KR100819479B1

KR100819479B1 - Ｐａｓ 변이체 및 이를 포함하는 벡터

Info

Publication number: KR100819479B1
Application number: KR1020060070722A
Authority: KR
Inventors: 엄수현; 진미영; 길지영; 김재일; 이준행; 김수영; 고영종; 이준혁
Original assignee: 애니젠 주식회사
Priority date: 2006-07-27
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2008-04-07
Anticipated expiration: 2026-07-27
Also published as: KR20080010565A

Abstract

본 발명은 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PAS 인자 변이체, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 펩타이드 또는 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PAS 인자 변이체를 포함하는 벡터는, 이에 융합되는 펩타이드 또는 단백질의 발현을 크게 개선시킨다. 또한, 종래의 벡터 시스템에서는 거의 발현되지 않는 세포통과 막단백질, 예컨대, 라이아노딘 수용체(Ryanodine receptor)와 인체-유래 단백질, 예컨대 칼시프레신(Calcipressin)의 발현을 PAS 인자 변이체는 가능하게 한다.

PAS, 변이, 단백질, 펩타이드, 발현

Description

ＰＡＳ 변이체 및 이를 포함하는 벡터{ＰＡＳ Mutants and Vectors Carrying the Same}

도 1은 야생형 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자의 3차원 구조를 나타내는 리본 다이어그램이다. 이 다이어그램은 PyMOL 프로그램(http://pymol.sourceforge.net/)을 이용하여 만들어졌다.

도 2는 야생형 PAS 인자의 정전기적 표면 포텐셜의 분포를 보여주는 그림이다. 소수성 패치 부분(큰 점선 원으로 표시됨)이 PAS 인자가 생체막과 상호작용할 것으로 예측되는 부분이다.

도 3은 본 발명의 변이 PAS 융합 벡터의 유전자 지도이다. GST, MCS, Kan^R, LacI 및 P_T7은 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제 유전자, 멀티플 클로닝 위치, 카나마이신 저항성 유전자, LacI 코딩 서열 및 T7 프로모터를 나타낸다.

도 4a는 본 발명의 벡터에 의한 칼시프레신(Calcipressin)의 성공적인 발현을 보여주는 젤 사진이다. 도 4b는 본 발명의 벡터에 의한 라이아노딘 수용체(Ryanodine receptor)의 성공적인 발현을 보여주는 젤 사진이다. 1. 분자량 마커, 2. 종래 벡터 pET29a를 이용한 발현 유도 전, 3. 종래 벡터 pET29a 발현유 도 후, 4. 종래 벡터 His-TEV 발현유도 전, 5. 종래 벡터 His-TEV 발현유도 후, 6. 종래 벡터 Trx-TEV 발현유도 전, 7. 종래 벡터 Trx-TEV 발현유도 후, 8. 종래 벡터 Nus-TEV 발현유도 전, 9. 종래 벡터 Nus-TEV 발현유도 후, 10. 종래 벡터 GST-TEV 발현유도 전, 11. 종래 벡터 GST-TEV 발현유도 후, 12. 야생형 PAS 벡터 발현유도 전, 13. 야생형 PAS 벡터 발현유도 후, 14^*. 변이 PAS 벡터 발현유도 전, 15^*. 변이 PAS 벡터 발현유도 후. 화살표는 발현된 칼시프레신(Calcipressin) 또는 라이아노딘 수용체를 가리킨다.

본 발명은 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PAS 인자 변이체, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 펩타이드 또는 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

생명공학 분야에서 유용 유전자를 클로닝하는 주된 이유 중 하나는 특정 미생물에서 유용 유전자를 과잉 발현시켜 유용 단백질을 대량생산하고자 하는데 있다. 생물산업 시장 규모에서 단백질 제품이 차지하는 시장 규모를 정확히 예측하는 것은 어려운 실정이나, 전체 시장 규모의 핵심을 이루고 있으며 60% 내외 정도 를 차지하고 있는 상황이다. 향후 단백질 시장의 규모는 급격하게 증가할 것으로 예측되며, 특히 제품의 용도 확대로 판매영역이 확대되고 있고, 개량제품의 생산으로 인하여 시장 확대가 가능하며, 신규 및 신기능 제품의 발굴 및 생산을 통하여 신규 수요의 창출이 가능해질 전망이다.

유용 단백질을 산업적 수준으로 생산하는 재조합 미생물을 개발하기 위해서, 주로 외래 단백질의 안정적인 생산을 위한 재조합 숙주의 개발과 외래 유전자를 고효율로 분비/발현시키기 위한 발현벡터의 개발에 연구의 초점이 집중되어 왔다.

그러나 상당히 많은 종류의 단백질들은 원하는 정도로 발현되지 않거나, 발현되었다 하더라도 제대로 폴딩되지 않아 봉입체(inclusion body)로 뭉쳐져 기능을 상실한 쓸모없는 형태로 변하기도 한다.

한편, 비브리오 패혈증은 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)에 오염된 어패류 생식 시 감염되거나 균에 오염된 해수에 의하여 상처 난 피부를 통해서 감염된다. 비브리오 패혈증은 잠복기가 짧고, 일단 발병하면 전격적으로 진행하여 효과적 항균제 치료 타이밍을 놓치기 쉽다. 이 질환에 의한 사망률(40-50%)은 매우 높아서 조기진단 및 신속한 치료가 필요하다. 또한 주로 어패류를 생식하는 일본이나 한국 등지에서 해수온도가 급증하는 여름철에 자주 발병하지만 전세계적으로도 임상증례가 계속 보고되고 있어 관심이 집중되고 있다.

비브리오 패혈증의 원인균인 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)은 바다에 살고 있는 그람음성 세균으로 NaCl의 농도가 1-3 %dls 배지에서 잘 증식한다. 오랫동안 다른 세균으로 오인되었다가 V. parahemolyticus와 달리 락토스를 분해한 다는 사실이 밝혀져 1979년에 V. vulnificus로 명명되었다. 이 균은 콜리스틴(colistin) 내성이지만, 암피실린과 카르베니실린에는 감수성이어서 다른 유사한 세균과 구별될 수 있다. 보통은 구부러진 쏘시지 모양이고 균체는 캡슐로 둘러싸여 있다. 캡슐 물질(capsular material)이 있는 비브리오 패혈증균은 혈청의 살균작용에 저항하고 항탐식 작용이 있으며 치사력이 높고 조직 침투력이 강하므로 균이 가진 독력의 척도가 된다. 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)이 생산하여 직접 증상을 일으키거나 유발시키는데 관여하는 독성인자로는 크게 3종류- 균독, 효소 및 기타 인자가 있다. 이 독성인자들은 비브리오 패혈증균이 사람에게 감염된 후에 급격한 환경변화에 살아남기 위해 과량으로 발현된다.

비브리오 패혈증균(V. vulnificus)이 인체에 침투하기 위해서는 다양한 독성인자들이 새로이 발현하게 되는데 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자는 그 중의 하나로서 76개의 아미노산으로 이루어진 작은 단백질이다. 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)이 자연 환경에 존재할 때에는 PAS 인자가 발현되지 않다가, 인체에 감염되면 과량의 PAS 인자가 발현되기 시작한다.

PAS 인자는 시험관 내에서 성장한 비브리오 패혈증균에서는 발현하지 않으며, 플라스미드에 PAS 인자 유전자를 클로닝 한 후 비브리오 패혈증균 내에서 과발현하였을 때만 시험관 내에서 발현되었고, 발현된 대부분의 PAS 인자는 주변세포질 분획에서만 관찰되었다(참조: Tokugawa, K., et al., J. Biotechnol ., 35:69-76( 1994); Tokukawa, K. et al., J. Biotechnol . 37:33-37(1994)).

PAS 인자 유전자를 과발현 했을 때 세포질에서보다 상대적으로 주변세포질에 과량 존재하는 것으로 보아, 발현된 대부분의 PAS 인자가 생성 즉시 주변세포질로 이동하는 것으로 추정된다. 이는 PAS 인자가 세포내에서 생성된 독성성분이 분비되도록 도와주는 단백질로써, 발현된 다른 단백질의 폴딩을 도와주는 샤페론(chaperon)의 기능도 가지고 있다는 것을 보여주는 것이다. 또한, PAS가 쉽게 안정된 구조로 폴딩되며, 특별한 리더 서열(leader sequence) 등이 없이도 효과적으로 세포 밖으로 분비되는 특성을 가지고 있음을 나타낸다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 재조합 펩타이드 또는 단백질을 재조합 DNA 기술로 대량 생산할 수 있는 발현 벡터를 제공하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 펩타이드 또는 단백질을 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체와 융합시켜 발현시키는 경우에는 클로닝된 펩타이드 또는 단백질의 발현이 매우 크게 향상됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 PAS 인자 변이체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 PAS 인자 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 PAS 인자 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 펩타이드 또는 단백질의 대량 생산 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체를 제공한다.

본 발명자들은 재조합 펩타이드 또는 단백질을 재조합 DNA 기술로 대량 생산할 수 있는 발현 벡터를 제공하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 펩타이드 또는 단백질을 PAS 인자 변이체와 융합시켜 발현시키는 경우에는 클로닝된 펩타이드 또는 단백질의 발현이 매우 크게 향상됨을 확인하였다.

본 발명자들은 비브리오 패혈증균에서 생체 내 특이적 분비촉진 인자인 PAS 인자를 최초로 분리하였고, 분리한 PAS 인자를 포함하는 PAS 융합 벡터를 제조한 바 있다(참조: 대한민국 특허출원공개 제2006-0006204호). 그러나, 상기 야생형 PAS 인자는 발현 촉진자로서의 그 기능이 완벽하지 못하였고, 이에 본 발명자들은 야생형 PAS 인자를 개량하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 PAS 인자 변이체는 야생형 PAS 인자의 아미노산 서열에서 36번째 친수성의 아미노산인 아스파르트산을 소수성의 프롤린으로 치환한 것이다. 이러한 치환 전략은 PAS 인자에 대한 구조 연구에 기초한 것이다. 상기 치환은 PAS 인자 단백질의 생체막 결합력을 향상시키고 PAS 인자 단백질의 샤페론으로서의 기능을 증가시켜, 결국 PAS 인자를 포함하는 벡터의 발현능을 크게 향상시킨다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제1서열로 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 PAS 인자 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열 목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 PAS 인자 변이체 자체에 변화를 가져올 수도 있다. PAS 인자 변이체의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 PAS 인자 변이체와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체를 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 재조합 펩타이드 또는 단백질을 발현시키기 위한 벡터이다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세 포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백 시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), FLAG, 6x His (hexahistidine), NusA 및 Trx 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 소망하는 재조합 펩타이드 또는 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 상기 융합 서열 뒤에 단백질 분해효소 인식 서열(예컨대, TEV 인식 서열)을 포함한다. 본 발명의 벡터를 이용하여 발현된 재조합 펩타이드 또는 단백질의 융합 단백질은 단백질 분해효소의 처리에 의해 다른 서열로부터 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 “PAS 인자 변이체-코딩 뉴클레오타이스 서열-융합 파트너 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열-재조합 펩타이드 또는 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열”로 이루어진 발현 컨스트럭트를 포함한다. 도 3에 본 발명의 벡터의 구체적인 실시예가 도시되어 있다.

본 발명의 벡터에 포함되는 단백질-코딩 서열은 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 벡터에 포함되는 펩타이드-코딩 서열은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 야생형 단백질의 생리활성 단편(fragments)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 PAS 인자 변이체-코딩 서열을 포함하는 벡터를 이용하여 펩타이드 또는 단백질을 발현시키는 경우에는 고수율로 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻을 수 있다. 더욱이, 종래의 벡터 시스템에서는 거의 발현되지 않는 세포통과 막단백질, 예컨대, 라이아노딘 수용체(Ryanodine receptor)와 인체-유래 단백질, 예컨대 칼시프레신(Calcipressin)의 발현을 가능하게 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli DH5α, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl. Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad. Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 대량의 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 형질전환체는 원핵세포, 가장 바람직하게는 E. coli를 숙주세포로 하여 제조된 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 재조합 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 본 발명의 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하고 상기 재조합 펩타이드 또는 단백질을 발현시키는 단계; 및 (c) 상기 발현된 재조합 펩타이드 또는 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 벡터는 “PAS 인자 변이체-코딩 뉴클레오타이드 서열-융합 파트너 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열-재조합 펩타이드 또는 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열”로 이루어진 발현 컨스트럭트를 포함한다.

본 발명의 방법에서, 형질전환된 세포의 배양은 당업계에서 통상적으로 이용되는 배지를 이용하여 실시될 수 있다.

예를 들어, 형질전환체가 원핵세포(예컨대, E. coli)인 경우, LB (Luria-Bertani) 배지를 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다. 형질전환체가 동물세포인 경우에는, 예컨대, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959))을 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다.

형질전환체의 다양한 배양방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 발현된 재조합 펩타이드 또는 단백질을 수득하는 단계는 연속 배양법에서 세포 배양하는 과정에서 또는 배치 배양법에서 세포 배양이 종료된 이후에 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 재조합 펩타이드 또는 단백질의 분리는 정제된 형태로 융합 단백질을 회수함으로써 실시된다. 예를 들어, 재조합 펩타이드 또는 단백질은 배지 및/또는 세포 파쇄액(lysates)를 이용하여, 암모늄 설페이트 침전법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리 및/또는 컬럼 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리를 이용하여 정제된 형태로 수득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 재조합 펩타이드 또는 단백질의 수득은 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시된다. 예컨대, 재조합 펩타이드 또는 단백질이 GST에 융합된 경우에는 글루타티온이 결합된 레진 컬럼, 그리고 6x His에 융합된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 소망하는 재조합 펩타이드 또는 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

사용된 균주 및 플라스미드

실시예에서 사용된 균주 및 플라스미드의 특성은 표 1에 정리되어 있다.

균주		특징	출처
Escherichia coli	BL21(DE3)	F- ompT hsdS ( rB - mB -) gal dcm(DE3)	Novagen사
	DH5α	supE44 , DlacU169 ( f80lacZDM15 ), recA1, endA1, thi -1, gyrA96, relA1
플라스미드		특징
pET30a		His-tag 발현 벡터, Kan^R
pET41a		GST-tag 발현 벡터, Kan^R

실시예에서 사용한 대장균 균주들은 LB(Luria Bertani) 배지(Merk사)에서 배양하였다. 균주들은 배양 후 글리세롤 20%가 되도록 첨가하여 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

실시예 1: 비브리오 패혈증균으로부터 PAS 인자 분리

비브리오 패혈증균(V. vulnificus)을 2.5% NaCl 심장 인퓨전(heart infusion: HI) 배지에서 배양한 후, 소듐 도데실 설페이트(SDS)-프로테아제 방법(Little, P.F.R (1987) DNA Cloning: A practical approach. IRL press 3:19-42)으로 비브리오균의 지놈 DNA를 정제하였다.

제한효소 Sau3AI으로 지놈 DNA를 절단하고, 잘린 DNA 조각들을 아가로스 젤 (Amersham사)을 이용하여 분리하였다. 0.5에서 1.0 kb 사이의 DNA 조각들이 포함된 아가로스 젤에 β-agarase (New England Biolabs; NEB사)을 처리하고 QIAEX Ⅱ 젤 추출 키트(Qiagen사)를 사용하여 아가로스 젤로부터 0.5에서 1.0 kb 사이의 DNA 조각들을 획득하였다. DNA 조각들을 pET30a 벡터(Novagen사)에 삽입하고 E. coli DH5α에 형질전환시킨 다음, 생성된 각각의 콜로니들로부터 플라스미드 라이브러리 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 라이브러리 DNA를 E. coli BL21(DE3)(Novagen사)에 형질전환시키고 발현시켰다.

비브리오 패혈증 환자의 혈장과 BL21(DE3)에서 발현된 비브리오균의 단백질을 이용하여 비브리오균에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하고, 제작된 항체와 콜로니들을 이용하여 콜로니 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하였다. 제조된 발현 라이브러리를 순차 희석하여 평판 배지 당 약 500 집락씩 도말한 후에 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 멸균된 벨벳천을 이용하여 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside: IPTG) 함유 배지에 레플리카 평판 배양 한 후 5시간 배양하여 클론된 유전자로부터 항원의 발현을 유도하였다. 균 배양 평판을 클로로포름 증기에 15분 정도 노출시켜 세균이 용균되어 발현된 단백질이 노출되도록 하고 그 후 니트로셀룰로스 여과지를 이 위에 15분 정도 중첩하여 단백질을 전이되도록 하였다. 단백질이 전이된 여과지를 5% 탈지분유, 0.5% Tween 20, pH 7.2 인산완충식염수로 4℃ 냉장고에서 하룻밤 동안 블록킹 다음 1차 항체로 흡수시킨 회복기 환자 혈청을 1:5000 이상 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로서 퍼옥시다아제-접합 항-인간 항체를 반응시킨 다음, ECL 화학발광 키트(Amersham Co.)로 측정하고, 반응성 집락을 보이는 12개의 클론을 선발하였다.

이어, 선발된 12개의 콜로니에 대하여 ABI Prism 377 automatic DNA sequencer(Perkin-Elmer Applied Biosystems사)를 이용하여 DNA 서열을 분석하였다.

DNA 서열 분석을 통해 획득하게 된 여러 항원 유전자 중 단백질 분비 인자로 추정되는 PAS 유전자를 확인 및 확보하였고, 확보된 PAS 유전자의 DNA 서열 분석 결과는 서열목록 제1서열에서 106-108번째 뉴클레오타이드가 gat인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것을 확인하였다.

실시예 2: PAS 인자를 이용하여 발현 벡터 제조

pET30a 벡터에 클로닝된 PAS 인자를 주형으로 하여 DNA 말단부위 양쪽에 제한효소 NdeⅠ 인식부위가 포함된 PAS 인자(231 bp)를 증폭하였다. 증폭에 사용된 센스 프라이머는 5'-GGTCATATGAAAGCCCTC(밑줄 부분이 NdeⅠ 인식부위이다)이고, 안티센스 프라이머는 5'-GCCCATATGGTGTTCAGG이다. 주형 100 ng, 0.2 pM 프라이머, 0.25 mM dNTPs 및 pfu DNA 중합효소(Stratagene사) 2 유니트를 이용하여 PCR-증폭을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응 조건은 94℃에서 5분 변성; 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안 반응시키는 것을 25회 반복; 최종적으로 72℃에서 10분 동안 연장반응이다. 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭된 231 bp의 PAS 인자는 QIAEX Ⅱ 젤 추출 키트(Qiagen사)를 이용하여 정제하였다.

증폭된 PAS 유전자 및 시판되고 있는 기존 벡터 중 PAS 벡터 개발에 사용될 GST-Tag 벡터(pET41a)에 제한효소 NdeⅠ(NEB사)을 처리한 후 정제하였다. 정제된 PAS 유전자를 pET41a 벡터에 클로닝하여 새로운 발현 벡터, 즉 PAS 융합 벡터, PAS-GST-Tag 벡터를 제조하였다. PAS-GST-Tag 벡터는 pET41a 플라스미드를 기본으로 하여 PAS 인자 뒤에 GST(glutathione S-transferase) Tag을 삽입하고, 뒤에는 단백질 분해 효소 중 하나인 TEV의 인식 부위, 그리고 여러 종류의 제한 효소들을 이용하여 외부 DNA를 클로닝할 수 있는 멀티플 콜로닝 위치(MCS)를 삽입한 벡터이다.

실시예 3: PAS 인자의 구조 분석

PAS 인자의 결정을 행잉-드랍(hanging-drop), 증기-분산 방법을 이용하여 성장시켰다. 단백질 용액(20 mM Hepes-NaOH, pH 7.5, 150 mM KCl 내의 11.8 mg/ml의 PAS 인자) 2 ㎕ 및 저장 용액(0.1 M Tris-HCL, pH 8.5, 22%(w/v) PEG 4000, 0.2 M MgCl₂) 2 ㎕를 혼합하여 수득한 드랍들로부터 가장 최적의 결정을 얻을 수 있엇다. 가장 큰 결정은, 1 주일 동안 최대 0.2 mm x 0.2 mm x 0.1 mm의 크기로 성장되었다. 20%(v/v) 글리세롤을 함유하는 저장 용액의 드랍으로부터 결정이 직접적으로 전이된 경우에 성공적인 플래쉬-동결이 이루어졌다. 브롬은 MAD(multiwavelength anomalous dispersion) 페이징을 위한 통상적인 변칙 스캐터(anomalous scatter)이기 때문에, 1 M NaBr을 함유하는 결정보호 용액에서 단일 결정을 1시간 동안 함침시켜, 브롬 MAD 데이터 세트를 수집하였다. 이어, 빔라인 BL-18B에서 ADSC 양자 4R CCD 검출기를 이용하여 1.9 Å 해상도로 MAD 데이터 세트를 수집하였다. 데이터 세트를 HKL2000 프로그램을 이용하여 처리하였다.

브롬을 변칙 스캐터로 이용하여, MAD 방법으로 PAS 인자의 구조를 결정하였다. 비대칭 단위에서의 5개 브롬 그룹의 위치를 SOLVE 프로그램으로 결정하였다(Terwilliger, T. C. & Berendzen, J. (1999). Automated MAD and MIR structure solution. Acta Crystallog. sect. D, 55, 849-861). RESOLVE 프로그램을 이용하여 용매 플래트닝 방법으로 초기 상을 개선시켰다(Terwilliger, T. C. (2000). Maximum likelihood density modification. Acta Crystallog. sect. D, 56, 965-972). 이렇게 하여 얻은 맵은 해석하기 용이하였고, 프로그램 O를 이용하여 모델 빌딩을 하였다(Jones, T. A., et al. (1991). Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallog. sect. A, 47, 110-119). 그리고 나서, 프로그램 CNS를 이용하여 초기 모델을 다듬었다(Brunger, A.T. et al., (1998) Crystallography & NMR system: a new software suite for macromolecular structure determination.

Acta Crystallog. sect. D, 54, 905-921). 매뉴얼 리빌딩을 실시한 다음, SHELXL를 이용하여 컨쥬게이트 그래딘언트 최소-스퀘어 리파인먼트를 몇 회 실시하였다(Sheldrick, G. & Schneider, T. (1997). SHELXL: highresolution refinement. Methods Enzymol. 277, 319-343). REFMAC5(Murshudov, G. N., et al., (1999). Efficient anisotropic refinement of Macromolecular structures using FFT. Acta Crystallog. sect. D, 55, 247-255)를 이용한 비방등성 리파인먼트의 최종 라운드를 실시하였다. PAS 인자 모델에 대한 최종 결정학적 R 값(25 Å으로부터 1.8 Å까지의 데이터)은 19.9%(R _free = 23.2%)이었다.

X선 회절을 통해 물질의 3차원 구조를 규명할 수 있는 X선 결정학 방법을 이용한 PAS 인자의 3차원 구조 분석결과, PAS 단백질은 전형적인 5-헬릭스 번들 구조를 가지고 있다는 것을 확인하였다(도 1). 5-헬릭스 번들 구조는 5개의 α-헬릭스가 평형되게 모인 구조이다. 번들의 내부는 소수성 가지쇄가 모여 패킹을 이루고 있으며, 외부에는 친수성 가지쇄가 노출되어 있다. 번들 내부는 매우 밀집되어 있어서 물분자 하나가 끼어들 수가 없는 구조이다. 도 2의 PAS 인자 단백질의 정전기 표면 포텐셜 분포도를 보면, PAS 인자 단백질의 세 번째 헬릭스 부분이 생체막과 상호작용 할 것으로 판단된다(트립토판 형광 스펙트로스코피 방식으로 분석됨). 이 결과로부터 PAS 인자 단백질의 아미노산 서열 36번째 친수성의 아미노산인 아스파르트산을 소수성의 프롤린으로 치환하면 PAS 인자 단백질의 생체막 결합력을 향상시키고 PAS 인자 단백질의 샤페론(chaperone) 기능이 증가할 것으로 기대하였다. 또한 이는 PAS 융합 벡터 발현 성능에도 큰 향상을 보일 것으로 예상되었다.

실시예 4: 위치-지정 변이유발( site - directed mutagenesis ) 방법을 이용한 변이 PAS 융합 벡터의 제조

PAS 인자 아미노산 서열 36번 위치의 아스파르트산을 프롤린으로 치환하기 위해, 위치-지정 변이유발(site-directed mutagenesis)를 위한 두 개의 프라이머(PAS-F-D36P 및 PAS-R-D36P)를 제작하였다: PAS-F-D36P, 5'-GAACAGTTGGATTTGCCTTTT CCA ATGCAACTGGCTTTGTATGC-3’; PAS-R-D36P, 5'-GCATACAAAGCCAGTTGCAT TGG AAAAGGCAAATCCAACTGTTC. 밑줄이 그어진 부분은 아스파르트산을 프롤린으로 치환하기 위한 부분이다. 실시예 2에서 제조한 PAS-GST-Tag 벡터를 주형으로 하여 PCR을 통하여 돌연변이된 5.8 kb의 mPAS-GST-Tag 벡터를 합성 및 증폭하였다. 주형 100 ng, 0.2 pM 프라이머, 0.25 mM dNTPs 및 pfu DNA 중합효소(Stratagene사) 2 유니트를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합액을 이용하여 PCR-증폭을 실시하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분 변성; 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안 반응시키는 것을 25회 반복; 최종적으로 72℃에서 10분 동안 연장반응이다. 반응 후 아가로오스 1 % 젤에서 PCR 생성물의 크기와 양을 확인하였다. 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭된 5.8 kb의 mPAS-GST-Tag 벡터는 QIAEX Ⅱ 젤 추출 키트(Qiagen사)를 이용하여 정제하였다.

이 유전자 증폭반응 반응물에서 주형 유전자(PAS-GST-Tag 벡터)를 얻기 위해 제한효소 DpnI(NEB사)을 처리하였다. 주형 유전자가 제거된 반응물을 다시 QIAEX Ⅱ 젤 추출 키트(Qiagen사)를 이용하여 정제하였다. 정제된 변이 PAS 융합 벡터의 구조는 도 3과 같다. 확보된 변이 PAS 융합 벡터를 ABI Prism 377 자동 DNA 시컨서(Perkin-Elmer Applied Biosystems사)를 이용하여 DNA 서열 분석하여 아미노산 서열 36번째의 아스파르트산이 프롤린으로 치환된 것을 확인하였다.

실시예 5: 변이 PAS 융합 벡터의 성능 검증

본 발명의 변이 PAS 융합 벡터 시스템의 성능을 검증하기 위해, 5종의 기존 벡터, pET29a(Novagen), His-TEV 벡터[pET28a 벡터(Novagen)의 멀티플클로닝위치 업스트림쪽에 TEV 인식부위를 삽입한 벡터, Nus-TEV 벡터[pET28a 벡터(Novagen)의 멀티플클로닝위치 업스트림쪽에 NusA-Tag 코딩 서열 및 TEV 인식부위를 삽입한 벡터], Trx-TEV[pET28a 벡터(Novagen)의 멀티플클로닝위치 업스트림쪽에 Trx-Tag 코딩 서열 및 TEV 인식부위를 삽입한 벡터] 및 GST-TEV[pET41a 벡터(Novagen)의 멀티플클로닝위치 업스트림쪽에 GST-Tag 코딩 서열 및 TEV 인식부위를 삽입한 벡터]를 이용하여 단백질 발현을 실시하였다. 또한, 야생형 PAS 융합 벡터를 이용하여 단백질 발현을 실시하였다. 상기 His-TEV 벡터, Nus-TEV 벡터, Trx-TEV 벡터 및 GST-TEV 벡터는 대한민국 특허출원 제2005-0051893호에 상세하게 설명되어 있다.

발현 성능 검증에 사용된 단백질들은 인체 근육 이완/수축에 관련된 세포통과 막 단백질인 라이아노딘 수용체(Ryanodine receptor)와 인체 유래 단백질인 칼시프레신(Calcipressin)이다. 이 단백질들은 일반적으로 사용되는 기존의 벡터와 변이 전 PAS 융합 벡터 모두에서 발현이 되지 않은 것들이다.

먼저, 5종의 기존 벡터, pET29a, His-TEV 벡터, Nus-TEV 벡터, Trx-TEV 벡터및 GST-TEV 벡터, 야생형 PAS 융합 벡터, 본 발명의 변이 PAS 융합 벡터 그리고 발현 실험에 사용될 대상 단백질의 유전자들을 제한 효소 HindⅢ와 XhoⅠ(NEB)으로 절단한 다음, 각각의 벡터에 대상 단백질 유전자를 클로닝하였다. 클로닝된 대상 단백질 유전자를 염화칼슘 방법으로 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시키고, 형질전환된 콜로니들을 25 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신이 포함된 3 ㎖ LB 액체배지에 접종하여 37℃ 배양기에서 16 시간 이상 배양하였다. 배양액의 일부(500 ㎕)를 50 ㎖ 액체 배지에 재접종하여 37℃에서 130 rpm의 속도로 배양하였고, 분광광도계를 이용하여 파장 600 ㎚에서 배양액의 흡광도가 0.45일 때 0.25 mM IPTG를 첨가하였다. IPTG 첨가 후 세포들을 6시간 동안 배양한 후 전체의 세포배양액 중 일부를 12% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 실시하여 단백질의 발현 양을 확인하였다(도 4a 및 4b).

도 4a 및 도 4b의 레인 1부터 11에서 볼 수 있듯이, 5종의 기존 벡터는 라이아노딘 수용체 및 칼시프레신을 발현시키기 못하였다. 또한, 야생형 PAS 융합 벡터에서도 역시 라이아노딘 수용체 및 칼시프레신을 발현시키기 못하였다. 그러나, 레인 15의 발현 유도 후 변이 PAS 융합벡터에서는 라이아노딘 수용체 및 칼시프레신이 발현되는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 신규한 변이 PAS 융합 벡터는 기존의 PAS 인자가 도입되지 않은 기존의 벡터보다 우수한 성능을 가졌음을 알 수 있으며, 더욱이 변이전의 PAS 융합 벡터에 비교하여도 그 기능이 향상되었음을 알 수 있다.

본 발명의 PAS 인자 변이체를 포함하는 벡터는, 이에 융합되는 펩타이드 또는 단백질의 발현을 크게 개선시킨다. 또한, 종래의 벡터 시스템에서는 거의 발현되지 않는 세포통과 막단백질, 예컨대, 라이아노딘 수용체(Ryanodine receptor)와 인체-유래 단백질, 예컨대 칼시프레신(Calcipressin)의 발현을 PAS 인자 변이체는 가능하게 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어지는 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체.
상기 제 1 항의 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
제 2 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
상기 제 2 항 또는 제 3 항의 PAS(Plasmid Acromobacter Secretion) 인자 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
상기 제 4 항의 벡터를 포함하는 형질전환체.
다음의 단계를 포함하는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 대량 생산 방법:

(a) 재조합 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 제4항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계;

(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하고 상기 재조합 펩타이드 또는 단백질을 발현시키는 단계; 및

(c) 상기 발현된 재조합 펩타이드 또는 단백질을 수득하는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 제1항의 PAS 인자 변이체-코딩 뉴클레오타이드 서열-융합 파트너 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열-재조합 펩타이드 또는 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 상기 PAS 인자 변이체는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 발현 컨스트럭트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.