시료 첫 번째 단백질 ID 두 번째 단백질 ID 공통 단백질 재현성(%)
정상시료 1(N1) 95 86 74 69.2
정상시료 2(N2) 133 147 121 76.1
정상시료 3(N3) 95 107 80 65.6
암 시료 1(C1) 121 120 99 69.7
암 시료 2(C2) 127 141 115 75.2
암 시료 3(C3) 112 128 101 72.7
또한, 당단백질 농축 효율성을 보기 위하여, 당단백질의 글리코실화 부위를 NetNGlyc 1.0 및 NetOGlyc 3.1 프로그램을 이용하여 예측하였다. 검출된 단백질들은 N-결합 글리코실화를 위한 NXS/T 서열 및 O-결합 글리코실화를 위한 S/T의 매칭에 의해 동정된 전체 단백질의 약 90%로 예측되었다(표 3). 따라서 동정된 단백질의 약 90% 이상이 한 개 또는 그 이상의 당질화 부위를 포함하고 있음 알 수 있었다. 단백질 검출에 있어서 약 71.4% 재현성 및 당단백질 농축의 90% 효율성은 혈청 당단백질 결합된 LC-MS/MS의 프로파일링이 혈청 바이오마커의 발견을 위해 매우 유용함을 보여준다.
LC-MS/MS 분석에 의해 동정된 단백질, 글리코실화 단백질의 수 및 글리코실화 부위
시료 단백질 ID N-결합 글리코실화 부위 함유 단백질 O-결합 글리코실화 부위 함유 단백질 총 당단백질 당단백질의 백분율
정상시료 132 97 89 119 90.2%
암시료 148 106 101 133 89.9%
<3-3> 암 시료와 정상 시료에서 당단백질의 발현 비교
암 시료에서 동정된 당단백질을 정상 시료에서 동정된 당단백질과 비교분석하였다. 3명의 암 환자의 혈청으로부터 99개의 단백질이 공통적으로 검출되었으며, 이 중에서 38개의 단백질의 정상인에 비해 암 환자의 혈청에서 높게 발현되는 것임을 확인할 수 있었다. 한편, 정상 혈청 2(N2)에서 동정된 당단백질의 일부분은 MS 점수 및 히트 펩타이드의 수에 있어서 다른 정상 혈청과 차이가 있었다. 따라서 N2 데이터를 제외하였다. 상기 38개의 단백질의 히트 펩타이드(hit peptide)가 정상인에 비해 약 1.5배 높은 것으로 나타났다. 특히, 암 당단백질 중 21개의 단백질의 히트 펩타이드 수가 정상 당단백질에 비해 2배 높게 나타났다(표 4). 38개의 단백질 중 약 60%는 상대적으로 사람의 혈청에서 높이 발현되지 않는 단백질에 속한다. 또한, 이들 중 일부는 폐암 환자의 혈청 또는 혈장에서, 폐암의 표지자로 사용할 수 있을 것이라고 보고 된 것들이다. 그 예로는 헵토글로빈(Heptoglobin, HP), 인터-알파-트립신 인히비터 H4(inter-alpha-trypsin inhibitor H4, ITI-H4), 보체 C3 전구체(complement C3 precursor), 루신-리치 알파 2 당단백질(leucin-rich alpha 2 glycoprotein) 등이 있다. 이들 이외의 단백질들은 아직까지 폐암 표지인자 또는 바이오마커로서 알려져 있지 않다. 폐암 환자의 혈청에서 증가된 38개의 단백질들은 6개의 Ig(15.8%), 8개의 다량 존재하는 단백질(high abundant protein)(21.1%), 1개의 헤모글로빈(2.6%) 및 23개의 미량 존재하는 단백질(non-high abundant proteins, 60.5%)로 이루어져 있다. 이러한 결과는 혈청 내 당단백질의 농축 및 분리가 미량 존재하는 단백질(low abundant protein)의 동정을 위한 유용한 도구임을 나타내준다.
Figure 112007022364446-pat00001
상기 표 4에 나타낸 38개의 선별된 단백질을 세포 내 분포에 따라 세포외 또는 멤브레인 단백질로 분류하였다(도 3의 A). 또한 이러한 단백질들은 분자적 기능(도 3의 B) 및 생물학적 프로세스(도 3의 C)에 따라 분류된다. 분자학적 기능의 관점에서, 38개의 단백질 중 20%가 엔도펩티다아제 억제 활성을 가지고 있으며 15%가 항원 결합 활성을 가지고 있고, 11%가 트립신 활성을 가지고 있었다. 생물학적 프로세스의 관점에서, 38개의 단백질 대부분이 트랜스포트 및 면역-염증 반응 단백질과 관련되어 있다.
<실시예 4>
웨스턴 블롯 분석에 의한 확인
실시예 3에서 선별된 38개의 단백질 중 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)가 폐암 환자의 혈청에서만 특이적으로 발현하는지 여부를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
상기 실시예 2에서 암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈청 당단백질 20㎍을 15% SDS-PAGE에 로딩하였다. 전기영동 후, 겔을 니트로셀룰로스막(Whatman, Germany)으로 옮겼다. 단클론 염소 항-ITI-H3 항체(Santa cruz, CA, USA)를 1:500으로 희석하고 4℃에서 하룻밤(overnight)동안 인큐베이션하였다. 그 다음 항-염소 IgG 항체(Santa cruz, CA, USA)를 1:2,000으로 희석하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 신호를 검출하기 위해 ECL 어드밴스 웨스턴 블럿팅 분석 시스템(Amersham Biosciences, UK)을 사용하였다.
실험 결과, 정상 혈청의 LC-MS/MS 분석에서는 ITI-H3가 동정되지 않았으나, 웨스턴 블롯팅에 의해서는 정상 혈청에서도 검출되었다. 그러나 ITI-H3는 정상 혈청에 비해 폐암 혈청에서 더 많이 발현되는 것으로 나타났다(도 4).
따라서 상기 ITI-H3는 폐암의 바이오마커로서 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폐암 진단용 마커는 폐암 환자의 혈청에서만 특이적으로 과량 발현되므로 폐암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하는데 매우 유용하다.

Claims (8)

  1. 보체 성분 c8 베타 사슬 전구체(Complement component c8 beta chain precursor), 단백질 s100-a9 (Protein s100-a9), C4b-결합 단백질 알파 사슬 전구체(C4b-binding protein alpha chain precursor), 아포리포단백질-II 전구체의 아형 2(Isoform 2 of apolipoprotein-l1 precursor), 단백질 s100-a8(Protein s100-a8), 카비아 포셀루스 포스파딜산 포스파타아제 2A mRNA 유사체(Similar to cavia porcellus phosphatidic acid phosphatase 2A mRNA), 보체 성분 c9 전구체(Complement component c9 precursor), 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor), Flj00385 단백질(Flj00385 protein (fragment), 응고인자 xii 전구체(Coagulation factor xii precursor), Ig 알파-2 사슬 c 영역(Ig alpha-2 chain c region), 보체 성분 c8 알파 사슬 전구체(Complement component c8 alpha chain precursor), 코르티코스테로이드-결합 글로불린 전구체(Corticosteroid-binding globulin precursor), 클러스테린 전구체(Clusterin precursor), 감마-g 글로빈(Gamma-g globin), 혈청 아밀로이드 p-성분 전구체(Serum amyloid p-component precursor), 혈장 칼리크레인 전구체(Plasma kallikrein precursor), Igha1 단백질(Igha1 protein), 헤파린 보조인자 2 전구체(Heparin cofactor 2 precursor), 16 kDa 단백질(16 kDa PROTEIN), Ig 카파 사슬 v-iii 영역 gol(Ig kappa chain v-iii region gol), 보체 인자 I 전구체(Complement factor I precursor), 헤모글로빈 서브유닛 베타(Hemoglobin subunit beta), 트리파타이트 모티브 단백질 49 유사체(Similar to tripartite motif protein 49), 보체 인자 b 전구체의 아형 1(Isoform 1 of complement factor b precursor (fragment), 알파-1-항트립신 전구체(Alpha-1-antitrypsin precursor), 카르복시펩티다제 n 서브유닛 2 전구체(Carboxypeptidase n subunit 2 precursor), 보체인자 h-관련 단백질 3 전구체(Complement factor h-related protein 3 precursor), 혈장 프로테아제 c1 인히비터 전구체(Plasma protease c1 inhibitor precursor), Ig 카파 사슬 c 영역(Ig kappa chain c region), 알파 2 마크로글로불린 변이체(Alpha 2 macroglobulin variant), 덤시딘 전구체(Dermcidin precursor), 보체 c5 전구체(Complement c5 precursor) 및 임신 단백질 전구체(Pregnancy zone protein precursor)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
  3. 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)에 대한 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 키트.
  4. 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)에 대한 특이적인 항체가 부착된 폐암 진단용 마이크로어레이.
  5. 보체 성분 c8 베타 사슬 전구체(Complement component c8 beta chain precursor), 단백질 s100-a9 (Protein s100-a9), C4b-결합 단백질 알파 사슬 전구체(C4b-binding protein alpha chain precursor), 아포리포단백질-II 전구체의 아형 2(Isoform 2 of apolipoprotein-l1 precursor), 단백질 s100-a8(Protein s100-a8), 카비아 포셀루스 포스파딜산 포스파타아제 2A mRNA 유사체(Similar to cavia porcellus phosphatidic acid phosphatase 2A mRNA), 보체 성분 c9 전구체(Complement component c9 precursor), 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor), Flj00385 단백질(Flj00385 protein (fragment), 응고인자 xii 전구체(Coagulation factor xii precursor), Ig 알파-2 사슬 c 영역(Ig alpha-2 chain c region), 보체 성분 c8 알파 사슬 전구체(Complement component c8 alpha chain precursor), 코르티코스테로이드-결합 글로불린 전구체(Corticosteroid-binding globulin precursor), 클러스테린 전구체(Clusterin precursor), 감마-g 글로빈(Gamma-g globin), 혈청 아밀로이드 p-성분 전구체(Serum amyloid p-component precursor), 혈장 칼리크레인 전구체(Plasma kallikrein precursor), Igha1 단백질(Igha1 protein), 헤파린 보조인자 2 전구체(Heparin cofactor 2 precursor), 16 kDa 단백질(16 kDa PROTEIN), Ig 카파 사슬 v-iii 영역 gol(Ig kappa chain v-iii region gol), 보체 인자 I 전구체(Complement factor I precursor), 헤모글로빈 서브유닛 베타(Hemoglobin subunit beta), 트리파타이트 모티브 단백질 49 유사체(Similar to tripartite motif protein 49), 보체 인자 b 전구체의 아형 1(Isoform 1 of complement factor b precursor (fragment), 알파-1-항트립신 전구체(Alpha-1-antitrypsin precursor), 카르복시펩티다제 n 서브유닛 2 전구체(Carboxypeptidase n subunit 2 precursor), 보체인자 h-관련 단백질 3 전구체(Complement factor h-related protein 3 precursor), 혈장 프로테아제 c1 인히비터 전구체(Plasma protease c1 inhibitor precursor), Ig 카파 사슬 c 영역(Ig kappa chain c region), 알파 2 마크로글로불린 변이체(Alpha 2 macroglobulin variant), 덤시딘 전구체(Dermcidin precursor), 보체 c5 전구체(Complement c5 precursor) 및 임신 단백질 전구체(Pregnancy zone protein precursor)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)를 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
  7. 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)를 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 키트.
  8. 인터-알파 트립신 인히비터 중쇄 h3 전구체(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain h3 precursor; ITI-H3)를 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브가 부착된 폐암 진단용 마이크로어레이.
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