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KR100840747B1 - 토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제 및 그 제조방법 - Google Patents

토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제 및 그 제조방법 Download PDF

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KR100840747B1
KR100840747B1 KR1020070015938A KR20070015938A KR100840747B1 KR 100840747 B1 KR100840747 B1 KR 100840747B1 KR 1020070015938 A KR1020070015938 A KR 1020070015938A KR 20070015938 A KR20070015938 A KR 20070015938A KR 100840747 B1 KR100840747 B1 KR 100840747B1
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KR
South Korea
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soil
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sustained
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KR1020070015938A
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김영권
홍석일
홍명표
남명흔
최재필
박정현
Original Assignee
고려바이오주식회사
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Abstract

본 발명은 토양전염성 병원균의 길항균, 특히 배추 무사마귀병 길항균이 담체에 흡착되어 있는 길항균을 서서히 토양으로 방출시키는 서방형 미생물제제에 관한 것으로, 본 발명의 서방형 미생물제제는 토양전염성 병해에 대한 길항균을 배양하여 길항균배양액을 제조하는 단계; 상기 길항균배양액에 대하여 젤라틴(gelatine), 전분(starch), 카르복시 메틸 셀룰오즈(Carboxy Methyl Cellulose, CMC), 폴리 비닐 알콜(Poly Vinyl Alcohol, PVA) 중에서 선택된 1종 이상인 생분해성 접착제 0.1 ~ 1.0 중량부를 길항균 먹이성분과 함께 길항균배양액과 혼합하는 단계; 상기 혼합액을 길항균배양액에 대하여 20 ~ 100 중량부인 담체에 흡착시키는 단계; 및 상기 담체를 건조시키는 단계를 포함하여 제조되어 토양전염성 병해 특히 배추 무사마귀병에 방제효과가 있는 길항균이 토양 중으로 서서히 방출되어 지속적인 방제효과를 나타내며, 내성유발이 없고, 인체에 무해하며 방제가가 종래 화학농약에 대등한 환경친환경적 미생물제제를 제공한다.
토양전염성 병해, 무사마귀병, 바실러스 서브틸리스, 생분해성 접착제

Description

토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제 및 그 제조방법{LONG-ACTING MICROBIAL AGENT FOR CONTROLING SOIL-BORNE DISEASE IN PLANTS AND PREPARING METHOD THEREOF}
도 1은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KB-291의 포자 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 서방형 미생물제제의 제조공정도이다.
도 3은 생분해성 접착제로 젤라틴 0.75중량%, CMC 0.75중량%, 접착제없이 단순미생물흡착시켜 제조된 미생물제제에 대하여 수계에서 10일간의 시간경과에 따른 미생물 방출율을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 토양전염성 병원균의 길항균을 이용한 미생물제제에 관한 것으로, 담체에 흡착되어 있는 길항균을 서서히 토양으로 방출시키는 서방형(long-acting) 미생물제제에 관한 것이고, 좀더 상세히는 배추 무사마귀병 방제를 위한 서방형 미생물제제에 관한 것이다.
토양전염성 병해는 기주식물체없이 병원균이 토양속에서 내구체를 형성하여 장기간 생존하는 병해를 말하며 곰팡이병으로는 돌림병(역병), 시들음병, 균핵병, 밑둥썩음병, 잘록병이 있고, 세균병으로는 무름병, 풋마름병, 검은썩음병이 있다.
이들 병해집단은 그 특징상 유기합성농약에 의한 방제효과가 대단히 낮기 때문에 우리나라 뿐만 아니라 세계각지에서 가장 큰 문제로 대두되고 있다. 특히 우리나라와 같이 경지면적이 적어서 이어짓기가 불가피한 경우는 병원균의 토양 내 누적에 의하여 이어짓기 장해의 주원인으로 되고 있어 그 피해가 대단히 크므로, 반드시 해결하지 않으면 안되는 가장 중요한 병해집단이다.
토양전염성 병해 중에서 특히 무사마귀병은 Plasmodiophora brassicae 라고 하는 토양전염성 근류병균에 의하여 발생하는 병이며, 무, 배추, 양배추, 콜리플라워 등의 십자화과 작물의 뿌리를 가해하여 치명적인 해를 입히는 병이다. 병원균은 토양서식균으로 뿌리의 근모를 통해서 침입하여 뿌리에 암종모양의 혹을 형성시키며, 이 혹이 도관부를 압박함으로써 뿌리로부터의 수분상승이 원활치 못하여 잎이 시들게 되며, 혹 자체도 토양세균의 2차 침입을 받아 썩게 되어 결국은 식물전체가 죽게 된다.
무사마귀병균은 병반부위에 다량의 휴면포자를 만들고, 이 휴면포자는 기주식물이 없어도 토양 내에서 약 7~8년 이상 생존이 가능하며, 불량환경에 대한 내성이 강해 10년 이상 생존이 가능하므로, 무사마귀병에 한번 걸린 포장은 매년 피해를 받을 수밖에 없다. 특히 논 토양보다는 밭 토양에서 많이 발생하고 비가 자주 내릴 때나 물이 잘 빠지지 않는 땅과 이어짓기를 하거나 전년도 병이 발생했던 포 장에서 많이 발생되며, 병원균에 감염된 포장의 흙을 상토로 이용해서 모를 기를 때, 지난해 병이 발생되었던 포장에서 작업한 농기계나 농기구에 의해서도 전염되고 바람에 날리는 가는 모래와 함께 전파되기도 한다. 이렇게 무사마귀병은 십자화과 채소류의 재배에 있어서 가장 무서운 병으로 알려져 있다.
병원균의 생리, 생태학적 특성을 살펴보면 토양에서는 주로 기주작물인 배추, 무의 이병조직에서 휴면포자의 형태로 월동하여 토양에 잔존하며 토양내 온도와 수분이 적합하면 발아하여 운동성이 있는 유주자를 토양에 방출하게 된다. 이 유주자들은 토양내 수분을 따라 이동하여 배추, 무 뿌리의 뿌리털을 침입하게 되며 침입한 조직에서 증식하여 크고 작은 여러 개의 뿌리혹을 만들게 된다. 뿌리혹은 나중에 토양 중에서 부패하여 조직에 들어 있던 휴면포자가 또다시 토양에 유출하게 되어 생활환을 반복한다.
병원균의 발병 최적온도는 20~25℃이며 최적 토양수분 함량은 최대 용수량의 80% 수준이다. 토양 pH는 병원균의 발아에 직접적인 영향을 미치는 중요요인으로 pH 4.6~6.5의 산성토양에서 발생이 많고 pH가 7.1 이상인 토양에서는 휴면포자의 발아가 억제되어 발병하지 않는다. 가을 재배보다는 봄 재배에서 일반적으로 많이 발생하며, 모래가 많이 섞인 사질토보다는 부식질이나 점토함량이 많은 곳에서 발생이 심하다. 무사마귀병균의 월동태인 휴면포자는 주위 환경에 대한 견디는 힘이 매우 높아 여간 해서는 잘 죽지 않으며 배추, 무를 연작하는 고랭지밭에서는 해마다 병원균이 그 밭에 누적하게 되어 병발생이 점점 심해지는 양상을 보이고 있다.
무사마귀병원균은 배추, 무, 양배추, 갓, 케일, 순무 등의 십자화과 채소만 을 침해하여 병을 일으키며 타작물에서는 병 발생이 없다. 또한 냉이 등의 십자화과 잡초에도 발생하여 병을 일으키는 것으로 알려져 있다.
강원도 평창군 방림면 소재 배추 재배포장 23개소에서 토양내의 무사마귀병균 밀도를 조사한 결과 병을 일으킬 수 있는 한계 밀도인 무사마귀병원균의 밀도가 1g 토양 당 10,000개 미만으로 적은 포장은 8개 포장뿐이었고 나머지 15개 포장은 그 밀도가 만개에서 백만 개 사이로 병원균의 밀도가 매우 높게 나타나 병원균이 토양내 많이 누적되어 있는 것으로 나타나고 있다.
봄배추 무사마귀병 감염시기와 배추피해와의 관계를 보면 일찍 병에 감염될수록 피해가 커서 육묘시 감염된 묘를 이식하거나 건전묘를 이식하더라도 정식 20일내에 감염되면 전연 수확이 불가능하고 정식 20~30일 사이에 감염되면 수확은 가능하나 상품성이 없고 정식 40일이후 감염된 것은 전연 피해가 없는 것으로 알려져 있다.
정식시 감염되면 그 20일후에 뿌리의 표면에 돌기가 형성되기 시작하여 혹이 비대하며 그 5일후에는 혹이 염주알 모양으로 커지고 세근이 비대한다. 세근비대 5일후에는 식물체가 시들기 시작하고 주근도 비대하며 주근비대 후 10일후에는 혹이 부패하기 시작하고 지상부는 심하게 위조하며 위조후 10일후에는 혹이 완전부패하고 식물체는 말라죽는다. 무사마귀병의 감염에서 식물체가 완전히 죽을때까지의 과정를 보면 감염에서 20일까지의 잠복기를 거쳐 다음 20일간의 혹비대기를 가지며 그 후 10일간의 혹부패기를 거쳐 토양내 전염원의 생존기를 갖는 것으로 알려지고 있다. 휴면포자의 발아는 8~32℃의 범위에서 폭넓게 이루워지고 있으며 최적 발아 온도는 24~28℃이며 24시간 후에는 약 50%가 발아되고 5~6일 후에는 70~80% 정도가 발아하는 것으로 알려져 있다. 휴면포자는 온도에 대한 저항력이 매우 높아 40~65℃의 고온에서 1시간 정도 있어도 40~50%만이 사멸하고 나머지 50~60%는 생존하는 것으로 나타나고 있으며, 70℃의 고온에서도 한시간 정도 처리해야 90%이상이 죽는 것으로 알려지고 있다.
토양내 휴면포자의 분포를 보면 병원균의 대부분이 표토와 5㎝이내의 토양에 존재하는 것으로 알려지고 있고, 토양 깊이가 깊어질수록 병원균의 숫자도 줄어들어 깊이 35㎝이하에서는 극히 적은 숫자가 발견되고 깊이 45㎝ 토양에서는 병원균이 전혀 발견되지 않고 있다. 토양 내 병원균의 수평분포를 조사해보아도 병원균의 휴면포자는 포장의 일정위치에 모여있기보다는 전지역에 골고루 분포하고 있는 것으로 확인되고 있다. 무사마귀병은 1980년대 말까지는 농가에 큰 피해를 주지 않은 병이었으나, 1991년부터 고양, 김포, 평택, 무주 등에서 발병이 시작되어, 1994년 경기도 고양시의 경우 약 30%의 배추수확량 감소를 초래하였으며, 1998년 횡성군의 경우 배추 전체재배면적 408ha중 약 61%인 250ha가 무사마귀병으로 인하여 수확이 불가능하였다. 현재 무사마귀병 방제용 농약이 고시되어 농가에서 사용하고 있으나, 방제가가 50~60% 수준으로 매우 미흡하여 배추재배농가는 재배기간 내내 불안해하고 있는 실정이며, 수확한 배추도 상품성이 떨어져 농가의 경제적 손실이 매우 큰 상황이다. 무사마귀병은 병원균이 토양에 상존하고 있으며, 해가 갈수록 그 밀도가 증가하므로 그 피해가 점점 심해진다는 것이 가장 큰 문제이다. 충청남도의 경우 발생급증 시기에 긴급예산을 투입하여 적극적인 방제에 나서고 있으며, 고랭 지배추 주생산지인 강원도에서는 무사마귀병 방제를 위하여 각종 시범포 운영, 방제법 개발 등 대책 마련에 고심을 하고 있으나, 완벽한 방제에는 어려움을 겪고 있는 실정이다. 또한 태백시의 경우 농업기술센터 총 예산의 30% 이상을 투입하여 무사마귀병 방제에 총력을 기울이고 있지만 만족할만한 결과가 나오지 않고 있는 실정이다. 무, 배추값 파동의 주요원인은 장마, 홍수와 같은 자연재해 그리고 무사마귀병 때문인 것으로 알려져 있다.
현재 대부분의 농가에서는 무사마귀병을 방제하기 위하여 화학농약을 사용하고 있다. 이러한 방제약제로는 후루아지남 분제(Fluajinam, 40㎏/10a)와 후루설파마이드 분제(Flusulfamide, 20㎏/10a)가 고시되어 있는데, 이는 휴면포자 발아억제, 근모감염과 피층감열을 억제하는 것으로 알려져 있으나, 무, 배추와 같은 노지재배작물에 일회성농약을 처리하여 토양전염성병해(무사마귀병)를 방제하는 것은 매우 어려운 일이다. 즉, 노지에서는 우수 및 관수에 의하여 약효성분의 용탈이 매우 심하여 방제효과가 나타나는 기간이 길지 않은 것이 보통이다. 이를 해결하기 위해서는 자가 증식 특성이 있는 길항미생물을 이용하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 방법은 환경오염, 약해, 잔류독성의 문제를 야기시키지 않는다는 장점 이외에 그 방제효과가 오래 지속된다는 면에서 매우 바람직한 방제방법으로 여겨지고 있다.
본 발명자들은 길항균에 의한 배추 무사마귀병의 생물학적 방제방법을 확립하기 위하여 수년간 연구를 수행한 결과, 국내 12개 배추 주산지역의 배추근권토양에서 총 967개의 미생물을 분리하여 실내와 포트에서 유사병원균(Pythium 균)에 대 한 항균력 평가, 배추종자 및 유묘에 대한 안전성 평가, 인공배양성 평가, 내구체 형성능 평가 등을 실시한 결과, 최종적으로 효과가 가장 우수한 세균 1종을 선발하여, 바실러스 서브틸리스 KB-291(Bacillus subtilis KB-291)이라고 명명하고, 2003년 10월 15일자로 사단법인 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections)에 KFCC 11324의 수탁번호로 기탁하였으며, 상기 바실러스 서브틸리스 KB-291은 대한민국 특허출원 제10-2003-73677호로 출원되어 공개번호 제10-2005-38662호(공개일자: 2005.04.29)로 공개되었다. 또한, 상기 발명은 바실러스 서브틸리스 KB-291(Bacillus subtilis KB-291 , KFCC 11324)을 영양배지에서 호기배양하여 길항균배양액을 제조하는 단계; 상기 길항균배양액을 탈지강, 제오라이트 및 질석 등과 같은 흡착물에 흡착시키고 건조시켜 길항균건조물을 제조하는 단계; 및 상기 길항균건조물에 포도당, 당밀, 콩가루, 깻묵, 어분 및 혈분 등과 같은 길항균 먹이성분을 혼합하는 단계를 포함하는 길항균제제 제조방법을 개시하고 있다.
상기와 같이 제조된 입상형 길항균제제는 액상제제와 달리 길항균이 흡착물에 흡착되어 있어 미생물이 토양환경에 일시적으로 완전 노출되지 않아 어느 정도 길항균의 토양내 정착 및 증식효율을 높이를 효과가 있다.
그러나, 배추 무사마귀병과 같은 토염전염성 병해들은 기주식물체없이 병원균이 토양속에서 내구체를 형성하여 장기간 생존하기 때문에 길항균이 토양내에서 미생물의 정착 및 증식을 더욱 높일 필요가 있으며, 토양환경이 갑자기 불량해질 경우에는 길항균의 활성이 저하되어 효과지속기간이 짧을 수 밖에 없으므로 길항균이 토양수분에 의하여 토양 중으로 최대한 서서히 흘러나오게 함으로써 불량한 토 양 환경하에서도 지속적인 효과를 발휘하게 할 필요가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 토양전염성 병해 특히 배추 무사마귀병에 방제효과가 있는 길항균이 토양 중으로 서서히 방출되어 지속적인 방제효과를 나타낼 수 있는 서방형 미생물제제를 제공하는 데 그 목적이 있다.
이러한, 서방형 미생물제제는 길항균이 생분해성 접착제를 통하여 담체에 오랫동안 흡착할 수 있도록 하는 것으로 달성될 수 있으며, 담체가 다공성을 가지는 경우 담체 속으로 길항균이 충분히 침투하도록 1일 이상 정치시키는 것으로 달성될 수 있다.
본 발명은 토양전염성 병균의 길항균을 이용한 미생물제제에 있어서, 생분해성 접착제에 의하여 길항균이 담체에 흡착되어 길항균이 서서히 토양내에서 방출되는 것을 특징으로 하는 토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제를 제공한다.
상기 생분해성 접착제는 천연수지 또는 합성수지로 된 접착성이 있는 물질로서, 길항균이 담체에 장시간 접착이 되고, 토양 내 수분에 의하여 접착력이 감소함에 따라 길항균이 토양내로 서서히 방출되도록 하는 역할을 한다.
상기 생분해성 접착제는 젤라틴(gelatine), 전분(starch), 카르복시 메틸 셀 룰오즈(Carboxy Methyl Cellulose, CMC), 폴리 비닐 알콜(Poly Vinyl Alcohol, PVA) 인 것이 바람직하고, 이 중에서 젤라틴인 것이 더욱 바람직하다.
토양전염성 병해는 배추 무사마귀병인 것이 바람직하나 본 발명의 목적이 토양내에서 길항균을 최대한 서서히 방출하는 서방형 입상제제를 제공한 것인 만큼, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 토양전염성 병해에도 적용될 수 있다.
토양전염성 병해가 배추 무사마귀병인 경우에는 길항균으로서 바실러스 서브틸리스가 이용될 수 있으며, 특히 본 발명자들에 의하여 분리된 바실러스 서브틸리스 KB-291(Bacillus subtilis KB-291, KFCC 11324)인 것이 더욱 바람직하다.
상기 담체는 길항균이 흡착될 수 있도록 작은 알갱이 크기의 재료이면 상관이 없으나, 다공성을 가지는 입상인 것이 바람직하며, 바람직하게는 제오라이트, 맥반석, 질석, 모래, 활성탄 중에서 선택될 수 있으며, 이 중에서 제오라이트가 가장 바람직하며 지름 0.5 ~ 1.0 mm 인 소성 제오라이트인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 토양전염성 병해에 대한 길항균을 배양하여 길항균배양액을 제조하는 단계; 담체 중량에 대하여 젤라틴(gelatine), 전분(starch), 카르복시 메틸 셀룰로즈(Carboxy Methyl Cellulose, CMC), 폴리 비닐 알콜(Poly Vinyl Alcohol, PVA) 중에서 선택된 1종 이상인 생분해성 접착제 0.1 ~ 1.0 중량%를 길항균 먹이성분과 함께 길항균배양액과 혼합하는 단계; 상기 혼합액을 길항균배양액 중량에 대하여 20 ~ 100 배인 담체에 흡착, 침적시키는 단계; 및 상기 담체를 건조시키는 단계를 포함하는 토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 상기 생분해성 접착제 및 길항균 먹이성분이 혼합된 혼합액을 담체에 흡착시킨 다음, 1일 이상 정치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 길항균을 건조시키기 전에 길항균이 담체에 충분히 흡착될 수 있도록, 다공성 담체인 경우에는 담체 내에 충분히 흡착될 수 있도록 하기 위한 것으로 1일 이상 정치시킴으로 보다 많은 길항균이 담체에 흡착되어 안정화될 수 있다.
본 발명자들은 토양전염성 병해 특히, 배추 무사마귀병의 생물학적 방제방법의 효율성을 재고하기 위하여 수년간 연구를 수행한 결과, 길항균이 생분해성 접착제를 통하여 담체에 흡착되는 경우 장시간에 걸쳐 토양 중으로 서서히 방출되어 불량한 토양환경에서도 길항균의 정착율 및 증식율이 증가하는 것을 확인하고서 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 서방형 미생물제제는 배추 무사마귀병 병해의 방제에 대하여 기술하나, 본 발명은 토양전염성 병해를 방제하기 위한 미생물제제로 길항균이 서서히 토양으로 방출되는 서방형 미생물제제에 관한 것이어서 모든 토양전염성 병해에 적용될 수 있으며, 배추 무사마귀병에만 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 배추 무사마귀병 길항균의 선발
본 발명에서 사용되는 배추 무사마귀병의 길항균으로는 바실러스 서브틸리스 KB-291을 사용하였다.
본 발명자들은 국내 12개 배추 주산지역의 배추근권토양에서 총 967개의 미 생물을 분리하여 실내와 포트에서 유사병원균(Pythium 균)에 대한 항균력 평가, 배추종자 및 유묘에 대한 안전성 평가, 인공배양성 평가, 내구체 형성능 평가 등을 실시한 결과, 최종적으로 효과가 가장 우수한 세균 1종을 선발하여, 바실러스 서브틸리스 KB-291(Bacillus subtilis KB-291, KFCC 11324)이라고 명명하고, 2003년 10월 15일자로 사단법인 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections)에 KFCC 11324의 수탁번호로 기탁하였으며, 상기 바실러스 서브틸리스 KB-291은 대한민국 특허출원 제10-2003-73677호로 출원되어 공개번호 제10-2005-38662호(공개일자: 2005.04.29)로 공개되었다.
바실러스 서브틸리스 KB-291의 주요 균학적인 특성은 다음과 같다.
[NA 배지에서의 특성]
1. 색깔 : 연황색
2. 균총형태 : 원형
3. 균총표면 : 볼록형
4. 균총크기 : 0.5~2.0㎛
[생리적 특성]
1. 그람반응 : 양성
2. 내성포자 형성유무 : 유
3. 세포형태 : 간형
4. 활동성 : 유
5. 산소요구성 : 호기성
6. 혐기적 생장 : 불가
7. 카탈라아제 생성 : 유
8. VP 테스트 : 양성
9. 산화작용
-. 포도당 : 유
-. 자일로오스 : 유
-. 만니톨 : 유
-. 아라비노오스 : 유
10. 포도당으로부터 가스 생성 : 무
11. 가수분해능
-. 카제인 : 양성
-. 젤라틴 : 양성
-. 녹 말 : 양성
12. 시트레이트 이용성 : 유
13. 프로피오네이트 이용성 : 무
14. 타이로신 분해능 : 무
15. 질산 환원능 : 유
16. 인돌 형성능 : 무
17. 염분 요구성 : 무
18. 7% 염분농도에서의 생장 : 유
19. 요소가수분해 : 무
20. 온도별 생장
-. 5℃ : 불가
-. 30℃ : 가능
-. 40℃ : 가능
-. 55℃ : 불가
본 발명의 길항균 바실러스 서브틸리스 KB-291은 배추 무사마귀병원균의 유사병원균(Pythium 균)의 균사생장 및 포자발아를 현저히 억제시키는 활성을 갖고 있어, 농작물이나 환경에 악영향을 미치지 않고 배추의 무사마귀병을 방제할 수 있다(참고로, 배추 무사마귀병원균인 Plasmodiophora brassicae는 활물기생균으로서 인공적인 배양이 불가능하므로 이와 생리적으로 가장 유사한 균인 Pythium 균을 대상으로 항균력 시험을 실시함).
실험예 2 : 길항균 바실러스 서브틸리스 KB -291의 길항균배양액 제조
상기 길항균 바실러스 서브틸리스 KB-291을 각기 다른 배지를 이용하여 배양하며 포자생성을 확인하였다. 배지는 TSB(1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% glucose, 0.5% sodium chloride, 0.25% K2HPO4)배지, YM broth(0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1% dextrose), Nutrient broth(0.3% beef extract, 0.5% peptone) 그리고 M-2배지(표 1)를 이용하였다. 배양은 37℃, 회전식 진탕배양기(rotary shaking incubator)에서 150rpm으로 7일간 배양하였으며, 3일후부터 포자를 관찰하였고, 모든 세포가 포자로 변하였는지는 현미경(×400)으로 확인하였다(도 1). 4가지 배지를 이용하여 포자 생성율을 비교한 결과 표 2에서 보는 바와 같이 37℃ 에서 진탕배양 시 M-2배지가 가장 좋은 것으로 나타났다.
M-2 배지 조성
배지 조성 함량(/ℓ)
Glucose 20g
Soybean flour 25g
KH2PO4 1g
K2HPO4 1g
CaCO3 1g
MgSO4·7H2O 0.3g
CuSO4·5H2O 0.01g
MnSO4 0.02g
FeSO4·7H2O 0.02g
ZnSO4·7H2O 0.02g
바실러스 서브틸리스 KB -291의 포자 생성율
구분 배양일에 따른 포자 비율(%)
3일 4일 5일 6일 7일
TSB - 20 40 60 90
YM broth - 20 50 70 90
Nutrient broth - 30 60 80 90
M-2 50 90 100 100 100
실험예 3 : 바실러스 서브틸리스 KB -291의 항균활성 평가
본 발명의 바실러스 서브틸리스 KB-291의 항균활성 평가를 위하여 그 외 몇가지 길항균과 함께 식물병원균에 대한 항균활성을 평가하였다. 즉, 길항균 NA배양액의 0.45㎛ 여과막 여과액을 준비하고 페이퍼 디스크(paper disc)방법에 준하여 3가지 식물병원균(Rhizoctonia sp., Pythium sp., Fusarium sp .)에 대한 항균활성을 평가한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
길항균배양액의 식물병원균 3종에 대한 항균활성 평가결과
대상병원균 길항균의 병원균 생육저지활성(생육저지환의 크기, ㎜)
KB-291 KB-14 KB-714
Rhizoctonia sp . 18.4 14.6 2.5
Pythium sp . 21.1 11.7 4.1
Fusarium sp . 15.8 11.8 1.5
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 길항균 바실러스 서브틸리스 KB-291의 식물병원균에 대한 항균활성은 다른 길항균(KB-14, KB-714)보다 월등히 우수함을 알 수 있으며, 바실러스 서브틸리스 KB-291은 식물병원균 3종에 대하여 공히 우수한 항균활성을 보이고 있다.
실험예 4 : 입상제형화를 위한 담체 선발
본 발명의 바실러스 서브틸리스 KB-291을 이용하여 입상형 미생물제제를 개발하기 위해서는 저가의 미생물 담체가 필요하며 담체와 미생물과의 친화성(Compatibility), 물리적 강도, 입도 등을 기준으로 최적의 담체를 선발하였다. 미생물과의 친화성은 후보 담체성분에 미생물을 중량비로 1% 혼합한 후 상온(18~25℃)에 보관하면서 길항균의 생존율을 조사하였고, 물리적 강도와 입도는 작업 시 미분의 발생 여부를 조사한 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이 후보 담체 성분들은 미생물의 활성에 큰 영향을 주지 않았으며, 종합적인 선발기준에의 적합성을 조사한 결과 0.5~1.0㎜ 크기의 소성 제오라이트가 가장 적합한 것으로 나타났다.
후보 담체성분간의 비교
구분 친화성 가격 물리적 강도 입도
제오라이트 미분 ⊙ ⊙ ○ ×
0.5~1.0㎜ 소성 ⊙ ○ ⊙ ⊙
비소성 ⊙ ⊙ ○ ⊙
2~3㎜ 소성 ⊙ ○ ⊙ ○
비소성 ⊙ ⊙ ○ ○
맥반석 미분 ⊙ ⊙ ○ ×
0.5~1.0㎜ ⊙ ○ ○ ⊙
2~3㎜ ⊙ ○ ○ ○
질석 ⊙ ⊙ △ ○
피트모스 ○ △ △ ×
코코피트 ○ ○ △ ×
휴믹산 ○ △ △ ○
풀빅산 ○ × × ×
Clay ball ⊙ △ ○ ○
모래 ⊙ ⊙ △ ×
활성탄 ⊙ ⊙ △ △
⊙ : 최우수, ○ : 우수, △ : 보통, × : 불량
실험예 5 : 입상제형화를 위한 생분해성 접착제 선발
담체를 이용하여 길항미생물을 서방형으로 용출시키기 위해 10종의 천연수지와 합성수지를 이용하여 제형화에 적합한 접착제를 조사하였다. 10종의 후보 접착제를 비교한 결과 하기 표 5에서와 같이 1차적으로 전분(Starch), 젤라틴(Gelatine), CMC(Carboxy Methyl Cellulose)와 PVA(Poly Vinyl Alcohol)가 적합한 것으로 나타났다.
후보 접착제의 비교 조사결과
수급도 물에 대한 용해도 수용액의 점성 용해 시 뭉침 현상 제형화 시 뭉침 현상
송진 ○ × × ○ ○
산탄검(Xanthan Gum) ○ △ △ △ △
Avicel (microcrystalline cellulose) △ △ △ △ △
전분( Starch ) ○ △ ○ ○ ○
젤라틴( Gelatine ) ○ ○ ○ ○ ○
CMC (Carboxy Methyl Cellulose) ○ ○ △ △ ○
PVA (Poly Vinyl Alcohol) ○ ○ ○ ○ ○
PVB (Poly vinyl butyral) ○ × × × ×
PHB (Poly hydroxy butyrate) △ × × △ ×
PLA (Poly lactic acid) × × × △ ×
○ : 우수, △ : 보통, × : 불량
실시예 1 : 서방형 미생물제제의 제조(생분해성 접착제: 젤라틴)
상기 실험예 4에서 선발한 젤라틴, 전분(corn starch), PVA, CMC 각각을 생분해성 접착제로 하여 서방형 미생물제제를 제조하였다.
도 2는 본 발명의 서방형 미생물제제의 제조공정도이다.
상기 생분해성 접착제는 제오라이트에 길항균을 코팅 접착시키는 점을 감안하여 0.5 ~ 1.0 mm의 소성 제오라이트 중량에 대하여 각각 0.5, 0.75 및 1.0중량%로 하여 제조하였다.
① 바실러스 서브틸리스 KB-291을 발효조를 이용하여 3일간 배양하였다.
② 생분해성 접착제로서 PVA, 옥수수 전분, 젤라틴, CMC 각 50, 75 및 100g 을 미생물 영양원인 M-2 배지 20g와 함께 지하수 1ℓ에 넣고 80~85℃에서 약 3시간 가열하여 젤라틴을 완전히 용해시킨 후, 상온에서 식혀 생분해성 접착제 용해액을 제조하였다.
③ 상기 생분해성 접착제 용해액에 길항균 배양액 400 ㎖를 골고루 혼합한 다음, 제오라이트 10kg에 스프레이 방식으로 교반하면서 골고루 흡착시켰다.
④ 혼합액 스프레이가 종료된 이후에도 약 30분간 계속 교반하여 흡착성 및 분산성을 높여주었다. 교반이 끝난 후 1일간 정치시켜 제오라이트에 길항미생물을 침적시켰다.
⑤ 35~40℃의 온도에서 약 15시간 교반하면서 혼합물내의 수분을 건조시켰다.
⑥ 상온으로 식힌 후의 수분함량은 10~12%, 미분비율은 3% 이내, 뭉침 현상은 없었고, 미생물밀도는 98% 이상이었다.
비교예 1 : 생분해성 접착제 없이 미생물제제의 제조
본 발명에 따른 생분해성 접착제의 서방성 효능을 확인하기 위한 대조구로서 상기 실시예 1과 동일 정량, 동일 방법으로 미생물제제를 제조하되, 생분해성 접착제를 첨가하지 않고서 미생물제제를 제조하였다.
실험예 6 : 접착제의 종류 및 농도 최적화
상기 실시예 1에서 제조된 미생물제제를 대상으로 시간 경과에 따른 미생물의 밀도를 측정하여 서방성을 측정 비교하였다. 또한, 대조구로서 비교예 1에서 제조된 미생물제제의 시간 경과에 따른 미생물 밀도를 측정하였다. 표 6에서 보는 바와 같이 CMC를 제외한 나머지 3종의 접착제(PVA, starch, gelatine)는 0.75중량%에서 서방성이 우수한 것을 알 수 있었다. 최종적으로 4가지 종류의 접착제로 시험한 결과 0.75중량%의 젤라틴(Gelatine)이 가장 우수한 서방성을 나타내고 있음을 확인하였다.
반면, 생분해성 접착제를 전혀 첨가하지 않은 비교예 1의 대조구는 24시간 후 84.2%나 방출된 것을 확인하였다.
이러한 결과로부터, 본 발명의 생분해성 접착제의 사용이 미생물의 용출 서방성을 매우 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
접착제 농도에 따른 서방성 비교
생분해성 접착제 농도 최초 포자의 수 (×108 cfu/g) 24시간 후 방출된 포자의 수(×108 cfu) 24시간 후 방출된 포자의 백분율(%)
PVA (폴리비닐 알콜) 0.5중량% 2.8 0.47 16.8
0.75중량% 4.7 0.57 12.1
1.0중량% 3.5 0.85 24.3
옥수수 전분 (Corn Starch) 0.5중량% 3.7 1.4 37.8
0.75중량% 6.3 9.2 14.6
1.0중량% 3.5 0.75 21.4
젤라틴(Gelatine) 0.5중량% 2.3 0.37 16.1
0.75중량% 3.2 0.34 10.6
1.0중량% 3.3 0.83 25.1
CMC 0.5중량% 2.7 2.0 74.1
0.75중량% 2.9 1.9 65.5
1.0중량% 3.1 1.2 38.7
생분해성 접착제 없이 단순미생물흡착 - 3.8 3.2 84.2
도 3은 생분해성 접착제로 젤라틴 0.75중량%, CMC 0.75중량%, 접착제없이 단순미생물흡착(비교예 1)시켜 제조된 미생물제제에 대하여 수계에서 10일간의 시간경과에 따른 미생물 방출율을 나타낸 그래프이다. 도 3에 보이는 바와 같이, 젤라틴이 CMC 보다 우수한 서방성을 가지는 것을 알 수 있으며, 단순미생물 흡착에 비해서는 월등한 서방성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
실시예 2 : 시제품 제조(스케일-업)
실험예 6에서 확인된 바와 같이 서방형제제를 위한 접착제로는 0.75중량%의 젤라틴이 가장 우수한 것으로 나타나 이를 스케일-업하여 시제품을 제조하였다.
길항균 바실러스 서브틸리스 KB-291 배양액, 제오라이트, 젤라틴의 혼합순서, 혼합시간, 혼합조건, 건조시간, 건조조건 등 공정인자를 서로 달리하여 시제품을 제조하면서 경제성, 작업성, 효율성 및 제품의 품질 등을 고려하여 제조공정을 최적화하였으며, 다음과 같은 최적 제조공정을 확립하여 시제품을 제조하였다. 길항균 바실러스 서브틸리스 KB-291 배양액의 밀도는 5×109 cfu/㎖ 이며, 미생물영양원인 M-2배지는 미생물 투입량 40ℓ를 기준으로 하여 투입하였다. 시제품은 대량생산용 혼합기를 이용하여 제조하였으며, 한 batch당 1톤씩 2회 제조하였다. 이렇게 제조한 시제품을 이용하여 이후의 시험을 실시하였다. 시제품의 최종 배합은 하기 표 7에 나타내었다.
① 바실러스 서브틸리스 KB-291을 발효조를 이용하여 3일간 배양하였다.
② 지하수 100ℓ에 효력증진 첨가제(미생물 영양원)인 M-2배지 2㎏과 젤라틴 7.5㎏을 투입하여 80~85℃에서 약 3시간 가열하여 젤라틴을 완전히 용해하고 상온에서 식혔다.
③ 젤라틴 용해액 100ℓ와 길항균 배양액 40ℓ를 골고루 혼합한 뒤 제오라이트에 스프레이 방식으로 골고루 흡착시켰다.
④ 혼합액 스프레이가 종료된 이후에도 약 30분간 계속 교반하여 흡착성 및 분산성을 높여준다. 교반이 끝난 후 1일간 정치시켜 제오라이트에 길항미생물을 침적시켰다.
⑤ 35~40℃의 온도에서 약 15시간 교반하면서 혼합물내의 수분을 건조시켰다.
⑥ 상온으로 식힌 후, 다음과 같은 품질관리항목을 분석하여 품질을 확인 후 최종 시제품을 제조하였다.[수분함량(10~12%), 미분비율(3% 이내), 뭉침 현상(없음), 미생물밀도(98% 이상)]
시제품의 최종배합 및 1톤 제조 시 투입량
원료명 투입비율 1톤 제조 시 투입량
Bacillus subtilis KB-291 배양액 3.82% 40ℓ
M-2배지(미생물 영양원) 0.19% 약 2㎏
gelatine(접착제) 0.72% 7.5㎏
Zeolite(담체) 95.27% 1,000㎏
지하수 10%* 100ℓ
* 단, 지하수는 제조량의 10%로 함.
실험예 7: 실시예 2의 시제품의 서방형 특성 조사
실시예 2에서 제조한 시제품 일정량을 멸균된 지하수가 담긴 용기에 물에 잠기도록 넣고 일정시간 단위로 용출된 미생물의 밀도를 측정하는 방법으로 미생물 용출속도를 평가하였으며, 동일한 방법으로 미생물이 용출되는 기간을 조사하였다. 용출액을 멸균된 용기로 옮긴 후 미생물 밀도분석을 실시하여 용출된 총 균수를 측정하였다.
단위시간당 미생물 용출속도에 따른 시제품의 서방형 특성 조사
경과 시간당 미생물 용출 누적 총 균수(cfu)
0h 4h 8h 12h 24h 36h
0 (0) 0.6×108 (1.6) 0.17×109 (4.5) 0.22×109 (5.8) 0.65×109 (17.1) 1.42×109 (37.4)
경과 시간당 미생물 용출 누적 총 균수(cfu)
48h 60h 72h 84h 96h 120h
1.96×109 (51.6) 2.41×109 (63.4) 2.72×109 (71.6) 2.93×109 (77.1) 3.05×109 (80.3) 3.47×109 (91.3)
경과 시간당 미생물 용출 누적 총 균수(cfu)
144h 168h 192h 216h 240h 264h
3.69×109 (97.1) 3.71×109 (97.6) 3.73×109 (98.2) 3.74×109 (98.4) 3.75×109 (98.7) 3.75×109 (98.7)
* 시제품 10g에 함유되어 있는 길항균수 : 3.8×109 cfu/10g
* 괄호안의 숫자는 용출율 백분율(%)
상기 표 8에서 나타난 바와 같이, 입제 내의 길항미생물은 수계에서 시간이 경과하면서 서서히 용출되는 것을 알 수 있으며, 약 240시간이 경과하면 용출 가능한 미생물은 모두 용출되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 볼 때, 본 시제품은 우수한 서방 용출 특성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8: 시제품의 이화학적, 생물학적 안정성 조사
실시예 2의 시제품을 고온(50℃), 실온(10~30℃), 저온(4℃)으로 1년간 보관하면서 시제품에 대한 pH 변화, 입제의 물성변화, 미분비율, 수분함량 등을 측정하여 시제품의 이화학적 특성을 분석하였다. 또한 시제품으로부터 용출된 길항미생물을 생균수를 측정함으로써 시제품내 길항균의 생존률을 측정하였다. 시험구별 시료는 2개월 간격으로 pH 변화, 수분함량은 시료를 100g씩 채취하여 측정하였으며, 입제의 물성변화, 미분비율은 제품 10㎏을 대상으로 측정하였다. 생물학적 안정성은 2개월 간격으로 100g씩 채취하여 그 중 10g에 대한 길항균의 밀도를 측정하였다.
보관온도에 따른 시제품의 이화학적 특성 비교
고온(50℃) 0일 2개월 4개월 6개월 8개월 10개월 12개월
pH 변화 6.75 6.78 6.76 6.75 6.75 6.77 6.76
물성변화 - 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음
수분함량 11.3% 11.2% 11.2% 11.3% 10.9% 10.9% 11.0%
미분비율 1.8% 1.8% 1.8% 1.7% 1.7% 1.7% 1.7%
실온(10~30℃) 0일 2개월 4개월 6개월 8개월 10개월 12개월
pH 변화 6.75 6.75 6.76 6.75 6.74 6.74 6.75
물성변화 - 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음
수분함량 11.3% 11.3% 11.3% 11.4% 11.3% 11.4% 11.4%
미분비율 1.8% 1.8% 1.8% 1.8% 1.8% 1.8% 1.9%
저온(4℃) 0일 2개월 4개월 6개월 8개월 10개월 12개월
pH 변화 6.75 6.74 6.74 6.75 6.75 6.76 6.74
물성변화 - 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음
수분함량 11.3% 11.4% 11.4% 11.3% 11.4% 11.5% 11.4%
미분비율 1.8% 1.8% 1.8% 1.8% 1.8% 1.7% 1.7%
보관온도에 따른 시제품의 길항균 생존률 비교
고온(50℃) 시제품내 길항균의 경시적 밀도(×108 cfu/g)
0일 2개월 4개월 6개월 8개월 10개월 12개월
밀도 2.4 2.28 2.19 2.05 1.97 1.82 1.74
생존률(%) 100.0 95.0 91.3 85.4 82.1 75.8 72.5
실온(10~30℃) 시제품내 길항균의 경시적 밀도(×108 cfu/g)
0일 2개월 4개월 6개월 8개월 10개월 12개월
밀도 2.4 2.4 2.41 2.42 2.39 2.4 2.39
생존률(%) 100.0 100.0 100.4 100.8 99.6 100.0 99.6
저온(4℃) 시제품내 길항균의 경시적 밀도(×108 cfu/g)
0일 2개월 4개월 6개월 8개월 10개월 12개월
밀도 2.4 2.4 2.4 2.41 2.4 2.39 2.4
생존률(%) 100.0 100.0 100.0 100.4 100.0 99.6 100.0
보관온도에 따른 시제품의 이화학적 특성은 하기 표 9에서 보는 바와 같이 경시적으로 보관온도와는 상관없이 이화학적 특성에는 변화가 없는 것으로 확인되었다. 즉, pH는 6.75 내외로 유지되었고, 물성변화는 없었으며, 수분함량은 10~12% 사이를 유지하였고, 미분비율은 3%이내를 유지하였다. 보관온도에 따른 시제품내 길항균의 밀도는 하기 표 10에서 보는 바와 같이 고온(50℃)에서는 다소 밀도가 떨어지는 것으로 확인되었지만, 실온(10~30℃)과 저온(4℃)에서는 밀도변화가 없는 것으로 확인되었다. 이것으로 볼 때 제품내에서 길항균이 고온, 특히 50℃ 이상일때 다소 안정성이 떨어지는 것으로 보이며, 보관 시에는 건냉암소에서 보관해야 할 것으로 판단된다.
실험예 9 : Pot test 를 통한 방제가 평가 및 효과지속기간 평가 Ⅰ
본 시험은 전년도에 무사마귀병 발병이 심했던 배추 경작지의 토양(강원도 태백지역)을 확보하고 이를 이용하여 간이 Pot를 제작(61×40×15㎝)한 뒤 소규모로 배추를 재배하여 시제품의 방제가 및 효과지속기간을 평가하였다. 배추는 관행적인 방법으로 49공 트레이에서 28일간 육묘하였다. 먼저 간이 Pot에 감염토양을 채운 후 기존에 발병하였던 무사마귀병 감염 뿌리를 믹서기로 분쇄하여 병원균 포자액을 만든 뒤 시험구에 접종하였다. 시제품을 10㎏/300평의 비율로 처리하고 배추 유묘를 심은 다음 50일간 재배하면서 방제 효과를 평가하였다. 시비량은 300평당 완숙퇴비 2,500㎏과 질소:인산:칼리는 20:10:15㎏의 비율로 처리하였으며, 살충제와 살균제는 농가관행에 준하여 실시하였다. 대조구로는 농약 “혹안나” 처리구와 무처리구를 두었고, 시험구별로 3개의 반복구를 두었으며 시험구별로 10일간격으로 지상부생육과 이병주수를 확인하였다. 시험구별 약제 처리 후 50일까지의 결과는 하기 표 11에서 보는 바와 같이 농약처리구와 시제품 처리구 모두 지상부의 생육이 양호하였고, 뿌리에 혹이 일부 생기기는 하였지만 작은 크기의 혹으로 배추생육에는 영향을 주지 않는 것으로 판단되며, 상품성에는 지장이 없을 것으로 여겨진다. 반면 무처리구는 약 20일 경과 후부터 뿌리에 혹이 생겼으며, 30일 경과 후에는 지상부에서 시드는 현상이 뚜렷이 나타났고, 뿌리에 혹이 만연함을 알 수 있었다. 40일 경과 후에는 완전히 시들어서 생육이 더 이상 진행되지 않았으며, 일부는 뿌리가 썩은 것을 확인할 수 있었다. 본 시험에서는 병 발생을 위해 감염 토양에다가 추가적으로 감염원을 접종하였기 때문에 포장상태와 거의 유사하다고 볼 수 있으며, 따라서 시제품은 실제 포장에서도 배추 무사마귀병 방제에 대한 효과지속기간이 50일 이상 유지될 것으로 보이며 방제효과 또한 농약 “혹안나”와 거의 유사하게 나타날 것으로 판단된다.
Pot test 결과 Ⅰ
정식 후 경과일수 처리구 총배추수 이병주수 발병율(%) 방제가(%) 지상부생육
10일 시제품 30 0 0 - 4.5
농약 30 0 0 - 4.5
무처리구 30 0 0 - 4.5
20일 시제품 30 1 3.3 - 4.0
농약 30 0 0 - 4.0
무처리구 30 9 30.0 - 3.5
30일 시제품 30 2 6.7 - 4.0
농약 30 2 6.7 - 4.0
무처리구 30 17 56.7 - 3.0
40일 시제품 30 3 10.0 - 3.5
농약 30 4 13.3 - 3.5
무처리구 30 22 73.3 - 1.5
50일 시제품 30 5 16.7 83.3 3.5
농약 30 5 16.7 83.3 3.5
무처리구 30 26 86.7 13.3 1.0
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구 전체 배추에 대한 백분율임.
실험예 10 : 시제품 처리량에 따른 방제가 및 효과지속기간 평가( Pot test ) Ⅱ
본 시험을 통해 시제품의 처리량에 따라 무사마귀병 방제가 및 효과지속기간을 실제 포장과 유사한 조건의 Pot test로 평가함으로써 최적 처리량을 유추, 확인하고자 하였다. 본 시험은 상기 실험예 6에서 실시하였던 시험과 유사한 조건으로 실시하였다. 전년도에 무사마귀병 발병이 심했던 배추 경작지의 토양(강원도 태백지역)을 우선 간이 Pot에 채운 후 기존에 발병하였던 무사마귀병 감염 뿌리를 믹서기로 분쇄하여 병원균 포자액을 만든 뒤 시험구에 접종하였다. 시제품은 1/2량(5㎏/300평), 기준량(10㎏/300평), 2배량(20㎏/300평)의 비율로 처리하고 배추 유묘를 심은 다음 50일간 재배하면서 방제 효과를 평가하였다. 시비량은 300평당 완숙퇴비 2,500㎏과 질소:인산:칼리는 20:10:15㎏의 비율로 처리하였으며, 살충제와 살균제는 농가관행에 준하여 실시하였다. 배추는 관행적인 방법으로 49공 트레이에서 28일간 육묘한 뒤 시험구당 10주씩 3반복구를 두었다. 대조구로는 농약 “혹안나” 처리구와 무처리구를 두었으며, 시험구별로 10일간격으로 지상부생육과 이병주수를 확인하였다. 시험구별 약제 처리 후 50일까지의 결과를 보면 표 12에서와 같이 농약처리구와 시제품 기준량, 2배량 처리구 모두 지상부의 생육과 방제가에서 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. 일부 시험구에서 간혹 뿌리에 혹이 일부 생기기는 하였지만 40일 이후에 감염된 것으로 보이며 크기 또한 작은 혹이어서 배추생육에는 전혀 문제가 없을 것으로 판단된다. 반면 시제품 1/2량 처리구는 10일차까지는 이상이 없었으나, 20일이후부터 이병주수가 늘어났고, 지상부의 생육도 시드는 현상이 많이 나타나는 것을 확인하였다. 무처리구는 약 20일 경과 후부터 뿌리에 혹이 만연되었고, 30일 경과 후에는 거의 대부분 지상부에서 시드는 현상이 나타났으며, 40일 경과 후에는 거의 대부분이 시들어 죽거나 생육이 뿌리가 썩은 것을 확인할 수 있었다. 본 시험 역시 병 발생을 위해 무사마귀병이 감염된 토양에다가 추가적으로 감염원을 접종하여 병발생 최적 조건이였기 때문에 포장상태와 거의 유사하다고 볼 수 있다. 이상의 시험 결과로 볼 때, 실제 포장에서의 처리량은 300평당 10㎏이 적정할 것으로 판단되며, 2배량을 처리하더라도 방제가 및 효과지속기간에는 차이가 없는 것을 확인하였다.
시제품 처리량에 따른 Pot test 결과 Ⅱ
정식 후 경과일수 처리구 총배추수 이병주수 발병율(%) 방제가(%) 지상부생육
10일 시제품 1/2량 30 0 0 - 4.5
시제품 기준량 30 0 0 - 4.5
시제품 2배량 30 0 0 - 4.5
농약 30 0 0 - 4.5
무처리구 30 1 3.3 - 4.5
20일 시제품 1/2량 30 5 16.7 - 3.5
시제품 기준량 30 0 0 - 4.0
시제품 2배량 30 0 0 - 4.5
농약 30 1 3.3 - 4.0
무처리구 30 12 40.0 - 3.0
30일 시제품 1/2량 30 11 36.7 - 3.0
시제품 기준량 30 2 6.7 - 4.0
시제품 2배량 30 1 3.3 - 4.0
농약 30 2 6.7 - 4.0
무처리구 30 19 63.3 - 2.5
40일 시제품 1/2량 30 15 50.0 - 2.0
시제품 기준량 30 3 10.0 - 3.5
시제품 2배량 30 3 10. - 3.5
농약 30 2 6.7 - 3.5
무처리구 30 24 80.0 - 1.0
50일 시제품 1/2량 30 22 73.3 26.7 1.5
시제품 기준량 30 3 10.0 90.0 3.5
시제품 2배량 30 3 10.0 90.0 3.5
농약 30 4 13.3 86.7 3.5
무처리구 30 28 93.3 6.7 1.0
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구 전체 배추에 대한 백분율임.
실험예 11 : 농가 포장 실증시험을 통한 토양의 종류에 따른 방제가 평가 Ⅰ
배추는 뿌리를 길게 뻗고 잔뿌리가 많아 토심이 깊으면서 물 빠짐이 잘되는 토양을 좋아한다. 따라서 보수력이 좋으면서 배수도 잘되는 토양에서 생육이 좋게된다. 하지만 이와 반대의 경우에는 배추 생육도 안좋아지며 무사마귀병 발생률도 증가하게 된다. 본 시험에서는 토양의 종류에 따라 시제품의 무사마귀병 방제가에 대해 확인하고자 하였다. 전년도에 발병이 심했던 배추 경작지를 대상으로 4가지 토양별로 구분하여 포장시험을 실시하였다. 토양구분은 충적토, 사양토, 사질토, 점질토로 구분하였으며, 총 4개지역의 농가를 대상으로 시험을 실시하였다. 포장관리는 일반 농가 경종방법에 준하여 실시하였다. 시험결과는 20일 간격으로 지상부 생육과 뿌리 상태, 발병도를 평가하였고, 최종적으로 방제가를 비교한 결과 표 13에서와 같이 시제품 및 농약을 처리한 시험구에서 토양종류에 따른 방제가에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 포장시험에 대한 개요는 다음과 같다.
① 충청남도 공주시 시험포
-. 시험기간 : 06. 8. 29 ~ 10. 20
-. 시험농가 : 충청남도 공주시 읍구읍 동해리 1농가
-. 토양종류 : 충적토
-. 처리일시 : 8. 29 토양 혼화처리 (정식 : 9. 2)
-. 처리내용 : 시제품 10㎏/300평, 시제품 20㎏/300평, 농약 300평, 무처리 300평
② 경기도 파주시 시험포
-. 시험기간 : 06. 4. 27 ~ 6. 23
-. 시험농가 : 경기도 파주시 적성면 구읍리 2농가
-. 토양종류 : 사양토, 사질토
-. 처리일시 : 4. 27 토양 혼화처리 (정식 : 4. 28)
-. 처리내용 : 시제품 10㎏/300평, 시제품 20㎏/300평, 농약 300평, 무처리 200평
③ 강원도 원주시 시험포
-. 시험기간 : 06. 5. 1 ~ 6. 30
-. 시험농가 : 강원도 원주시 판부면 금내리 1농가
-. 토양종류 : 점질토
-. 처리일시 : 5. 1 토양 혼화처리 (정식 : 5. 5)
-. 처리내용 : 시제품 10㎏/300평, 시제품 20㎏/300평, 농약 300평, 무처리 200평
토양의 종류에 따른 방제가 평가 비교 ① 충청남도 공주시 충적토 시험포장 결과
정식 후 경과일수 처리구 지상부생육 뿌리상태 발병도(%) 방제가(%)
20일 시제품 10㎏ 4.0 4.0 2.5 -
시제품 20㎏ 4.5 4.0 2.5 -
농약 4.5 4.5 2.5 -
무처리구 3.0 3.0 35 -
40일 시제품 10㎏ 3.5 3.5 10 -
시제품 20㎏ 3.5 3.5 7.5 -
농약 3.5 4.0 7.5 -
무처리구 2.0 1.5 57.5 -
60일 시제품 10㎏ 3.0 3.0 12.5 87.5
시제품 20㎏ 3.0 3.0 12.5 87.5
농약 3.5 3.5 10 90
무처리구 1.0 1.5 72.5 27.5
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 뿌리상태(근모발달) : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
② 경기도 파주시 사양토 시험포장 결과
정식 후 경과일수 처리구 지상부생육 뿌리상태 발병도(%) 방제가(%)
20일 시제품 10㎏ 4.5 4.5 0 -
시제품 20㎏ 4.5 4.0 0 -
농약 4.0 4.5 0 -
무처리구 3.5 3.5 32.5 -
40일 시제품 10㎏ 4.0 4.0 5 -
시제품 20㎏ 3.5 3.5 7.5 -
농약 3.5 4.0 7.5 -
무처리구 2.0 1.5 52.5 -
60일 시제품 10㎏ 3.0 3.0 10 90
시제품 20㎏ 3.0 3.0 10 90
농약 3.0 3.0 12.5 87.5
무처리구 1.0 1.0 62.5 37.5
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 뿌리상태(근모발달) : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
③ 경기도 파주시 사질토 시험포장 결과
정식 후 경과일수 처리구 지상부생육 뿌리상태 발병도(%) 방제가(%)
20일 시제품 10㎏ 4.5 4.5 0 -
시제품 20㎏ 4.0 4.0 2.5 -
농약 4.5 4.0 2.5 -
무처리구 4.0 3.5 27.5 -
40일 시제품 10㎏ 4.0 3.5 7.5 -
시제품 20㎏ 4.0 3.5 5 -
농약 4.0 4.0 5 -
무처리구 2.5 1.5 47.5 -
60일 시제품 10㎏ 3.0 3.0 7.5 92.5
시제품 20㎏ 3.0 3.0 10 90
농약 3.5 3.5 10 90
무처리구 1.0 1.5 57.5 42.5
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 뿌리상태(근모발달) : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
④ 강원도 원주시 점질토 시험포장 결과
정식 후 경과일수 처리구 지상부생육 뿌리상태 발병도(%) 방제가(%)
20일 시제품 10㎏ 4.0 4.5 0 -
시제품 20㎏ 4.5 4.0 0 -
농약 4.5 4.0 0 -
무처리구 4.0 3.0 25 -
40일 시제품 10㎏ 3.5 4.5 5 -
시제품 20㎏ 4.0 3.5 2.5 -
농약 4.0 4.0 5 -
무처리구 3.0 2.0 62.5 -
60일 시제품 10㎏ 3.0 4.0 7.5 92.5
시제품 20㎏ 3.5 3.5 5 95
농약 3.0 3.5 7.5 92.5
무처리구 1.5 1.0 77.5 32.5
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 뿌리상태(근모발달) : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
⑤ 토양종류별 시험포장 결과 종합
정식 후 경과일수 처리구 토양종류별 발병도(%)
충적토 사양토 사질토 점질토
20일 시제품 10㎏ 2.5 0 0 0
시제품 20㎏ 2.5 0 2.5 0
농약 2.5 0 2.5 0
무처리구 35 32.5 27.5 25
40일 시제품 10㎏ 10 5 7.5 5
시제품 20㎏ 7.5 7.5 5 2.5
농약 7.5 7.5 5 5
무처리구 57.5 52.5 47.5 62.5
60일 시제품 10㎏ 12.5 10 7.5 7.5
시제품 20㎏ 12.5 10 10 5
농약 10 12.5 10 7.5
무처리구 72.5 62.5 57.5 77.5
* 발병도는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
실험예 12 : 농가 포장 실증시험을 통한 방제가 평가 Ⅱ
전년도에 발병이 심했던 배추 경작지를 대상으로 최종 처리방법을 동일하게 하여 포장시험을 실시하였다. 시제품 처리량은 10㎏/300평으로 정식 3일전에 토양 혼화처리하도록 하였다. 대조구로 농약처리구(혹안나)와 무처리구를 두었고, 포장관리는 일반 농가 경종방법에 준하여 실시하였다. 시험결과는 20일 간격으로 지상부 생육과 뿌리 상태, 발병도를 평가하였고, 최종적으로 60일차의 방제가를 비교하였다. 포장시험에 대한 개요는 다음과 같다.
① 경기도 파주시 시험포
-. 시험기간 : 06. 8. 25 ~ 10. 18
-. 시험농가 : 경기도 파주시 적성면 답곡리 1농가
-. 토양종류 : 사질토
-. 처리일시 : 8. 25 토양 혼화처리 (정식 : 8. 28)
-. 처리내용 : 시제품 10㎏/300평, 농약 300평, A사 스팟 300평, 무처리 300평
② 경기도 평택시 시험포
-. 시험기간 : 06. 8. 25 ~ 10. 18
-. 시험농가 : 경기도 평택시 청북면 백봉리 1농가
-. 토양종류 : 사질토
-. 처리일시 : 8. 25 토양 혼화처리 (정식 : 8. 28)
-. 처리내용 : 시제품 10㎏/300평, 농약 300평, B사 생명탄 300평, 무처리 300평
③ 강원도 원주시 시험포
-. 시험기간 : 06. 5. 13 ~ 7. 10
-. 시험농가 : 강원도 원주시 귀래면 귀래리 1농가
-. 토양종류 : 사질토
-. 처리일시 : 5. 13 토양 혼화처리 (정식 : 5. 17)
-. 처리내용 : 시제품 10㎏/300평, 농약 300평, C사 싸이렌 300평, 무처리 300평
3개 지역의 농가 포장실증시험을 통해 최종적으로 화학농약대비 방제가를 확인한 결과 시제품 300평당 10㎏을 처리한 시험구의 방제가는 평균 85.8%를 나타내었고, 화학농약은 평균 85.8%의 방제가를 나타내었다. 타사 기존제품(3개 회사)의 평균 방제가는 69.2%로 시제품은 기존 타사제품 대비 16.6% 이상의 향상된 방제가를 나타내는 것으로 확인되었다.지금까지의 결과를 종합해 볼 때 본 시제품은 화학농약과 방제가가 거의 동일하게 나타나기 때문에 충분히 화학농약을 대체할 수 있을 것으로 판단된다. 최종 농가 포장실증시험에 대한 결과는 하기 표 14에 나타내었다.
농가 포장 실증시험 결과 ① 경기도 파주시 적성면 답곡리 시험포장 결과
정식 후 경과일수 처리구 지상부생육 뿌리상태 발병도(%) 방제가(%)
20일 시제품 10㎏ 3.5 4.0 0 -
농약 4.0 4.5 0 -
A사 스팟 3.0 3.5 0 -
무처리구 3.0 3.5 10 -
40일 시제품 10㎏ 3.5 3.0 10 -
농약 3.5 3.5 7.5 -
A사 스팟 2.5 3.0 15 -
무처리구 2.0 2.0 22.5 -
60일 시제품 10㎏ 3.0 3.0 17.5 82.5
농약 3.0 3.0 15 85
A사 스팟 1.5 2.0 32.5 67.5
무처리구 1.0 1.0 52.5 35
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 뿌리상태(근모발달) : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
② 경기도 평택시 청북면 백봉리 시험포장 결과
정식 후 경과일수 처리구 지상부생육 뿌리상태 발병도(%) 방제가(%)
20일 시제품 10㎏ 4.0 4.0 2.5 -
농약 4.5 4.5 0 -
B사 생명탄 3.5 3.5 0 -
무처리구 3.5 3.0 17.5 -
40일 시제품 10㎏ 3.5 3.5 5 -
농약 3.5 3.5 7.5 -
B사 생명탄 3.5 2.5 17.5 -
무처리구 2.5 2.5 60 -
60일 시제품 10㎏ 3.0 3.5 15 85
농약 3.0 3.0 15 85
B사 생명탄 1.5 2.0 32.5 67.5
무처리구 1.0 1.5 65 35
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 뿌리상태(근모발달) : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
③ 강원도 원주시 귀래면 귀래리 시험포장 결과
정식 후 경과일수 처리구 지상부생육 뿌리상태 발병도(%) 방제가(%)
20일 시제품 10㎏ 4.5 4.5 0 -
농약 4.5 4.5 2.5 -
C사 싸이렌 4.0 4.0 2.5 -
무처리구 4.0 3.5 7.5 -
40일 시제품 10㎏ 4.0 4.0 7.5 -
농약 4.0 4.0 7.5 -
C사 싸이렌 3.5 3.5 15 -
무처리구 3.0 2.0 25 -
60일 시제품 10㎏ 3.5 3.5 10 90
농약 3.5 3.5 12.5 87.5
C사 싸이렌 3.0 2.5 27.5 72.5
무처리구 2.0 1.5 62.5 37.5
* 지상부 생육 : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 뿌리상태(근모발달) : 1: 불량, 2: 다소불량, 3: 보통, 4: 양호, 5: 아주 양호
* 발병도 및 방제가는 시험구별 무작위 선발 40주에 대한 백분율임.
본 발명의 토양전염성 병해에 대한 서방형 미생물제제는 길항균의 담체에 대한 접착력을 증강시키기 위해 젤라틴, 전분, PVA, CMC 등과 같은 생분해성 접착제를 혼합하여 제조하기 때문에, 종래 입상형 미생물제제에 대하여 길항균의 활성이 더욱 지속되어 불량한 토양환경속에서도 오랜시간 방제효과가 지속될 수 있는 장점이 있다.

Claims (12)

  1. 토양전염성 병균의 길항균을 이용한 미생물제제에 있어서,
    배추 무사마귀병의 길항균인 바실러스 서브틸리스가 생분해성 접착제인 젤라틴(gelatine)에 의하여 담체에 흡착되어 토양내에서 서서히 방출되는 것을 특징으로 하는 토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스는 바실러스 서브틸리스 KB-291(Bacillus subtilis KB-291, KFCC 11324)인 토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 담체는 제오라이트, 맥반석, 질석, 모래, 활성탄 중에서 선택된 1종 이상인 토양전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제.
  7. 제6항에 있어서, 제오라이트는 지름 0.5 ~ 1.0 mm 인 소성 제오라이트인 토양 전염성 병해 방제용 서방형 미생물제제.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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