KR100829972B1 - 항-ｈｇｆ/ｓｆ 인간화 항체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-HGF/SF 인간화 항체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 인간 항체의 경쇄 가변영역과 인간 이외의 동물 유래의 항-HGF/SF 항체의 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 (HCDR)가 이식된 인간 항체의 중쇄 가변영역의 조합으로 이루어진 항-HGF/SF 키메릭 Fab 라이브러리를 파지 표면발현시켜 제조된 본 발명의 항-HGF/SF 인간화 항체는, 모체 항-HGF/SF 항체와 동등 이상의 HGF/SF에 대한 결합 친화도 및 HGF/SF와 이의 수용체인 cMET의 결합을 억제하는 중화활성을 가지면서도 인체 내에서 낮은 면역 부반응을 나타내므로, 보다 효과적으로 HGF와 그 수용체인 cMET의 결합에 의해 야기되는 여러 가지 질환, 특히, 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
도 1은 항체 라이브러리 제조에 사용된 파지미드 벡터 pComb3X의 개략적인 유전자 구성을 도식화한 것으로, 파지 표면에 Fab를 표면발현 (display)하는 것을 나타낸 것이고,
도 2 및 도 3은 모체 항체인 토끼/인간 키메릭 단일클론 항체 SFN 68과 본 발명에 따른 인간화 항체들의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 각각 비교한 것이고 (여기서, -는 동일한 아미노산을, 굵은 글자는 PCR 프라이머에 의해 치환되는 아미노산을, 밑줄은 프라이머를 코딩하는 아미노산을, *는 PCR에 의해 인간 cDNA로부터 클로닝된 다양성을 갖는 영역을 나타낸다.),
도 4는 실시예 4에서 정제된 Fab 절편에 대해 쿠마시 염색을 수행한 겔사진이고,
도 5는 본 발명에 따른 인간화 항체에 의한 HGF/SF와 cMET/Fc 키메라의 결합 억제 정도를 모체 항체인 SFN 68과 비교한 그래프이며,
도 6은 HGF/SF에 대한 본 발명에 따른 인간화 항체와 항-인간 Fab 특정 IgG의 혼합물의 MDCK 분산 억제 정도를 나타낸 사진이다.
본 발명은 항-HGF/SF 인간화 항체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 항체의 경쇄 가변영역 (VL)과 인간 이외의 동물 유래의 항-HGF/SF 항체의 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 (HCDR)가 이식된 인간 항체의 중쇄 가변영역 (VH)의 조합으로 이루어진 항-HGF/SF 키메릭 Fab 라이브러리를 파지 표면발현시켜 제조된 항-HGF/SF 인간화 항체에 관한 것이다.
HGF/SF (hepatocyte growth factor/scatter factor; 간세포 성장인자/분산인자)는 간엽간세포 (mesenchymal cell)에 의해 생산되는 다기능성 이종이중체 (heterodimer) 폴리펩타이드로서, N-말단 도메인과 세린 프로테아제와 같은 베타-체인 C-말단 도메인에 공유결합으로 연결된 4 개의 크링글 도메인 (NK4)을 포함하는 알파-체인으로 이루어져 있다. 또한, 인간 HGF/SF는 생물학적으로 비활성인 단일 체 형태의, 728 개의 아미노산을 갖는 전구체로 합성되고, R494 잔기가 특이적 혈청 세린 프로테아제에 의해 절단되어 생물학적으로 활성인 HGF/SF가 되며, 활성 HGF/SF는 69 kDa의 알파-체인과 34 kDa의 베타-체인이 이황화 결합으로 연결된 이종이중체이다.
HGF/SF가 그 수용체인 cMET에 결합하면 다양한 세포 유형의 성장 및 분화를 유발하고, 상피 간엽 전이 및 세관 (tubule)과 내강 (lumen)의 형성을 매개하며, 혈관신생을 촉진한다. cMET와 HGF/SF가 모두 넉아웃 (knock-out)된 쥐는 배아 단계에서 사망률이 높고, 태반, 태아 간 및 팔다리/근육 형성에 있어 분화의 결함을 나타낸다 (Cao et al., PNAS., 98(13), 7443-7448, 2001; Gmyrek et al., American Journal of Pathology, 159(2), 579-590, 2001). 또한, cMET는 간, 전립선, 대장, 유방, 뇌 및 피부를 포함하는 다양한 인간 암에서 과량 발현되는 것으로 보고되었다 (Maulik et al, Cytokine & Growth Factor Reviews, 13(1), 41-59,200). 따라서 cMET 활성화는 혈관신생, 세포 운동성 및 세포 표면 단백질 분해효소 조절과 같은 과정에 자극적인 영향을 미치는 것으로부터 시작하여 암의 전이를 현저히 증가시키므로 암을 예방 및 치료하기 위한 표적 인자로서 관심의 대상이 되어 왔다 (Wielenga et al., American Journal of Pathology, 157(5), 1563-1573, 2000).
단일클론 항체 (monoclonal antibody, mAb)는 치료제로서 엄청난 잠재력을 가지고 있지만, 이러한 비인간 항체들은 인체 내에서 외래 항원으로 간주되기 때문에 면역반응을 유발하고 반감기가 짧기 때문에 치료효과가 제한적이다.
따라서 이러한 문제를 해결하기 위해, 항원과 직접적으로 결합하는 모체 단일클론 항체의 가변영역의 상보성 결정부위 (complementary determining region, CDR)를 인간 항체 골격에 이식함으로써 (CDR-이식방법) "인간화 항체 (humanized antibody)"를 개발하고자 하는 많은 노력이 있었다. 이에 따라 수득된 인간화 항체는 모체 항체의 친화도 및 특이성을 유지하면서 인체 내에서의 면역반응을 줄이고 반감기를 연장시킨다 (Baselga, J. et al., J Clin Oncol, 14, 737-744, 1996).
그러나 상기와 같이 단순한 CDR-이식방법은 종종 모체 단일클론 항체보다 항원 결합력이 약한 인간화 항체를 제공하기도 한다 (Carter, P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 4285-4428, 1992; Eigenbrot, C. et al., Proteins, 18, 49-62, 1994; 및 Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng., 4, 773-778, 19911).
이에, 모체 단일클론 항체의 친화도를 유지하는 인간화 항체를 제공하기 위해 CDR 루프 (loop) 형성에 영향을 주는 인간 항체 골격부위영역 (framework region, FR)에 존재하는 주요한 아미노산 잔기들을 이에 대응되는 모체 단일클론 항체의 아미노산 잔기들로 대체시킨다 (Chothia, C. et al., Nature, 342, 877-888, 1989). 그러나 항원 결합에 관여하는 골격부위의 잔기들을 알아내는 것은 매우 어려우므로, 이를 이용한 항체의 인간화 방법은 많은 시간이 소요되게 된다.
이에, 본 발명자들은 HGF/SF와 이의 수용체인 cMET의 결합을 억제하는 중화활성을 갖는 항-HGF/SF의 인간화 항체 및 이의 효과적인 제조방법에 대한 연구를 계속한 결과, 인간 항체의 경쇄 가변영역과 인간 이외의 동물 유래의 항-HGF/SF 항체의 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 (HCDR)가 이식된 인간 항체의 중쇄 가변영역으로 구성된 조합 항체 라이브러리의 파지 표면발현을 이용하면 모체 항체에 비해 동등 이상의 활성을 가지면서도 단일클론 항체에 의해 유발되는 인체 내 면역 부반응이 낮은 인간화 항체를 신속하게 제조할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 낮은 면역 부반응을 나타내며 모체 단일클론 항체에 비해 동등 이상의 결합 친화도를 갖는 항-HGF/SF 인간화 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 파지 표면발현을 이용하여 상기 항-HGF/SF 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 상보성 결정부위에 각각 하기 아미노산 서열을 갖는 인간 항체의 중쇄 가변영역;
TYYMS YIGTSSGTTYYANSVKG GLGRINL
(서열번호 1 내지 3)
b) 인간 항체의 경쇄 가변영역과 동일한 경쇄 가변영역;
c) 인간 항체의 중쇄 불변영역과 동일한 중쇄 불변영역; 및
d) 인간 항체의 경쇄 불변영역과 동일한 경쇄 불변영역
을 갖는 것을 특징으로 하는, 항-HGF/SF 인간화 항체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상보성 결정부위에 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 인간 항체의 중쇄 가변영역과 인간 항체의 경쇄 가변영역의 조합으로 이루어진 키메릭 Fab 라이브러리를 제조한 후, 이를 파 지에 표면발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항-HGF/SF 인간화 항체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 키메릭 (chimeric) 항체는, 항체 가변영역 (variable domain) 또는 이의 CDR이 항체의 나머지 부분과 상이한 동물에서 기원된 항체를 말한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 항체 가변 영역은 인간 이외의 동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역 (constant domain)은 인간에서 유래한 항체일 수 있다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
인간화 항체 (humanized antibody)는 동물유래 단일클론항체의 높은 친화도와 특이성을 유지하면서도 인체 내에서의 면역 부반응은 감소시키기 위하여, 동물유래 단일클론항체의 CDR을 인간항체에 이식시켜 제조되는 항체를 의미한다.
중쇄는 항원에 대한 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
경쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체 길 이 경쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
또한, Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역 (CH1)을 가지는 구조로 1 개의 항원 결합 부위를 가진다.
본 발명의 인간화 항체는 인간 항체의 경쇄 가변영역, 인간 이외의 동물 유래의 항-HGF/SF 항체의 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 (HCDR)들이 이식된 인간 항체의 중쇄 가변영역 및 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 불변영역으로 구성된다.
상기 중쇄 가변영역에 이식되는 상보성 결정부위는, 상보성 결정부위에 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 인간 이외의 모든 동물의 항체 중쇄로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는, 항-HGF/SF 토끼/인간 키메릭 단일클론 항체 SFN 68 (대한민국 특허등록 제 556660 호)의 중쇄 가변영역으로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 항-HGF/SF 인간화 항체는 단편 또는 전체 형태의 항체일 수 있으며, 바람직하게는 Fab의 형태를 갖는다.
또한, 본 발명의 인간화 항체는 HGF/SF에 대하여 1×10-9 내지 5×10-8 M의 결합친화도 (KD)를 갖는다.
본 발명에서는 항원과의 결합력을 높이기 위하여, 상보성 결정부위가 유래한 모체 항체에서 CDR 루프의 형태에 영향을 주는 골격부위영역의 아미노산 잔기가 추가로 이식된 인간 항체의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 상기 아미노산 잔기 는 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 SFN 68 중쇄 가변영역의 2, 37, 48, 49, 71, 75 및 78번 아미노산 잔기 중 하나 이상인 것이 바람직하다. 본 발명에서 아미노산 잔기 번호는 카벳 번호부여 체계 (Kabat numbering scheme)에 따라 지정하였다.
본 발명의 항-HGF/SF 인간화 항체는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.
먼저, 인간 골수로부터 추출한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 다음, 이를 주형으로 하고 축퇴 프라이머 (degenerate primer)들의 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 인간 항체의 경쇄 가변영역을 합성하고, 인간 항체의 경쇄 불변영역 (Cκ)을 중첩 연장 PCR로 결합시켜 경쇄 유전자를 제조한다.
서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR들, 예를 들어 토끼/인간 키메릭 단일클론 항체 SFN 68의 HCDR들이 이식된 인간 항체의 중쇄 가변영역을 증폭하기 위하여, 먼저 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 SFN 68 중쇄 가변영역의 HCDR1 (아미노산 31-35), HCDR2 (아미노산 50-65) 또는 HCDR3 (아미노산 95-102)을 이식할 수 있도록 설계된 프라이머를 이용하여, 골격부위 FR1 (HCDR1 포함), FR2 (HCDR2 포함), FR3 (HCDR3 포함) 및 FR4 (인간 항체 중쇄 불변영역 CH1 포함)를 합성하는 각각의 PCR을 수행한다.
이때, 제조되는 항체의 항원과의 결합력을 높이기 위하여 골격부위영역의 임의의 위치에 이에 대응하는 SFN 68의 아미노산 잔기를 추가로 이식할 수 있도록 설 계된 프라이머를 이용할 수 있다. 이때, 추가로 이식되는 골격부위 영역의 아미노산 잔기는, 토끼/인간 키메릭 단일클론 항체 SFN 68의 중쇄 아미노산 서열 및 이와 유사성이 높은 인간 주형의 아미노산 서열을 정렬시킨 다음, 토끼와 인간의 골격부위영역의 차이로부터 CDR 루프의 형태에 영향을 주는 골격부위영역의 아미노산 잔기를 확인함으로써 결정할 수 있으며, 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 SFN 68 중쇄 가변영역의 2, 37, 48, 49, 71, 75 및 78번 아미노산 잔기 중 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기에서 얻은 FR1 내지 FR4에 대한 PCR 산물들을 중첩 연장 PCR (overlap extension PCR)로 결합시켜 토끼/인간 키메릭 단일클론 항체 SFN 68의 HCDR들이 이식된 인간 항체의 중쇄 가변영역과 인간 항체의 중쇄 불변영역 (CH1)으로 조합된 중쇄 유전자를 제조한다. 이때 사용되는 프라이머는 효과적인 결합을 위하여 각 HCDR에 대응하는 염기를 20 개 이상 갖도록 설계된다.
본 발명에서는 상기에서 얻은 중쇄 및 경쇄 유전자들을 중첩 연장 PCR로 결합시켜 토끼/인간 키메릭 Fab 항체의 DNA 라이브러리를 제조한다.
본 발명에서는 상기 라이브러리의 DNA 절편들을 벡터에 삽입한 후, 상기 벡터로 대장균을 형질전환시킴으로써 토끼/인간 키메릭 Fab 항체 라이브러리를 제조한다. 상기 벡터와 대장균은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으나, 벡터로는 파지미드 벡터, 예를 들어 pComb3X (the Scripps Research Institute, 미국)를 사용하는 것이 바람직하고, 대장균으로는 대장균 ER2537 (NEB)을 사용하는 것이 바람직하다. 라이브러리 DNA를 포함하는 파지미드 벡터로 대장균을 형질전환시키면, 도입된 파지가 파지코트 단백질 (phage coat protein)인 pIII에 융합 단백질 형태로서 Fab 항체를 표면발현한다.
이후, HGF/SF로 코팅된 ELISA 플레이트 및 항-인간 염소 Fab 다중클론 항체를 사용한 효소 면역법을 통해 항-HGF/SF Fab를 포함하는 파지 클론을 선별한다. 선별된 항-HGF/SF Fab를 포함하는 파지 클론들 중, SFN 68과 동등 이상의 친화도를 나타낸 클론들을 HSFN 68-13, HSFN 68-16, HSFN 68-27 및 HSFN 68-41로 각각 명명하였다.
상기 HSFN 68-13 클론은 각각 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-16 클론은 각각 서열번호 10 및 11의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-27 클론은 각각 서열번호 14 및 15의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-41 클론은 각각 서열번호 18 및 19의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을 갖는다.
이로부터 상기 클론들의 VL 및 VH 영역에 대한 아미노산 서열을 유추해보면, HSFN 68-13 클론은 각각 서열번호 4 및 5의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-16 클론은 각각 서열번호 8 및 9의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-27 클론은 각각 서열번호 12 및 13의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역 을, HSFN 68-41 클론은 각각 서열번호 16 및 17의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역을 갖는다.
상기 클론들의 아미노산 서열에서 골격부위 (FR)와 CDR을 분석해보면, 각 클론의 VL 및 VH 영역에는 각각 4개의 FR과 3개의 CDR이 존재하며 (도 2 및 3 참조), 상기 HSFN 68 클론들과 SFN 68의 경쇄 서열 유사도는 78 내지 81%이고, 중쇄 서열 유사도는 85 내지 90%이다.
본 발명의 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄는 유전자 코드에 따라 인간화 항체 중쇄 및 경쇄로부터 예측되는 염기 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 특정 아미노산에 대해 이를 코드하는 몇 개의 다른 코돈이 존재한다는 사실은 공지되어 있으며, 따라서 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열로부터 예측되는 모든 염기서열이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 바람직하게는 인간화 항체 중쇄 및 경쇄 유전자 서열은 숙주세포의 하나 이상의 선호 코돈을 포함한다.
또한, 본 발명에서는 선별된 클론의 파지미드 DNA로 대장균을 형질전환시키고 항체 단백질을 발현시킨 다음, 배양액을 통상의 방법으로 정제함으로써 항-HGF/SF 인간화 항체를 얻는다. 상기 대장균과 정제 방법은 당업계에서 재조합 단백질의 생산을 위해 통상적으로 사용되는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으나, 대장균으로는 HB2151 (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하는 것이 바람직하고, 정제 방법으로는 배양액을 농축한 다음, 단백질 L 컬럼 (protein L column; Pierce Chemical Co, 미국)으로 정제하는 것이 바람직하다.
HGF/SF에 대한 HSFN 68 클론들의 친화도를 조사한 결과, HSFN 68-13 클론이 분석된 4 개의 클론들 중에서 가장 높은 친화도를 나타내며, 이는 SFN 68보다 6 배나 강한 것이다. 한편, HSFN 68-16은 가장 약한 친화도를 나타내며, HSFN 68-27 및 41은 SFN 68과 유사한 친화도를 나타낸다 (표 2 참조).
또한, 본 발명에 따른 인간화 항체는 HGF/SF와 cMET/Fc 키메라 사이의 결합을 SFN 68과 동등한 수준으로 억제하며 (도 5 참조), SFN 68과 유사한 중화활성을 나타낸다 (도 6 참조).
이와 같이, 완전히 인간화된 경쇄 가변영역, 및 이식된 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 및 골격부위의 일부 잔기를 제외하고는 모두 인간화된 중쇄가변영역을 갖는 본 발명에 따른 인간화 항체는, 모체 SFN 68과 동등 이상의 HGF/SF에 대한 결합 친화도를 가지고 HGF/SF와 이의 수용체인 cMET의 결합을 억제하는 중화활성을 가지면서도 인체 내에서 낮은 면역 부반응을 나타내므로, 보다 효과적으로 HGF와 그 수용체인 cMET의 결합에 의해 야기되는 여러 가지 질환, 특히 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 본 발명에서는 상기 인간화 항체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 역시 제공한다. 본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 정맥 및 근육 주사를 포함하는 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 활성성분의 투여량은 환자의 상태, 투여경로, 연령, 성별 및 체중을 포함하는 다양한 관련 인자, 및 환자의 중증도에 따라 결정될 수 있으며, 따라서 투여량은 어떠한 방법으로도 발명의 범위를 제한하지 않는다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항-HGF/SF 토끼/인간 키메릭 Fab를 포함하는 파지 라이브러리의 제조
(1-1) 인간 항체의 경쇄 가변영역 (V
L
)의 증폭
TRI 시약 (Molecular Research Center, 미국)을 사용하여 인간 골수 (입수처: 실험실 연구원 기증)로부터 전체 RNA를 추출한 후, 염화리튬 침전법으로 정제한 다음, 올리고 (dT)를 프라이머로 하고 수퍼스크립트 전증폭 시스템 (SUPERSCRIPT Preamplification System; Life Technologies, Inc.)을 이용하여 인간 cDNA를 합성하였다.
상기 인간 cDNA를 주형으로 하고 하기 표 1의 서열번호 21 내지 25의 축퇴 프라이머 (degenerate primer)들의 조합을 이용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행함으로써 인간 항체의 경쇄 가변영역을 합성하였다.
각 PCR 반응을 위하여 상기에서 합성한 cDNA (약 0.5 ㎍) 1 ㎕ , 각각 60 pmol의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, 0.5 ㎕의 Taq 중합효소, 8 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 10 ㎕의 10×PCR 완충용액을 혼합하고 증류수를 100㎕까지 첨가하였다. 상기 혼합물을 94℃에서 15 초, 56℃에서 30 초, 72℃에서 90 초의 반응을 30회 반복한 후, 72℃에서 10 분간 정치하였다.
증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 LaboPass™ 겔 추출 키트 (Cosmo, 한국)를 이용하여 정제하였다.
(1-2) 인간 항체의 경쇄 불변 영역 (Cκ)의 증폭
인간 항체의 경쇄 불변 영역 (Cκ)을 증폭하기 위하여, 20 ng의 인간 Fab의 Cκ 서열을 포함하고 있는 pComb3XTT 벡터 (the Scripps Research Institute, 미국)를 주형으로 하고 각 60 pmol의 서열번호 26 및 27로 기재되는 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 (1-1)과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
(1-3) 경쇄의 증폭
상기 (1-1) 및 (1-2)에서 얻은 인간 항체의 경쇄 가변영역 (VL) 및 인간 항체의 경쇄 불변 영역 (Cκ)을 중첩 연장 PCR로 결합시켜 경쇄 유전자를 제조하였다.
PCR 반응을 위하여 각각 100 ng의 VL 및 Cκ PCR 산물, 각각 서열번호 28 및 27로 기재되는 60 pmol의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, 0.5 ㎕의 Taq 중합효소, 8 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 10 ㎕의 10×PCR 완충용액을 혼합하고 증류수를 100㎕까지 첨가하였다. 상기 혼합물을 94℃에서 15 초, 56℃에서 30 초, 72℃에서 2 분의 반응을 15회 반복한 후, 72℃에서 10 분간 정치하였으며, 이후 증폭된 DNA를 상기 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
(1-4) SFN 68의 HCDR이 이식된 중쇄 가변영역 (V
H
) 및 인간 중쇄 불변영역(C
H
1)의 증폭
상기 (1-1)에서 얻은 인간 cDNA를 주형으로 하고 하기 표 2의 서열번호 29 내지 36의 프라이머들을 이용하여 토끼/인간 키메릭 단일클론 항체 SFN 68 (대한민국 특허등록 제 556660 호)의 HCDR이 이식된 인간 항체의 중쇄 골격부위 FR1 (HCDR1 포함), FR2 (HCDR2 포함) 및 FR3 (HCDR3 포함)을 PCR로 합성하였으며, FR4는 인간 항체의 중쇄 불변영역 CH1의 서열을 포함하도록, 인간 Fab의 CH1 서열을 포함하고 있는 pComb3XTT 발현 벡터 (the Scripps Research Institute, 미국)를 주형으로 하고 하기 표 2의 서열번호 37 및 38의 프라이머들을 이용하여 PCR로 합성하였다.
상기 각 PCR은 주형으로서 각각 500 ng의 cDNA 또는 20 ng의 pComb3XTT 발현 벡터를 사용한 것을 제외하고는 상기 (1-1)과 동일한 조건으로 수행되었으며, 이후 증폭된 DNA를 상기 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
이때 사용된 프라이머들은 도 3에 도시된 바와 같이, 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 SFN 68 중쇄 가변영역의 HCDR1 (아미노산 31-35), HCDR2 (아미노산 50-65) 또는 HCDR3 (아미노산 95-102), 및 2, 37, 48, 49, 71, 75 및 78번 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 인간 항체의 중쇄 서열의 대응 위치로 이식되도록 설계되었다.
(1-5) 중쇄의 증폭
하기 표 3에 기재된 주형 및 프라이머들의 조합을 이용하여 상기 (1-3)과 동일한 방법으로 중첩 연장 PCR을 수행함으로써 상기 (1-4)에서 얻은 FR1 내지 FR4에 대한 각 PCR 산물들을 차례로 결합시켜 SFN 68의 HCDR이 이식된 중쇄 가변영역 (VH) 및 인간 중쇄 불변영역(CH1)을 포함하는 중쇄를 합성하였으며, 이후 증폭된 DNA를 상기 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
이때, 사용된 프라이머들은 효과적인 결합을 위하여 항 HGF/SF Fab를 코딩하는 염기서열의 HCDR의 염기서열에 대응하는 염기들을 20개 이상 갖도록 설계되었다.
(1-6) 항-HGF/SF 토끼/인간 키메릭 Fab 라이브러리 유전자의 제조
항-HGF/SF 토끼/인간 키메릭 Fab 라이브러리 유전자를 만들기 위한 PCR을 수행하기 위하여, 각각 100 ng의 상기 (1-3)에서 정제된 경쇄 유전자 산물과 상기 실시예 (1-5)에서 정제된 중쇄 유전자 산물, 각각 60 pmol의 서열번호 28 및 서열번호 40으로 기재되는 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 (1-3)과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였으며, 이후 증폭된 DNA를 상기 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
(1-7) 항-HGF/SF 토끼/인간 키메릭 Fab 라이브러리 유전자를 포함하는 파지의 제조
상기 (1-6)에서 정제된 키메릭 Fab 라이브러리 유전자를 제한효소 SfiI (Roche, 미국)으로 절단하고, 순수 분리한 다음 도 1에 도시되어 있는 파지미드 벡터 pComb3X (the Scripps Research Institute, 미국)에 삽입한 다음, 제조된 파지미드 DNA로 대장균 ER2537 (NEB, 미국)을 전기천공 (eletroporation)을 통하여 형질전환시켰다.
이렇게 도입된 파지는 파지 코트 단백질 (phage coat protein)인 pⅢ에 융합단백질 형태로서 Fab를 표면발현하게 된다.
상기 형질전환된 균주를 SB 배지 (10g의 MOPS (3(N-Morpholino) propanesulfonic acid, Sigma), 30g의 트립톤 (BD Biosciences, Difco) 및 20g의 효모 추출물 (BD sciences, Difco) 포함)를 이용하여 37℃, 250 rpm에서 배양한 다음, 배양물에 헬퍼 파지 VCSM13 (Stratagene, 미국)을 첨가하여 파지 구조 (phage rescue)를 수행하였다 (문헌 [Barbas, C.F. et al., Phage Display: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001] 참조). 밤새 배양하여 얻은 배양물을 4℃, 14,000×g에서 20 분간 원심분리하여 세포 펠렛을 제거한 다음, 상층액에 4% (w/v) 폴리에틸렌글라이콜-8000 (PEG, 시그마) 및 3% (w/v) NaCl을 첨가하고 얼음에서 30 분간 방치시켜 파지를 침전시켰다. 이를 4℃, 17,000×g에서 20 분간 원심분리한 다음, 펠렛을 3% (w/v) BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 TBS (TBSB) 1 ㎖에 다시 용해시켰다. 수득된 라이브러리의 다양성을 파지 적정법 (문헌 [Barbas, C.F. et al., Phage Display: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001] 참조) 및 BstNI 핑거프린팅 (fingerprinting) (문헌 [Barbas, C.F. et al., Phage Display: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001] 참조)으로 확인하였다.
실시예 2: 인간화된 항-HGF/SF Fab를 포함하는 파지 클론의 선별
(2-1) 바이오패닝 (Biopanning)
96-웰 마이크로 플레이트 (Costar, 미국)의 각 웰에 0.1 M 중탄산나트륨 완충액 (pH 8.6, 코팅 완충액)에 녹인 10 ㎍/㎖ HGF/SF 50 ㎕를 넣어 4℃에서 밤새 코팅하였다. 각 웰에 TBSB (5% BSA 포함) 100 ㎕을 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 정치하여 코팅되지 않은 부분을 블로킹하였다. 코팅된 각 웰에 실시예 1에서 제조한 Fab를 표면발현하고 있는 파지를 TBSB에 현탁시킨 용액 50 ㎕를 가한 후 2 시간 정도 37℃에서 정치한 후, 0.05% 트윈 20을 포함하는 TBS (TBS-T)로 세척한 다음, 웰에 고정되어 있는 파지를 0.1 M HCl-글리신 (pH 2.2) 100 ㎕로 용출하고, 1 M Tris-Cl (pH 9.1) 16 ㎕를 첨가하여 중화시켰다. 패닝은 총 4회 실시하였고, 세척 회수는 첫 패닝 (panning)에 1 회, 두 번째 및 세 번째 패닝에 5 회 및 네 번째 패닝에 10 회로 증가시켰다. 각 패닝마다 용출된 파지로 지수성장기의 대장균 ER2537 세포를 형질전환시킨 후, 실시예 1의 (1-7)과 동일한 방법으로 파지 구조를 수행하고, 입출 역가 (input-output titer)를 통상의 방법 (문헌 [Barbas, C.F. et al., 2001] 참조)으로 조사하였다.
(2-2) ELISA
HGF/SF에 결합하는 클론을 알아내기 위하여, 표면발현된 Fab를 이용한 ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 상기 (2-1)에서 마지막 회 패닝 후의 출력 역가 플레이트 (output titer plate)로부터 41개의 클론을 무작위로 선별한 후, 카베니실린 (carbenicillin)이 포함된 SB 배지에 상기 클론들을 접종하여 4시간을 배양한 다음, 헬퍼 파지 VCSM13을 처리하여 파지 구조를 수행하였다. 2시간 후에 카나마이신을 처리하여 밤새 배양하여 최종적으로 파지표면에 Fab이 발현된 상층액을 얻었다. 96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 코팅 완충액에 녹인 1 ㎍/㎖ HGF/SF를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅하고 TBSB로 블로킹하였다. 상기에서 얻은 파지 상층액을 동일 부피의 TBSB와 혼합하여 코팅된 각 웰에 50㎕씩 첨가한 다음, 37℃에서 1 시간 동안 방치하고 TBS-T로 세척하였다. 각 웰에 ABTS (one-step ABTS 용액, 시그마)를 기질로 사용하여 HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 양 (sheep) 항-M13 파지 다중클론 항체 (Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하고 37℃에서 30 분간 방치한 다음, 405 nm에서 광학밀도를 측정하였다.
그 결과, HGF/SF에 대해 결합 활성을 갖는 총 33 개의 클론이 선별되었으며, 이들에 대해 상기와 동일한 방법으로 ELISA를 수행하여 SFN 68과 동등 이상의 결합 친화도를 나타내는 4 개의 클론을 선별하였다. 선별된 클론들을 각각 HSFN 68-13, 16, 27 및 41로 명명하였으며, 이후의 실험에 사용하였다.
실시예 3: 선별된 파지의 서열 분석
상기 실시예 2에서 선별된 4 개의 클론들의 Fab 유전자의 염기서열 분석은 문헌 [Barbas, C.F. et al., 2001]에 기재된 특정 프라이머들을 이용하여 다이데옥시 사슬 종료 (dideoxy chain termination) 방법으로 수행하였다. 시퀀싱 반응의 산물들은 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (Applied Biosystems, 미국)로 분석되었다.
그 결과, HSFN 68-13 Fab 유전자는 각각 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-16 Fab 유전자는 각각 서열번호 10 및 11의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-27 Fab 유전자는 각각 서열번호 14 및 15의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-41 Fab 유전자는 각각 서열번호 18 및 19의 염기서열을 갖는 VL 및 VH 영역을 갖는다는 것을 확인하였다.
이로부터 상기 Fab들의 VL 및 VH 영역에 대한 아미노산 서열을 유추해본 결과, HSFN 68-13 Fab는 각각 서열번호 4 및 5의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-16 Fab는 각각 서열번호 8 및 9의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-27 Fab는 각각 서열번호 12 및 13의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역을, HSFN 68-41 Fab는 각각 서열번호 16 및 17의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 영역을 갖는다는 것을 확인하였다.
상기 Fab들의 아미노산 서열에서 골격부위 (FR)와 CDR을 공지된 방법 (문헌 [Harris et al., Protein Science, 4(2), p306-310, 1995] 참조)으로 분석해 본 결과, 도 2 및 3과 같은 영역 구성을 가짐을 알 수 있었다.
또한, HSFN 68 Fab들과 SFN 68 Fab의 경쇄 서열 유사도는 78 내지 81%이고, 중쇄 서열 유사도는 85 내지 90%이었다.
실시예 4: 항-HGF/SF Fab의 발현 및 시험관내 분석을 위한 정제
상기 실시예 2에서 선별된 클론들의 파지미드 DNA로 비억제성 대장균 HB2151 (Amersham Pharmacia Biotech)을 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 50 ㎍/㎖의 카베니실린을 포함하는 LB 배지 400 ㎖에 넣고 600 nm에서의 O.D가 0.5-1.0이 될 때까지 30℃, 250 rpm의 조건으로 배양한 다음, 1 mM IPTG를 첨가하고 30℃에서 밤새 배양하면서 발현을 유도하였다. 배양액의 상층액을 Labscale TFF System (Millipore, 미국)으로 농축하고 protein L 컬럼 (Pierce Chemical Co, 미국)으로 정제한 다음, 정제된 50 KDa의 Fab를 쿠마시 염색으로 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
시험예 1: HGF/SF에 대한 항-HGF/SF Fab 인간화 항체의 결합 친화도 분석
HGF/SF에 대한 항-HGF/SF Fab 인간화 항체의 결합 친화도는 BIAcore 기기 (BIAcore, 스웨덴)를 사용하여 SPR (Surface plasmon Resonance; 표면 플라즈몬 공명 기술)로 결정하였다.
구체적으로, 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액 (pH 4.0)을 5 ㎕/min의 속도로 흘려주면서 아민 커플링 키트 (Biacore AB)와 함께 키트에 내재된 설명서에 따라 CM5 (carboxymethyldextran-modified) 센서 칩 (Biacore AB)에 HGF/SF를 고정시켰다. 0.005% 트윈 20 (시그마)을 포함하는 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)에 녹인 4 종류의 항-HGF/SF Fab 및 대조군으로서 SFN 68을 각각 25℃에서 2 분 동안 30 ㎕/min의 속도로 칩에 주입하였다. 항-HGF/SF Fab 인간화 항체는 1.25-200 nM의 농도로 희석되었다. 표면은 1 M NaCl/50 mM NaOH로 재생하였으며, 분석 소프트웨어 (BIA evaluation software)를 이용하여 운동 속도 상수 (k on 및 k off)와 평형 해리 상수 (K D)를 얻었다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타난 바와 같이, HSFN 68-13 Fab가 분석된 4 개의 Fab들 중에서 가장 높은 친화도를 나타내었으며, 이는 대조군으로 사용된 SFN 68보다 6 배나 강한 것이다. 한편, HSFN 68-16은 가장 약한 친화도를 나타내었으며, HSFN 68-27 및 41은 SFN 68과 유사한 친화도를 나타내었다.
시험예 2: 항-HGF/SF Fab의 중화활성 측정을 위한 경쟁 효소 면역법 (competition enzyme immunoassay)
96-웰 마이크로플레이트를 1 ㎍/㎖의 HGF/SF로 코팅하고 상기 실시예 2의 (2-2)와 동일한 방법으로 블로킹하였다. 2 nM cMET/Fc 키메라 (R&D systems, USA) 25 ㎕와 TBSB에 녹인 0 내지 200 nM의 HSFN 68-13 또는 SFN 68 25 ㎕를 HGF/SF이 코팅된 웰에 첨가한 후, 37℃에서 1 시간 동안 방치한 다음, TBS-T로 세척하였다. 웰에 고정된 cMET/Fc의 양은 기질로서 울트라-TMB 기질 용액 (Pierce)을 사용하여 HRP가 결합된 토끼 항-인간 Fc 특이적 IgG (Pierce)로 측정하였다. 30 분간 방치한 후, 450 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 모든 실험을 세 번씩 수행하였으며, 이들의 평균값 및 표준 편차를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, HSFN 68-13 클론은 그 양이 증가함에 따라 고정된 HGF/SF와 cMET/Fc 키메라 사이의 결합을 억제하였으며, 이러한 중화 활성은 SFN 68과 유사하였다.
시험예 3: MDCK 분산 (scattering) 분석
HSFN 68 Fab들이 HGF/SF의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는지를 확인하기 위해, HGF/SF 및 cMET 신호전달에 대한 저해제의 효과를 정량하기 위해 가장 널리 이용되는 MDCK 분산 분석 (문헌 [Thiery J.P. et al., Nat. Rev. Cancer., 2, p442-445, 2002] 참조)을 수행하였다.
MDCK 세포 (Epithelial Madin Darbey Canine Kidney cell; ATCC CCL 34)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰당 1.5×103 개의 MDCK 세포를 분주하고 24 시간 동안 정치하였다. 18.75 pM의 HGF/SF를 0 내지 4.7 nM의 HSFN 68-13 및 0 내지 700 ng/㎖의 다중클론 염소 항-인간 Fab 특이적 IgG (시그마)의 혼합물과 37℃에서 1 시간 동안 전배양한 다음, PBS로 세척한 각 웰에 첨가하고 밤새 반응시켰다. 이때, 비교를 위해 SFN 68을 이용하여 상기와 동일한 실험을 반복하였다. 또한, 다중클론 염소 항-인간 Fab 특이적 IgG, 또는 비특이적 Fab (Calbiochem Inc, USA)와 항-인간 Fab 특이적 IgG의 혼합물을 HGF/SF와 함께 처리한 실험군을 비교군으로 사용하였다. 세포를 메탄올 및 아세톤 혼합물 (1:1 (v/v))로 고정하고, 1% (w/v) 크리스탈 바이올렛 수용액으로 염색한 후, 역위 광학 현미경으로 분산 효과를 관찰하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 아무런 처리도 하지 않은 대조군의 MDCK 세포 (A)에 비해, HGF/SF로 처리된 MDCK 세포 (B)에서는 세포의 분산이 관찰되었다. 한편, 다중클론 염소 항-인간 Fab 항체와 함께 전배양되어 이량체화된 HSFN 68-13 또는 SFN 68을 배지에 첨가하면 (C 및 D), HGF/SF에 의한 MDCK 세포의 분산이 차단되어 대조군과 유사한 결과를 나타내었으며, 이때 HSFN 68-13과 SFN 68은 최소 187.5 pM 농도에서 14.06 ng/㎖의 염소 항-인간 Fab 다중클론 항체와 함께 중화 효과를 나타내었다. 반면, 비교군으로 사용된 다중클론 염소 항-인간 Fab 특이적 IgG (E) 및 비특이적 Fab와 염소 항-인간 Fab 특이적 IgG의 혼합물 (F)은 HSF/SF에 의한 세포 분산에 대해 어떠한 억제 효과도 나타내지 않았다.
완전히 인간화된 경쇄 가변영역, 및 이식된 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 및 골격부위의 일부 잔기를 제외하고는 모두 인간화된 중쇄가변영역을 갖는 본 발명의 항-HGF/SF 인간화 항체는, 모체 항체와 동등 이상의 HGF/SF에 대한 결합 친화도를 가지고 HGF/SF와 이의 수용체인 cMET의 결합을 억제하는 중화활성을 가지면서도 인체 내에서 낮은 면역 부반응을 나타내므로, 보다 효과적으로 HGF와 그 수용체인 cMET의 결합에 의해 야기되는 여러 가지 질환, 특히, 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역으로 이루어진 군에서 선택되는 경쇄 및 중쇄 가변영역; 및 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 불변영역과 동일한 중쇄 및 경쇄 불변영역을 갖는 항-HGF/SF 인간화 항체.
- 제 1 항에 있어서,항원에 대한 결합친화도 (KD)가 1×10-9 내지 5×10-8 M인 것을 특징으로 하는, 항-HGF/SF 인간화 항체.
- 제 1 항에 있어서,Fab인 것을 특징으로 하는, 항-HGF/SF 인간화 항체.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항의 인간화 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA.
- 제 6 항에 있어서,서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15 또는 서열번호 19의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
- 상보성 결정부위에 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 SFN 68 중쇄 가변영역의 2, 37, 48, 49, 71, 75 및 78번 아미노산 잔기 중 하나 이상이 이식된 항체의 중쇄 가변영역과 인간 항체의 경쇄 가변영역의 조합을 포함하는 Fab의 라이브러리를 제조한 후, 이를 파지에 표면발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 따른 항-HGF/SF 인간화 항체의 제조방법.
- 제 8 항에 있어서,상보성 결정부위가 토끼로부터 유래한 것임을 특징으로 하는, 제 1 항에 따른 항-HGF/SF 인간화 항체의 제조방법.
- 삭제
- 제 1 항의 인간화 항체를 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물.
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