KR100822041B1 - 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 에이 코딩 유전자의 발현이강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한엘-라이신 생산방법 - Google Patents
몰리브덴 보조인자 생합성 효소 에이 코딩 유전자의 발현이강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한엘-라이신 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A 코딩 유전자의 발현이 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법에 관한 것으로, 코리네박테리움의 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A를 암호화하는 moaA 유전자의 발현을 강화시킴으로써 L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리아 균주를 이용해 발효법으로 종전보다 생산성이 증대된 L-라이신 제조법을 제공하는 효과가 있다.
코리네박테리움, L-라이신, moaA, 몰리브덴 보조인자 생합성 효소, L-아미노산
Description
도 1은 본 발명의 moaA 유전자 발현 벡터인 pECCG122-moaA 를 도시한 것이다.
본 발명은 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A 코딩 유전자의 발현이 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 코리네박테리움의 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A(moaA) 의 활성이 내재적 활성보다 증가된 형질전환 균주와 이를 이용한 L-라이신 생산방법에 관한 것이다.
코리네박테리움(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주를 이용한 발효에 의해 주로 생성되고 있다.
이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.
특히, 재조합 DNA 기술을 이용하여 각각의 L-아미노산 생합성 관련 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고, L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어 왔다[Kinoshita, "glutamic acid bacteria" in Biology of industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds), Benjamin Chummings, London, UK, 1985, 115-142; Hiliger, BioTec 2, 40-44(1991); Eggeling, Amino Acids 6, 261-272(1994); Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); 및 Sahm et al, Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)].
또는, 특정유전자를 파괴하거나 감쇠발현(Underexpression) 시킴으로써 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하는 연구가 시도되었다. 예를 들면, 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트의 대한민국 특허공개 제2001-51915호 및 제2001-62279호에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 sucC 및 sucD 유전자 및 zwa2 유전자를 감쇠발현(underexpression)시켜 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키는 방법이 기술되어 있다.
또한, 외부의 다른 박테리아 유래의 유전자를 도입하는 경우도 있다. 예를 들어, 일본 특허공보 제(평)7-121228호에서는 에스케리키아 콜리 유래의 시트르산 신타제를 암호화하는 유전자의 도입하는 방법이 기술되어 있다.
한편, 몰리브덴은 거의 모든 생물계에서 매우 중요한 역할을 하는 필수 전이원소로서 세포 전체의 탄소, 황, 질소대사에서 다양한 핵심 반응들을 촉매하는 효소들에 요구된다. 그러나 몰리브덴 스스로는 생물학적인 활성을 갖지 못하므로 세포 내에서 프테린(pterin) 혼합물과 복합체를 이룸으로써 비로소 고유한 활성을 갖게 되는데 이를 몰리브덴 보조인자라 한다. 몰리브덴 보조인자 생합성 경로는 진화적으로 잘 보존되어 있어서 이에 관여하는 여러 단백질과 그 유전자들은 박테리아에서부터 인간을 포함하는 고등동물들에 이르기까지 고도의 상동성을 갖고 있다.
몰리브덴 보조인자 생합성 과정은, 처음 구아노신 트리포스페이트가 몰리브돕테린 전구체 Z로 전환되고 이것이 다시 몰리브돕테린으로 전환된 다음 마지막으로 여기에 몰리브덴이 결합함으로써 완결된다.
몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A의 경우, 몰리브덴 보조인자 생합성 과정의 첫 단계에 관여하는 효소로서 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 C와 함께 작용하여 구아노신 트리포스페이트를 몰리브돕테린 전구체 Z로 전환시키는 역할을 한다.
박테리아에서 몰리브덴 보조인자를 함유하는 것으로 알려진 50여종 이상의 효소들 중 일부는 질소대사과정의 핵심 반응에 관여한다. 예를 들면, 질산염 환원효소는 질산염을 아질산염으로 환원시키는 반응을 통해 무기질소원의 동화작용을 촉매하는 주효소로서 작용한다. 한편, 한 분자당 두 개의 질소 원자를 갖는 L-라이신 생산에 있어서 질소 동화작용은 매우 중요하다 할 수 있다.
본 발명자들은 상기의 사실들에 근거하여, 몰리브덴 보조인자의 생합성 강화 를 통한 질소대사 관여 효소들의 활성 증가를 유도하고자 하였으며 이로부터 질소 원자의 원활한 공급이 이루어져 L-라이신 생산 효율을 높일 수 있을 것으로 예상하여 본 발명을 안출하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 몰리브덴 보조인자 생합성이 강화되어 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 L-라이신 생산균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 L-라이신 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적은 코리네박테리움에서 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A를 암호화하는 유전자 moaA를 코리네형 세균-대장균 셔틀벡터 pECCG122에 클로닝 한 후, L-라이신 생산균주에 형질전환하여 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A의 발현이 강화된 형질전환 균주를 제작하고 상기 균주를 배양하여 L-라이신을 생산함으로써 달성하였다.
본 발명은 코리네박테리움의 moaA 유전자의 발현이 강화된 형질전환주를 제작하는 단계와 상기 균주를 직접발효법으로 배양하여 발효액 중에 L-라이신을 축적시키고, 그로부터 L-라이신을 회수하는 단계로 구성된다.
본 발명은 L-라이신의 생산능을 가진 미생물로서, 바람직하게는 상기 미생물 내의 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A의 활성을 증가시킴으로써 L-라이신의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 효소의 활성화는 당업계에 알려진 임의의 활성화 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 활성화란 상기 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A를 코딩하는 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 높은 수준으로 발현되는 유전자가 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 효소 활성화는 상기 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A를 코딩하는 유전자의 프로모터 부위를 포함하여 발현단위 전체가 발현되도록 하여 활성화된 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 활성화는 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A를 코딩하는 유전자(moaA)의 프로모터 부위를 포함하여 발현단위 전체가 발현되도록 서열번호 1의 서열을 포함하는 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시키고, 배양하여 선발되는 것일 수 있다.
본 발명에서는 재조합 발현벡터를 코리네박테리아에 삽입하여 기능이 강화된 moaA를 발현시키는 방법을 사용하였으나, 재조합벡터 이외에도 외래 유전자의 발현을 위한 바이러스의 감염 등 공지의 방법을 이용하여 moaA 유전자를 발현할 수 있어 이에 한정하지 않는다.
L-라이신을 제조하기 위한 상기 코리네박테리움 속 미생물은 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A(moaA)의 효소 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CA01-015 (수탁번호: KCCM-10802P)임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 그 배양액을 발효 배 양하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 "형질전환"이라는 용어는 유전자를 숙주세포 내로 도입하여 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있는 상태이기만 하면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 것이든 염색체외에 위치하는 것이든 어느 것이나 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로서 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 상기 유전자의 발현에 필요한 모든 요소(element)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사종결 신호, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결 신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터의 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포로 도입되어, 숙주세포의 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되는 것일 수도 있다.
본 발명에 따라 사용되는 코리네박테리아 균주는 배치 공정(batch process) 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식 또는 회분식으로 배양할 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); 및 Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.
본 발명에서 사용되는 코리네박테리아 배양 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
미생물 배양 배지에서 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
상기 배지의 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.
상기 배지의 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다.
또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질 이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다.
배양물의 온도는 보통 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160시간에서 달성된다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의해 분석할 수 있다(Spackman et al. Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예
1:
코리네박테리움
유래
moaA
유전자 발현벡터 제작
코리네박테리움의 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A의 염기서열 정보를 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 확보하였다(moaA; 서열번호 1). 코리네박테리아의 게놈상의 moaA 유전자의 활성을 증가시키는 방법으로 세포 내에 moaA 유전자의 발현을 강화시키는 발현벡터를 도입하고자 하였다. 보고된 염기서열에 근거하여 moaA 유전자의 프로모터를 포함하는 발현단위 전체를 증폭하기 위해 보고된 염기서열에 근거하여 한 쌍의 프라이머(서열번호 2 및 3)를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC13032)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 연쇄중합법(PCR법)[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=96℃, 30초/Annealing=52℃, 30초/Polymerization=72℃, 2분, 30회)에 의해 moaA 유전자의 단편을 증폭하였다. 당사에서 제작, 보유하고 있는 코리네형 세균-대장균 셔틀벡터인 pECCG122에 제한효소 EcoRV를 처리한 다음, 접합효소(ligation enzyme)를 이용하여 moaA 유전자 단편 증폭 산물과 연결함으로써 pECCG122-moaA를 제조하였다(도 1 참조).
실시예
2:
moaA
유전자의 발현이 강화된 L-라이신
생산균주
제작
실시예 1에서 제작한 pECCG122-moaA를 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 형질전환한 후(Appl. Microbiol. Biotechnol.(1999) 52:541-545 에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신 25㎍/㎖를 함유한 LB 한천배지에 도포한 뒤 형질전환주를 선별, 획득하였고(CA01-015) 각각의 형질전환 균주로부터 pECCG122-moaA를 분리, 확인하였다.
실시예
3:
moaA
유전자 강화 L-라이신
생산균주에서의
라이신 생산
실시예 2에서 얻어진 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-015 균주를 L-라이신 생산을 위해 다음과 같은 방법으로 배양하였다.
종 배지 ( pH 7.0): (공정수 1 리터 기준)
원당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO4 7 H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아마이드 2000㎍
생산 배지 ( pH 7.0): (공정수 1리터 기준)
원당 100g, (NH4)2SO4 40g, 대두단백 2.5g, Corn Steep Solids 5g, 요소 3g, KH2PO4 1g, MgSO4 7H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아마이드 3000㎍, CaCO3 30g
상기 종 배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC10881과 CA01-015를 접종하고 30℃에서 20시간 동안 진탕 배양(200rpm) 하였다. 상기 생산 배지 24㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 1㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 120시간 동안 진탕배양(200rpm)하였다.
배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정한 결과는 표 1과 같다.
| 균주 | L-라이신 생산량(g/L) | 모균주 대비 L-라이신 생산증가율 | ||||
| 균주 | 뱃치 1 | 뱃치 | 뱃치 3 | 뱃치 1 | 뱃치 2 | 뱃치 3 |
| KFCC-10881 | 45 | 45.2 | 44.7 | 4.2% | 4% | 4.1% |
| CA01-015 | 46.9 | 47 | 46.5 | |||
표 1에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-015의 배양물 중의 L-라이신 농도는 모균주인 KFCC10881의 배양물 중의 L-라이신 농도 대비 4.1% 증가하였음을 확인하였다.
상기로부터 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A의 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-015 균주를 2006년 11월 27일자로 사단법인 한국종균협회부설 한국미생물보존센터에 기탁하고, 기탁번호 제 KCCM-10802P호를 부여받았다.
상기 실시예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A 코딩 유전자의 발현이 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법에 관한 것으로, 코리네박테리움의 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A를 암호화하는 moaA 유전자의 발현을 강화시킴으로써 L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리아 균주를 이용해 발효법으로 종전보다 생산성이 증대된 L-라이신 제조법을 제공하는 효과가 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (4)
- 서열번호 1의 몰리브덴 보조인자 생합성효소 A를 암호화하는 moaA 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킴으로서 몰리브덴 보조인자 생합성효소 A의 활성이 증가되어 L-라이신 생산능이 향상된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 moaA 활성의 증가는 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 A를 코딩하는 유전자의 프로모터 부위를 포함하여 발현단위전체가 발현되도록 서열번호 1의 서열을 포함하는 벡터에 의한 코리네박테리움 속 미생물의 형질전환에 의한 것임을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CA01-015 KCCM-10802P임을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
- 제1항 기재의 미생물 또는 상기 미생물의 배양액을 발효 배양하여 L-라이신을 생산하는 방법.
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